Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Immunofluorescence farging bruke IBA1 og TMEM119 for Mikrogliaaggregater Density, morfologi og perifere myelogen Cell infiltrasjon analyse i Mouse Brain

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 1,2,4, 1,2
1Axe Neurosciences, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, 2Département de Médecine Moléculaire, Faculté de Médecine, Université Laval, 3Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 4Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokollen beskriver en trinnvis arbeidsflyt for immunofluorescent costaining av IBA1 og TMEM119, i tillegg til analyse av mikrogliaaggregater tetthet, distribusjon og morfologi, samt perifere myelogen celle infiltrasjon i mus hjernevev.

Abstract

Dette er en protokoll for den doble visualisering av mikroglia og infiltrere makrofager i mus hjernevev. TMEM119 (som etiketter mikroglia selektivt), kombinert med IBA1 (som gir en eksepsjonell visualisering av morfologi deres), tillater gransking av endringer i tetthet, distribusjon og morfologi. Kvantifisere disse parametrene er viktig for å gi innsikt i de rollene som utøves av mikroglia, bosatt makrofager av hjernen. Under normale fysiologiske forhold, mikroglia er regelmessig fordelt i en mosaikk-lignende mønster og presentere et lite Soma med ramified prosesser. Likevel, som et svar på miljømessige faktorer (dvs. traumer, infeksjon, sykdom, eller skade), mikrogliaaggregater tetthet, distribusjon og morfologi er endret i ulike manerer, avhengig av fornærmelse. I tillegg tillater den beskrevne dobbel farge metoden visualisering av infiltrere makrofager i hjernen basert på deres uttrykk for IBA1 og uten colocalization med TMEM119. Denne tilnærmingen tillater dermed diskriminering mellom mikroglia og infiltrere makrofager, som er nødvendig for å gi funksjonell innsikt i deres distinkte engasjement i hjernens homeostase på tvers av ulike kontekster av helse og sykdom. Denne protokollen integrerer de siste funnene i neuroimmunology som gjelder for identifisering av selektive markører. Det fungerer også som et nyttig verktøy for både erfarne neuroimmunologists og forskere som ønsker å integrere neuroimmunology i prosjekter.

Introduction

Enten akutt eller kronisk, nevroinflammasjon er tett påvirket av mikroglia, bosatt makrofager av hjernen. Visualisering mikroglia gjennom immunostaining er verdifullt for studiet av nevroinflammasjon med bruk av lys mikroskopi, en lett tilgjengelig teknikk. I homøostatisk forhold er mikroglia vanligvis fordelt i et nonoverlapping, mosaikk-lignende mønster. De viser små somas som forlenger ramified prosesser1, som noen ganger kontakter hverandre2. Mikrogliaaggregater ramified prosesser dynamisk undersøkelse hjernen parenchyma, i samspill med neurons, andre gliacellene celler, og blodkar under normale fysiologiske forhold3. Mikroglia er utstyrt med et arsenal av reseptorer som tillater dem å utføre immunologiske oppgaver og reagere på endringer i hjernen miljø, til celle død, eller til vevsskade. I tillegg utøver de viktige fysiologiske funksjoner, spesielt i Synaptic formasjon, vedlikehold og eliminering4,5.

Blant de tilgjengelige markører som brukes til å studere mikroglia, ionisert kalsium bindende adapter molekyl 1 (IBA1) er en av de mest brukte. IBA1 er et kalsium bindende protein som gir eksepsjonell visualisering av mikrogliaaggregater morfologi, inkludert fine, klare prosesser, som bekreftet av elektron mikroskopi6. Dette verktøyet har vært medvirkende i karakteriserer mikrogliaaggregater transformasjon, tidligere kalt "aktivisering", i et stort utvalg av dyr sykdom modeller7,8,9. I nærvær av nevroinflammasjon, mikrogliaaggregater respons inkluderer: microgliosis som er definert som en økning i cellulær tetthet, endringer i fordelingen som noen ganger resulterer i klynger, utvidelse av celle kroppen, samt tykkelse og forkortelse av prosesser knyttet til mer ameboid figurer10,11,12,13.

Immunostaining er begrenset av tilgjengeligheten av antistoffer rettet mot spesifikke markører. Viktigere er IBA1 uttrykt ved mikroglia, men også av perifere makrofager som infiltrere hjernen14. Mens observasjon av IBA1-positive celler inne i hjernen har blitt en markør for mikroglia i denne forskningen feltet, perifere macrophage infiltrasjon har blitt rapportert under ulike forhold, selv marginalt i sunn hjernen15,16 ,17,18. Følgelig, bruk av IBA1 alene tillater ikke selektiv visualisering av mikroglia. I tillegg har makrofager vedta molekylære og morfologiske funksjoner av fastboende mikroglia når de har infiltrere hjernen, og dermed hindre differensiering19. Dette representerer en utfordring når man undersøker funksjonen til både mikroglia og infiltrere makrofager.

Mens mikroglia og perifere makrofager har distinkt opprinnelse (f. eks, fra embryonale eggeplomme og benmarg, henholdsvis20,21), det er et økende antall funn som indikerer at de to celle populasjoner utøve ulike roller i hjernen19. Det er derfor avgjørende å bruke metoder som diskriminerer mellom disse to populasjoner uten invasiv manipulasjoner (dvs. benmarg chimeras eller parabiose) som kan modulere deres tetthet, distribusjon, morfologi og funksjon. TMEM119 har dukket opp som en mikroglia-spesifikk markør på tvers av helse og sykdom forhold22. Når det kombineres med IBA1, blir denne markøren nyttig for å skille disse cellene fra infiltrere makrofager, som er TMEM119-negative og IBA1-positive. Mens det er developmentally regulert, er TMEM119 uttrykt så tidlig som postnatal dager 3 (P3) og 6 (P6), stadig økende til de når voksen nivåer mellom P10 og P1422. IBA1 uttrykkes så tidlig som embryonale dagen 10,5 (E 10.5)23. Den foreslåtte dobbel merking protokollen er derfor nyttig å studere disse to populasjoner gjennom postnatal livet.

Denne protokollen gir en trinnvis immunostaining prosedyre som tillater diskriminering mellom mikroglia og perifere makrofager. Det forklarer også hvordan å gjennomføre en kvantitativ analyse av mikrogliaaggregater tetthet, distribusjon og morfologi, samt analyse av perifere macrophage infiltrasjon. Mens etterforskningen av mikroglia og perifere makrofager er nyttig på egen hånd, tillater denne protokollen videre lokalisering av neuroinflammatory Foyers; dermed fungerer det også som en plattform for å identifisere bestemte regioner for å undersøke, med bruk av komplementære (ennå, mer tid-og ressurskrevende) teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samråd med retningslinjene for institusjonelle Animal etikk komiteer, i samsvar med den kanadiske Council on Animal Care og Animal Care Committee of Université Laval.

1. Immunostaining

  1. Velg tre mus hjernen deler som inneholder regionen av interesse (ROI) (dvs. hippocampus) ved hjelp av en hjerne Atlas. Plasser delene i en fler brønn plate i plast, og dekk dem med 350 μL av fosfat-bufret saltvann (PBS) (tabell 1).
    Merk: for optimale resultater bør hjernen være perfusert med 4% paraformaldehyde og kuttes til en tykkelse på 50 μm med en vibratome. For en 24 multi-brønn plate, kan hver brønn holde opp til seks seksjoner. Det anbefalte løsnings volumet for hver brønn er 350 μL (for opptil tre seksjoner) og 500 μL for brønner som inneholder seks seksjoner. For et høyere antall seksjoner, anbefales det å bruke en 12 multi-brønn plate. Sørg for at det valgte volumet av løsningen for hver brønn dekker helt vevet og lar delene flyte. De anbefalte volumene gjelder for alle løsninger som brukes i resten av protokollen.
  2. Vask prøvene ved å dekke dem med 350 μL av PBS og la dem hvile ved å plassere en multi-brønn plate oppå en flerbruks shaker ved romtemperatur (RT). Fjern PBS etter 5 min og erstatte den 5x med frisk PBS.
    Merk: en overførings pipette anbefales for å fjerne løsningene. Når du helle i noen løsning, sørg for å plassere spissen av pipette mot brønnen veggen for å beskytte vev integritet. Sørg også for å bruke en ny pipette for hver nye løsning.
  3. Fjern PBS og tilsett 350 μL av 10 mM natrium citrate buffer med pH = 6,0 (tabell 1).
  4. Forsegle multi-brønn plate med parafin film og la den flyte på et tidligere forvarmet vannbad for 40 min ved 70 ° c.
  5. La multi-brønn plate avkjøles i ca 15 min.
  6. Fjern natrium citrate buffer og vask seksjonene i PBS som gjort i trinn 1,2.
  7. Fjern PBS og tilsett 350 μL av nylagde 0,1% NaBH4 (tabell 1) og la ruge i 30 min på RT.
  8. Fjern løsningen på 0,1% NaBH4 og vask SEKSJONENE i PBS som gjort i trinn 1,2.
  9. Fjern PBS og Legg til blokkerings buffer (tabell 1) for 1 time på RT på toppen av en flerbruks shaker.
    Merk: Sørg for å forberede doblet volumer av blokkering buffer, som den samme løsningen vil bli brukt i neste trinn.
  10. Fjern blokkering buffer og erstatte ved å blokkere buffer som inneholder blanding av primære antistoffer (1:150 mus IBA1 + 1:300 TMEM119). Forsegle platen med para fin film og la den ruge over natten ved 4 ° c.
  11. Neste dag, varme prøver på RT for ca 15 min.
  12. Vask delene 5x i 5 minutter hver i PBS med Triton (PBST) (tabell 1).
  13. Fjern PBST og legge til blokkering buffer som inneholder blanding av sekundære antistoffer (1:300 esel anti-mus Alexa 488 for IBA1; 1:300 geit anti-kanin Alexa 568 for TMEM119) for 1,5 h ved RT. starter fra dette punktet og framover, beskytte prøvene fra lys.
  14. Fjern blokkerings bufferen og vask delene 5x som gjort i trinn 1,2, bortsett fra denne gangen med PBST.
  15. Fjerne det PBST og sammenlegge 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) [1:20000] for 5 min for RT.
  16. Fjern DAPI og vask seksjonene 3x i 5 minutter hver i fosfat buffer (PB).
  17. Monter delene på et objektglass. La dem tørke mens beskyttet mot lys.
  18. Når tørket, tilsett noen dråper montering fluorescens medium og dekk med en dekkglass, unngå boble formasjon.
    Merk: Oppbevar lysbildene mens de er beskyttet mot lys, i en histologiske lysbilde boks ved 4 ° c. Prøvene kan bevares i flere måneder.

2. Imaging for tetthet og distribusjon analyse

  1. Med hjelp av et widefield epifluorescence mikroskop, bruke en lav forstørrelse og DAPI kanal for å finne AVKASTNINGEN (dvs. den CA1 regionen av hippocampus).
  2. Skaff bilder på 20x, ved hjelp av en numerisk blenderåpning (NA) på 0,5, med DAPI-, 488-og 568-kanaler og-filtre, med en oppløsning på 0,3 μm/piksel. Fang et mosaikk bilde som dekker AVKASTNINGEN. Alternativt kan du ta individuelle bilder som vil bli sydd inn i et større bilde.
    Merk: en mosaikk bilde er en super bilde konstituert av mindre bilder. Mosaic bilder er vanligvis brukt til å overvinne den begrensede området av feltet-of-View av høy forstørrelser. Noe programvare inkluderer en mosaikk funksjon; ikke desto mindre, profilen kanne likeledes være manuelt sydd sammen med annet foto redigere bort programvare av søm det individ profilen i ettall. Husk å legge til Skalerings informasjonen i filen. For denne typen analyser anbefales det å ha minst 300 mikrogliaaggregater celler avbildet per ROI/dyr (tilsvarende ca. 10 − 15 bilder for hippocampus, for eksempel), med minimum fem dyr pr. eksperimentell tilstand. Figur 1A − C viser bildene av colabelled mikroglia.
  3. Lagre bildet som en TIFF-fil.

3. Imaging for morfologi analyse

  1. Bruk et konfokalmikroskopi eller strukturert belysnings mikroskop ved å bruke DAPI-kanalen til å finne AVKASTNINGEN ved lav forstørrelse.
  2. Bruke en 40x mål (dvs. NA 1,4 olje), finne en IBA1 +/TMEM119 + celle innenfor AVKASTNINGEN. Mens Live Imaging, flytte i Z-aksen. Så snart signalet fra den tilfeldig valgte mikroglia forsvinner, angir du dette Z-nivået som begynnelsen av Z-stakken. Beveg langs Z-aksen i motsatt retning til signalet for mikroglia forsvinner og sett dette punktet som slutten av Z-stakken.
    Merk: figur 2A − C viser bilder av IBA1 +/TMEM119 + mikroglia.
  3. Lag en Z-stabel i alle tre kanaler (DAPI, 488, 568) ved hjelp av en 0,33 μm Z-intervall og pikselstørrelse på 0,15 μm/pixel. Legg til Skalerings informasjonen i filen.
    Merk: det anbefalte Z-intervallet avhenger av den løse kraften til målet (for eksempel for et 40x-objektiv som for eksempel NA 1,4-olje, det er 0,33 μm). For morfologi analyse, anbefales det å ha minst 20 celler per dyr med minst fem dyr per eksperimentell tilstand.
  4. Lagre filen som en TIFF-fil.

4. Density og distribusjon analyse

  1. Åpne FIJI/ImageJ med nærmeste nabo distanse (NND) plugin installert. Åpne 20x bilde.
    Merk: Bruk en søkemotor med søkeordet "nærmest nabo avstander beregning med ImageJ" for å finne installasjonsinstruksjonene. Plugin forfatter er Yuxiong Mao.
  2. Hvis du vil angi skalaen manuelt basert på en skala trykt på bildet, velger du det rette linjeverktøyet (figur 3e), plasserer markøren på kanten av skalaen og, mens du trykker på Skift-tasten, tegner du en linje så nært som mulig til skalaen på bildet (figur 3I ), velger du analyser | Angi skala, og angi deretter riktig informasjon (figur 3J).
    Merk: skalaen kan noen ganger ligge i metadataene til filen og stilles inn automatisk.
  3. Velg bilde | Farge | Gjør sammensatt for å opprette et sammensatt bilde av alle kanaler.
    Merk: under bildeoppkjøp vil FIJI/ImageJ automatisk opprette en sammensatt i RGB-format.
  4. På menylinjen velger du analyser | Angi målinger. Kontroll område, Centroidog perimeter. I kategorien Omadresser til, klikker du og velger den åpnede filen (figur 3k).
  5. Gå til bilde | Farge | Kanal verktøyet for å åpne kanal verktøyet.
    Merk: denne menyen gjør det mulig å deaktivere en bestemt farge. DAPI-kanalen kan være nyttig for å identifisere AVKASTNINGEN og for å bekrefte celler. Den kan deaktiveres for å gjøre telling enklere.
  6. Tegn en grov omkrets på AVKASTNINGEN med verktøyet for fri hånds markering (figur 3D).
  7. Aktiver markerings penselen ved å dobbeltklikke det ovale verktøyet på verktøylinjen og kontrollere at det er merket av for Aktiver valg pensel (figur 3g). Dette verktøyet vil bli brukt til å avgrense AVKASTNINGEN mer presist. Velg en passende pensel størrelse mellom 200 − 400.
  8. Bruk markerings børsten til å justere omkretsen slik at den passer best mulig til AVKASTNINGEN. Trykk på T på tastaturet for å legge til ROI Manager (figur 3l).
  9. Velg analyser | Mål eller trykk på M -tasten, og et resultat vindu vil dukke opp. Kopier og lim inn resultatene på et dataark, og lagre informasjonen om området (dvs. arealet av AVKASTNINGEN; Figur 3r).
  10. Når du har kopiert området for AVKASTNINGEN, sletter du informasjonen fra resultatvinduet ved å klikke på den og trykke på tilbake -tasten.
  11. Gå til vinduet ROI Manager (figur 3l), høyreklikk ROI-sporingen, endre navnet slik at det samsvarer med bildets navn, og lagre.
  12. Dobbeltklikk pensel verktøyet på verktøylinjen. Velg den svarte fargen og en pensel størrelse på 10. Kontroller at alternativet maling av overlegg er ukontrollert (figur 3h).
  13. I TMEM119 kanal, nøye plassere en svart prikk på midten av Soma for hver TMEM119 + mikroglia. Plasser en hvit prikk på midten av cellene som ikke er positive for TMEM119 (for å markere infiltrere makrofager). Gjenta den samme fremgangsmåten for alle cellene som finnes i AVKASTNINGEN.
    Merk: det er viktig at alle prikker (svart og hvitt) er plassert i samme kanal. Identiteten til kanalen kan verifiseres (rød, blå eller grønn) ved å se på fargen på bilde vindus etikettene.
  14. Velg bilde | Farge | Delt kanal. Et vindu for hver kanal vises. Deretter identifiserer du kanalen som har prikk-merknader, og lukker de to andre vinduene.
  15. Omdiriger det nye delte kanal bildet. Gå til analyser | Angi målinger. I kategorien Omdiriger tilklikker du og velger det delte kanal bildet (figur 3k).
  16. Velg bilde | Type | 8-biters. Gå til bilde | Justere og velge terskel (figur 3O). Hvis du vil justere terskelen, skyver du knappen på den andre stolpen, helt til venstre (terskelverdi = 0) i begge stolpene.
    Merk: Dette vil bare la de sorte prikkene på bildet vises hvitt.
  17. Velg AVKASTNINGEN i vinduet ROI Manager. Velg analyser | Analysere partikkel (figur 3N). På størrelse (inch ˆ 2): Skriv 1 − 20. Hold pixel-enheten ukontrollert, sjekk Vis, Oppsummer og Legg til Manager, og trykk OK. Sammendraget vinduet vil dukke opp og gi antall poeng (figur 3p). Kopier og lim inn informasjonen i dataarket.
  18. Velg plugins | NND. NND-vinduet vil dukke opp (figur 3Q). Kopier/Lim inn all informasjonen i dataarket. Hvert tall representerer avstanden hver mikroglia har til nærmeste nabo mikroglia.
  19. Gå tilbake til terskelen vinduet og skyv den første linjen helt til høyre (terskelverdi = 255 i begge barene), som vil la alle de hvite prikkene synlige, vises hvitt (figur 3m).
  20. Velg analyser | Analysere partikkel. Sammendragsvinduet som viser antall poeng vil dukke opp (figur 3p). Kopier og lim inn informasjonen i dataarket.
  21. Gå til ROI Manager velge alle punktene, høyreklikk, og lagre med bildets navn. Dette vil tillate lagring av alle punktene i en zip-fil (figur 3l). Velg fil | Lagre som, og lagre filen med et navn som tillater identifisering av det analyserte bildet.
  22. Oppnå tettheten av mikroglia (for hvert bilde) ved å dele antall IBA1 +/TMEM119 + dobbelt positive celler etter arealet av AVKASTNINGEN.
    Merk: verdiene for hvert bilde kan være gjennomsnitt for hvert dyr. Dataene kan da bli presentert som gjennomsnittet ± standard feil av gjennomsnittet (SEM) av alle dyrene.
  23. Bestem NND ved å få et gjennomsnitt per bilde av NND-verdiene for alle TMEM119 +-celler.
    Merk: dataene kan da bli presentert som gjennomsnittet ± SEM av alle dyrene.
  24. Beregn avstands indeksen ved hjelp av formelen: NND2 x Density.
    Merk: dataene kan da bli presentert som gjennomsnittet ± SEM av alle dyrene. Enhetene for denne målingen vil være vilkårlige enheter.
  25. Kvantifisere mikrogliaaggregater klynger ved å identifisere celler som har en NND under 12 μm.
    Merk: Her er 12 μm valgt, da det er omtrentlig avstand mellom to direkte tilsammen mikrogliaaggregater celler berøre hverandre med arborizations. Hvis det er mer enn tre mikroglia som oppfyller denne betingelsen, går du tilbake til bildet og kontrollerer om disse cellene er en del av én eller flere klynger.
  26. Etter at du har bekreftet antall klynger, skriver du antall klynger i dataarket.
    Merk: antall klynger kan deles av AVKASTNINGEN området for å oppnå tettheten av celler/mm2 for hvert dyr. Dataene kan da bli presentert som gjennomsnittet ± SEM av alle dyrene.
  27. For å finne ut hvor mange prosent av perifer myelogen celle infiltrasjon, beregne% av IBA1 +/TMEM119-celler over det totale antall myelogen celler (TMEM119 +/IBA1 + + TMEM119-/IBA1 +) for hvert dyr.
    Merk: dataene kan da bli presentert som gjennomsnittet ± SEM av alle dyrene.

5. morfologi analyse

  1. Åpne FIJI/ImageJ.
  2. Åpne 40x bildet ved hjelp av image J eller FIJI. Velg et popup-vindu vises og spør om bildene skal åpnes i en stabel. Klikk på OK. Deretter velger du bilde | Stabler | Z-prosjekt for å åpne z-projeksjons vinduet. Ta med alle sektorer fra første til siste sektor. Kontroller at maksimal intensitet er valgt under projeksjons type, og klikk OK
  3. Klikk på det nye vinduet med Z-prosjektet. Velg bilde | Farger | Delte kanaler. Gjennomføre spor på bildene av IBA1 kanalen.
    Merk: de andre kanalene (TMEM119 og DAPI) kan holdes åpne og konsultert etter behov under mikrogliaaggregater morfologi analyse.
  4. På menylinjen velger du analyser | Angi målinger. Sjekk området, Centroid, og omkretsen. I kategorien Omdiriger tilvelger du den åpnede filen (figur 3k).
  5. Angi skalaen som beskrevet i trinn 4,2.
  6. For å måle Soma størrelse i IBA1 kanal, tegne en grov omkrets av Soma med Frihånd utvalg verktøyet (figur 3D).
  7. Aktiver markerings pensel verktøyet ved å dobbeltklikke det ovale verktøyet på verktøylinjen, etterfulgt av å merke av for å aktivere markerings børsten (figur 3g). Velg en utvalgs pensel størrelse mellom 10 − 20 (figur 3b).
  8. Bruke valget pensel, justere spor til best passer Soma. Zooming i vil muliggjøre presisjon i dette trinnet (figur 2i).
  9. Trykk på T -tasten for å legge til Soma-SPORINGEN til ROI Manager (figur 3l).
  10. Velg analyser | Mål eller trykk på M -tasten. Et resultat vindu vil dukke opp. Kopier og lim inn resultatene i et dataark (figur 3r).
  11. For å lagre informasjon om Soma området, gå til ROI Manager-vinduet, høyreklikk på AVKASTNINGEN, endre navnet til å samsvare med navnet på bildet, angi at sporingen er for Soma, og deretter lagre filen.
  12. For å måle arborization området i IBA1-kanalen, klikk på en mikrogliaaggregater prosess med polygon markeringsverktøyet, som vil starte polygon formen (figur 3c).
  13. Følg tipsene til de mikrogliaaggregater prosessene, gå rundt mikroglia ved å klikke på tuppen av hver prosess i ekstremiteter for å danne en polygon som best representerer området som dekkes av mikrogliaaggregater arborizations (figur 2D− H).
    Merk: Pass på at polygon kobler sammen alle mikrogliaaggregater prosess ekstremiteter. Linjene danner polygon bør aldri krysser hverandre. Når du klikker rundt en mikrogliaaggregater prosess spissen, være nøye med å unngå å kutte ut noen del av prosessen. Noen ganger er det nyttig å legge til ekstra poeng for å gå rundt en prosess. Antall poeng som danner en polygon, er ikke direkte knyttet til antallet prosesser som kan kobles fra, og er derfor ikke relevant for studien.
  14. For å lukke polygon, klikk på startpunktet på polygon.
  15. Trykk på T -tasten for å legge til SPORINGEN til ROI Manager (figur 3l). Velg analyser | Mål eller trykk på M -tasten. Et resultat vindu vil dukke opp. Kopier og lim inn resultatene i et dataark (figur 3r).
  16. Hvis du vil lagre informasjonen om arborization området, går du til vinduet ROI Manager, høyreklikker AVKASTNINGEN, endrer navnet slik at det samsvarer med bildets navn, angir for arborization og lagrer deretter filen.
  17. Bestem Soma området ved snitt alle Soma områder for hvert dyr.
    Merk: dataene kan presenteres som gjennomsnittet ± SEM av alle dyrene.
  18. Bestem arborization området ved snitt alle arborization områder for hvert dyr.
    Merk: dataene kan presenteres som gjennomsnittet ± SEM av alle dyrene.
  19. Beregn morfologi indeksen ved hjelp av formelen Soma området/arborization område for hver mikrogliaaggregater celle og gjennomsnitt per dyr.
    Merk: dataene kan presenteres som gjennomsnittet ± SEM av alle dyrene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser co-merking av MIKROGLIA bruker IBA1 og TMEM119 i en koronale delen av rygg hippocampus avbildet på 20x av fluorescens mikroskopi. En vellykket farging avslører mikrogliaaggregater celle organer og deres fine prosesser (figur 1A − C). Denne farging tillater bestemmelse av mikrogliaaggregater tetthet og distribusjon og identifisering av mikrogliaaggregater klynger (figur 1I) og infiltrere makrofager (figur 1F).

Figur 2 viser IBA1 +/TMEM119 + Mikroglia (figur 2A − C) i et trinnvis eksempel på prosedyren mikrogliaaggregater arborization tracing (figur 2D − H), i tillegg til et eksempel på celle tekst sporing (figur 2I ), både avbildet på 40x av konfokalmikroskopi mikroskopi.

Figure 1
Figur 1: IBA1 og TMEM119 dobbel farging av mus hjernevev for tetthet, distribusjon, klynger, og perifere myelogen celle infiltrasjon analyse. (A − C) Typisk mikrogliaaggregater distribusjon i hippocampus i en C57BL/6 voksen mus. (D − F) Mikroglia identifisert som IBA1 +/TMEM119 + og infiltrere macrophage identifisert som IBA1 +/TMEM119 (hvit pil) i amygdala av en mannlig mus. (G − I) Klynge av to mikroglia (hvit firkant) i hippocampus på en mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: IBA1 og TMEM119 farging for mikrogliaaggregater morfologi analyse. (A − C) Mikroglia. (D − I) Steg-for-trinn eksempel på arborization tracing med IBA1 kanalen ved hjelp av polygonverktøyet i FIJI/ImageJ. (J) eksempel på mikroglia Soma TRACING med IBA1 kanalen ved hjelp av Frihånd utvalg verktøyet i FIJI/ImageJ. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: FIJI/ImageJ-grensesnitt og verktøy for mikrogliaaggregater tetthet, distribusjon, klynger, morfologi og perifer myelogen celle infiltrasjon analyse. (A − R) Utarbeidelse av alle verktøy, menyer og vinduer som brukes for tetthet, klynge, og morfologi analyser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Løsninger Forberedelse
Blokkering buffer 0,5% gelatin + 5% naturlig geit serum + 5% naturlig esel serum + 0,01% Triton X-100 i TBS [0,05 M]
Citrate buffer 1,92 g sitronsyre [10 mM], 500 μL av mellom 20 [0,05% (v/v)], 700 mL ultrarent vann, Juster pH = 6,0 med NaOH [10 N], fyll opp til 1 L med ultrarent vann
NaBH4 [0,01% w/w] Disolve 0,01 g av NaBH4 i 10 ml ultrarent vann, bør løsningen være godt blandet. Denne løsningen skaper boble; Løsne trykket ved å åpne hetten etter blanding
Pb [100 mM] Disolve 23,48 g av na2HPO4 og 4,8 g av NaH2PO4· H2O i 1 l av ultrarent vann, fyll deretter opp til 2 l, Juster pH = 7,4
Pbs [50 mM] Disolve 5,87 g av na2HPO4, 1,2 g av NaH2PO4· H2O, 9 g av NaCl i 500 ml ultrarent vann, fyll opp til 1 L med ultrarent vann, Juster pH = 7,4
PBST PBS + 0,01% Triton X-100
Tbs Fortynne Tris HCl [0,5 M] med ultrarent vann 1:10 [0,05 M], ta 1 L av Tris HCl [0,05 M] og tilsett 8,75 g av NaCl
Tris HCl [0,5 M] 950 mL ultrarent vann, tilsett 78,8 g Tris buffer hydrochloride (C4H11nr3CL) Juster pH = 8 og fyll opp til 1 L

Tabell 1: løsninger som brukes til immunostaining.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen kan deles i to viktige deler: kvaliteten på farging og analyse. Hvis farging ikke er optimal, vil den ikke representerer mikrogliaaggregater celler tilstrekkelig, og dermed påvirker tettheten, fordelingen, og morfologi målinger. I tillegg kan andelen av infiltrasjon perifere myelogen celler undervurderes. Dette er en optimalisert versjon av farge protokollen, men det er flere faktorer som kan føre til suboptimal bilder. Selv om av dyret ikke er inkludert i denne protokollen, hvis hjernen fiksering er ikke godt utført, kvaliteten på farging vil bli kompromittert. I tillegg kreves tilstrekkelig blodmangel for å sikre at det ikke finnes makrofager inne i blodkarene som kan forstyrre studien.

Med hensyn til immunostaining, de mest kritiske detaljene inkluderer kvaliteten på buffere, blokkering trinn, riktig lagring av antistoffer, og hjernen prøvehåndtering. Riktig utarbeidelse av buffere og deres lagring har en direkte innflytelse på kvaliteten på farging. Med mindre noe annet er angitt, kan noen buffere lagres i lange perioder, men bruk av buffer som viser tegn på forurensning, bør unngås. Hvis buffere er klargjort dager eller uker på forhånd, bør pH i hver løsning før bruk verifiseres.

I tillegg, om immunostaining, er tilstedeværelsen av bakgrunnen flekker en av de vanligste problemene. Bakgrunn farging gjør det vanskelig å analysere mikroglia, spesielt deres morfologi, og dermed vil bias resultatene. For å forhindre bakgrunn er det viktig at blokkerings trinnet gjøres riktig. Den lagring av antistoffer har også direkte effekter på deres effekt. Det anbefales å strengt følge retningslinjene for lagring som tilbys av selskapet, samt unngå hyppig tine-frysing sykluser. Til slutt, under hele prosessen, er det viktig å ta hensyn til den fysiske integriteten til hjernen seksjoner. Det er viktig å utvise forsiktighet ved hver manipulering (buffer endringer, vasker og montering), spesielt hvis eksperimentator ikke oppleves med denne prosedyren. Det anbefales å unngå å forlate prøvene uten væske løsning når du skifter løsninger eller buffere, løsninger for det påfølgende trinnet bør være klar til å helle i brønnen på forhånd. Den multi-brønn plate bør være riktig forseglet med parafin film i løpet av natten trinn for å unngå fordampning som kan føre prøvene til tørk.

Kvantitativ analyse av mikrogliaaggregater tetthet, distribusjon og morfologi har flere fordeler fremfor kvalitative rapporter. For å hindre bias, forskeren utføre analysen bør være blindet til eksperimentell tilstand. Dermed er det foreslått å ha forskjellige personer utføre analysen og endre navnet på filene (samtidig beholde den opprinnelige og nye navn i et nøkkel ark). De nye navnene skal ikke ha noen hint av den eksperimentelle tilstanden. Hele analysen kan gjøres på disse blindet filer, og det opprinnelige bildet identitet er avslørt først etter kompilering av data og før statistisk analyse. Selv om blendende er allerede praktisert av erfarne forskere, er det fortsatt verdifulle råd for de som utfører denne typen analyser for første gang.

Kontrollere for hjernen regionen er gjort under hjernen delen utvalg og sporing av AVKASTNINGEN under analysen. Sørg for å bruke seksjoner fra samme utvalg av Bregma nivåer på tvers av dyr. Den samme AVKASTNINGEN bør brukes for tetthet, distribusjon, og morfologi analyser. For tetthet og distribusjon analyser, er det spesielt viktig å være presis når du tegner AVKASTNINGEN i FIJI/image J. Bruken av en hjerne Atlas anbefales på det sterkeste for både seksjonsvalg og ROI-sporing. Bruken av DAPI Letter også identifisering av nevroanatomi landemerker. For å unngå varians anbefales det å avvise mikroglia som bare er delvis plassert i AVKASTNINGEN, da de kan være forskjellige blant mikromiljøet. Når du markerer mikroglia for tetthets analyse, kan DAPI-kanalen brukes som utvalgskriterium. Ved bare å telle mikroglia som inneholder DAPI-farget kjerner, alle betraktet som mikroglia er i samme plan, redusere den personlige bias under valg.

Siden målingene for NND, avstands indeks og klynge analyse er basert på plasseringen av prikker som markerer enkeltceller, og siden avstandene beregnes av FIJI/ImageJ, er det viktig å være konsekvent når du plasserer disse prikkene. Sørg for å strengt plassere prikkene i midten av cellen kroppen, som bestemmes visuelt. I tillegg bør størrelsen på prikkene være konsekvente gjennom hele analysen. Dette vil bidra til en bedre representasjon av den romlige fordelingen av den mikrogliaaggregater befolkningen. For klynge analyse ble 12 μm valgt som en avstands terskel basert på våre tidligere analyser. Likevel, hvis det er fire eller flere forskjellige celler med en NND under 12 μm, kan alle disse cellene ta del av en enkelt klynge eller representerer to klynger av to celler. Dette gjorde det nødvendig å gå tilbake til bildene og bekrefte det faktiske antall klynger.

I motsetning til tetthet og distribusjon, der AVKASTNINGEN bestemmes av nevroanatomi funksjoner ved hjelp av en hjernen Atlas, valg av mikrogliaaggregater celler for morfologi analyse er basert på evnen til å analysere cellen. Alle cellene som kan analyseres, bør velges for analyse i en Z-stabel før de flyttes til en annen Z-stabel for å hindre at markeringen blir merket. Grunner for å ekskludere celler inkluderer problemer med immunostaining eller vevs kjæring, prosessering (f.eks. rive) eller montering (f.eks. boble formasjon). Ideelt sett bør hjernen seksjoner med slike spørsmål være systematisk ekskludert fra Imaging og analyse. Det er også viktig å merke seg at farging for TMEM119 og IBA1 ikke viser 100% overlapping (figur 2A − C). Fordi TMEM119 ikke tillater visualisering av prosess kontinuitet (så vel som IBA1), gjør dette det vanskelig å vurdere hvor en celle slutter og hvor en annen starter. Dermed er morfologi analyse gjøres ved hjelp av IBA1 kanalen. I tillegg bør alle spor og prikker lagres og visualisere for fremtidig revisjon, noe som åpner for økt åpenhet og reproduserbarhet av resultatene.

Denne protokollen gir verdifull informasjon om mikroglia og infiltrere makrofager. Eksempler på sine søknader inkluderer oppdage tegn på nevroinflammasjon gjennom endringer i mikroglia i ulike hjerneregioner, studere anti-inflammatoriske effekter av et sammensatt, og studere faktorer som forstyrrer den riktige funksjonen til mikroglia. Tatt i betraktning at denne protokollen gjør det mulig påvisning av infiltrere makrofager i hjernen og differensiering av disse cellene fra mikroglia, tilleggsprogrammer inkluderer: bestemmelse om rekruttering av makrofager oppstår i en bestemt fornærmelse eller med Bruk av andre teknikker (dvs. genetiske verktøy), og bekrefter og studerer konsekvensene av fraværet av perifere makrofager i hjernen under fornærmelse. Husk at fluorescens mikroskopi på egen hånd er ikke tilstrekkelig til å bekrefte infiltrasjon inne i hjernen parenchyma. Når IBA1 +/TMEM119-celler er observert nær ventriklene eller inflammasjon plass, høyere romlig oppløsning teknikker som elektron mikroskopi er pålagt å bekrefte sin lokalisering i parenchyma. Mens endringer i tetthet, distribusjon og morfologi er gode indikatorer for mikrogliaaggregater og macrophage roller, er denne tilnærmingen mektigste når den kombineres med funksjonelle undersøkelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til Nathalie Vernoux for hennes veiledning og assistanse med eksperimenter. Vi vil også gjerne takke DRS. Emmanuel Planel og Serge Rivest for bruk av deres fluorescens og konfokalmikroskopi mikroskop, henholdsvis. Dette arbeidet ble delvis finansiert av stipend fra Mexican Council of Science and Technology (CONACYT; til F. G. I), Fondation famille-Choquette og Centre thématique de Recherche en Neurosciences (CTRN; til K.P.), fonds de Recherche du Québec-santé (til M.B.), og Shastri Indo-kanadiske Institute (til K.B.), samt en Discovery stipend fra Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (NSERC) til M.E.T. M.E.T. har en Canada Research Chair (tier II) av Neuroimmune plastisitet i helse og terapi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Invitrogen/Thermofisher A21202
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit Invitrogen/Thermofisher A11011
Biolite 24 Well multidish Thermo Fisher 930186
Bovine serum albumin EMD Millipore Corporation 2930
Citric acid Sigma-Aldrich C0759-500G
DAPI Nuceleic acid stain Invitrogen/Thermofisher MP 01306
Fine Brush Art store
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Gelatin from coldwater fish skin Sigma-Aldrich G7765
Microscope coverglass Fisher Scientific 1254418
Microslides positively charged VWR 48311-703
Monoclonal mouse Anti-IBA1 Millipore MABN92
Na2H2PO4·H2O BioShop Canada Inc. SPM306, SPM400
Na2HPO4 BioShop Canada Inc. SPD307, SPD600
NaBH4 Sigma-Aldrich 480886
NaCl Fisher Scientific S642500
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 017-000-121
Normal goat serum (NGS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 005-000-121
Parafilm-M Parafilm PM-999
Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 Abcam ab209064
Reciprocal Shaking bath model 25 Precision Scientific -
Transfer pipette
Tris buffer hydrochloride BioShop Canada Inc. TRS002/TRS004
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  2. Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
  3. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
  5. Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
  6. Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
  7. Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
  8. Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  9. Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
  10. Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
  11. Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
  12. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
  13. Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
  14. Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
  15. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  16. Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
  17. Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
  18. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
  19. Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
  20. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
  21. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).

Tags

Immunologi og infeksjon mus hjerne mikroglia myelogen celler neuroimmunology immunofluorescence IBA1 TMEM119 mikroskopi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.

The name was corrected from:

Maude Bordelau

to:

Maude Bordeleau

Immunofluorescence farging bruke IBA1 og TMEM119 for Mikrogliaaggregater Density, morfologi og perifere myelogen Cell infiltrasjon analyse i Mouse Brain
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

González Ibanez, F., Picard,… More

González Ibanez, F., Picard, K., Bordeleau, M., Sharma, K., Bisht, K., Tremblay, M. È. Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (152), e60510, doi:10.3791/60510 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter