Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Иммунофлуоресценция пятно использованием IBA1 и TMEM119 для микроглиальной плотности, морфологии и периферической миелоидной клеточной инфильтрации анализа в мышиный мозг

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 1,2,4, 1,2
1Axe Neurosciences, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, 2Département de Médecine Moléculaire, Faculté de Médecine, Université Laval, 3Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 4Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia

ERRATUM NOTICE

Summary

Этот протокол описывает пошаговой рабочий процесс для иммунофлуоресцентного костейни IBA1 и TMEM119, в дополнение к анализу микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также периферической миелоидной инфильтрации в ткани мозга мыши.

Abstract

Это протокол для двойной визуализации микроглии и проникновения макрофагов в ткани мозга мыши. TMEM119 (который маркирует микроглию выборочно), в сочетании с IBA1 (который обеспечивает исключительную визуализацию их морфологии), позволяет исследует изменения плотности, распределения и морфологии. Количественная оценка этих параметров имеет важное значение для получения информации о роли, которую играет микроглия, резидентные макрофаги мозга. В нормальных физиологических условиях микроглия регулярно распределяется по мозаичному узору и представляет собой небольшую сому с беспорядочными процессами. Тем не менее, в ответ на экологические факторы (наиболее травмы, инфекции, болезни или травмы), микроглиальная плотность, распределение и морфология изменяются различными способами, в зависимости от оскорбления. Кроме того, описанный метод двойного окрашивания позволяет визуализировать проникновение макрофагов в мозг на основе их экспрессии IBA1 и без колокализации с TMEM119. Таким образом, такой подход позволяет проводить дискриминацию между микроглией и инфильтративающимися макрофагами, что необходимо для обеспечения функционального понимания их явного участия в гомеостазе мозга в различных контекстах здоровья и болезней. Этот протокол интегрирует последние выводы в нейроиммунологии, которые относятся к идентификации селективных маркеров. Он также служит полезным инструментом как для опытных нейроиммунологов, так и для исследователей, стремящихся интегрировать нейроиммунологию в проекты.

Introduction

Будь то острое или хроническое, нейровоспаление находится под сильным влиянием микроглии, резидентов макрофагов мозга. Визуализация микроглии с помощью иммуностоинга ценна для изучения нейровоспаления с использованием световой микроскопии, высокодоступной техники. В гомеостастатных условиях, микроглии, как правило, распространяются в nonoverlapping, мозаика, как картина. Они проявляют небольшие сомы, которые расширяют неразрешимые процессы1, которые иногда контактируют друг с другом2. Микроглиальные неразрежденные процессы динамически обследуют паренхиму головного мозга, взаимодействуя с нейронами, другими глиальными клетками и кровеносными сосудами при нормальных физиологических условиях3. Микроглия оснащена арсеналом рецепторов, которые позволяют им выполнять иммунологические задачи и реагировать на изменения в среде мозга, на гибель клеток или на повреждение тканей. Кроме того, они оказывают ключевые физиологические функции, в частности, в синаптической формирования, технического обслуживания и ликвидации4,5.

Среди доступных маркеров, используемых для изучения микроглии, ионизированная молекула адаптера связывания кальция 1 (IBA1) является одним из наиболее широко используемых. IBA1 является кальциевым связывающим белком, который обеспечивает исключительную визуализацию микроглиальной морфологии, включая тонкие дистальные процессы, что подтверждается электронной микроскопией6. Этот инструмент сыграл важную роль в характеристике микроглиальной трансформации, ранее называемой "активацией", в широком спектре моделей болезней животных7,8,9. При наличии нейровоспаления микроглиальный ответ включает в себя: микроглиоз, который определяется как увеличение плотности клеток, изменения в распределении, которые иногда приводят к кластеризации, увеличению тела клетки, а также утолщение и сокращение процессов, связанных с более амибойдформы10,11,12,13.

Иммуностогирование ограничено наличием антител, направленных против конкретных маркеров. Важно отметить, что IBA1 выражается в микроглии, но и периферических макрофагов, которые проникают в мозг14. В то время как наблюдение IBA1-положительных клеток внутри мозга стало маркером микроглии в этой области исследований, периферийные инфильтрации макрофагов было сообщено в различных условиях, даже незначительно в здоровом мозге15,16 ,17,18. Следовательно, использование IBA1 само по себе не позволяет селективной визуализации микроглии. Кроме того, макрофаги принимают молекулярно-морфологические особенности резидентов микроглии, как только они проникли в мозг, тем самым препятствуя дифференциации19. Это представляет собой проблему при изучении функции как микроглии, так и инфильтрации макрофагов.

В то время как микроглии и периферических макрофагов имеют четкое происхождение (например, от эмбрионального желтка мешок и костный мозг, соответственно20,21), есть все большее число выводов, указывающих, что две популяции клеток оказывают различные роли в мозге19. Поэтому крайне важно использовать методы, которые различают эти две популяции без инвазивных манипуляций (т.е. химер костного мозга или парабиоза), которые могут модулировать их плотность, распределение, морфологию и функции. TMEM119 стал микроглии конкретных маркера через здоровье и болезни условия22. В сочетании с IBA1, этот маркер становится полезным для дифференциирования этих клеток от проникновения макрофагов, которые TMEM119-отрицательный и IBA1-положительный. Хотя это регулируется в развитии, TMEM119 выражается уже в послеродовые дни 3 (P3) и 6 (P6), неуклонно растет до достижения взрослых уровней между P10 и P1422. IBA1 выражается уже в эмбриональный день 10.5 (E10.5)23. Таким образом, предлагаемый протокол двойной маркировки полезен для изучения этих двух популяций на протяжении всей послеродовой жизни.

Этот протокол обеспечивает пошаговую иммуностоинизационную процедуру, которая допускает дискриминацию между микроглией и периферийными макрофагами. В нем также объясняется, как проводить количественный анализ микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также анализ инфильтрации периферических макрофагов. В то время как исследование микроглии и периферических макрофагов полезно само по себе, этот протокол далее позволяет локализацию нейровоспалительных фойе; таким образом, он также служит платформой для определения конкретных регионов для проведения расследований с использованием дополнительных (пока больше времени и затрат) методов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами институциональных комитетов по этике животных в соответствии с Канадским советом по уходу за животными и Комитетом по уходу за животными Университета Лаваля.

1. Иммуностоидинг

  1. Выберите три секции мозга мыши, содержащие область интереса (ROI) (т.е. гиппокамп) с помощью атласа мозга. Поместите секции в пластиковую многоскважинную пластину и накройте их 350 злителками фосфатно-буферного сосуда (PBS)(Таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов, мозг должен быть проникнут 4% параформальдегида и сократить до толщины 50 мкм с вибратом. Для 24 многослойной пластины каждая скважина может вместить до шести секций. Рекомендуемый объем раствора для каждой скважины составляет 350 л (до трех секций) и 500 Л л для скважин, содержащих шесть секций. Для более высокого количества секций рекомендуется использовать 12 многоколодцк. Убедитесь, что выбранный объем раствора для каждого колодца полностью покрывает ткани и позволяет секциям плавать. Рекомендуемые объемы применяются для каждого решения, используемого в остальной части протокола.
  2. Вымойте образцы, покрыв их 350 л PBS и дайте им отдохнуть, поместив многослойную пластину поверх многофункционального шейкера при комнатной температуре (RT). Удалите PBS после 5 мин и замените его 5x на свежий PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для удаления растворов рекомендуется переложить пипетку. При заливке в любом растворе, убедитесь, что место кончик пипетки против стенки колодца для защиты целостности тканей. Также не забудьте использовать новый пипетку для каждого нового решения.
  3. Удалить PBS и добавить 350 л 10 мМ цитрат натрия цитрат буфера с рН 6,0 (Таблица 1).
  4. Запечатайте многослойную пластину парафинаи и дайте ей плавать на ранее разогретой водяной бане в течение 40 минут при 70 градусах Цельсия.
  5. Дайте многослойной пластине остыть около 15 мин.
  6. Удалите буфер цитрата натрия и промойте секции в PBS, как это делается в шаге 1.2.
  7. Удалить PBS и добавить 350 л свежеприготовленных 0,1% NaBH4 (Таблица 1) и пусть инкубировать в течение 30 минут на RT.
  8. Удалите раствор 0,1% NaBH4 и мыть разделы в PBS, как это делается в шаге 1.2.
  9. Удалить PBS и добавить блокирующий буфер (Таблица 1) для 1 ч на RT на вершине многоцелевой шейкер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы подготовить удвоенные объемы блокирующего буфера, так как одно и то же решение будет использовано на следующем этапе.
  10. Удалите блокирующий буфер и замените блокированием буфера, содержащего смесь первичных антител (1:150 мышь IBA1 и 1:300 TMEM119). Запечатать тарелку парафинаю пленкой и дать ей инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
  11. На следующий день теплые образцы на RT в течение примерно 15 минут.
  12. Вымойте разделы 5x в течение 5 минут каждый в PBS с тритоном (PBST)(Таблица 1).
  13. Удалить PBST и добавить блокирующий буфер, содержащий смесь вторичных антител (1:300 осла анти-мышь Alexa 488 для IBA1; 1:300 коза анти-кролик Alexa 568 для TMEM119) для 1,5 ч на RT. Начиная с этого момента, защитить образцы от света.
  14. Удалите блокирующий буфер и смойте разделы 5x, как это делается в шаге 1.2, за исключением этого времени с PBST.
  15. Снимите PBST и добавьте 4",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (DAPI) в течение 5 минут на RT.
  16. Удалить DAPI и мыть разделы 3x в течение 5 минут каждый в фосфатном буфере (PB).
  17. Установите секции на слайд микроскопа. Дайте им высохнуть, защищаясь от света.
  18. Когда высушите, добавить несколько капель монтажа флуоресценции среды и накрыть крышкой, избегая образования пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните слайды, защищаясь от света, внутри гистологического слайд-бокса, при 4 градусах Цельсия. Образцы могут храниться в течение нескольких месяцев.

2. Визуализация для анализа плотности и распределения

  1. С помощью широкоугольного эпифлюоресцентного микроскопа используйте низкое увеличение и канал DAPI, чтобы найти рентабельность инвестиций (т.е. область CA1 гиппокампа).
  2. Приобретайте изображения в 20x, используя числовую диафрагму (NA) 0,5, с каналами DAPI, 488 и 568 с разрешением 0,3 мкм/пиксель. Захват мозаичной картинки, покрывающей рентабельность инвестиций. Кроме того, принять отдельные фотографии, которые будут сшиты в большее изображение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мозаичное изображение представляет собой супер изображение, составленное меньшими изображениями. Мозаичные изображения обычно используются для преодоления ограниченной площади поля зрения высоких увеличений. Некоторые программы включают в себя функцию мозаики; тем не менее, изображения также могут быть сшиты вручную вместе с другим программным обеспечением для редактирования фотографий путем сшивания отдельных изображений в один. Не забудьте добавить информацию о масштабе в файл. Для этого типа анализа рекомендуется иметь по крайней мере 300 микроглиальных клеток, изображенных на рентабельность инвестиций/животных (соответствующих примерно 10-15 снимкам для гиппокампа, например), с минимум пятью животными на экспериментальное состояние. На рисунке 1АКК показаны изображения колмаркированной микроглии.
  3. Сохранить изображение в виде файла TIFF.

3. Визуализация для анализа морфологии

  1. Используя конфокальный или структурированный подсветку, используйте канал DAPI, чтобы найти рентабельность инвестиций при низком увеличении.
  2. Используя 40-разную цель (т.е. масло NA 1.4), найдите ячейку IBA1/TMEM119 внутри рентабельности инвестиций. В то время как живая визуализация, двигайтесь по оси. Как только сигнал случайно выбранной микроглии исчезает, установите этот уровень в качестве начала стека. Двигайтесь по оси в противоположном направлении до тех пор, пока сигнал микроглии не исчезнет и не установите эту точку в конце стека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2АЗС показаны изображения микроглии IBA1/TMEM119.
  3. Создайте стек во всех трех каналах (DAPI, 488, 568), используя 0,33 мкм с интервалом 0,15 мкм/пиксель. Добавьте информацию о масштабе в файл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая интервальная зона зависит от разрешиваемых сил цели (например, для 40-x цели, такой как масло NA 1.4, она составляет 0,33 мкм). Для анализа морфологии рекомендуется иметь не менее 20 клеток на одно животное с минимум пятью животными на экспериментальное состояние.
  4. Сохранить файл в виде файла TIFF.

4. Анализ плотности и распределения

  1. Откройте FIJI/ImageJ с установленным плагином ближайшего соседского расстояния (NND). Откройте изображение 20x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте поисковую систему с ключевым словом "Ближайший расчет расстояний соседа с ImageJ", чтобы найти инструкции по установке. Плагин Автор Yuxiong Мао.
  2. Чтобы установить шкалу вручную на основе шкалы, отпечатанной на изображении, выберите инструмент прямой линии(рисунок 3E),поместите курсор на край шкалы и, нажав клавишу переноса, нарисуйте линию как можно ближе к шкале на изображении (Рисунок 3I/c1 В), выберите Анализ Установите масштаб,затем введите правильную информацию(рисунок 3J).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шкала иногда может содержаться в метаданных файла и устанавливаться автоматически.
  3. Выберите изображение Цветовая гамма Сделать композитный для создания композитного изображения всех каналов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время приобретения изображения, FIJI/ImageJ автоматически создаст композит в формате RGB.
  4. В баре меню выберите Анализ Набор измерений. Проверить площадь, Центр, и периметр. На вкладке Перенаправить на,нажмите кнопку и выберите открытый файл(рисунок 3K).
  5. Перейти к изображению Цветовая гамма Инструмент канала для открытия инструмента канала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это меню позволит отключать определенный цвет. Канал DAPI может быть полезен для определения рентабельности инвестиций и подтверждения ячеек. Он может быть отключен, чтобы сделать подсчет легче.
  6. Нарисуйте грубый периметр рентабельности инвестиций с помощью инструмента выбора от руки(рисунок 3D).
  7. Включите инструмент чистки выбора, дважды нажав овальный инструмент на панели инструментов и убедитесь, что поле для выбора enable проверяется(рисунок 3G). Этот инструмент будет использоваться для более точного разграничения рентабельности инвестиций. Выберите подходящий размер кисти от 200 до 400.
  8. Используя кисть выбора, отрегулируйте периметр, чтобы наилучшим образом соответствовать рентабельности инвестиций. Нажмите T на клавиатуре, чтобы добавить к менеджеру roI(рисунок 3L).
  9. Выберите Анализ (ru) Измерьте или нажмите ключ M, и окно результатов всплывет. Копировать и вставить результаты на листе данных, а затем сохранить информацию о области (т.е. области рентабельности инвестиций; Рисунок 3R).
  10. После копирования области ROI, стереть информацию из окна результатов, нажав на него и нажав клавишу Backspace.
  11. Перейти к окну менеджера ROI(рисунок 3L), право нажмите на roI след, изменить имя, чтобы соответствовать имени изображения, а затем сохранить.
  12. Дважды щелкните инструмент кисти в панели инструментов. Выберите черный цвет и размер кисти 10. Убедитесь, что вариант Краска наложения не остановить(Рисунок 3H).
  13. В канале TMEM119 тщательно поместите черную точку в центре сомы для каждой микроглии TMEM119. Поместите белую точку в центре клеток, которые не являются положительными для TMEM119 (для обозначения проникновения макрофагов). Повторите одну и ту же процедуру для всех клеток, содержащихся в рентабельности инвестиций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы все точки (черный и белый) расположены в одном канале. Личность канала может быть проверена (красный, синий или зеленый), посмотрев на цвет меток окна изображения.
  14. Выберите изображение Цветовая гамма Сплит-канал. Появится окно для каждого канала. Затем определите канал, который имеет точечные аннотации, и закройте два других окна.
  15. Перенаправьте новое изображение разделенного канала. Перейти к анализу Набор измерений. На вкладке Перенаправить на,нажмите кнопку и выберите изображение разделенного канала(рисунок 3K).
  16. Выберите изображение Тип (тип) 8-битный. Перейти к изображению Отрегулируйте и выберите Порог (рисунок 3O). Чтобы отрегулировать порог, сдвиньте кнопку второй панели, вплоть до левой (пороговое значение 0) в обоих барах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это оставит только черные точки на изображении, появляясь белыми.
  17. Выберите рентабельность инвестиций в окне менеджера ROI. Выберите Анализ (ru) Анализ частиц (рисунок 3N). На размер (дюйм): напишите 1'20. Держите единицу пикселей неконтролируемой, проверьте дисплей, обобщить и добавить к менеджеру,и нажмите Ok. Резюме окно будет всплывающее и дать количество очков(Рисунок 3P). Копировать и вставить информацию в лист данных.
  18. Выберите плагины NND. Окно NND будет всплывающее(Рисунок 3 "). Копируйте/вставьте всю информацию в лист данных. Каждое число представляет расстояние, которое каждая микроглия имеет до ближайшей соседней микроглии.
  19. Вернитесь к пороговому окну и сдвиньте первый бар вправо (пороговое значение 255 в обоих барах), что оставит все белые точки видимыми, появляясь белыми(рисунок 3M).
  20. Выберите Анализ (ru) Анализ частиц. Резюме окно, которое обеспечивает количество очков будет всплывающее(Рисунок 3P). Копировать и вставить информацию в лист данных.
  21. Перейдите к менеджеру ROI, выберите все точки, нажмите правой кнопкой мыши и сохраните имя изображения. Это позволит сохранить все точки в почтовом файле(рисунок 3L). Выберите файл Сохранить как,и сохранить файл с именем, которое позволяет идентифицировать анализируемое изображение.
  22. Получить плотность микроглии (для каждого изображения), разделив количество IBA1 '/TMEM119 "двойной положительные клетки на площадь рентабельности инвестиций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения для каждой картины могут быть усреднена для каждого животного. Данные могут быть представлены как средняя - стандартная ошибка средней (SEM) всех животных.
  23. Определите NND, получив среднее значение значений NND всех клеток TMEM119.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в качестве среднего - SEM всех животных.
  24. Рассчитайте индекс интервала с помощью формулы: NND2 x плотность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в качестве среднего - SEM всех животных. Единицы для этого измерения будут произвольными единицами.
  25. Количественная микроглиальная группа путем выявления клеток, которые имеют NND под 12 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, 12 мкм выбран, так как это приблизительное расстояние между двумя непосредственно сопоставления микроглиальных клеток, касающихся друг друга с беседками. Если существует более трех микроглий, которые отвечают этому условию, вернитесь к изображению и проверьте, являются ли эти клетки частью одного или нескольких кластеров.
  26. После подтверждения количества кластеров напишите количество кластеров в таблице данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кластеров может быть разделено по области рентабельности инвестиций, чтобы получить плотность клеток / мм2 для каждого животного. Данные могут быть представлены в виде среднего SEM всех животных.
  27. Чтобы определить процент инфильтрации периферических миелоидных клеток, вычислите процент iBA1/TMEM119- клеток над общим числом миелоидных клеток (TMEM119/IBA1) - TMEM119-/IBA1) для каждого животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в качестве среднего - SEM всех животных.

5. Анализ морфологии

  1. Открыть FIJI/ImageJ.
  2. Откройте 40x изображение с помощью изображения J или FIJI. Появится окно всплывающих окон, спрашивающее, следует ли открывать изображения в стеке. Нажмите OK. Далее выберите Изображение Стеки Проект по открытию окна «Проекция». Включите все ломтики, от первого до последнего ломтика. Убедитесь, что максимальная интенсивность выбрана в соответствии с типом проекции,и нажмите OK
  3. Нажмите на новое окно с проектом «К». Выберите изображение Цвета Разделение каналов. Проведите следы на изображениях канала IBA1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие каналы (TMEM119 и DAPI) могут быть открыты и консультироваться по мере необходимости во время микроглиального анализа морфологии.
  4. В баре меню выберите Анализ Набор измерений. Проверьте площадь, Центр, и периметр. На вкладке Перенаправить на, выберите открытый файл(рисунок 3K).
  5. Установите шкалу, описанную в шагах 4.2.
  6. Для измерения размера сомы в канале IBA1, нарисуйте грубый периметр сомы с помощью инструмента выбора от руки(рисунок 3D).
  7. Включите инструмент чистки выбора, дважды нажав на овальный инструмент на панели инструментов, а затем проверь Включить поле кисти выбора (Рисунок 3G). Выберите размер кисти выбора от 10 до 20(рисунок 3B).
  8. Используя кисть выбора, отрегулируйте след, чтобы наилучшим образом соответствовать соме. Масштабирование позволит точность во время этого шага(Рисунок 2I).
  9. Нажмите на клавишу T, чтобы добавить след сомы к менеджеру roI(рисунок 3L).
  10. Выберите Анализ (ru) Измерьте или нажмите клавишу M. Окно результатов всплывет. Копировать и вставить результаты на листе данных(рисунок 3R).
  11. Чтобы сохранить информацию о области сомы, перейдите в окно менеджера ROI, нажмите на рентабельность инвестиций, измените имя, чтобы соответствовать имени изображения, укажите, что след для сомы, а затем сохраните файл.
  12. Для измерения области беседки в канале IBA1 нажмите на микроглиальную оконечность процесса с помощью инструмента выбора полигона, который запустит форму полигона(рисунок 3C).
  13. Следуя советам микроглиальных процессов, обойти микроглии, нажав на кончики каждой конечности процесса, чтобы сформировать полигон, который наилучшим образом представляет область, покрытую микроглиальными арборизациями (Рисунок 2DЗ.Х.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что полигон соединяет все конечности микроглиального процесса. Линии, образующие полигон, никогда не должны пересекаться. При нажатии вокруг микроглиального процесса отзыв, будьте осторожны, чтобы избежать отрезать любую часть процесса. Иногда полезно добавить дополнительные очки, чтобы обойти процесс. Количество точек, формирующих полигон, напрямую не связано с количеством дистальных процессов и, таким образом, не имеет значения для исследования.
  14. Чтобы закрыть полигон, нажмите на отправную точку полигона.
  15. Нажмите на клавишу T, чтобы добавить след менеджера roI(рисунок 3L). Выберите Анализ (ru) Измерьте или нажмите клавишу M. Окно результатов всплывет. Копировать и вставить результаты на листе данных(рисунок 3R).
  16. Чтобы сохранить информацию о области беседки, перейдите в окно менеджера ROI, нажмите на рентабельность инвестиций, измените имя, чтобы соответствовать имени изображения, укажите для беседки, а затем сохраните файл.
  17. Определите область сомы путем усреднения всех сома областях для каждого животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в виде среднего - SEM всех животных.
  18. Определите область беседки, усреднев все области беседки для каждого животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в виде среднего - SEM всех животных.
  19. Рассчитайте индекс морфологии с помощью формулы сома области / области arborization для каждой микроглиальной клетки и в среднем на животное.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в виде среднего - SEM всех животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показана сомаркировка микроглии с использованием IBA1 и TMEM119 в корональном разделе суставного гиппокампа, изображенного в 20x флуоресценционной микроскопией. Успешное окрашивание показывает микроглиальные клеточные тела и их тонкие процессы(рисунок 1АКС). Это окрашивание позволяет определить микроглиальную плотность и распределение и идентификацию микроглиальных кластеров(рисунок 1I)и проникновение макрофагов(рисунок 1F).

На рисунке 2 показана микроглия IBA1/TMEM119(рисунок 2АЗС)в шаге пример процедуры отслеживания микроглиальной арборизации(рисунок 2ДЗЗ),а также пример отслеживания тела клеток (Рисунок 2I ), оба изображены на 40x конфокальной микроскопии.

Figure 1
Рисунок 1: IBA1 и TMEM119 двойное окрашивание ткани мозга мыши для плотности, распределения, кластеризации и анализа периферической миелоидной клетки. (АКК) Типичное микроглиальное распределение в гиппокампе взрослой мыши C57BL/6. (ДКФ) Микроглия, идентифицированная как IBA1/TMEM119 и проникающая макрофаг, идентифицированная как IBA1/TMEM119 (белая стрелка) в миндалине мужской мыши. (ГЗИ) Кластер двух микроглий (белый квадрат) в гиппокампе мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: IBA1 и TMEM119 окрашивания для микроглиального анализа морфологии. (АКК) Микроглии. (ДЗИ) Пошагонный пример отслеживания беседки с каналом IBA1 с помощью инструмента полигона в FIJI/ImageJ. (J) Пример микроглии сома трассировки с каналом IBA1 с помощью инструмента выбора от руки в FIJI/ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: интерфейс FIJI/ImageJ и инструменты для микроглиальной плотности, распределения, кластеризации, морфологии и анализа периферической миелоидной инфильтрации. (АЗР) Компиляция всех инструментов, меню и окон, используемых для анализа плотности, кластера и морфологии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Решения Подготовка
Блокирующий буфер 0,5% желатина - 5% натуральная сыворотка коз, 5% натуральная сыворотка осла - 0,01% Тритон Х-100 в ТБС (0,05 М)
Цитрат буфер 1,92 г лимонной кислоты (10 мМ), 500 л tween 20 (v/v) , 700 мл ультрачистой воды, отрегулируйте рН 6,0 с NaOH 10 N, заполните до 1 л ультрачистой водой
NaBH4 0,01% ж/ч Выразить 0,01 г NaBH4 в 10 мл ультрачистой воды, раствор должен быть хорошо перемешан. Это решение создает пузырь; давление релиза, открыв крышку после смешивания
Pb (100 мМ) Растворить 23,48 г Na2HPO4 и 4,8 г2PO4 H2O в 1 l ультрачистой воды, затем заполнить до 2 л, настроить рН 7,4
Pbs (50 мМ) Растворить 5,87 г Na2HPO4, 1,2 г2PO4 H2O, 9 г NaCl в 500 мл ультрачистой воды, заполните до 1 л с ультрачистой водой, отрегулируйте рН 7,4
PBST PBS 0.01% Тритон X-100
Tbs Разбавить Tris HCl (0,5 М) с ультрачистой водой 1:10 (0,05 М), взять 1 л Tris HCl и добавить 8,75 г NaCl
Трис HCl 0,5 М- 950 мл сверхчистой воды, добавьте 78,8 г гидрохлорида буфера Tris (C4H11NO3Cl) отрегулируйте рН 8 и заполните до 1 л

Таблица 1: Решения, используемые для иммуностоинга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол можно разделить на две критические части: качество окрашивания и анализа. Если окрашивание не является оптимальным, оно не сможет представлять микроглиальные клетки адекватно, тем самым влияя на плотность, распределение и измерения морфологии. Кроме того, доля инфильтрации периферических миелоидных клеток может быть занижена. Это оптимизированная версия протокола окрашивания, но есть несколько факторов, которые могут привести к неоптимальным изображениям. Даже если перфузия животного не включена в этот протокол, если фиксация мозга не выполняется хорошо, качество окрашивания будет поставлено под угрозу. Кроме того, требуется достаточная перфузия для обеспечения отсутствия макрофагов внутри кровеносных сосудов, которые могут помешать исследованию.

Что касается иммуностоинга, наиболее важные детали включают качество буферов, блокирование шага, надлежащее хранение антител, и обработки образцов мозга. Надлежащая подготовка буферов и их хранение оказывает непосредственное влияние на качество окрашивания. Если не указано, некоторые буферы могут храниться в течение длительного времени, но использование любого буфера, который показывает признаки загрязнения следует избегать. Если буферы подготовлены за несколько дней или недель, рН каждого раствора перед использованием должен быть проверен.

Кроме того, что касается иммуностоинга, наличие фонового окрашивания остается одной из наиболее распространенных проблем. Фоновое окрашивание затрудняет анализ микроглии, особенно их морфологии, и, следовательно, будет смещения результатов. Чтобы предотвратить фон, важно, чтобы блокирующий шаг был сделан правильно. Условия хранения антител также оказывают прямое влияние на их эффективность. Рекомендуется строго соблюдать рекомендации по хранению, предоставляемые компанией, а также избегать частых циклов замораживания оттаивания. Наконец, в течение всего процесса, очень важно обратить внимание на физическую целостность секций мозга. Важно соблюдать осторожность при каждой манипуляции (изменения буфера, стирание и монтаж), особенно если экспериментатор не имеет опыта с этой процедурой. Рекомендуется не оставлять образцы без жидкого раствора при смене растворов или буферов, решения для последующего шага должны быть готовы заранее влить в скважину. Многоскважинная пластина должна быть правильно запечатана парафиновой пленкой во время ночного шага, чтобы избежать испарения, которое может привести к высыханию образцов.

Количественный анализ микроглиальной плотности, распределения и морфологии имеет ряд преимуществ перед качественными отчетами. Чтобы предотвратить предвзятость, исследователь, выполняющий анализ, должен быть ослеплен экспериментальным состоянием. Таким образом, предлагается, чтобы разные люди выполняют анализ и изменить название файлов (при сохранении оригинала и новых имен в листе ключа). Новые имена не должны иметь никаких намеков на экспериментальное состояние. Весь анализ может быть сделан на этих ослепленных файлов, и исходное удостоверение изображения раскрывается только после компиляции данных и до статистического анализа. Хотя ослепительно уже практикуется опытными исследователями, он остается ценным советом для тех, кто выполняет этот тип анализа в первый раз.

Контроль для области мозга осуществляется во время отбора секций мозга и отслеживания рентабельности инвестиций во время анализа. Убедитесь в том, чтобы использовать разделы из того же диапазона уровней Bregma между животными. Такая же рентабельность инвестиций должна использоваться для анализа плотности, распределения и морфологии. Для анализа плотности и распределения особенно важно быть точным при рисовании рентабельности инвестиций в FIJI/Image J. Использование атласа мозга настоятельно рекомендуется как для выбора секции, так и для отслеживания рентабельности инвестиций. Использование DAPI также облегчает идентификацию нейроанатомических ориентиров. Чтобы избежать дисперсии, рекомендуется отказаться от микроглии, которые только частично расположены в рентабельности инвестиций, так как они могут отличаться между их микроокружением. При маркировке микроглии для анализа плотности канал DAPI может быть использован в качестве критерия отбора. Только считая микроглии, которые содержат DAPI окрашенных ядер, все считается микроглии находятся в одной плоскости, уменьшая личные предубеждения во время отбора.

Поскольку измерения для NND, индекса интервалов и кластерного анализа основаны на местоположении точек, маркирующих отдельные ячейки, а поскольку расстояния рассчитываются FIJI/ImageJ, важно быть последовательным при размещении этих точек. Убедитесь в том, чтобы строго поместить точки в центре клеточного тела, который определяется визуально. Кроме того, размер точек должен оставаться неизменным на протяжении всего анализа. Это будет способствовать более эффективному представлению пространственного распределения микроглиальной популяции. Для кластерного анализа 12 мкм было выбрано в качестве порога расстояния на основе наших предыдущих анализов. Тем не менее, если есть четыре или более различных ячеек с NND ниже 12 мкм, все эти клетки могут принять участие в одном кластере или представляют собой два кластера из двух ячеек. Это заставило вернуться к изображениям и подтвердить фактическое количество кластеров.

В отличие от плотности и распределения, при которых рентабельность инвестиций определяется нейроанатомическими особенностями с помощью атласа мозга, выбор микроглиальных клеток для анализа морфологии основан на способности анализировать клетку. Все ячейки, которые могут быть проанализированы, должны быть выбраны для анализа в стеке, прежде чем перейти к другому стеку, чтобы предотвратить смещение выбора. Причины исключения клеток включают проблемы с иммуностоингом или резкой тканей, обработкой (например, разрывом) или монтажом (например, образованием пузырьков). В идеале, участки мозга с такими проблемами должны систематически исключаться из визуализации и анализа. Важно также отметить, что окрашивание для TMEM119 и IBA1 не показывает 100% перекрытия(рисунок 2АКК). Поскольку TMEM119 не позволяет визуализировать непрерывность процесса (а также IBA1), это затрудняет оценку того, где заканчивается одна ячейка и где начинается другая. Таким образом, анализ морфологии проводится с помощью канала IBA1. Кроме того, все следы и точки должны быть сохранены и визуализированы для будущего пересмотра, что позволяет повысить прозрачность и воспроизводимость результатов.

Этот протокол предоставляет ценную информацию о микроглии и проникновении макрофагов. Примеры его применения включают обнаружение признаков нейровоспаления через изменения в микроглии в различных областях мозга, изучение противовоспалительного воздействия соединения, и изучение факторов, которые мешают надлежащей функции микроглии. Учитывая, что этот протокол позволяет обнаружить проникновение макрофагов в мозг и дифференциацию этих клеток от микроглии, дополнительные приложения включают: определение, если вербовка макрофагов происходит в частности оскорбление или с использование других методов (т.е. генетических инструментов), а также подтверждение и изучение последствий отсутствия периферических макрофагов в головном мозге во время оскорбления. Имейте в виду, что микроскопии флуоресценции сама по себе недостаточно, чтобы подтвердить проникновение внутрь мозга паренхимы. При наблюдении клеток IBA1/TMEM119 вблизи желудочков или периваскулярного пространства требуется более высокое пространственное разрешение, такое как электронная микроскопия, для подтверждения их локализации в рамках паренхимы. Хотя изменения в плотности, распределении и морфологии являются хорошими показателями ролей микроглиальных и макрофагов, этот подход является наиболее мощным в сочетании с функциональными исследованиями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарны Натали Верно за ее руководство и помощь в проведении экспериментов. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Эммануэль Планель и Серж Ривест за использование их флуоресценции и конфокальных микроскопов, соответственно. Эта работа частично финансировалась за счет стипендий От Мексиканского совета по науке и технике (CONACYT; F.G.I), Фонда Фамиль-Чокетт и Центра тематика де речерче-н-р неврологии (CTRN; к К.П.), Фонды де Рехерче дю Квебек - Санте (до М.Б.), и Шастри Индо-канадский институт (к KB), а также Грант Discovery от естественных наук и инженерных исследований Совета Канады (NSERC) в M.E.T. M.E.T. имеет канадский научно-исследовательский кафедры (Tier II) нейроиммунной пластичности в области здравоохранения и терапии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Invitrogen/Thermofisher A21202
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit Invitrogen/Thermofisher A11011
Biolite 24 Well multidish Thermo Fisher 930186
Bovine serum albumin EMD Millipore Corporation 2930
Citric acid Sigma-Aldrich C0759-500G
DAPI Nuceleic acid stain Invitrogen/Thermofisher MP 01306
Fine Brush Art store
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Gelatin from coldwater fish skin Sigma-Aldrich G7765
Microscope coverglass Fisher Scientific 1254418
Microslides positively charged VWR 48311-703
Monoclonal mouse Anti-IBA1 Millipore MABN92
Na2H2PO4·H2O BioShop Canada Inc. SPM306, SPM400
Na2HPO4 BioShop Canada Inc. SPD307, SPD600
NaBH4 Sigma-Aldrich 480886
NaCl Fisher Scientific S642500
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 017-000-121
Normal goat serum (NGS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 005-000-121
Parafilm-M Parafilm PM-999
Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 Abcam ab209064
Reciprocal Shaking bath model 25 Precision Scientific -
Transfer pipette
Tris buffer hydrochloride BioShop Canada Inc. TRS002/TRS004
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  2. Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
  3. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
  5. Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
  6. Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
  7. Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
  8. Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  9. Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
  10. Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
  11. Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
  12. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
  13. Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
  14. Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
  15. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  16. Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
  17. Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
  18. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
  19. Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
  20. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
  21. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 152 мышь мозг микроглия миелоидные клетки нейроиммунология иммунофлуоресценция IBA1 TMEM119 микроскопия

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.

The name was corrected from:

Maude Bordelau

to:

Maude Bordeleau

Иммунофлуоресценция пятно использованием IBA1 и TMEM119 для микроглиальной плотности, морфологии и периферической миелоидной клеточной инфильтрации анализа в мышиный мозг
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

González Ibanez, F., Picard,… More

González Ibanez, F., Picard, K., Bordeleau, M., Sharma, K., Bisht, K., Tremblay, M. È. Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (152), e60510, doi:10.3791/60510 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter