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Summary
이 프로토콜은 마우스 뇌 조직에서 말초 골수성 세포 침투뿐만 아니라 미세 교졸 밀도, 분포 및 형태학의 분석 뿐만 아니라 IBA1 및 TMEM19의 면역 형광 유행성 화에 대한 단계별 워크플로우를 설명합니다.
Abstract
이것은 microglia의 이중 시각화및 마우스 뇌 조직에 있는 대식세포 침투를 위한 프로토콜입니다. TMEM119(마이크로글리아를 선택적으로 라벨로 표시함)는 IBA1(형태에 대한 탁월한 시각화를 제공함)과 결합될 때 밀도, 분포 및 형태학의 변화를 조사할 수 있습니다. 이러한 매개 변수를 정량화하는 것은 뇌의 상주 대식세포인 microglia가 가하는 역할에 대한 통찰력을 제공하는 데 중요합니다. 정상적인 생리적 조건하에서, microglia는 모자이크 와 같은 패턴으로 정기적으로 분포하고 난폭한 과정으로 작은 소마를 제시합니다. 그럼에도 불구하고, 환경 적 요인 (즉, 외상, 감염, 질병, 또는 상해)에 대한 반응으로서, 미세 교밀도, 분포 및 형태는 모욕에 따라 다양한 방식으로 변경된다. 추가적으로, 기술된 이중 염색 방법은 TMEM119를 가진 공동 현지화 없이 IBA1의 그들의 표현에 근거를 둔 두뇌에 있는 대식세포 침투의 시각화를 허용합니다. 이 접근은 이렇게 건강과 질병의 각종 맥락에서 두뇌 항상성에 있는 그들의 명백한 관여에 기능적인 통찰력을 제공하기 위하여 요구되는 microglia와 침투대식세포 사이 차별을 허용합니다. 이 프로토콜은 선택적 마커의 식별에 관련된 신경 면역학의 최신 연구 결과를 통합합니다. 그것은 또한 프로젝트에 신경 면역학을 통합 하고자 하는 경험이 풍부한 신경 면역 학자와 연구자 모두에 대 한 유용한 도구 역.
Introduction
급성 또는 만성 여부, 신경 염증은 단단히 microglia에 의해 영향을, 뇌의 상주 대 식 세포. 면역 염색을 통해 미세 글리아를 시각화하는 것은 매우 접근 가능한 기술인 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 신경 염증을 연구하는 데 유용합니다. 동종 조건에서, microglia는 일반적으로 비 오버랩, 모자이크 같은 패턴으로 분포된다. 그들은 때때로 서로 접촉 1, ramified 프로세스1을확장 작은 소마를 전시2. Microglial ramified 프로세스는 동적으로 뇌 의 실조를 조사, 뉴런과 상호 작용, 다른 신경교 세포, 정상적인 생리 적 조건 동안 혈관3. Microglia는 면역 학적 작업을 수행하고 뇌 milieu의 변화, 세포 사멸 또는 조직 손상에 반응 할 수있는 수용체의 무기고를 갖추고 있습니다. 또한, 그들은 시냅스 형성, 유지 보수 및 제거4,5에서특히 주요 생리 기능을 발휘합니다.
마이크로글리아를 연구하는 데 사용되는 마커 들 중, 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1(IBA1)은 가장 널리 사용되는 것 중 하나이다. IBA1은 전자 현미경6에의해 확인된 바와 같이 미세 원위 과정을 포함하여 미세 교안 형태학의 뛰어난 시각화를 제공하는 칼슘 결합 단백질입니다. 이 도구는 동물 질병 모델7,8,9의광대 한 배열에서 이전에 "활성화"라고 불리는 미세 교어 변환을 특성화하는 데 중요한 역할을했습니다. 신경 염증의 존재, microglial 응답 포함: 세포 밀도의 증가로 정의 되는 microgliosis, 때로는 클러스터링 귀 착되는 분포의 변화, 세포 신체의 확대, 뿐만 아니라 두껍게 하 고 더 ameboid 모양10,11,12,13와관련된 프로세스의 단축 .
면역 염색은 특정 마커에 대하여 지시된 항체의 가용성에 의해 제한됩니다. 중요한 것은, IBA1은 마이크로글리아에 의해뿐만 아니라 뇌에 침투하는 말초 대식세포에 의해 발현된다14. 뇌 내부의 IBA1 양성 세포의 관찰이 연구 분야에서 마이크로 글리아의 마커가되었지만, 말초 대식세포 침투는 건강한 뇌에서 도 미미하게, 다양한 조건하에서 보고되었습니다15,16 ,17,18. 따라서, IBA1 단독의 사용은 마이크로글리아의 선택적 시각화를 허용하지 않는다. 또한, 대식세포는 일단 뇌에 침투하면 상주 마이크로글리아의 분자 및 형태학적 특징을 채택하여 분화19를방해한다. 이것은 microglia의 기능을 조사하고 대식세포에 침투할 때 도전을 나타냅니다.
미세글리아 및 말초 대식세포는 뚜렷한 기원을 가지고 있지만(예를 들어, 배아 노른자 낭과 골수에서 각각20,21),두 세포 집단이 운동한다는 것을 나타내는 발견의 수가 증가하고 있다. 뇌의 다른 역할19. 따라서 그들의 밀도, 분포, 형태학 및 기능을 조절할 수 있는 침략적인 조작 (즉, 골수 키메라 또는 parabiosis) 없이 이 2개의 인구 사이 구별하는 방법을 사용하는 것이 중요합니다. TMEM119는 건강 및 질병 상태22에걸쳐 마이크로글리아 특이적 마커로 나타났다. IBA1와 결합될 때, 이 마커는 TMEM119 음성 및 IBA1 양성인 대식세포에 침투하는 이 세포를 분화하는 데 유용하게 됩니다. TMEM119는 발달조절이 되는 반면, TMEM119는 출생 후 3일(P3) 및 6(P6)으로 일찍 발성되며, P10과 P1422사이의 성인 수준에 도달할 때까지 꾸준히 증가한다. IBA1은 배아일10.5(E10.5)23일부터발현된다. 제안된 이중 표지 프로토콜은 이렇게 출생 후 생활 내내 이 2개의 인구를 공부하는 것이 유용합니다.
이 프로토콜은 마이크로글리아와 말초 대식세포 사이의 차별을 허용하는 단계별 면역 염색 절차를 제공합니다. 또한 미세 교졸 밀도, 분포 및 형태학의 정량적 분석뿐만 아니라 말초 대식세포 침투의 분석을 수행하는 방법에 대해서도 설명합니다. microglia 및 말초 대식 세포의 조사는 그 자체로 유용하지만,이 프로토콜은 신경 염증성 조련사를 국소화 할 수 있습니다. 따라서 보완적인(아직 더 많은 시간 및 리소스 소모적인) 기술을 사용하여 조사할 특정 지역을 식별하는 플랫폼의 역할도 합니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 캐나다 동물 관리 위원회와 라발 대학의 동물 관리 위원회에 따라 기관 동물 윤리 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 면역 염색
- 뇌 지도프로그램의 도움으로 관심 영역(ROI)(즉, 해마)을 포함하는 3개의 마우스 뇌 섹션을 선택합니다. 플라스틱 멀티 웰 플레이트에 섹션을 놓고 인산염 완충 식염수 (PBS)의 350 μL로 덮습니다(표 1).
참고 : 최적의 결과를 얻으려면 뇌를 4 % 파라 포름 알데히드와 함께 관전하고 진동으로 50 μm의 두께로 절단해야합니다. 24 개의 멀티 웰 플레이트의 경우 각 우물은 최대 6 개의 섹션을 수용 할 수 있습니다. 각 웰에 대한 용액의 권장 부피는 350 μL (최대 3 개의 섹션에 대한) 및 6 개의 섹션을 포함하는 우물의 경우 500 μL입니다. 섹션의 높은 수의 경우, 12 멀티 웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 각 잘에 대한 용액의 선택 된 볼륨이 완전히 조직을 커버하고 섹션이 떠 있도록 있는지 확인하십시오. 권장 볼륨은 프로토콜의 나머지 부분에 사용되는 모든 솔루션에 적용됩니다. - 350 μL의 PBS로 샘플을 덮어 시료를 세척하고 다목적 셰이커 위에 다중 웰 플레이트를 실온(RT)에 놓아 놓습니다. 5분 후에 PBS를 제거하고 5배 신선한 PBS로 교체합니다.
참고: 솔루션을 제거하려면 이송 파이펫을 권장합니다. 어떤 용액에 부어 때, 조직 무결성을 보호하기 위해 우물 벽에 파이펫의 끝을 배치해야합니다. 또한 각 새 솔루션에 새 파이펫을 사용해야 합니다. - PBS를 제거하고 pH = 6.0(표 1)으로구연산 나트륨 완충액 10 mM의 350 μL을 추가합니다.
- 파라핀 필름으로 멀티 웰 플레이트를 밀봉하고 70 °C에서 40 분 동안 이전에 예열 된 수조에 떠있게하십시오.
- 멀티 웰 플레이트를 약 15분 동안 식힙니다.
- 구연산나트륨 완충제를 제거하고 1.2단계에서 행한 것처럼 PBS에서 단면을 세척한다.
- PBS를 제거하고 갓 만든 0.1% NaBH4 (표 1)의350 μL을 추가하고 RT에서 30 분 동안 배양시하십시오.
- 0.1% NaBH4의 용액을 제거하고 1.2단계에서 수행된 것처럼 PBS에서 단면을 세척한다.
- PBS를 제거하고 다목적 셰이커 위에 RT에서 1시간 동안 블로킹버퍼(표 1)를추가합니다.
참고: 다음 단계에서 동일한 솔루션이 사용되기 때문에 두 배의 차단 버퍼를 준비해야 합니다. - 차단 버퍼를 제거하고 1차 항체의 혼합물을 포함하는 완충액을 차단하여 교체한다(1:150 마우스 IBA1 + 1:300 TMEM119). 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하고 4 °C에서 밤새 배양시키십시오.
- 다음날, RT에서 약 15 분 동안 따뜻한 샘플을.
- 트리톤(PBST)으로 PBS에서 각각 5x씩 5x로 세척합니다(표1).
- PBST를 제거하고 이차 항체의 혼합물을 포함하는 차단 버퍼를 추가 (1:300 당나귀 안티 마우스 알렉사 488 IBA1; 1:300 염소 안티 토끼 알렉사 568 TMEM119에 대한) RT에서 1.5 시간. 이후이 시점에서 시작, 빛으로부터 샘플을 보호.
- 차단 버퍼를 제거하고 PBST를 사용하는 이 시간을 제외하고 1.2단계에서 수행한 것처럼 섹션을 5x 로 세척합니다.
- PBST를 제거하고 추가 4′,6-디아미디노-2-페니린돌 (DAPI) [1:20000] RT에서 5 분.
- DAPI를 제거하고 인산염 완충제(PB)에서 각각 5분 동안 3x 섹션을 세척합니다.
- 현미경 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 빛으로부터 보호하면서 건조시키십시오.
- 건조시, 장착 형광 매체의 몇 방울을 추가하고 거품 형성을 피하고, 커버 슬립으로 커버.
참고: 슬라이드를 4°C에서 조직학적 슬라이드 상자 안에 빛으로부터 보호하면서 보관하십시오. 샘플은 몇 달 동안 보존 할 수 있습니다.
2. 밀도 및 분포 분석을 위한 이미징
- 광시야 에피플루온스 현미경의 도움으로, 낮은 배율 및 DAPI 채널을 사용하여 ROI(즉, 해마의 CA1 영역)를 찾습니다.
- 0.5의 숫자 조리개(NA)를 사용하여 DAPI, 488 채널 및 568채널 및 필터를 사용하여 0.3 μm/픽셀의 해상도로 이미지를 20x로 가져옵니다. ROI를 덮는 모자이크 사진을 캡처합니다. 또는 더 큰 이미지로 스티치될 개별 사진을 찍습니다.
참고: 모자이크 이미지는 작은 이미지로 구성된 슈퍼 이미지입니다. 모자이크 이미지는 일반적으로 높은 배율의 시야의 제한된 영역을 극복하는 데 사용됩니다. 일부 소프트웨어에는 모자이크 기능이 포함되어 있습니다. 그럼에도 불구하고 개별 이미지를 하나로 바느질하여 이미지를 다른 사진 편집 소프트웨어와 함께 수동으로 스티치 할 수도 있습니다. 파일에 축척 정보를 추가해야 합니다. 이러한 유형의 분석을 위해, 실험 조건당 최소 5마리의 동물과 함께 ROI/동물당 적어도 300개의 미세교세포(예를 들어 해마의 경우 약 10-15장의 사진에 해당)를 이미지화하는 것이 좋습니다. 그림 1A-C는 공동 라벨이 부착된 마이크로글리아의 이미지를 나타낸다. - 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다.
3. 형태학 분석을 위한 이미징
- 공초점 또는 구조화 조명 현미경을 사용하여 DAPI 채널을 사용하여 낮은 배율로 ROI를 찾습니다.
- 40x 목표(즉, NA 1.4 오일)를 사용하여 ROI 내부에서 IBA1+/TMEM119+ 셀을 찾습니다. 라이브 이미징 동안 Z축으로 이동합니다. 임의로 선택된 마이크로글리아의 신호가 사라지자마자 이 Z 레벨을 Z 스택의 시작으로 설정합니다. 마이크로글리아의 신호가 사라질 때까지 반대 방향으로 Z축을 따라 이동하고 해당 점을 Z 스택의 끝으로 설정합니다.
참고: 그림 2A−C는 IBA1+/TMEM119+ 마이크로글리아의 이미지를 보여줍니다. - 0.33μm Z 간격과 0.15 μm/픽셀의 픽셀 크기를 사용하여 세 채널(DAPI, 488, 568)에서 Z 스택을 만듭니다. 파일에 축척 정보를 추가합니다.
참고: 권장되는 Z 간격은 목표의 분해력에 따라 달라집니다(예: NA 1.4 오일과 같은 40x 목표의 경우 0.33 μm임). 형태학적 분석의 경우, 실험 조건당 최소 5마리의 동물을 가진 동물당 최소 20개의 세포를 가지고 있는 것이 좋습니다. - 파일을 TIFF 파일로 저장합니다.
4. 밀도 및 분포 분석
- 가장 가까운 이웃 거리 (NND) 플러그인이 설치된 피지 / ImageJ를 엽니 다. 20x 이미지를 엽니다.
참고: "ImageJ를 사용하여 가장 가까운 이웃 거리 계산"이라는 키워드가 있는 검색 엔진을 사용하여 설치 지침을 찾습니다. 플러그인 저자는 유성 마오입니다. - 이미지에 각인된 축척을 기준으로 수동으로 축척을 설정하려면 직선도구(그림 3E)를선택하고, 저울 가장자리에 커서를 놓고, 시프트 키를 누를 때 이미지의 배율에 가능한 한 가깝게 선을 그립니다(그림3I) 분석 선택 | 축척을 설정한다음 올바른 정보를 입력합니다(그림3J).
참고: 배율을 파일의 메타데이터에 포함하고 자동으로 설정할 수 있는 경우도 있습니다. - 이미지 선택 | 색상 | 합성을 만들어 모든 채널의 합성 이미지를 만듭니다.
참고: 이미지 수집 중에 FIJI/ImageJ는 RGB 형식으로 합성을 자동으로 만듭니다. - 메뉴 모음에서 분석 | 측정값을 설정합니다. 영역, 중심및 둘레를 확인합니다. 탭에서 로 리디렉션하려면열려 있는파일(그림 3K)을클릭하고 선택합니다.
- 이미지로 이동 | 색상 | 채널 도구를 열어 채널 도구를 엽니다.
참고: 이 메뉴는 특정 색상을 사용하지 않도록 설정합니다. DAPI 채널은 ROI를 식별하고 셀을 확인하는 데 유용할 수 있습니다. 계산을 더 쉽게 하기 위해 비활성화할 수 있습니다. - 자유형 선택도구(그림 3D)를사용하여 ROI의 대략적인 둘레를 그립니다.
- 도구 모음의 타원형 도구를 두 번 클릭하여 선택 브러시 도구를 활성화하고 선택 활성화 브러시 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다(그림3G). 이 도구는 ROI를 보다 정확하게 설명하는 데 사용됩니다. 200-400 사이의 적절한 브러시 크기를 선택합니다.
- 선택 브러시를 사용하여 ROI에 가장 잘 맞도록 둘레를 조정합니다. 키보드에서 T를 눌러 ROI 관리자에 추가합니다(그림3L).
- 분석 선택 | M 키를 측정하거나 누르면 결과 창이 나타납니다. 데이터시트에 결과를 복사하여 붙여넣은 다음 해당 영역(즉, ROI 영역)에 대한 정보를 저장합니다. 그림 3R)을참조하십시오.
- ROI 영역을 복사한 후 ROI를 클릭하고 백스페이스 키를 눌러 결과 창에서 정보를 지웁습니다.
- ROI 관리자창(그림 3L)으로이동하여 ROI 추적을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 이미지를 이름과 일치하도록 이름을 변경한 다음 저장합니다.
- 도구 모음에서 브러시 도구를 두 번 클릭합니다. 검은색과 브러시 크기를 10으로 선택합니다. 오버레이 페인트 옵션을 선택하지 않았는지 확인합니다(그림3H).
- TMEM119 채널에서 각 TMEM119+ 마이크로글리아의 소마를 중앙에 조심스럽게 배치합니다. TMEM119에 대해 양성이 아닌 셀중앙에 흰색 점을 배치합니다(침투대식 세포에 표시). ROI에 포함된 모든 셀에 대해 동일한 절차를 반복합니다.
참고: 모든 점(흑백)이 동일한 채널에 위치하는 것이 중요합니다. 이미지 창 레이블의 색상을 확인하여 채널의 ID를 확인할 수 있습니다(빨간색, 파란색 또는 녹색). - 이미지 선택 | 색상 | 분할 채널. 각 채널의 창이 나타납니다. 그런 다음 점 주석이 있는 채널을 식별하고 다른 두 창을 닫습니다.
- 새 분할 채널 이미지를 리디렉션합니다. 분석으로 이동 | 측정값을 설정합니다. 탭에서 로 리디렉션하려면분할 채널이미지(그림 3K)를클릭하고 선택합니다.
- 이미지 선택 | 유형 | 8 비트. 이미지로 이동 | 임계값을 조정하고 선택합니다(그림3O). 임계값을 조정하려면 두 번째 막대의 단추를 두 막대의 왼쪽(임계값 = 0)으로 밉니다.
참고: 이렇게 하면 이미지에 검은색 점만 남게 되어 흰색으로 표시됩니다. - ROI 관리자 창에서 ROI를 선택합니다. 분석 선택 | 입자 분석(그림 3N). 크기 (인치2): 1-20을 작성하십시오. 픽셀 단위를 선택하지 않은 상태로 유지하고, 디스플레이를 확인하고, 요약하고, 관리자에 추가하고, 확인을누릅니다. 요약 창이 나타나고 포인트 수를제공합니다(그림 3P). 정보를 복사하여 데이터시트에 붙여넣습니다.
- 플러그인 선택 | NND. NND 창이나타납니다(그림 3Q). 모든 정보를 데이터시트에 복사/붙여넣습니다. 각 숫자는 각 마이크로글리아가 가장 가까운 이웃 마이크로글리아까지의 거리를 나타낸다.
- 임계값 창으로 돌아가서 첫 번째 막대를 오른쪽(임계값 = 255)으로 밀어 모든 흰색 점이 흰색으로 표시되고 흰색으로표시됩니다(그림 3M).
- 분석 선택 | 입자를 분석합니다. 포인트 수를 제공하는 요약 창이나타납니다(그림 3P). 정보를 복사하여 데이터시트에 붙여넣습니다.
- ROI 관리자로 이동하여 모든 포인트를 선택하고 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 이미지 이름으로 저장합니다. 이렇게 하면 zip 파일의 모든 점을 저장할 수있습니다(그림 3L). 파일 선택 | 을 로 저장하고 분석된 이미지를 식별할 수 있는 이름으로 파일을 저장합니다.
- IBA1+/TMEM119+ 이중 양성 셀 수를 ROI 영역별로 나누어 마이크로글리아(각 이미지)의 밀도를 가져옵니다.
참고: 각 그림의 값은 각 동물에 대해 평균화될 수 있습니다. 그런 다음 데이터는 모든 동물의 평균±표준 오차(SEM)로 제시될 수 있다. - 모든 TMEM119+ 셀의 NND 값의 그림당 평균을 얻어 NND를 결정합니다.
참고: 데이터는 모든 동물의 평균 ± SEM으로 제시될 수 있다. - 수식: NND2 x 밀도를 사용하여 간격 인덱스를 계산합니다.
참고: 데이터는 모든 동물의 평균 ± SEM으로 제시될 수 있다. 이 측정의 단위는 임의 단위입니다. - 12 μm 이하의 NND가 있는 세포를 식별하여 미세 교졸 클러스터를 정량화합니다.
참고: 여기서, 12 μm는 수목과 함께 서로 접촉하는 두 개의 직접 병치 미세 교교 세포 사이의 대략적인 거리이기 때문에 선택된다. 이 조건을 충족하는 3개 이상의 microglia가 있는 경우에, 심상으로 돌아가서 이 세포가 하나 또는 다중 클러스터의 일부인지 확인하십시오. - 클러스터 수를 확인한 후 데이터시트에 클러스터 수를 작성합니다.
참고: 클러스터 수를 ROI 영역으로 나누어 각 동물에 대한셀/mm2 밀도를 얻을 수 있습니다. 데이터는 모든 동물의 평균 ± SEM으로서 제시될 수 있다. - 말초 골수성 세포 침투의 백분율을 결정하려면 각 동물에 대해 총 골수성 세포 수(TMEM119+/IBA1++ + TMEM119-/IBA1+)에 대해 IBA1+/TMEM119-세포의 %를 계산합니다.
참고: 데이터는 모든 동물의 평균 ± SEM으로 제시될 수 있다.
5. 형태학 분석
- 피지/이미지J를 엽니다.
- 이미지 J 또는 FIJI를 사용하여 40x 이미지를 엽니다. 이미지를 스택에서 열어야 하는지 묻는 팝업 창이 나타납니다. 확인을 클릭합니다. 다음으로 이미지 | 선택 스택 | Z 프로젝션 창을 여는 Z 프로젝트입니다. 첫 번째부터 마지막 조각까지 모든 슬라이스를 포함합니다. 최대 강도가 투영 유형 아래에서 선택되었는지 확인하고 확인을 클릭합니다.
- Z 프로젝트가 있는 새 창을 클릭합니다. 이미지 선택 | 색상 | 분할 채널. IBA1 채널의 이미지에 흔적을 수행합니다.
참고: 다른 채널(TMEM119 및 DAPI)은 미세교형성 형태 분석 중에 필요에 따라 개방되고 협의될 수 있습니다. - 메뉴 모음에서 분석 | 측정값을 설정합니다. 영역, 중심및 둘레를확인합니다. 탭에서 로 리디렉션하려면열린파일(그림 3K)을선택합니다.
- 단계 4.2에 설명된 대로 배율을 설정합니다.
- IBA1 채널에서 소마 크기를 측정하려면 자유형 선택도구(그림 3D)를사용하여 소마의 대략적인 둘레를 그립니다.
- 도구 모음의 타원형 도구를 두 번 클릭한 다음 선택 브러시 활성화 상자(그림3G)를선택하여 선택 브러시 도구를 활성화합니다. 10-20(그림3B)에서선택 브러시 크기를 선택합니다.
- 선택 브러시를 사용하여 소마에 가장 잘 맞도록 추적을 조정합니다. 확대하면 이 단계에서 정밀도가 활성화됩니다(그림2I).
- T 키를 눌러 ROI 관리자에 소마 추적을 추가합니다(그림3L).
- 분석 선택 | M 키를 측정하거나 누릅니다. 결과 창이 나타납니다. 데이터시트에 결과를 복사하여 붙여넣습니다(그림3R).
- soma 영역에 대한 정보를 저장하려면 ROI 관리자 창으로 이동하여 ROI를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 이미지 이름과 일치하도록 이름을 변경하고 추적이 soma에 대한 것이라는 점을 지정한 다음 파일을 저장합니다.
- IBA1 채널에서 arborization 영역을 측정하려면 다각형모양(그림 3C)을시작하는 다각형 선택 도구를 사용하여 미세 교어 공정 말단을 클릭합니다.
- 마이크로교교 공정의 팁에 따라, 각 공정 말단의 끝을 클릭하여 마이크로교아교가 커버되는 영역을 가장 잘 나타내는 다각형을 형성한다(그림2D-H).
참고 : 다각형이 모든 미세 교어 공정 사지를 연결하는지 확인하십시오. 다각형을 형성하는 선은 교차해서는 안 됩니다. 마이크로 글리놀 공정 팁을 클릭 할 때, 프로세스의 일부를 절단하지 않도록주의하십시오. 프로세스를 둘러볼 추가 점을 추가하는 것이 유용한 경우도 있습니다. 다각형을 형성하는 점의 수는 말위 처리의 수에 직접 연결되지 않으며 따라서 연구와 관련이 없습니다. - 다각형을 닫려면 다각형의 시작점을 클릭합니다.
- T 키를 눌러 ROI 관리자에 추적을 추가합니다(그림3L). 분석 선택 | M 키를 측정하거나 누릅니다. 결과 창이 나타납니다. 데이터시트에 결과를 복사하여 붙여넣습니다(그림3R).
- 수목 영역에 대한 정보를 저장하려면 ROI 관리자 창으로 이동하여 ROI를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 이미지 이름과 일치하도록 이름을 변경하고 수목화를 지정한 다음 파일을 저장합니다.
- 각 동물에 대한 모든 소마 영역을 평균화하여 소마 영역을 결정합니다.
참고: 데이터는 모든 동물의 평균 ± SEM으로 제시될 수 있다. - 각 동물에 대한 모든 수목 영역을 평균화하여 수목 면적을 결정합니다.
참고: 데이터는 모든 동물의 평균 ± SEM으로 제시될 수 있다. - 각 미세교세포에 대한 수식 소마 영역/수목 영역과 동물당 평균을 사용하여 형태학적 지수를 계산합니다.
참고: 데이터는 모든 동물의 평균 ± SEM으로 제시될 수 있다.
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Representative Results
도 1은 형광 현미경으로 20x에서 촬영된 등쪽 해마의 관상 구간에서 IBA1 및 TMEM119를 이용하여 마이크로글리아의 공동 라벨링을 나타낸다. 성공적인 염색은 미세 교세포 체체와 미세 한 과정을 보여줍니다(그림 1A−C). 이러한 염색은 마이크로교졸 밀도및 분포및 마이크로교암군모의 분포 및 식별을 가능하게한다(도 1I)및 침투 대식세포(도1F).
도 2는 마이크로교목구이 추적절차(도 2D−H)의단계적 예에서 IBA1+/TMEM119+ 마이크로글리아(그림2A−C)를나타내며, 세포체 추적의 예(그림2II)를 나타낸다. ), 공초점 현미경으로 40배에서 모두 이미지화.
그림 1: 밀도, 분포, 군집 화 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위한 마우스 뇌 조직의 IBA1 및 TMEM19 이중 염색. (A-C) C57BL/6 성인 마우스의 해마에서 의 전형적인 미세 교만 분포. (D-F) 마이크로글리아는 IBA1+/TMEM119+로 확인되었으며, 수컷 마우스의 편도체에서 IBA1+/TMEM119(흰색 화살표)로 확인된 대식세포에 침투합니다. (G−I) 마우스의 해마에서 두 개의 마이크로 글리아 (흰색 사각형)의 클러스터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 미세교형성 분석을 위한 IBA1 및 TMEM119 염색. (A-C) 마이크로 글리아. (D-I) FIJI/ImageJ의 다각형 도구를 사용하여 IBA1 채널을 사용한 수목 추적의 단계별 예제입니다. (J)FIJI/ImageJ의 자유형 선택 도구를 사용하여 IBA1 채널을 사용한 마이크로글리아 소마 추적의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미세교밀도, 분포, 군집, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위한 FIJI/ImageJ 인터페이스 및 도구. (A-R) 밀도, 클러스터 및 형태 분석에 사용되는 모든 도구, 메뉴 및 창을 편집합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 솔루션 | 준비 |
| 블로킹 버퍼 | 0.5% 젤라틴 + 5% 천연 염소 세럼 + 5% 천연 당나귀 세럼 + 0.01% 트리톤 X-100 TBS [0.05 M] |
| 시산염 버퍼 | 구연산 1.92 g[10 mM], 500 μL 의 트웬20 [0.05% (v/v)], 초순수 700 mL, pH = 6.0 을 NaOH로 조정 [10 N], 초순수로 최대 1L 채우기 |
| 나브4 | [0.01% w/w] 초순수 10 mL에서 NaBH4의 0.01 g을 해소하고 용액을 잘 혼합해야합니다. 이 솔루션은 거품을 만듭니다. 혼합 후 캡을 열어 방출 압력 |
| Pb | 【100 mM】 풀이 23.48 g 의 Na2HPO4 및 NaH2PO4의4.8 g · H2초순수 1L에 O를 채운 다음 최대 2L까지 채우고 pH = 7.4를 조정합니다. |
| Pbs | 【50 mM】 풀은 5.87 g 의 Na2HPO4,NaH2PO4의 1.2 g H2O, 500 mL의 초순수 NaCl 9g, 초순수로 최대 1L 채우기, pH = 7.4 조정 |
| PBST | PBS + 0.01% 트리톤 X-100 |
| Tbs | 희석 트리스 HCl [0.5 M] 초순수 1:10 [0.05 M], 트리스 HCl 1 L을 취하고 [0.05 M] 및 NaCl 8.75 g추가 |
| 트리스 HCl | [0.5 M] 950 mL의 초순수, 트리스 완충염 염화물 78.8 g (C4H11NO3Cl)을 추가하여 pH = 8을 조정하고 최대 1L까지 채웁니다. |
표 1: 면역 염색에 사용되는 용액.
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Discussion
이 프로토콜은 염색 및 분석의 품질이라는 두 가지 중요한 부분으로 나눌 수 있습니다. 염색이 최적이 아닌 경우 미세 교세포를 적절히 나타내지 못하여 밀도, 분포 및 형태 측정에 영향을 미칩니다. 또한, 침윤 말초 골수성 세포의 비율은 과소 평가될 수 있다. 이것은 염색 프로토콜의 최적화된 버전이지만 최적이 아닌 이미지를 초래할 수 있는 몇 가지 요인이 있습니다. 동물의 관류가이 프로토콜에 포함되어 있지 않더라도 뇌 고정이 잘 실행되지 않으면 염색의 품질이 손상됩니다. 추가적으로, 충분한 관류는 연구 결과 방해할 수 있는 혈관의 안쪽에 대식세포의 부재를 지키기 위하여 요구됩니다.
면역 염색과 관련하여 가장 중요한 세부 사항은 버퍼의 품질, 차단 단계, 항체의 적절한 저장 및 뇌 샘플 처리를 포함합니다. 버퍼 및 저장의 적절한 준비는 염색의 품질에 직접적인 영향을 미칩니다. 지정하지 않는 한 일부 버퍼는 장기간 저장할 수 있지만 오염 징후를 보이는 버퍼의 사용은 피해야 합니다. 버퍼가 며칠 또는 몇 주 전에 준비된 경우 사용하기 전에 모든 솔루션의 pH를 확인해야 합니다.
또한 면역 염색과 관련하여 배경 염색의 존재는 가장 흔한 문제 중 하나입니다. 배경 염색은 microglia, 특히 그들의 형태를 분석하는 것을 어렵게 하고, 그러므로 결과를 편향할 것입니다. 백그라운드를 방지하려면 차단 단계가 올바르게 수행되는 것이 중요합니다. 항체의 저장 조건은 또한 그들의 효험에 직접적인 효력이 있습니다. 회사가 제공하는 보관 지침을 엄격히 준수하고 잦은 해동 동결 주기를 피하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 전체 과정 동안, 뇌 섹션의 물리적 무결성에주의를 지불하는 것이 중요합니다. 특히 실험자가 이 절차를 경험하지 않은 경우 각 조작(버퍼 변경, 워시 및 장착)에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 용액이나 버퍼를 변경할 때 액체 용액없이 샘플을 남기지 않는 것이 좋습니다, 후속 단계에 대한 솔루션은 사전에 우물에 부어 준비해야합니다. 멀티 웰 플레이트는 시료가 건조하도록 유도할 수 있는 증발을 피하기 위해 하룻밤 동안 파라핀 필름으로 올바르게 밀봉되어야 합니다.
미세교밀도, 분포 및 형태학의 정량적 분석은 정성적 보고서에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 편견을 방지하기 위해 분석을 수행하는 연구원은 실험 조건에 눈을 멀게해야합니다. 따라서 다른 사람들이 분석을 수행하고 파일의 이름을 변경하도록 하는 것이 좋습니다(키 시트에 원본 이름과 새 이름을 유지하면서). 새 이름에는 실험 조건에 대한 힌트가 없어야 합니다. 전체 분석은 이러한 블라인드 파일에서 수행 할 수 있으며, 원래 이미지 ID는 데이터의 컴파일 후 통계 분석 전에 공개됩니다. 블라인드는 이미 숙련 된 연구자에 의해 수행되지만, 처음으로 이러한 유형의 분석을 수행하는 사람들에게 는 귀중한 조언으로 남아 있습니다.
뇌 영역에 대한 제어는 분석 중에 ROI를 선택및 추적하는 동안 수행됩니다. 동물에 걸쳐 Bregma 수준의 동일한 범위에서 섹션을 사용 해야 합니다. 밀도, 분포 및 형태 분석에도 동일한 ROI를 사용해야 합니다. 밀도 및 분포 해석의 경우 FIJI/Image J에서 ROI를 그릴 때 정밀하게 하는 것이 특히 중요합니다. 뇌 아틀라스의 사용은 섹션 선택과 ROI 추적 모두에 권장됩니다. DAPI의 사용은 또한 신경 해부학 적 랜드 마크의 식별을 용이하게합니다. 분산을 방지하려면 미세 환경간에 다를 수 있으므로 ROI에 부분적으로만 있는 마이크로글리아를 거부하는 것이 좋습니다. 밀도 분석을 위해 마이크로글리아를 마킹할 때 DAPI 채널을 선택 기준으로 사용할 수 있습니다. DAPI 염색 핵을 포함하는 microglia만 계산해서, 고려된 microglia는 선택 도중 개인적인 편견을 감소시키는 동일 면에 있습니다.
NND, 간격 인덱스 및 클러스터 분석에 대한 측정은 개별 셀을 표시하는 점의 위치를 기반으로 하므로 거리는 FIJI/ImageJ에 의해 계산되므로 이러한 점을 배치할 때 일관성을 유지해야 합니다. 시각적으로 결정되는 세포 체의 중앙에 점을 엄격하게 배치해야합니다. 또한 점의 크기는 분석 전체에서 일관되게 유지되어야 합니다. 이것은 미세 교어 인구의 공간 분포의 더 나은 표현에 기여할 것입니다. 클러스터 해석의 경우 이전 분석을 기반으로 12 μm를 거리 임계값으로 선택했습니다. 그럼에도 불구하고, NND가 12 μm 이하인 4개 이상의 상이한 세포가 있는 경우에, 이 모든 세포는 단 하나 클러스터의 일부를 취하거나 2개의 세포의 2개의 군집을 나타낼 수 있었습니다. 따라서 이미지로 돌아가 실제 클러스터 수를 확인해야 했습니다.
뇌 아틀라스를 사용하여 신경 해부학 적 특징에 의해 ROI가 결정되는 밀도 및 분포와 달리 형태 분석을위한 미세 교세포 선택은 세포를 분석하는 능력에 기초합니다. 분석할 수 있는 모든 셀은 선택 편향을 방지하기 위해 다른 Z 스택으로 이동하기 전에 Z 스택에서 분석을 위해 선택해야 합니다. 세포를 배제하는 이유는 면역 염색 또는 조직 절단, 처리(예를 들어, 찢어짐) 또는 장착(예를 들어, 기포 형성)에 대한 문제를 포함한다. 이상적으로, 이러한 문제를 가진 뇌 섹션은 체계적으로 화상 진찰과 분석에서 제외되어야 합니다. 또한 TMEM119 및 IBA1의 염색이 100% 겹치지 않는다는 점에 유의해야합니다(그림 2A−C). TMEM119는 IBA1뿐만 아니라 프로세스 연속성(IBA1)의 시각화를 허용하지 않기 때문에 한 셀이 끝나는 위치와 다른 셀이 시작되는 위치를 평가하기가 어렵습니다. 따라서, 형태분석은 IBA1 채널을 사용하여 수행된다. 또한 모든 추적 및 점을 저장하고 향후 개정을 위해 시각화해야 하므로 결과의 투명성과 재현성을 높일 수 있습니다.
이 프로토콜은 마이크로글리아 및 침투 대식세포에 관한 귀중한 정보를 제공합니다. 그것의 응용 프로그램의 보기는 다른 두뇌 지구에 있는 microglia에 있는 변경을 통해 neuroinflammation의 표시를 검출하고, 화합물의 항염증 효과를 공부하고, microglia의 적당한 기능을 방해하는 요인을 공부하는 포함합니다. 이 프로토콜은 뇌의 대식세포 에 침투의 검출과 microglia에서 이러한 세포의 분화를 허용하는 것을 고려, 추가 응용 프로그램은 다음과 같습니다 : 대식세포의 모집이 특정 모욕또는 다른 기술 (즉, 유전 도구)의 사용, 그리고 확인 및 모욕 하는 동안 뇌의 말 초 식 대 식 세포의 부재의 결과 공부. 형광 현미경 검사법 자체만으로는 뇌 의 실사 에 침투하는 것으로는 충분하지 않다는 것을 명심하십시오. IBA1+/TMEM119-세포가 심실 또는 시막 공간 근처에서 관찰될 때, 실치내의 국소화를 확인하기 위해 전자 현미경 검사법과 같은 더 높은 공간 분해 기술이 요구됩니다. 밀도, 분포 및 형태학의 변화는 미세 교안 및 대식세포 역할의 좋은 지표이지만, 이 방법은 기능 적 조사와 결합될 때 가장 강력합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
나탈리 베르누(Nathalie Vernoux)의 지도와 실험에 대한 지원에 감사드립니다. 우리는 또한 각각 그들의 형광및 공초점 현미경의 사용에 대한 박사 에마누엘 플래넬과 세르지 Rivest에게 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 멕시코 과학 기술 위원회 (CONACYT; F.G.I), 재단 파밀 - 초케트 및 센터 테마티크 드 recherche en 신경 과학 (CTRN; K.P.), 퐁 드 레체체 뒤 퀘벡 - 산테 (M.B.) 장학금에 의해 지원되었다 샤스트리 인도 -캐나다 연구소 (K.B.), 뿐만 아니라 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에서 발견 보조금 (NSERC) M.E.T. M.E.E.E.T.는 건강과 치료에 있는 신경 면역 가소성의 캐나다 연구 의자 (Tier II)를 보유하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | - | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
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면역학 및 감염 문제 152 마우스 뇌 미세 글리아 골수성 세포 신경 면역학 면형형 IBA1 TMEM119 현미경 검사법Erratum
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.
The name was corrected from:
Maude Bordelau
to:
Maude Bordeleau
