Summary
Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para o uso de imagens de ultrassom de alta frequência para medir o diâmetro luminal, a velocidade de propagação do pulso, a destensibilidade e a tensão radial em um modelo de camundongo do aneurisma aórtico abdominal.
Abstract
Um aneurisma abdominais (AAA) é definido como uma dilatação localizada da aorta abdominal que excede o diâmetro intraluminal máximo (MILD) em 1,5 vezes do seu tamanho original. Estudos clínicos e experimentais mostraram que pequenos aneurismas podem romper, enquanto uma subpopulação de grandes aneurismas pode permanecer estável. Assim, além da medição do diâmetro intraluminal da aorta, o conhecimento dos traços estruturais da parede da embarcação pode fornecer informações importantes para avaliar a estabilidade da AAA. O endurecimento aórtico surgiu recentemente como uma ferramenta confiável para determinar mudanças precoces na parede vascular. A velocidade de propagação do pulso (PPV) juntamente com a destensibilidade e a cepa radial são métodos altamente úteis baseados em ultrassom relevantes para avaliar a rigidez aórtica. O objetivo principal deste protocolo é fornecer uma técnica abrangente para o uso do sistema de imagem de ultrassom para adquirir imagens e analisar as propriedades estruturais e funcionais da aorta determinadas por LEVE, PPV, destensibilidade e cepa radial.
Introduction
Um aneurisma abdominais (AAA) representa uma doença cardiovascular significativa caracterizada por uma dilatação localizada permanente da aorta que excede o diâmetro original do vaso em 1,5 vezes1. A AAA está entre as 13 principais causas de mortalidade nos Estados Unidos2. A progressão da AAA é atribuída à degeneração da parede aórtica e à fragmentação da elastina, levando, em última instância, à ruptura aórtica. Essas alterações na parede aórtica podem ocorrer sem um aumento significativo no diâmetro intraluminal máximo (MILD), sugerindo assim que o MILD sozinho não é suficiente para prever a gravidade da doença3. Portanto, fatores adicionais precisam ser identificados para detectar alterações iniciais na parede aórtica, o que pode orientar as opções de tratamento precoce. O objetivo geral deste protocolo é fornecer um guia prático para avaliar propriedades funcionais aórticas utilizando imagens de ultrassom caracterizadas por medições de velocidade de propagação de pulso (PPV), destensibilidade e cepa radial.
Um modelo experimental bem caracterizado para estudar AAA, descrito pela primeira vez por Daugherty e colegas, envolve infusão subcutânea de angiotensin II (AngII) através de bombas osmóticas em Apoe-/- ratos4. A medição precisa do LEVE usando imagens de ultrassom tem sido fundamental para caracterizar a AAA neste mouse modelo5. Embora as mudanças histológicas durante o desenvolvimento da AAA tenham sido extensivamente estudadas, as mudanças nas propriedades funcionais da parede da embarcação, como a rigidez aórtica, não foram bem caracterizadas. Este protocolo enfatiza o uso de ultrassom de alta frequência em combinação com as análises sofisticadas como ferramentas poderosas para estudar a progressão temporal da AAA. Especificamente, essas abordagens nos permitem avaliar as propriedades funcionais da parede da embarcação medida pelo PPV, destensibilidade e cepa radial.
Estudos clínicos recentes em indivíduos humanos com AAA, bem como no modelo AAA induzido por elastase murina, sugerem uma correlação positiva entre rigidez aórtica e diâmetro aórtico6,7. O PPV, indicador de rigidez aórtica, é aceito como uma excelente medida para quantificar mudanças na rigidez na parede do vaso6,8. O PPV é calculado medindo o tempo de trânsito da forma de onda de pulso em dois locais ao longo da vasculatura, proporcionando assim uma avaliação regional da rigidez aórtica. Recentemente demonstramos que o aumento da rigidez aórtica medida pelo PPV, e no nível celular determinado usando microscopia de força atômica, correlaciona positivamente com o desenvolvimento do aneurisma9. Além disso, a literatura sugere que a rigidez aórtica pode preceder a dilatação aneurismal e, portanto, pode fornecer informações úteis sobre propriedades intrínsecas regionais da parede do navio durante o desenvolvimento da AAA10. Da mesma forma, destensibilidade e medidas de tensão são as ferramentas de quantificação para medir mudanças anteriores do condicionamento arterial. Artérias saudáveis são flexíveis e elásticas, enquanto com aumento da rigidez e menos elasticidade, destensibilidade e tensão são diminuídas. Aqui, fornecemos um guia prático e protocolo passo a passo para o uso de um sistema de ultrassom de alta frequência para medir leve, PPV, destensibilidade e tensão radial em camundongos. O protocolo fornece abordagens técnicas que devem ser utilizadas em conjunto com as informações básicas fornecidas por manuais para instrumentos específicos de ultrassom e o tutorial de vídeo que acompanha. É importante ressaltar que, em nossas mãos, o protocolo de imagem descrito fornece dados reprodutíveis e precisos que parecem valiosos no estudo do desenvolvimento e progressão da AAA experimental.
Para demonstrar ainda mais a utilidade da imagem de ultrassom, fornecemos imagens e medições de exemplo retiradas de nossos próprios estudos com o objetivo de usar abordagens farmacológicas para prevenir o AAA11experimental . Especificamente, a sinalização de entalhe foi proposta para estar envolvida em múltiplos aspectos do desenvolvimento vascular e inflamação12. Usando haploinsuficiência genética e abordagens farmacológicas, já demonstramos anteriormente que a inibição de notch reduz o desenvolvimento de AAA em camundongos, prevenindo a infiltração de macrófagos no local de lesão vascular13,14,15. Para o artigo atual, utilizando a abordagem farmacológica para inibição de Notch focamos na relação entre rigidez aórtica e fatores relacionados à AAA. Esses estudos ilustram que a inibição do notch reduz a rigidez aórtica, que é uma medida da progressão AAA11.
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Protocol
O protocolo de manuseio de camundongos e ultrassom foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Missouri (protocolo animal número 8799) e foi conduzido de acordo com a AAALAC International.
1. Configuração de equipamentos e preparação de camundongos
- Configuração de equipamentos
- Ligue o instrumento de ultrassom, o aquecedor de gel ultrassônico e a almofada de aquecimento.
- Abra o programa de ultrassom e digite o nome do estudo e informações descritivas para cada mouse.
- Selecione o aplicativo como Imagem Geral.
- Escolha o transdutor adequado para imagem abdominal (Figura 1B,C). Neste experimento, o transdutor MS400 é usado.
- Certifique-se de anestesia isoflurane e os níveis de oxigênio são adequados para cada sessão experimental.
- Limpe a plataforma de imagem animal de ultrassom.
- Preparação do mouse
- Coloque a gaiola do rato em cima de uma almofada de aquecimento (36,5 a 38,5 °C).
- Segure suavemente o rato pela base traseira e coloque na câmara de isoflurano cheia de oxigênio.
- Direcione o fluxo de isoflurano e oxigênio para a câmara de indução.
- Ligue o vaporizador isoflurano e configure o nível de isoflurano para 1-2% vol/vol. Ligue a pressão do tanque de oxigênio para 1-2 L/min.
- Após ~2 min, confirme a profundidade adequada da anestesia pela ausência de reflexos de retirada ao beliscar a almofada do pé do rato.
- Em seguida, desligue o ramo de abastecimento da câmara de indução e ligue o galho direcionado ao cone do nariz da anestesia.
- Transfira o rato da câmara de indução para o estágio de ultrassom e posicione o cone de anestesia sobre o nariz do animal.
- Incline a plataforma de imagem animal em torno de 10° para o canto inferior direito para uma varredura ideal(Figura 1B).
- Coloque uma gota de solução oftálmica estéril em ambos os olhos de camundongos para evitar a secagem anestesia.
- Posicione o mouse na posição supina com o nariz inserido no cone da anestesia.
- Aplique o gel de eletrodo nas quatro patas usando um cotonete de algodão e fita as patas para os cabos de cobre na plataforma de imagem animal para leituras de eletrocardiograma(Figura 1C).
- Use cortadores para raspar cabelo no local de imagem e, em seguida, aplique creme depilatório para remover peles restantes. Deixe por menos de 1 min.
- Limpe suavemente o creme e o cabelo com uma toalha de papel úmida.
- Monitore a respiração e certifique-se de que a frequência cardíaca seja mantida entre 450-550 batidas/min. Se abaixo desse nível, reduza o fluxo de isoflurano e espere até que a frequência cardíaca se recupere.
- Aplique gel ultrassônico pré-aquecido (37 °C) ao local da pele preparado e conecte o transdutor ao seu suporte e abaixe até que ele toque o gel(Figura 1C).
2. Ultrassom de imagem da aorta abdominal
- Posicione o transdutor horizontalmente (ou seja, perpendicular à linha média do mouse).
- Alise o gel ultrassônico e remova bolhas usando a vara de madeira de um cotonete de algodão.
- Abaixe o transdutor e coloque 0,5 a 1 cm abaixo do diafragma depois de tocar o gel. Agora comece a observar as imagens.
- Visualize a aorta abdominal na visão do eixo curto (Figura 1C).
NOTA: O modo B é o modo padrão e mais eficaz para localizar anatomicamente a aorta e posicionar o transdutor. A aorta abdominal é identificada pela presença de fluxo pulsátil usando modos doppler colorido e doppler de potência no eixo curto (ou seja, a seção transversal circunferencial da aorta). Ajuste os micromanipuladores no palco animal e o transdutor para levar a seção transversal da aorta para o centro da imagem. - Gire suavemente o transdutor 90° no sentido horário e ajuste lentamente o botão micromanipulador do eixo X para visualizar a aorta em visão longa do eixo (seção longitudinal da aorta).
NOTA: Em muitos casos, gases gastro-intestinais podem interferir na imagem, ou a aorta pode não estar no ângulo ideal para permitir uma visão clara do eixo longo. Ajuste o ângulo do transdutor lentamente e horizontalmente até que uma visão de eixo longo aceitável seja obtida. Se os problemas persistirem, elevam o transdutor, verifique se há bolhas de ar o transdutor, ajuste ligeiramente o ângulo inclinado do estágio animal, reaplique géis e repita todos os passos novamente. - Defina a zona de foco e a profundidade na região da aorta utilizando os alternadores focus zone e Focus Depth, respectivamente. Ajuste o tempo de compensação deslizante manualmente para escurecer o lúmen da aorta para alcançar um contraste ideal da parede aorta.
- Ajuste o manipulador do eixo Y para visualizar os pontos de ramificação das artérias renais superiores e renais certas. Use a artéria renal direita como um marco para capturar a imagem da aorta suprarrenal (Figura 2A).
- Grave pelo menos 100 quadros de imagens do modo B na aorta suprarrenal.
- Pressione a cinestore para salvar as imagens do modo B.
- Pressione o botão do modo M no teclado do instrumento para ativar a gravação do modo M. Enrole a bola do cursor para levar a linha indicadora amarela para uma seção normal de aorta com imagem clara da parede da embarcação, ou para as seções onde o diâmetro máximo do aneurisma é observado.
- Pressione o alternador do SV/portão e ajuste a bola do cursor para garantir que as paredes do vaso estejam incluídas no suporte de medição. Pressione a atualização para gravar medições do modo M e pressione a cinestore a capturar(Figura 2A,B).
NOTA: O diâmetro máximo do aneurisma pode não estar no mesmo plano de imagem da visão ideal do eixo longo da aorta. Ajuste ligeiramente o botão manipulador do eixo X para cada medição do modo M para garantir que o LEVE de cada seção seja capturado. - Para obter imagens de Visualização Kilohertz (EKV) portadas pelo ECG, pressione o botão do modo B para voltar à gravação do modo B.
NOTA: Se as imagens não estiverem afiadas, ajuste o manipulador do eixo X para alcançar a imagem mais nítida da parede superior do lúmen sobre um comprimento de seção (ou seja, > 6 mm). - Pressione o botão Configurações de Fisioterapia no teclado e selecione Gating respiration. Ajuste a marcha Delay and Window manualmente para registrar os dados apenas durante as partes mais lisonjeiras da onda de respiração. As seções de gravação serão mostradas como blocos coloridos no rastreamento da onda de respiração.
NOTA: Sem o ajuste da gating de respiração, as imagens do EKV serão borradas devido ao movimento normal do animal durante a respiração. - Pressione o botão EKV para ativar o modo EKV. No menu apropriado, selecione Resolução Padrão e taxa de quadros 3000 ou superior. Selecione proceder para gravar imagens EKV. Pressione a cinestore para salvar as imagens. Use a imagem do modo EKV para obter medições de velocidade de propagação de pulso (PPV), destensibilidade e cepa radial.
NOTA: A gravação do EKV pode falhar se houver flutuações anormais na respiração, o animal está repirando muito rapidamente, ou as configurações das taxas de quadros são muito altas. Nesse caso, defina a taxa de quadros mais baixa e aguarde a respiração animal para estabilizar. Definir a taxa de quadros em 3000 geralmente é apropriado para ratos e ratos.
3. Passos pós-imagem
- Limpe suavemente o gel ultrassônico da área abdominal do mouse com uma toalha de papel umedecida com água morna.
- Coloque o rato de volta em sua gaiola em uma almofada de aquecimento.
- Desligue a máquina de isoflurano, limpe a plataforma de imagem animal e transdutor com lenços umedecidos.
- Transfira os dados de imagem coletados durante o ultrassom para o disco rígido.
- Desligue o instrumento de ultrassom.
- Depois que o rato se recuperar da anestesia e estiver alerta, remova a almofada de aquecimento e devolva a gaiola ao rack de habitação animal.
4. Análise de imagens aórticas abdominais
- Análise de imagens do modo M para medir O MILD
- Abra o programa de ultrassom e digite o nome do estudo e informações descritivas para cada mouse.
- Abra os dados de ultrassom no software de análise e abra a imagem do modo M e pause o batimento cardíaco.
- Clique em Medidas.
- Selecione o pacote vascular nas opções de entrega. Clique em Profundidade e desenhe uma linha através do lúmen aórtico que se estende da parede interna à parede(Figura 2C,D).
NOTA: Para consistência, as medidas devem ser tomadas na fase sistolica do ciclo cardíaco quando a aorta é ampliada. Desenhe três linhas em três batimentos cardíacos diferentes para obter medições precisas e médias de MILD. Na AAA, as medidas são tomadas na dilatação máxima da aorta. Também é aconselhável jejuar os animais de 4 a 6h antes de coletar imagens para evitar interferências da motilidade intestinal e garantir clareza de imagem.
- Análise para velocidade de propagação de pulso (PPV)
- Abra a imagem do EKV e pare o batimento cardíaco.
- Abra uma nova janela no software de análise (por exemplo, Vevo Vac) clicando no ícone do nome.
- Clique na opção PPV (seta na Figura 3D). Uma pequena janela aparecerá ainda mais com a imagem da aorta.
- Desenhe uma caixa retangular clicando na parede superior do vaso e arrastando o ponteiro por cerca de 4 mm cobrindo ambas as paredes da aorta suprarrenal.
NOTA: Mantenha o comprimento da caixa consistente (~4 mm) para todas as imagens. O usuário pode ajustar a caixa retangular girando para alinhar a caixa e selecionando a linha e arrastando para uma nova posição na embarcação que está sendo analisada para obter a inflexão mais apropriada e clara da onda de pulso. As linhas verticais de dados do retângulo serão exibidas e identificadas como a esquerda (imagem superior) e direita (imagem inferior) no ROI. Para uma melhor visualização da inflexão da onda de pulso, às vezes é útil para a caixa de desenho apenas na parede superior, como mostrado na Figura 3. O software calculará automaticamente o PPV (m/s). No entanto, é sempre melhor ajustar manualmente as linhas roxas para definir o ponto exato de inflexão nas ondas de pulso e o PPV mudará de acordo. - Por fim, selecione o comando Aceitar para salvar os valores do PPV. Exporte os números e os dados para a unidade de armazenamento de dados.
- Análise para destensibilidade e cepa radial
- Abra a imagem do EKV e pare o batimento cardíaco.
- Clique no ícone do software. O software abrirá uma nova janela.
- Clique no traço do novo ROI e desenhe uma caixa retangular nas duas paredes do vaso. O software rastreará automaticamente as paredes superior e inferior da embarcação. O usuário pode ajustar o traço para se alinhar na parede clicando em pontos verdes (Figura 4A,B).
- Agora aceite o rastro. O software calculará a distensibilidade (1/Mpa) no ROI selecionado.
- Para a medição da tensão radial, selecione a opção de tensão apropriada nas barras do menu na parte superior esquerda. As imagens para tensão radial e tensão tangencial serão abertas.
- Obtenha o valor para a cepa radial (%) movendo o cursor no pico da curva. Exporte os dados como imagens ou em formato de vídeo (Figura 4A,B).
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Representative Results
Imagens representativas do modo M da aorta abdominal normal e aneurisma dos camundongos são mostradas na Figura 2A e Figura 2B,respectivamente. A aorta abdominal suprarrenal é identificada por sua localização ao lado da artéria renal direita e a artéria mesentérica superior(Figura 2A). Imagens representativas utilizadas para o cálculo do MILD, em três batimentos cardíacos diferentes do ciclo cardíaco sistolic, em aorta normal e aneurisma são mostradas na Figura 2C,D, respectivamente. Na situação em que um aneurisma aórtico se desenvolveu, o diâmetro luminal é determinado por desenhar uma linha amarela perpendicular entre as duas bordas internas do lúmen na área de dilatação máxima (Figura 2B). Três medidas independentes são tipicamente médias para determinar um diâmetro intraluminal preciso.
As imagens representativas do EKV da aorta abdominal utilizadana análise do PPV são mostradas na Figura 3. O PPV é calculado por meio da senha de uma caixa retangular na parede luminal da aorta suprarrenal (Figura 3E) e ajuste das linhas roxas verticais de dados obtidos na caixa retangular (Figura 3F). As linhas roxas devem ser ajustadas para definir o ponto de inflexão das ondas de pulso. Imagens EKV representativas da aorta abdominal adequadas para análise de destensibilidade e cepas radiais são mostradas na Figura 4. A destensibilidade e a cepa radial são calculadas rastreando as paredes luminal da aorta suprarrenal, como mostrado na Figura 4E. O valor para destensibilidade (1/MPa) é obtido escolhendo a opção de distensibilidade/elasticidade do menu suspenso da caixa (seta vermelha, Figura 4F). A cepa radial (%) é obtido escolhendo a opção de tensão radial(Figura 4G) e movendo o cursor para o pico do gráfico de tensão radial(Figura 4H).
Validamos o significado do PPV no modelo de camundongo induzido por AngII da AAA e examinamos ainda mais o potencial terapêutico de um inibidor de entalhe (N-[N-(3,5-difluorofephenacetil)-L-alanyl]-(S)-phenyglicine t-butyl ester; DAPT) sobre a progressão e estabilidade da AAA pré-estabelecida. Especificamente, todos esses estudos de aneurisma foram realizados em Apoe de 8 a 10 semanas de idade -/- camundongos machos após a infusão de AngII pelos protocolos publicados4,13. No dia 28 de infusão angii, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos e foram administrados veículo ou DAPT (10 mg/kg) até o sacrifício no dia 5613. A imagem de ultrassom transabdominal mostrou um aumento progressivo no LEVE, PPV e uma diminuição na destensibilidade e tensão radial em resposta ao AngII no dia 28 (Figura 5A-E). A infusão angii aumentou marginalmente mild do dia 28 para 56 e o DAPT não mudou significativamente leve em comparação com angii apenas (Figura 5A e Figura 5B). No entanto, o PPV aumentou progressivamente com a infusão de AngII a partir do dia 28 até o dia 56 e o DAPT diminuiu significativamente ainda mais os aumentos no PPV no dia 56(Figura 5C). A destensibilidade e as cepas radiais, parâmetros para avaliar a elasticidade da parede da embarcação foram diminuídos com a infusão de AngII, enquanto o DAPT não apresentou efeito significativo (Figura 5D e 5E). É importante perceber que a PWV correlacionou fortemente com o MILD no dia 28 (R2=0,51, Figura 5F), enquanto no dia 56, a correlação foi relativamente fraca (R2=0,22) (Figura 5G). A rigidez aórtica na AAA está associada principalmente a mudanças na arquitetura da parede aórtica. Histologicamente, a infusão angii aumentou a degradação do colágeno e atividade proteolítica na camada medial da aorta (Figura 5H, linha superior). O tratamento DAPT minimizou tais mudanças na degradação do ECM (Figura 5H, linha inferior).
Figura 1: Configuração do instrumento. (A)Vista geral da máquina de ultrassom junto com câmara de indução para anestesia e gel mais quente. (B)Close-up view da plataforma de imagem e do sistema transdutor. (C)A visão da colocação do transdutor ao capturar a imagem do eixo curto da aorta abdominal. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Análise de imagens do modo M para obtenção de diâmetro intraluminal máximo (LEVE). As imagens do modo M de aorta normal (A) e aorta com aneurisma abdominal(B)de camundongos são mostradas. (C) e(D),LEVE desenhado em fase sistolica do ciclo cardíaco na aorta suprarrenal de camundongos normais (C) e camundongos com AAA(D). Medições em três batimentos cardíacos diferentes são tomadas como mostrado e o valor médio é calculado. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Análise de imagens De KKV para obtenção de velocidade de propagação de pulso (PPV). Imagens de EKV coletadas de aorta de rato normal. A análise é feita clicando em medições(A)e no ícone do software(B). Uma nova janela aparecerá com os ícones do lado direito, como mostrado em C. Agora, clique em PPV(D) e novamente, uma pequena janela aparecerá(E). Desenhe uma caixa retangular na parede superior do lúmen, como mostrado em E e clique em aceitar. O valor PPV será obtido conforme mostrado em F (seta). As linhas roxas são ajustadas para definir o ponto de inflexão das ondas de pulso(G). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Medição de destensibilidade e cepa radial. Imagens de EKV coletadas de aorta de rato normal. A análise é feita clicando em medições(A)e no ícone do software(B). Uma nova janela aparecerá com os ícones do lado direito, como mostrado em C. Agora, clique em traçar o novo ROI(D),uma nova janela aparecerá com traços na parede superior e inferior do lúmen, como mostrado em E e clique em aceitar. O valor para a destensibilidade será obtido na tabela como mostra no F. Para tensão, clique em tensão(G). A janela mostrará o valor da tensão radial (caixa de destaque verde), já que o cursor é colocado no pico do gráfico de tensão radial(H). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: PPV correlaciona-se com traços estruturais de aorta na AAA estabelecida. (A) Imagens representativas de ultrassom transabdominal mostrando o MILD no dia 0, 28, 42 e 56 de grupos experimentais indicados em Apoe-/- camundongos. O DAPT começou no dia 28. Linhas amarelas pontilhadas esboçam o lúmen. (B) Quantificação do MILD nos grupos indicados (a cor roxa e verde mostra AngII + veículo e ratos tratados AngII + DAPT respectivamente (n=16-18). (C, D e E) PPV, destensibilidade e tensão radial em vários dias de tratamentos AngII e DAPT (n=8). (F e G), Gráficos mostrando a correlação de Pearson entre PPV e MILD no dia 28(F) e dia 56(G). (H) Imagens histológicas representativas para coloração de colágeno (manchada com tricromo e vista como coloração azul) e atividade proteolítica por in situ zymography com ou sem tratamento DAPT no dia 56. O teste de comparações múltiplas tukey foi usado para análise de dados. *P<0.05; ns = não significativo. Escala de 50 μm em H. Este número é adaptado de Sharma et al. (2019), Scientifc Reports (SREP-19-16491B)11. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
A imagem de ultrassom fornece uma técnica poderosa para determinar propriedades funcionais da aorta através de medições de PPV, destensibilidade e cepa radial. Essas medidas são particularmente instrutivas para estudar modelos de camundongos da AAA e a abordagem in vivo permite a coleta de dados longitudinal que são potencialmente importantes para entender o desenvolvimento temporal da patologia aórtica. Especificamente, as medidas de rigidez aórtica in vivo são determinadas localmente na aorta abdominal por PPV, destensibilidade e cepa radial analisando dados do EKV e são consideradas como um fator de risco independente para a instabilidade AAA16. As técnicas descritas nestes protocolos são relativamente diretas e levam apenas 8-10 minutos para obter conjuntos de imagem de um mouse. Todas as imagens devem ser coletadas preferencialmente por um único operador usando marcos bem definidos e consistentes para gerar dados reprodutíveis e precisos.
Existem fatores potenciais que requerem conhecimento técnico para as aplicações dessas ferramentas. Por exemplo, em primeiro lugar, o PPV pode não refletir apenas o grau de desenvolvimento da AAA na parede arterial local, pois é uma medida indireta da rigidez arterial regional. Em segundo lugar, pode ser difícil medir com precisão o PPV se a parede intimal estiver danificada. Em terceiro lugar, pode ser desafiador obter imagens de resolução acentuada sem expertise na operação do instrumento. Algumas dessas preocupações têm sido abordadas em versões recentes de sistemas de imagem de ultrassom onde o ruído e artefatos são reduzidos, preservando e melhorando a aquisição de dados para estudos em pequenos animais.
O foco das técnicas utilizadas no passado (Doppler, microangiografia, ressonância magnética) para determinar a rigidez aórtica limitou-se a imagens bidimensionais. O PPV calculado a partir da imagem de ultrassom vem emergindo como um método confiável e reprodutível para determinar a rigidez aórtica e parece ser independente da pressão arterial9,17. É importante notar que a definição predominante de AAA usando diâmetro máximo como índice padrão nem sempre se correlaciona com observações clínicas. Por exemplo, pequenos aneurismas podem romper enquanto alguns grandes aneurismas tendem a permanecer estáveis18,19,20. O endurecimento aórtico é uma mudança precoce gerando estresse na parede aórtica que desencadeia o crescimento aneurisma, e remodelando10 e tem sido fortemente correlacionado com Mmp2 e Mmp9 em modelos de mouse da AAA10. Assim, além do diâmetro da aorta, análises funcionais podem fornecer informações importantes para avaliar a progressão e estabilidade da AAA.
Usando esses protocolos, examinamos o potencial terapêutico de um potente inibidor de entalhe farmacológico (2S-N-[(3,5-Difluorofofifyl) acetil]-L-alanyl-2-feniglicine 1,1-dimetiletiletill ester; DAPT) sobre a progressão e estabilidade da AAA pré-estabelecida usando um modelo de mouse induzido por AngII de AAA11. A imagem de ultrassom transabdominal mostrou um aumento progressivo no LEVE, PWV e uma diminuição na destensibilidade e tensão radial no Apoe-/- camundongos em resposta a AngII do que controles no dia 28. Nenhum aumento adicional no MILD foi observado além do dia 28 até o dia 56(Figura 5). No entanto, o PPV aumentou progressivamente e foi significativamente maior no dia 56 em comparação com o dia 28. Com a inibição da sinalização notch pelo DAPT, os camundongos MILD não eram significativamente diferentes do AngII sozinhono no dia 56. Curiosamente, o DAPT impediu um aumento ainda maior no PPV de tal forma que era significativamente menor do que AngII no dia 56(Figura 5C). O tratamento da DAPT não afetou significativamente a destensibilidade ou a cepa radial(Figura 5D,E). Curiosamente, o PPV correlacionou-se fortemente com mild no dia 28 (R2=0,51), enquanto no dia 56, a correlação foi relativamente fraca (R2=0,22; Figura 5F). Essas mudanças na rigidez aórtica foram refletidas no aumento da degradação do colágeno e da atividade proteolítica com AngII e na atenuação pelo DAPT (Figura 5H). Este exemplo destaca o valor potencial das medâncias de rigidez aórtica baseada em ultrassom na compreensão do curso de tempo e previsibilidade tanto da progressão e estabilidade da AAA.
Além disso, a abordagem baseada em ultrassom parece valiosa na avaliação do papel potencial das intervenções farmacológicas, particularmente em estágios que provavelmente serão independentes de mudanças no diâmetro intraluminal (ou seja, além da expectativa de real regressão). Em resumo, a compreensão detalhada e o uso dessa tecnologia se beneficiarão na avaliação do prognóstico da AAA em estágio inicial da doença para intervenções terapêuticas eficazes.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela R01HL124155 (CPH) e financiamento do Instituto de Pesquisa da Universidade do Missouri para a CPH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma | A9525 | |
| Apoe-/- mice | The Jackon lab |  |
|
| Clippers | WAHL | 1854 | |
| Cotton swab | Q-tips | ||
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| Depilatory cream | Nair | LL9038 | |
| Electrode cream | Sigma | 17-05 | |
| Gel warmer | Thermasonic (Parker) | 82-03 (LED) | |
| Heating pad | Stryker | T/pump professional | |
| Isoflurane | VetOne | Fluriso TM | |
| Isoflurane vaporizer | Visualsonics | VS4244 | |
| Lubricating ophthalmic ointment | Lacri-lube | ||
| Osmotic pumps | Alzet | Model 2004 | |
| Oxygen tank | Air gas | ||
| Tranducer | Visualsonics | MS-400 or MS550D | |
| Ultrasonic gel | Parker | Aquasonic clear | |
| Ultrasound Imaging System | Visualsonics | Vevo 2100 | |
| Vevo Vasc Software | Visualsonics |
References
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