Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Immunofluorescensfärgning med IBA1 och TMEM119 för Mikroglial densitet, morfologi och perifer myeloid cell infiltration analys i mushjärna

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 1,2,4, 1,2
1Axe Neurosciences, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, 2Département de Médecine Moléculaire, Faculté de Médecine, Université Laval, 3Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 4Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta protokoll beskriver ett steg-för-steg-arbetsflöde för Immunofluorescerande cofärgning av IBA1 och TMEM119, förutom analys av mikroglial densitet, distribution och morfologi, samt perifer myeloisk cell infiltration i mus hjärnvävnad.

Abstract

Detta är ett protokoll för den dubbla visualiseringen av mikroglia och infiltrerande makrofager i mus hjärnvävnad. TMEM119 (vilka etiketter mikroglia selektivt), i kombination med IBA1 (som ger en exceptionell visualisering av deras morfologi), möjliggör utredning av förändringar i densitet, distribution och morfologi. Kvantifiera dessa parametrar är viktigt för att ge insikter i de roller som utövas av microglia, bosatt makrofager i hjärnan. Under normala fysiologiska förhållanden, mikroglia regelbundet distribueras i en mosaik-liknande mönster och presentera en liten Soma med förgrenade processer. Ändå, som ett svar på miljöfaktorer (dvs trauma, infektion, sjukdom, eller skada), mikroglial densitet, distribution och morfologi ändras på olika sätt, beroende på förolämpningen. Dessutom, den beskrivna dubbel-färgning metod tillåter visualisering av infiltrerande makrofager i hjärnan baserat på deras uttryck av IBA1 och utan colocalization med TMEM119. Detta tillvägagångssätt möjliggör diskriminering mellan mikroglia och infiltrerande makrofager, vilket krävs för att ge funktionella insikter i deras distinkta engagemang i hjärnans homeostas över olika sammanhang av hälsa och sjukdom. Detta protokoll integrerar de senaste fynden i Neuroimmunologi som hänför sig till identifieringen av selektiva markörer. Det fungerar också som ett användbart verktyg för både erfarna neuroimmunologer och forskare som vill integrera Neuroimmunologi i projekt.

Introduction

Oavsett om akut eller kronisk, neuroinflammation är tätt påverkad av microglia, den bosatta makrofager i hjärnan. Att visualisera mikroglia genom immunofärgning är värdefullt för studiet av neuroinflammation med hjälp av ljusmikroskopi, en mycket lättillgänglig teknik. I homeostatiska förhållanden distribueras mikroglia vanligtvis i ett icke-överlappande, mosaik-liknande mönster. De uppvisar små Somas som sträcker förgrenat processer1, som ibland kontakta varandra2. Microglial förgrenat processer dynamiskt undersökning av hjärnparenkymet, interagera med nervceller, andra gliaceller och blodkärl under normala fysiologiska förhållanden3. Microglia är utrustade med en arsenal av receptorer som gör att de kan utföra immunologiska uppgifter och reagera på förändringar i hjärn miljön, celldöd eller vävnadsskada. Dessutom, de utövar viktiga fysiologiska funktioner, särskilt i synaptisk formation, underhåll, och eliminering4,5.

Bland de tillgängliga markörer som används för att studera microglia, Joniserat kalcium bindande adapter molekyl 1 (IBA1) är en av de mest använda. IBA1 är ett kalcium bindnings protein som ger exceptionell visualisering av mikroglial morfologi, inklusive fina distala processer, vilket bekräftas av elektronmikroskopi6. Detta verktyg har varit avgörande för att karakterisera mikroglial omvandling, tidigare kallad "aktivering", i ett brett spektrum av djursjukdomar modeller7,8,9. I närvaro av neuroinflammation, den mikrogliala svar inkluderar: microgliosis som definieras som en ökning av cellulär densitet, förändringar i distributionen som ibland resultera i klustring, utvidgningen av cellkroppen, samt förtjockning och förkortning av processer i samband med mer ameboid former10,11,12,13.

Immunofärgning begränsas av tillgången på antikroppar riktade mot specifika markörer. Viktigt, IBA1 uttrycks av mikroglia men också av perifera makrofager som infiltrera hjärnan14. Medan observation av IBA1-positiva celler inne i hjärnan har blivit en markör för mikroglia inom detta forskningsområde, perifer makrofag infiltration har rapporterats under olika förhållanden, även marginellt i den friska hjärnan15,16 ,17,18. Användningen av IBA1 ensamt tillåter därför inte selektiv visualisering av mikroglia. Dessutom, makrofager anta molekylära och morfologiska egenskaper hos Resident mikroglia när de har infiltrerat hjärnan, vilket hindrar differentiering19. Detta är en utmaning när man undersöker funktionen hos både mikroglia och infiltrerande makrofager.

Medan mikroglia och perifera makrofager har distinkta ursprung (t. ex. från den embryonala äggula säcken och benmärgen, respektive20,21), finns det ett ökande antal fynd som indikerar att de två cell populationerna utövar olika roller i hjärnan19. Det är därför viktigt att använda metoder som diskriminerar mellan dessa två populationer utan invasiva manipulationer (dvs., benmärgs chimärer eller parabios) som kan modulera deras densitet, distribution, morfologi, och funktion. TMEM119 har dykt upp som en microglia-specifik markör över hälsa och sjukdomstillstånd22. När den kombineras med IBA1, blir denna markör användbar för att differentiera dessa celler från infiltrerande makrofager, som är TMEM119-negativa och IBA1-positiva. Medan det är utvecklingsreglerat, TMEM119 uttrycks så tidigt som postnatal dag 3 (P3) och 6 (P6), stadigt ökar tills når vuxna nivåer mellan P10 och P1422. IBA1 uttrycks så tidigt som embryonala dag 10,5 (E 10.5)23. Den föreslagna dubbel märkning protokollet är därför användbart att studera dessa två populationer under postnatal liv.

Detta protokoll ger en stegvis immunfärgnings procedur som möjliggör diskriminering mellan mikroglia och perifera makrofager. Det förklarar också hur man genomför en kvantitativ analys av mikroglial densitet, distribution, och morfologi, samt analys av perifer makrofaginfiltration. Medan utredningen av mikroglia och perifera makrofager är användbar på egen hand, detta protokoll ytterligare tillåter lokalisering av neuroinflammatoriska Foyers; Således fungerar det också som en plattform för att identifiera specifika regioner att undersöka, med hjälp av kompletterande (ännu, mer tids-och resurskrävande) tekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella förfaranden utfördes i samförstånd med riktlinjerna från de institutionella djur etikkommittéerna, i enlighet med det kanadensiska rådet för djuromsorg och djur vårds nämnden vid Université Laval.

1. immunofärgning

  1. Välj tre mus hjärn sektioner som innehåller regionen av intresse (ROI) (dvs., Hippocampus) med hjälp av en hjärn Atlas. Placera sektionerna i en plastplatta med flera plattor och täck dem med 350 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (tabell 1).
    Anmärkning: för optimala resultat ska hjärnorna parfymera med 4% PARAFORMALDEHYD och kapas till en tjocklek av 50 μm med en vibratome. För en 24 multi-well tallrik, varje brunn kan rymma upp till sex sektioner. Den rekommenderade volymen av lösningen för varje brunn är 350 μL (för upp till tre sektioner) och 500 μL för brunnar som innehåller sex sektioner. För ett större antal sektioner rekommenderas att använda en 12 multi-well tallrik. Se till att den valda volymen av lösningen för varje brunn täcker helt vävnaden och tillåter sektionerna att flyta. De rekommenderade volymerna gäller för alla lösningar som används i resten av protokollet.
  2. Tvätta proverna genom att täcka dem med 350 μL PBS och låt dem vila genom att placera multi-well-plattan ovanpå en universalskakapparat i rumstemperatur (RT). Ta bort PBS efter 5 min och ersätt den 5x med färsk PBS.
    Anmärkning: för att ta bort lösningarna rekommenderas en överföringspipett. När du häller i någon lösning, se till att placera spetsen på pipetten mot brunnen väggen för att skydda vävnad integritet. Se också till att använda en ny pipett för varje ny lösning.
  3. Ta bort PBS och tillsätt 350 μL 10 mM natriumcitratbuffert med pH = 6,0 (tabell 1).
  4. Försegla multi-well plattan med paraffin film och låt den flyta på ett tidigare förvärmd vattenbad för 40 min vid 70 ° c.
  5. Låt multi-well plattan svalna i ca 15 min.
  6. Ta bort natriumcitratbufferten och tvätta avsnitten i PBS som gjort i steg 1,2.
  7. Ta bort PBS och tillsätt 350 μL nytillverkat 0,1% NaBH4 (tabell 1) och låt Inkubera i 30 minuter vid RT.
  8. Ta bort lösningen på 0,1% NaBH4 och tvätta avsnitten i PBS som gjort i steg 1,2.
  9. Ta bort PBS och Lägg till blockeringsbuffert (tabell 1) för 1 h vid RT ovanpå en universalshaker.
    Observera: se till att förbereda dubblerade volymer blockeringsbuffert, som samma lösning kommer att användas i nästa steg.
  10. Ta bort blockeringsbufferten och ersätt genom att blockera buffert som innehåller blandningen av primära antikroppar (1:150 Mouse IBA1 + 1:300 TMEM119). Försegla plattan med paraffin film och låt den Inkubera över natten vid 4 ° c.
  11. Nästa dag, varma prover på RT för cirka 15 min.
  12. Tvätta avsnitten 5x för 5 min vardera i PBS med Triton (PBST) (tabell 1).
  13. Ta bort PBST och Lägg till blockeringsbuffert som innehåller blandningen av sekundära antikroppar (1:300 Donkey anti-Mouse Alexa 488 för IBA1; 1:300 Goat anti-kanin Alexa 568 för TMEM119) för 1,5 h vid RT. från och med denna punkt, skydda proverna från ljus.
  14. Ta bort blockeringsbuffert och tvätta avsnitten 5x som gjort i steg 1,2, utom denna gång med PBST.
  15. Ta bort PBST och tillsätt 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) [1:20000] för 5 min vid RT.
  16. Ta bort DAPI och tvätta avsnitten 3x för 5 min vardera i fosfatbuffert (PB).
  17. Montera sektionerna på en Mikroskop bild. Låt dem torka medan de skyddas från ljus.
  18. När torkad, tillsätt några droppar monteringsfluorescensmedium och täck med en täckslip, undvika bubbelbildning.
    Förvara bilderna medan de skyddas från ljus, inuti en histologisk bildruta, vid 4 ° c. Proverna kan bevaras i flera månader.

2. avbildning för densitet och distribution analys

  1. Med hjälp av ett widefield epifluorescensmikroskopi-Mikroskop använder du en låg förstoring och DAPI-kanalen för att hitta ROI (dvs. regionen CA1 i hippocampus).
  2. Hämta bilder på 20x med en numerisk bländare (NA) på 0,5, med kanalerna DAPI, 488 och 568 och filter, med en upplösning på 0,3 μm/pixel. Fånga en mosaik bild som täcker ROI. Alternativt kan du ta enskilda bilder som kommer att sydda i en större bild.
    Obs: en mosaik bild är en super bild som består av mindre bilder. Mosaik bilder används vanligtvis för att övervinna den begränsade delen av fältet-of-view av höga förstoringar. Vissa program innehåller en mosaik funktion; icke desto mindre, bilder kan också manuellt sys ihop med andra fotoredigeringsprogram genom att sy de enskilda bilderna i en. Kom ihåg att lägga till skalnings informationen i filen. För denna typ av analys, det rekommenderas att ha minst 300 mikrogliala celler avbildas per ROI/djur (motsvarande cirka 10 − 15 bilder för Hippocampus, till exempel), med minst fem djur per försöks tillstånd. Figur 1A − C visar bilderna av colabelled microglia.
  3. Spara bilden som en TIFF-fil.

3. avbildning för Morfologisk analys

  1. Med hjälp av ett konfokaleller strukturerat belysnings Mikroskop kan du använda DAPI-kanalen för att hitta avkastningen vid låg förstoring.
  2. Med hjälp av en 40x mål (dvs., NA 1,4 olja), leta upp en IBA1 +/TMEM119 + cell inuti ROI. Medan Live Imaging, flytta i Z-axeln. Så snart signalen från slumpmässigt utvalda mikroglia försvinner, Ställ denna z-nivå som början av z-stacken. Flytta längs z-axeln i motsatt riktning tills signalen från mikroglia försvinner och Ställ in den punkten som slutet på z-stacken.
    Anm.: figur 2A − C visar bilder på IBA1 +/TMEM119 + microglia.
  3. Skapa en Z-stack i alla tre kanalerna (DAPI, 488, 568) med ett 0,33 μm Z-intervall och pixelstorlek på 0,15 μm/pixel. Lägg till skalnings informationen i filen.
    Obs: det rekommenderade Z-intervallet beror på målsättningen (t. ex. för ett 40x-objektiv såsom NA 1,4-olja är det 0,33 μm). För Morfologisk analys rekommenderas att ha minst 20 celler per djur med minst fem djur per försöks tillstånd.
  4. Spara filen som en TIFF-fil.

4. densitet och fördelning analys

  1. Öppna FIJI/ImageJ med närmaste granne avstånd (NND) plugin installerat. Öppna 20x-bilden.
    Obs: Använd en sökmotor med sökordet "närmaste granne avstånd beräkning med ImageJ" för att hitta installationsanvisningarna. Plugin författaren är Yuxiong Mao.
  2. Om du vill ställa in skalan manuellt baserat på en skala som är tryckt på bilden, väljer du verktyget rak linje (bild 3E), placerar markören på skalan och, medan du trycker på SKIFT-tangenten, ritar du en linje så nära skalan på bilden som möjligt (bild3i ), Välj analysera | Ställ in skalanoch ange sedan rätt information (figur 3j).
    Obs!: skalan kan ibland finnas i filens metadata och ställas in automatiskt.
  3. Välj bild | Färg | Gör komposit för att skapa en sammansatt bild av alla kanaler.
    Obs: under bild förvärv, FIJI/ImageJ kommer automatiskt att skapa en komposit i RGB-format.
  4. På menyraden väljer du analysera | Ställa in mätningar. Kontrollera område, Centroidoch perimeter. På fliken omdirigera till, klicka och välj den öppnade filen (figur 3K).
  5. Gå till bild | Färg | Kanal verktyget för att öppna kanal verktyget.
    Den här menyn tillåter att en viss färg inaktiveras. DAPI-kanalen kan vara användbar för att identifiera ROI och bekräfta celler. Den kan avaktiveras för att göra det lättare att räkna.
  6. Rita en grov omkrets av ROI med FreeHand markeringsverktyget (figur 3D).
  7. Aktivera markerings penselverktyget genom att dubbelklicka på verktyget oval i verktygsraden och kontrollera att pensel rutan Aktivera markering är markerad (bild 3G). Detta verktyg kommer att användas för att avgränsa ROI mer exakt. Välj en lämplig pensel storlek mellan 200 − 400.
  8. Använd markerings borsten och justera omkretsen så att den passar bäst för ROI. Tryck på T på tangentbordet för att lägga till ROI-hanteraren (figur 3L).
  9. Välj analysera | Mät eller tryck på M -tangenten och ett resultatfönster kommer att dyka upp. Kopiera och klistra in resultaten på ett datablad och spara sedan informationen om området (dvs. området för ROI; Figur 3R).
  10. När du har kopierat området ROI, radera informationen från resultatfönstret genom att klicka på den och trycka på back stegs tangenten.
  11. Gå till ROI Manager-fönstret (figur 3L), högerklicka på ROI-spårningen, ändra namnet så att det matchar bildens namn och spara sedan.
  12. Dubbelklicka på penselverktyget i verktygsraden. Välj den svarta färgen och en pensel storlek på 10. Se till att alternativet Paint av overlay är avmarkerat (figur 3H).
  13. I TMEM119-kanalen, Placera försiktigt en svart prick på mitten av Soma för varje TMEM119 + microglia. Placera en vit prick på mitten av cellerna som inte är positiva för TMEM119 (för att markera infiltrerande makrofager). Upprepa samma procedur för alla celler som ingår i ROI.
    Observera: det är viktigt att alla punkter (svartvitt) finns i samma kanal. Kanalens identitet kan verifieras (röd, blå eller grön) genom att titta på färgen på bildfönstrets etiketter.
  14. Välj bild | Färg | Delad kanal. Ett fönster för varje kanal visas. Sedan identifierar du kanalen med punkt anteckningarna och stänger de andra två fönstren.
  15. Omdirigera den nya delade kanalbilden. Gå till analysera | Ställa in mätningar. På fliken omdirigera till, klicka och välj delad kanalbild (figur 3K).
  16. Välj bild | Typ | 8-bitars. Gå till bild | Justera och välj tröskelvärde (bild 3O). För att justera tröskeln, skjut knappen på den andra stapeln, hela vägen till vänster (tröskel värde = 0) i båda staplarna.
    ANMÄRKNINGAR: detta kommer endast att lämna de svarta prickarna på bilden, som visas vita.
  17. Välj ROI i ROI Manager-fönstret. Välj analysera | Analysera partikel (figur 3N). På storlek (tum ˆ 2): Skriv 1 − 20. Håll pixel enheten avmarkerad, markera Visa, summera och Lägg till i hanterarenoch tryck på OK. Sammanfattningsfönstret kommer att dyka upp och ge antalet poäng (figur 3P). Kopiera och klistra in informationen i databladet.
  18. Välj insticksmoduler | Nnd. NND-fönstret kommer att dyka upp (figur 3Q). Kopiera/klistra in all information i databladet. Varje nummer representerar avståndet varje mikroglia har till närmaste angränsande mikroglia.
  19. Gå tillbaka till tröskel fönstret och skjut den första stapeln hela vägen till höger (tröskel värde = 255 i båda staplarna), vilket kommer att lämna alla vita prickar synliga, visas vita (figur 3m).
  20. Välj analysera | Analysera partikel. Fönstret Sammanfattning som anger antalet punkter kommer att dyka upp (bild 3P). Kopiera och klistra in informationen i databladet.
  21. Gå till ROI-hanteraren Markera alla punkter, högerklicka och spara med bildens namn. Detta gör det möjligt att spara alla punkter i en zip-fil (figur 3L). Välj fil | Spara somoch spara filen med ett namn som gör det möjligt att identifiera den analyserade bilden.
  22. Få tätheten av mikroglia (för varje bild) genom att dividera antalet IBA1 +/tmem119 + dubbel-positiva celler av området för ROI.
    Observera: värdena för varje bild kan beräknas för varje djur. Data kan sedan presenteras som medelvärdet ± standardfel av medelvärdet (SEM) av alla djur.
  23. Bestäm NND genom att erhålla en genomsnittlig per bild av NND-värdena för alla TMEM119 +-celler.
    Obs: uppgifterna kan sedan presenteras som medelvärdet ± SEM av alla djur.
  24. Beräkna avståndet index med hjälp av formeln: NND2 x densitet.
    Obs: uppgifterna kan sedan presenteras som medelvärdet ± SEM av alla djur. Enheterna för denna mätning kommer att vara godtyckliga enheter.
  25. Kvantifiera mikrogliala kluster genom att identifiera celler som har en NND under 12 μm.
    Anmärkning: här väljs 12 μm, eftersom det är det ungefärliga avståndet mellan två direkt juxtaposerar mikrogliala celler vidrör varandra med arborizations. Om det finns fler än tre mikroglia som uppfyller detta villkor, gå tillbaka till bilden och kontrollera om dessa celler är en del av ett eller flera kluster.
  26. När du har bekräftat antalet kluster, skriver du antalet kluster i databladet.
    Obs: antalet kluster kan delas av ROI-området för att få tätheten av celler/mm2 för varje djur. Uppgifterna kan sedan presenteras som medelvärdet ± SEM av alla djur.
  27. För att bestämma procentandelen perifer myeloisk cell infiltration, beräkna% av IBA1 +/tmem119-cells över det totala antalet myeloida celler (TMEM119 +/iba1 + + TMEM119-/iba1 +) för varje djur.
    Obs: uppgifterna kan sedan presenteras som medelvärdet ± SEM av alla djur.

5. morfologi analys

  1. Öppna FIJI/ImageJ.
  2. Öppna 40x-bilden med hjälp av bild J eller FIJI. Välj ett popup-fönster kommer att visas frågar om bilderna ska öppnas i en stapel. Klicka på OK. Välj sedan bild | Stackar | Z-projektet för att öppna z-Projektionsfönstret. Inkludera alla segment, från det första till sista segmentet. Kontrollera att Max intensiteten har valts under projektionstypoch klicka på OK
  3. Klicka på det nya fönstret med Z-projektet. Välj bild | Färger | Delade kanaler. Utför spåren på bilderna av IBA1 kanalen.
    Obs: de andra kanalerna (TMEM119 och DAPI) kan hållas öppna och konsulteras vid behov under den mikrogliala morfologiska analysen.
  4. På menyraden väljer du analysera | Ställa in mätningar. Kontrollera området, Centroidoch perimeter. På fliken omdirigera tillväljer du den öppnade filen (bild 3K).
  5. Ange skalan enligt beskrivningen i steg 4,2.
  6. För att mäta Soma storlek i IBA1 kanal, rita en grov omkrets av Soma med FreeHand markeringsverktyget (figur 3D).
  7. Aktivera markerings penselverktyget genom att dubbelklicka på verktyget oval på verktygsraden, följt av kryssrutan Aktivera markerings penseln (bild 3G). Välj en pensel storlek på markeringen mellan 10 − 20 (bild 3b).
  8. Använd markerings borsten och justera spårningen så att den passar till Soma. Om du zoomar in blir precisionen under det här steget (figur 2i).
  9. Tryck på T -tangenten för att lägga till Soma trace till ROI Manager (figur 3L).
  10. Välj analysera | Mät eller tryck på M -knappen. Ett resultatfönster kommer att dyka upp. Kopiera och klistra in resultaten i ett datablad (figur 3R).
  11. För att spara information om Soma-området, gå till ROI Manager-fönstret, högerklicka på ROI, ändra namnet så att det matchar bildens namn, ange att spårningen är för Soma och spara sedan filen.
  12. För att mäta arborization område i IBA1 kanalen, klicka på en mikrogliala process extremitet med polygon markeringsverktyget, som kommer att starta polygon formen (figur 3c).
  13. Efter tipsen i mikroglial processer, gå runt mikroglia genom att klicka på tipsen i varje process extremiteter att bilda en polygon som bäst representerar det område som täcks av mikrogliala arborizations (figur 2D− H).
    Obs: se till att polygonen förbinder alla mikroglialprocessens extremiteter. De linjer som bildar polygonen ska aldrig korsa varandra. När du klickar runt en mikrogliala process spets, vara noga med att undvika att skära av någon del av processen. Det är ibland användbart att lägga till extra poäng för att gå runt en process. Antalet punkter som bildar polygonen är inte direkt kopplat till antalet distala processer och är därför inte relevant för studien.
  14. Om du vill stänga polygonen klickar du på polygonens startpunkt.
  15. Tryck på T -knappen för att lägga till SPÅRNINGEN i Roi-hanteraren (figur 3L). Välj analysera | Mät eller tryck på M -knappen. Ett resultatfönster kommer att dyka upp. Kopiera och klistra in resultaten i ett datablad (figur 3R).
  16. Om du vill spara informationen om området arborization går du till fönstret ROI Manager, högerklickar på ROI, ändrar namnet så att det matchar bildens namn, anger för arborization och sparar sedan filen.
  17. Bestäm Soma området genom att i genomsnitt alla Soma områden för varje djur.
    Obs: data kan presenteras som medelvärdet ± SEM av alla djur.
  18. Bestäm arborization område genom att medelvärdes alla arborization områden för varje djur.
    Obs: data kan presenteras som medelvärdet ± SEM av alla djur.
  19. Beräkna morfologi index med hjälp av formeln Soma område/arborization område för varje mikrogliala cell och genomsnitt per djur.
    Obs: data kan presenteras som medelvärdet ± SEM av alla djur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar Co-märkning av mikroglia med IBA1 och TMEM119 i en koronala delen av dorsala Hippocampus avbildas på 20x av fluorescens mikroskopi. En lyckad färgning avslöjar mikrogliala cell organ och deras fina processer (figur 1A − C). Denna färgning möjliggör bestämning av mikroglialtäthet och fördelning och identifiering av mikrogliala kluster (figur 1I) och infiltrerande makrofager (figur 1F).

Figur 2 visar IBA1 +/tmem119 + mikroglia (figur 2A − C) i ett stegvis exempel på mikrogliala arboriseringsspårningsprocedur (figur 2D − H), samt ett exempel på cell kroppsspårning (figur 2i ), båda avbildas på 40x av konfokalmikroskopi.

Figure 1
Figur 1: IBA1 och TMEM119 dubbel färgning av mus hjärnvävnad för densitet, distribution, klustring, och perifer myeloisk cell infiltration analys. (a − C) Typisk mikroglial distribution i hippocampus en C57BL/6 vuxen mus. (D − F) Microglia identifieras som IBA1 +/TMEM119 + och infiltrerande makrofage identifierats som IBA1 +/TMEM119 (vit pil) i amygdala av en manlig mus. (G − I) Kluster av två mikroglia (vit kvadrat) i hippocampus av en mus. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: IBA1 och TMEM119 färgning för mikroglial morfologi analys. (a − C) Mikroglia. (D − I) Steg-för-steg-exempel på arboriseringsspårning med IBA1-kanalen med hjälp av polygonverktyget i FIJI/ImageJ. (J) exempel på mikroglia Soma-spårning med IBA1-kanalen med verktyget FreeHand Selection i Fiji/imagej. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Fiji/imagej gränssnitt och verktyg för mikroglial densitet, distribution, klustring, morfologi, och perifer myeloisk cell infiltration analys. (a − R) Sammanställning av alla verktyg, menyer och fönster som används för densitet, kluster och morfologi analyser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Lösningar Förberedelse
Blockerande buffert 0,5% gelatin + 5% naturligt get serum + 5% naturlig åsna serum + 0,01% Triton X-100 i TBS [0,05 M]
Citratbuffert 1,92 g citronsyra [10 mm], 500 μl av Tween 20 [0,05% (v/v)], 700 ml ultrarent vatten, justera pH = 6,0 med NaOH [10 N], fyll upp till 1 L med ultrarent vatten
NaBH4 [0,01% vikt/vikt] Disolve 0,01 g av nabh4 i 10 ml ultrarent vatten, lösningen bör vara väl blandad. Denna lösning skapar bubbla; släpp trycket genom att öppna locket efter blandning
Pb [100 mM] Disolve 23,48 g na2HPO4 och 4,8 g NaH2Po4· H2O i 1 l ultrarent vatten, fyll sedan upp till 2 l, justera pH = 7,4
Pbs [50 mM] Disolve 5,87 g na2HPO4, 1,2 g NaH2Po4· H2O, 9 g NaCl i 500 ml ultrarent vatten, fyll upp till 1 L med ultrarent vatten, justera pH = 7,4
PBST PBS + 0,01% Triton X-100
Tbs Späd Tris HCl [0,5 m] med ultrarent vatten 1:10 [0,05 m], ta 1 L Tris HCl [0,05 m] och tillsätt 8,75 g NaCl
Tris HCl [0,5 M] 950 ml ultrarent vatten, tillsätt 78,8 g Tris bufferhydroklorid (C4H11No3cl) justera pH = 8 och fyll upp till 1 L

Tabell 1: lösningar som används för immunofärgning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll kan delas in i två kritiska delar: kvaliteten på färgning och analys. Om infärgning inte är optimalt, kommer det inte att representera mikrogliala celler adekvat, vilket påverkar tätheten, distribution, och morfologi mätningar. Dessutom kan andelen infiltrations perifera myeloida celler underskattas. Detta är en optimerad version av infärgnings protokollet, men det finns flera faktorer som kan resultera i suboptimala bilder. Även om perfusion av djuret inte ingår i detta protokoll, om hjärnan fixering inte är väl utförda, kvaliteten på färgning kommer att äventyras. Dessutom, tillräcklig perfusion krävs för att säkerställa frånvaron av makrofager insidan av blodkärl som kan störa studien.

När det gäller immunofärgning, de mest kritiska detaljerna inkluderar kvaliteten på buffertar, blockerande steg, korrekt lagring av antikroppar, och hjärnans provhantering. Korrekt beredning av buffertar och deras lagring har en direkt inverkan på kvaliteten på färgning. Om inte annat anges kan vissa buffertar lagras under långa perioder, men användningen av en buffert som visar tecken på kontaminering bör undvikas. Om buffertar förbereds dagar eller veckor i förväg, bör pH i varje lösning före användning verifieras.

Dessutom, när det gäller immunofärgning, är närvaron av bakgrunds färgning fortfarande ett av de vanligaste problemen. Bakgrunds färgning gör det svårt att analysera microglia, särskilt deras morfologi, och därmed kommer att bias resultaten. För att förhindra bakgrund är det viktigt att blockeringssteget görs på rätt sätt. Lagringsförhållandena för antikropparna har också direkta effekter på deras effekt. Det rekommenderas att strikt följa de riktlinjer för lagring som tillhandahålls av företaget samt undvika frekventa upptinning frysning cykler. Slutligen, under hela processen, det är viktigt att uppmärksamma den fysiska integriteten i hjärnans sektioner. Det är viktigt att använda försiktighet under varje manipulation (buffert förändringar, tvättar, och montering), särskilt om försöksledaren inte är erfaren med detta förfarande. Det rekommenderas att undvika att lämna proverna utan någon flytande lösning vid byte av lösningar eller buffertar, lösningar för det efterföljande steget bör vara redo att hälla i brunnen i förväg. Den multi-well plattan bör vara korrekt förseglade med paraffin film under natten steg för att undvika avdunstning som kan leda proverna för att torka.

Kvantitativ analys av mikroglial densitet, distribution och morfologi har flera fördelar jämfört med kvalitativa rapporter. För att förhindra bias bör forskaren som utför analysen vara blind för försöks tillståndet. Sålunda, det föreslås att ha olika människor utföra analysen och ändra namnet på filerna (samtidigt som den ursprungliga och nya namn i ett nyckel blad). De nya namnen bör inte ha några inslag av försöks tillståndet. Hela analysen kan göras på dessa förblindade filer, och den ursprungliga bilden identitet avslöjas först efter sammanställning av data och före statistisk analys. Även om blindning redan praktiseras av erfarna forskare, är det fortfarande värdefulla råd för dem som utför denna typ av analys för första gången.

Kontroll för hjärnregionen görs under val av hjärn sektion och spårning av ROI under analys. Se till att använda sektioner från samma utbud av Bregma nivåer över djur. Samma ROI bör användas för densitet, distribution, och morfologi analyser. För densitet och distribution analyser, är det särskilt viktigt att vara exakt när man ritar ROI i FIJI/bild J. Användningen av en hjärn Atlas rekommenderas starkt för både sektions val och ROI-spårning. Användningen av DAPI underlättar också identifieringen av neuroanatomiska landmärken. För att undvika avvikelse, rekommenderas att avvisa mikroglia som endast delvis finns i Roi, eftersom de kan skilja sig mellan deras mikromiljö. När du markerar mikroglia för densitetsanalys kan DAPI-kanalen användas som ett urvalskriterium. Genom att bara räkna mikroglia som innehåller DAPI-färgade kärnor, alla anses mikroglia är i samma plan, minska den personliga bias under valet.

Eftersom mätningar för NND, avstånds index och klusteranalys baseras på placeringen av punkter som markerar enskilda celler, och eftersom avstånden beräknas av FIJI/ImageJ, är det viktigt att vara konsekvent när du placerar dessa punkter. Se till att strikt placera prickar i mitten av cellen kroppen, som bestäms visuellt. Dessutom bör Prickens storlek förbli konsekvent under hela analysen. Detta kommer att bidra till en bättre representation av den rumsliga fördelningen av den mikrogliala befolkningen. För klusteranalys valdes 12 μm som ett avstånds tröskelvärde baserat på våra tidigare analyser. Ändå, om det finns fyra eller flera olika celler med en NND under 12 μm, alla dessa celler kan ta del av ett enda kluster eller representera två kluster av två celler. Detta gjorde det nödvändigt att återgå till bilderna och bekräfta det faktiska antalet kluster.

Till skillnad från densitet och distribution, där avkastningen bestäms av neuroanatomiska funktioner med hjälp av en hjärna Atlas, är urvalet av mikrogliala celler för morfologi analys baserat på förmågan att analysera cellen. Alla celler som kan analyseras bör väljas för analys i en Z-stack innan de flyttas till en annan Z-stack för att förhindra val bias. Orsaker till att utesluta celler är problem med immunofärgning eller vävnads skärning, bearbetning (t. ex. rivning) eller montering (t. ex. bubbelbildning). Helst bör hjärn sektioner med sådana frågor systematiskt uteslutas från avbildning och analys. Det är också viktigt att notera att färgning för TMEM119 och IBA1 inte visar 100% överlappning (figur 2A − C). Eftersom TMEM119 inte tillåter visualisering av process kontinuitet (samt IBA1) gör det det svårt att bedöma var en cell slutar och var en annan startar. Sålunda, morfologi analys görs med hjälp av IBA1 kanal. Dessutom bör alla spår och prickar sparas och visualiseras för framtida revidering, vilket möjliggör ökad transparens och reproducerbarhet av resultaten.

Detta protokoll ger värdefull information om mikroglia och infiltrerande makrofager. Exempel på dess tillämpningar är att upptäcka tecken på neuroinflammation genom förändringar i mikroglia i olika hjärnregioner, studera de antiinflammatoriska effekterna av en förening, och studera faktorer som stör den korrekta funktionen av mikroglia. Med tanke på att detta protokoll tillåter detektion av infiltrerande makrofager i hjärnan och differentiering av dessa celler från microglia, ytterligare tillämpningar inkluderar: bestämning om rekrytering av makrofager förekommer i en viss förolämpning eller med användningen av andra tekniker (dvs. genetiska verktyg), och bekräfta och studera konsekvenserna av avsaknaden av perifera makrofager i hjärnan under förolämpning. Tänk på att fluorescens mikroskopi på egen hand är inte tillräckligt för att bekräfta infiltration inuti hjärnparenkymet. När IBA1 +/TMEM119-celler observeras nära ventriklarna eller perivaskulära rymden, högre rumsliga upplösning tekniker såsom elektronmikroskopi krävs för att bekräfta sin lokalisering inom parenkymet. Medan förändringar i densitet, distribution och morfologi är bra indikatorer på mikrogliala och makrofagroller, är denna metod mest kraftfull i kombination med funktionella utredningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot Nathalie Vernoux för hennes vägledning och hjälp med experimenten. Vi skulle också vilja tacka DRS. Emmanuel Planel och Serge Rivest för användning av deras fluorescens och konfokala Mikroskop, respektive. Detta arbete finansierades delvis av stipendier från mexikanska vetenskaps-och teknik rådet (CONACYT, till F. G. I), Fondation Famille-Choquette och Centre Thématique de Recherche en neurovetenskap (ctrn; to K.P.), fonds de Recherche du Québec-santé (till M.B.), och Shastri Indo-kanadensiska Institute (till K.B.), samt ett Discovery Grant från Natural Sciences och Engineering Research Council of Canada (NSERC) till M.E.T. M.E.T. innehar en Canada Research Chair (Tier II) av Neuroimmunplasticitet i hälsa och terapi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Invitrogen/Thermofisher A21202
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit Invitrogen/Thermofisher A11011
Biolite 24 Well multidish Thermo Fisher 930186
Bovine serum albumin EMD Millipore Corporation 2930
Citric acid Sigma-Aldrich C0759-500G
DAPI Nuceleic acid stain Invitrogen/Thermofisher MP 01306
Fine Brush Art store
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Gelatin from coldwater fish skin Sigma-Aldrich G7765
Microscope coverglass Fisher Scientific 1254418
Microslides positively charged VWR 48311-703
Monoclonal mouse Anti-IBA1 Millipore MABN92
Na2H2PO4·H2O BioShop Canada Inc. SPM306, SPM400
Na2HPO4 BioShop Canada Inc. SPD307, SPD600
NaBH4 Sigma-Aldrich 480886
NaCl Fisher Scientific S642500
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 017-000-121
Normal goat serum (NGS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 005-000-121
Parafilm-M Parafilm PM-999
Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 Abcam ab209064
Reciprocal Shaking bath model 25 Precision Scientific -
Transfer pipette
Tris buffer hydrochloride BioShop Canada Inc. TRS002/TRS004
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  2. Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
  3. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
  5. Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
  6. Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
  7. Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
  8. Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  9. Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
  10. Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
  11. Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
  12. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
  13. Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
  14. Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
  15. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  16. Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
  17. Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
  18. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
  19. Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
  20. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
  21. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).

Tags

Immunologi och infektion mus hjärna microglia myeloida celler Neuroimmunologi immunofluorescens IBA1 TMEM119 mikroskopi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.

The name was corrected from:

Maude Bordelau

to:

Maude Bordeleau

Immunofluorescensfärgning med IBA1 och TMEM119 för Mikroglial densitet, morfologi och perifer myeloid cell infiltration analys i mushjärna
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

González Ibanez, F., Picard,… More

González Ibanez, F., Picard, K., Bordeleau, M., Sharma, K., Bisht, K., Tremblay, M. È. Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (152), e60510, doi:10.3791/60510 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter