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Immunology and Infection

एसिनेटोबैक्टर बौमैनी के लिए तकनीकी समायोजन के साथ इनर और बाहरी झिल्ली अंशों में ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए सेल लिफाफे का पृथक्करण

Published: April 10, 2020 doi: 10.3791/60517
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया दो स्थानिक रूप से अलग झिल्ली का उत्पादन करते हैं। बाहरी झिल्ली को आंतरिक झिल्ली से एक परिधीय और पेप्टिडोग्लिकन परत द्वारा विभाजित किया जाता है। इन रोगाणुओं के दोहरे बाइलेयर को अलग करने की क्षमता उनके शरीर विज्ञान और रोगजनन को समझने के लिए महत्वपूर्ण रही है।

Abstract

यह विधि ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिफाफे को कुल, आंतरिक और बाहरी झिल्ली (ॐ) अंशों में विभाजित करके काम करती है और बाइलेयर की शुद्धता का आकलन करने के लिए परखों के साथ समाप्त होती है। ओम में आंतरिक झिल्ली की तुलना में समग्र घनत्व में वृद्धि हुई है, मुख्यतः बाहरी पत्रक के भीतर लिपूलीगोसैकराइड्स (एलओएस) और लिपोपॉलीसैकराइड्स (एलपीएस) की उपस्थिति के कारण। लॉस और एलपीएस अणु एम्फीपैथिक ग्लाइकोलिपिड होते हैं जिनमें एक समान संरचना होती है, जिसमें लिपिड-ए अलग-अलग और कोर-ओलिगोसाक्राइड प्रतिस्थापन होते हैं। हालांकि, केवल एलपीएस अणुओं को ओ-पॉलीसैकराइड, या ओ-एंटीजन के रूप में जाना जाता है एक तीसरी उपइकाई के साथ सजाया जाता है। मौजूद ग्लाइकोलिपिड का प्रकार और मात्रा किसी जीव के ओम घनत्व को प्रभावित करेगी। इसलिए, हमने परीक्षण किया कि क्या विभिन्न ग्लाइकोलिपिड सामग्री वाले बैक्टीरिया की झिल्ली को हमारी तकनीक का उपयोग करके इसी तरह अलग किया जा सकता है। एलपीएस उत्पादक जीवों, साल्मोनेला आंत्रिका सेरोवर टाइथिमुरियम और एस्चेरिचिया कोलाईके लिए, झिल्ली आसानी से अलग-थलग पड़ गई थी और एलपीएस ओ-एंटीजन मोईटी ने बाइलेयर विभाजन को प्रभावित नहीं किया। एसिनेटोबैक्टर बौमैनी लॉस अणुओं का उत्पादन करता है, जिसमें ओ-एंटीजन की कमी वाले एलपीएस अणुओं का समान द्रव्यमान होता है; हालांकि, इन रोगाणुओं की झिल्ली को शुरू में अलग नहीं किया जा सका। हमने तर्क दिया कि ए बौमनी का ओम एंट्रोबैक्टीरिया की तुलना में कम घना था, इसलिए सुक्रोज ढाल को समायोजित किया गया और झिल्ली अलग-थलग पड़ गई। इसलिए तकनीक को अन्य जीवों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित और संशोधित किया जा सकता है।

Introduction

ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया दो झिल्ली का उत्पादन करते हैं जो एक परिपिलेमिक स्थान और पेप्टिडोग्लिकन सेल दीवार1से अलग होते हैं। आंतरिक झिल्ली (आईएम) साइटोसोल को घेरती है और फॉस्फोलिपिड का एक सममित बाइलेयर है। पेप्टिडोग्लिक्स टर्गोर दबाव से बचाता है और जीवाणु को कोशिका आकार प्रदान करता है, और लिपोप्रोटीन2,,3द्वारा बाहरी झिल्ली (ओम) से जुड़ा होता है। ॐ परिसिपल को घेरे हुए है और मुख्य रूप से असममित है। आंतरिक पत्रक में फॉस्फोलिपिड होते हैं और बाहरी पत्रक में ग्लाइकोलिपिड होते हैं, जिसे लिपूलिगोसैकराइड्स (एलओएस) या लिपोपॉलीसैकराइड्स (एलपीएस)4,,5के रूप में जाना जाता है। लिपिड विषमता और बाहरी पत्रक में लॉस/एलपीएस अणुओं की जैव रसायन कोशिका सतह को बाधा गुण प्रदान करता है जो जीवाणु को अपने पर्यावरण6,7में खतरों से बचाता है ।

एलपीएस अणुओं में तीन घटक शामिल हैं: लिपिड ए डिसैचरोलिपिड, कोर ओलिगोसाक्धारी, और ओ-पॉलीसैकराइड या ओ-एंटीजन। लिपिड ए एक गुणा acylated disaccharolipid है। कोर-ओलिगोसैकराइड्स में 10-15 शर्करा होती है जिसे रफ एलपीएस या आर-एलपीएस के नाम से जाना जाता है। कोर को आंतरिक क्षेत्र में विभाजित किया गया है, जो 2-कीटो-3-डिऑक्सी-डी-मैनो-ऑक्टुलोसोनिक एसिड (केडीओ) और एक या अधिक हेपेटोज अवशेषों से बना है, और एक बाहरी क्षेत्र जिसमें आम तौर पर हेक्सोज़ (ग्लूकोज या गैलक्टोज) और हेपेटोस, या एसीटामिडो शर्करा5शामिल हैं। बाहरी कोर क्षेत्र आंतरिक कोर की तुलना में इसके घटकों और संरचना में अधिक परिवर्तनशील है। साल्मोनेला sppमें, केवल एक कोर संरचना का वर्णन किया गया है; हालांकि, एस्चेरिचिया कोलाई में पांच अलग-अलग कोर संरचनाएं (नामित K-12, R1, R2, R3, और R4)8हैं। ई. कोलाई कश्मीर-12 DH5α, जो हम इस प्रक्रिया में उपयोग एक उत्परिवर्तन है कि उत्पादन आर एलपीएस9में परिणाम किया जाता है । आर-एलपीएस अणुओं में ओ-एंटीजन मोईटी की कमी होती है और लॉस अणुओं के समान आणविक वजन होता है ।

आर-एलपीएस के लिए ओ एंटीजन के अलावा चिकनी एलपीएस, या एस एलपीएस में इस अणु बदल जाता है । ओ-एंटीजन छोटे 3-4 कार्बोहाइड्रेट उपइकाइयों से बनाए जाते हैं और इसमें अलग-अलग चेन लम्हों10के साथ कई तौर-तरीके शामिल होते हैं। कुछ एलपीएस उत्पादक बैक्टीरिया, जैसे साल्मोनेला आंत्रिका सेरोवर टाइथिमुरियम(एस। टाइपिमुरिनियम,10,11की सतह पर एलपीएस अणुओं का एक त्रिमंडल वितरण प्रदर्शित करता है। बहुत लंबी श्रृंखला ओ-एंटीजन में एक सौ से अधिक उपइकाइयां हो सकती हैं और एक सौ किलोसे अधिक वजन हो सकती हैं। ओ-एंटीजन जीवाणु को सतह गुण प्रदान करते हैं जो एंटीबायोटिक दवाओं का विरोध करने, बैक्टीरियोफेज द्वारा पर्प्रिशन से बचने और बीमारी का कारण बनने के लिए आवश्यक हैं।

कैम्पिलोबैक्टर, बोर्डेटेला, एसिनेटोबैक्टर, हीमोफिलस, नेसेरिया और अन्य की प्रजातियां12की सतह पर एलपीएस अणुओं के बजाय लॉस अणु उत्पन्न करती हैं । लॉस अणुओं लिपिड ए और कोर ओलिगोसैकराइड्स से मिलकर बनता है लेकिन ओ-एंटीजन की कमी है। इस प्रकार के ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया अपने कोर ओलिगोसैकराइड्स को अतिरिक्त शर्करा और शर्करा के संयोजन के साथ सतह गुणों को बदलने के लिए संशोधित करते हैं12। लॉस और एलपीएस-उत्पादक रोगाणु दोनों लिपिड ए और कोर अणुओं पर फॉस्फेट को सीनिक मोईकेट्स7के साथ प्राप्त करते हैं। इन परिवर्धन में फॉस्फोथेनॉलमाइन, गैलेक्टोसामाइन और अमीनोराबिनोज प्रतिस्थापन शामिल हैं, जो एनीनिक सतह आवेश को बेअसर करके कार्य करते हैं और इस तरह सीनिक एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स से रक्षा करते हैं। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया शर्करा, या अतिरिक्त केडो अणुओं के चर गैर-स्टोइचियोमेट्रिक प्रतिस्थापन के साथ कोर ओलिगोसैक्राइड संरचना को भी संशोधित करते हैं, और लिपिड-ए डिचरोलिपिड्स7पर एसीसाइल चेन की संख्या को बदल देते हैं।

आईएम को ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के ॐ से अलग करने की क्षमता रोगाणुरोधी प्रतिरोध और रोगरोगजनक1111,12में कोशिका लिफाफे की भूमिका को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । इस दृष्टिकोण के व्युत्पन्नका का उपयोग ओम के लिए असेंबली, रखरखाव और प्रोटीन, फॉस्फोलिपिड और ग्लाइकोलिपिड घटकों के तंत्र को कम करने के लिए किया गया है।

हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से ग्राम-नकारात्मक प्रजातियों की एक किस्म में प्रोटीन मध्यस्थता लिपिड विनियमन और लिपिड समारोह का अध्ययन करने के लिए बैक्टीरियल लिपिडोमिक विश्लेषण करती है । प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली मात्रा पतली परत क्रोमेटोग्राफी और तरल क्रोमेटोग्राफी टैंडेमरी13,,14द्वारा गैर-रेडियोलेबल फॉस्फोलिपिड का विश्लेषण करने के लिए इस प्रक्रिया के नियमित उपयोग को दर्शाती है।

प्रोटोकॉल ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के एक ठंडा निलंबन को सुक्रोज के उच्च ओस्मोलर समाधान के लिए उजागर करने और अंतर्निहित पेप्टिडोग्लिकन परत(चित्र ा 1)12से ओम को अलग करने के लिए lysozyme जोड़ने से शुरू होता है । इसके बाद EDTA को lysozyme के प्रवेश की सुविधा के लिए जोड़ा जाता है, क्योंकि डाइवेलेंट cation ज़ब्ती आसन्न लॉस/एलपीएस अणुओं15के बीच पार्श्व इलेक्ट्रोस्टैटिक ब्रिजिंग इंटरैक्शन को बाधित करता है । मूल प्रोटोकॉल जिसमें से हमारा अनुकूलित किया गया है, वह स्पेरोप्लास्ट के गठन की आवश्यकता है, एक ग्राम-नकारात्मक जीवाणु कोशिका रूप जिसमें प्लाज्मा झिल्ली और साइटोसोल शामिल है, लेकिन पेप्टिडोग्लिकन परत और एक ओम का अभाव है। यह संभव है कि गोलाकार अनुकूलित विधि द्वारा उत्पादित किए जाते हैं; हालांकि, तकनीक सफलता के लिए उनके गठन पर भरोसा या इरादा नहीं है। इसके बजाय, lysozyme-EDTA इलाज बैक्टीरिया तेजी से केंद्रीकरण द्वारा काटा जाता है और दबाव lysis से पहले कम एकाग्रता के एक सुक्रोज समाधान में फिर से निलंबित कर दिया जाता है । ओएमएस जो स्पॉरोप्लास्ट बनाकर जारी किया गया हो सकता है, सिद्धांत रूप में इलाज कोशिकाओं के सुपरनेटेंट से कटाई योग्य होना चाहिए, लेकिन यह दृष्टिकोण यहां विस्तृत नहीं है। अंततः, उपचारित कोशिकाओं को पारंपरिक समरूपता और लिसिस के अधीन किया जाता है, जो झिल्ली पृथक्करण प्रक्रिया16की दक्षता और प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है।

लिसिस के बाद, कुल झिल्ली अल्ट्रासेंट्रोफैगेशन द्वारा एकत्र की जाती है और आईएमएस और ओएमएस को आंशिक करने के लिए एक असतत सुक्रोज घनत्व ढाल पर लागू होती है। शास्त्रीय दृष्टिकोण में अधिक निरंतर ढाल का उपयोग किया जाता है जिसमें कम से कम पांच विभिन्न सुक्रोज समाधान होते हैं11,12. हमारे प्रोटोकॉल में असतत ढाल में तीन सुक्रोज समाधान होते हैं और बिलेयरों को दो अलग अंशों में विभाजित किया जाता है17। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के ओएमएस के भीतर लॉस और एलपीएस अणु लिफाफे को एक ऊपरी भूरे रंग के कम घनत्व आईएम अंश और एक कम सफेद उच्च घनत्व ओम अंश(चित्रा 1 और चित्रा 2)में विभाजित करने के लिए ड्राइव करते हैं।

एसिनेटोबैक्टर बौमैनी महत्वपूर्ण मल्टीड्रग प्रतिरोधी मानव रोगजनक हैं जो अपने ओम में लॉस अणुओं का उत्पादन करते हैं और एक कोशिका लिफाफा खड़ा करते हैं जिसे18,19को अलग करना मुश्किल होता है । हाल के कार्य से पता चलता है कि हम यहां मौजूद प्रोटोकॉल के एक व्युत्पन्न का उपयोग इन जीवों के बाइलेयर ों को20के विभाजित करने के लिए किया जा सकता है । इसलिए, हमने ए बौमनी 17978 पर अपने प्रोटोकॉल का परीक्षण किया। प्रारंभ में प्रक्रिया अपर्याप्त थी। हालांकि, हमने मध्य घनत्व समाधान की सुक्रोज एकाग्रता को संशोधित किया और बहुत बेहतर अलगाव(चित्रा 2)। एक NADH dehydrogenase परख और एक लॉस/एलपीएस निष्कर्षण और पता लगाने की प्रक्रिया ए baumannii,जंगली प्रकार एस के लिए जुदाई की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । टाइथिमुरियाम और दो ओ-एंटीजन की कमी आंत्रजीवाणु जीनोटाइप; अर्थात्, गाले-उत्परिवर्ती एस. Typhimurium और एक प्रयोगशाला तनाव, ई. कोलाई DH5α(चित्रा 3 और चित्रा 4)।

इस काम का उद्देश्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की झिल्ली को पुन: उत्पन्न करने के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण की आपूर्ति करना है। प्रोटोकॉल का उपयोग इन रोगाणुओं के लिए कई प्रकार के झिल्ली से जुड़े अणुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. झिल्ली निष्कर्षण के लिए जनरल रिएजेंट्स और मीडिया की तैयारी

  1. बैक्टीरियल ग्रोथ मीडिया: शोरबा मीडिया के 1 एल को अच्छी तरह से साफ और ऑटोक्लेव ्ड 2 एल फ्लास्क में तैयार और स्टरलाइज करें।
  2. जनरल रिस्पेंशन बफर (1 एम ट्रिस बफर पीएच 7.5; 50 मीटर): एच2ओ के 30 मीटर में 6.05 ग्राम ट्रिस बेस को भंग करें। पीएच को 5 एम एचसीएल के साथ 7.5 पर समायोजित करें। अल्ट्राप्यूरी एच2ओ के साथ 50 मीटर तक अंतिम मात्रा समायोजित करें।
  3. डाइवेलेंट के मास्टर स्टॉक (0.5 एम ईटीए पीएच 8; 100 मीटर): एच2ओ के 80 मीटर के लिए डाइसोडियम एथिलीन टेट्रासेटेट2 2 एच2ओ के 18.6 ग्राम जोड़ें जोरदार ढंग से और पीएच को नाह के साथ 8.0 में समायोजित करें। अल्ट्राप्योर एच2ओ के साथ 100 मीटर तक अंतिम मात्रा समायोजित करें।
    नोट: EDTA के डिसोडियम नमक तब तक भंग नहीं होगा जब तक समाधान का पीएच नाओएच के अलावा ~ 8.0 तक समायोजित नहीं हो जाता है।
  4. ओस्मोटिक बफर ए (0.5 एम सुक्रोज, 10 एमएम ट्रिस पीएच 7.5; 1 एल): 171.15 ग्राम सुक्रोज का वजन करें और 1 एल सिलेंडर में स्थानांतरित करें। 1 एम ट्रिस पीएच 7.5 के 10 mL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्राप्योर एच2ओ स्टोर के साथ 1 एल की अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
  5. Lysozyme (10 मिलीग्राम/mL; 5 mL): वजन ५० मिलीग्राम (चिकन अंडा-सफेद) lysozyme और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 mL अल्ट्राप्यूरी एच2ओ स्टोर में भंग ।
  6. पतला डाइवेलेंट ेशन चेलेशन सॉल्यूशन (1.5 एमएम ईटीए; 500 मीटर): 4 डिग्री सेल्सियस पर 497.5 मिलीएम अल्ट्राप्योर एच2ओ स्टोर में 0.5 मीटर ईटीए (स्टेप 1.3) का 1.5 मिलील जोड़ें।
  7. ओस्मोटिक बफर बी (0.2 एम सुक्रोज, 10 एमएम ट्रिस पीएच 7.5; 2 एल): 136.8 ग्राम सुक्रोज का वजन करें और 2 एल सिलेंडर में स्थानांतरित करें। 1 एम Tris पीएच 7.5 के 20 मीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्राप्योर एच2ओ स्टोर के साथ 2 एल करने के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
  8. न्यूकैपलीज सह-कारक (1 एम एमजीसीएल2;10 मिलीएल): अल्ट्राप्यूरी एच2ओ के 8 मिलील में एमजीसीएल2·6एच2ओ के 2.03 ग्राम को भंग करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  9. RNase और DNase एंजाइमों सहित Nuclease समाधान कॉकटेल: सामग्री की तालिकादेखें । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  10. प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल: सामग्री की तालिकादेखें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  11. कम घनत्व वाले आसोपीनिक सुक्रोज ग्रेडिएंट सॉल्यूशन (20% डब्ल्यू/वी सुक्रोज, 1 एमएम ईटीए, 1 एमएम ट्रिस पीएच 7.5 सॉल्यूशन; 100 मिलीआर): 20 ग्राम का वजन करें और 200 मीटर सिलेंडर में स्थानांतरित करें। 1 एम ट्रिस बफर पीएच 7.5 और 0.5 एम EDTA पीएच 8 के 200 माइक्रोन के 100 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर अल्ट्राप्योर एच2ओ स्टोर के साथ 100 मीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
  12. मध्यम घनत्व आसोपीनिक सुक्रोज ग्रेडिएंट सॉल्यूशन (53% डब्ल्यू/वी सुक्रोज, 1 एमएम ईटीए, 1एमएम ट्रिस पीएच 7.5 सॉल्यूशन; 100 मिलीग्राम): 53 ग्राम का वजन करें और 200 मिलीग्राम स्नातक सिलेंडर में स्थानांतरित करें। 1 एम ट्रिस बफर पीएच 7.5 और 0.5 एम EDTA पीएच 8 के 200 माइक्रोन के 100 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर अल्ट्राप्योर एच2ओ स्टोर के साथ 100 मीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
    नोट: सुक्रोज के उच्च प्रतिशत के कारण सटीकता सुनिश्चित करने के लिए स्नातक सिलेंडर में इस समाधान को तैयार करें। एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें और तब तक हिलाएं जब तक कि सुक्रोज समाधान में पूरी तरह से भंग न हो जाए। इस प्रक्रिया में कई घंटे लग सकते हैं।
  13. उच्च घनत्व आसोपीनिक सुक्रोज ग्रेडिएंट सॉल्यूशन (73% डब्ल्यू/वी सुक्रोज, 1 एमएम ईटीए, 1 एमएम ट्रिस पीएच 7.5 सॉल्यूशन; 100 मिलीग्राम): 73 ग्राम का वजन करें और 200 मिलीग्राम स्नातक सिलेंडर में स्थानांतरित करें। 1 एम ट्रिस बफर पीएच 7.5 और 0.5 एम EDTA पीएच 8 के 200 माइक्रोन के 100 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर अल्ट्राप्योर एच2ओ स्टोर के साथ 100 मीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
    नोट: सुक्रोज के उच्च प्रतिशत के कारण सटीकता सुनिश्चित करने के लिए स्नातक सिलेंडर में इस समाधान को तैयार करें। एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें और तब तक हिलाएं जब तक कि सुक्रोज पूरी तरह से भंग न हो जाए। इस प्रक्रिया में कई घंटे लग सकते हैं।
  14. अलग-झिल्ली-भंडारण बफर (10 एम ट्रिस बफर पीएच 7.5; 1 एल): 1 एम ट्रिस बफर पीएच 7.5 का 1 एल एल जोड़ें और अंतिम मात्रा को अल्ट्राप्योर एच2ओ के साथ 1 एल में समायोजित करें।
  15. "-निकोटिनमाइड एडेनाइन डिनुक्लियोटाइड (NADH) (10 मिलीग्राम/mL समाधान): अल्ट्राप्योर एच2ओ में 10 मिलीग्राम NADH को रिसस्पेंड करें ताजा स्टॉक, साप्ताहिक तैयार करें । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  16. फिनॉल समाधान 10 एम ट्रिस एचसीएल, पीएच 8.0, 1 एम एम ईटीए के साथ समानित: सामग्री की तालिकादेखें। समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  17. लिपोपोलिसाक्रिडे जेल दाग किट: सामग्री की तालिकादेखें ।
  18. ब्रैडफोर्ड अभिकर्ता: सामग्री की तालिकादेखें ।
    नोट: सभी समाधान और मीडिया लगातार परिणाम सुनिश्चित करने के लिए परख प्रदर्शन के सप्ताह के भीतर तैयार किया जाना चाहिए ।

2. झिल्ली निष्कर्षण के लिए बैक्टीरिया की तैयारी

  1. ताजा आगर प्लेटों पर जमे हुए ग्लाइसेरोल स्टॉक से बैक्टीरिया लकीर । कालोनियों के विकसित होने के बाद प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। शोरबा मीडिया और संस्कृति बैक्टीरिया के रूप में रातोंरात वांछित से भरा एक 5 mL ट्यूब में एक ही कॉलोनी टीका ।
  2. रातोंरात बैक्टीरियल कल्चर को पसंदीदा शोरबा मीडिया और कल्चर बैक्टीरिया के 1 एल में तब तक पतला करें जब तक वांछित ऑप्टिकल घनत्व हासिल नहीं हो जाता।
    नोट: शोरबा मीडिया के 1 एल में एक बैक्टीरियल कॉलोनी को प्रभावित करने की सिफारिश उत्परिवर्ती जीनोटाइप के लिए की जाती है जो विकास फेनोटाइप को दबाने के लिए प्रवण होते हैं, लेकिन कुछ ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया बस दूसरों की तुलना में धीमे हो जाते हैं। यदि एकल-कॉलोनी टीका द्वारा पर्याप्त संस्कृति घनत्व प्राप्त करना संभव नहीं है, तो मीडिया के 1 एल में एक रात की संस्कृति को पतला करना विकास को सिंक्रोनाइज करने की एक रणनीति है। बैक्टीरियल-झिल्ली संरचना संस्कृति के विकास चरण (logarithmic बनाम स्थिर चरण)13के आधार पर भिन्न होती है। विकास चरण के साथ संस्कृति घनत्व को सहसंबंधित करने के लिए सभी उपभेदों के साथ समय के एक समारोह के रूप में बैक्टीरियल संस्कृतियों के लिए ऑप्टिकल घनत्व में परिवर्तन को मापने के विकास घटता है ।
  3. बर्फ पर शोरबा संस्कृतियों युक्त फ्लास्क सेट करें। 600 एनएम (ओडी600)पर ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें और संस्कृति की मात्रा की गणना करें जो 6.0 और 8.0 x 1011 बैक्टीरियल कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) के बीच है। एस के लिए Typhimurium, यह 0.6-0.8 के बीच की एक ओडी६०० पर संस्कृति के 1 एल से मेल खाती है, के बाद से १.० के एक OD६०० लगभग 1.0x109 cfu/mL के बराबर है । इस मात्रा को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें और यह सुनिश्चित करें कि शेष संस्कृतियां बर्फ पर तब तक रहें जब तक कि उनका उपयोग नहीं किया जाए।
  4. 10 मिन के लिए एक निश्चित कोण उच्च गति अपकेंद्रित्र में 7,000-10,000 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र द्वारा बैक्टीरिया को गोली मार ें।
    नोट: पहले से ठंडा और कम तापमान पर अपकेंद्री बनाए रखें। पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर नमूनों को बनाए रखें।
  5. दशांव और अतिशयोक्ति को सावधानी से त्यागें।
    नोट: यदि झिल्ली के अंश तुरंत निकाले नहीं जा रहे हैं तो गोली को फ्लैश फ्रीज किया जा सकता है और/या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। हालांकि, कोशिकाओं को काटा जाता है, और विशेष रूप से गैर-आंत्रजीवाणु प्रजातियों के लिए विशेष रूप से अनुशंसित है, उसी दिन प्लाज्मोलिसिस के साथ सीधे आगे बढ़ने की सिफारिश की जाती है।

3. बाहरी झिल्ली और प्लाज्मोलिसिस का विच्छेदन

  1. बर्फ पर सेल छर्रों गल अगर पहले-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और प्रक्रिया के शेष के लिए बर्फ पर नमूनों को बनाए रखने । बफर ए के 12.5 mL में अपकेंद्रित्र ट्यूब के भीतर प्रत्येक सेल गोली को फिर से निलंबित करें कोशिकाओं के निलंबन के लिए एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें।
  2. प्रत्येक सेल रिस्पेंशन में 10 मिलीग्राम/एमएल लाइसोजाइम (144 μg/mL की अंतिम एकाग्रता) के 180 माइक्रोन जोड़ें। 2 मिन के लिए सरगर्मी करते हुए नमूनों को बर्फ पर रखें।
  3. प्रत्येक सेल रिस्पेंशन के लिए 1.5 मीटर EDTA समाधान के 12.5 mL जोड़ें और एक अतिरिक्त 7 मिन के लिए बर्फ पर सरगर्मी जारी रखें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 9,000-11,000 x ग्राम पर 50 मीटर शंकुपूर्ण ट्यूब और अपकेंद्रित्र में निलंबन को डिडेंट करें।
  5. सुपरनेटेंट को बायोहैज़र्ड वेस्ट कंटेनर में छोड़ दें और बर्फ पर छर्रों को बनाए रखें।
  6. सेल पैलेट में बफर बी का 25 mL जोड़ें।
  7. 1 एम एमजीसीएल2के 55 माइक्रोन जोड़ें, RNase/DNase nuclease अभिकर्ता के 1 μL (समरूपीकरण से पहले प्लाज्मोलिसिस से गुजर बैक्टीरिया से जुड़े चिपचिपाहट समस्याओं से बचने के लिए), और बफर बी की मात्रा के लिए प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल का 1 μL जो सेल पैलेट के ऊपर बैठता है
  8. बफर बी मिश्रण में गोली को फिर से निलंबित करें। एक समरूप समाधान को देखने तक सख्ती से पाइप और भंवर।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के चरण 4 पर आगे बढ़ने से पहले समरूप समाधान होना बहुत महत्वपूर्ण है। पुनः निलंबित कोशिकाओं में उपस्थिति और स्थिरता जैसे चिपचिपा केक-बल्लेबाज होना चाहिए।
  9. भंवर 15 एस के लिए प्रत्येक नमूना बर्फ पर निलंबन बनाए रखने और 4 कदम के लिए आगे बढ़ना ।

4. दबाव समरूपता और Lysis

नोट: लिसिस के लिए कई तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है। गर्मी की पीढ़ी के कारण सोनिकेशन आदर्श नहीं है। ओस्मोटिक लाइसेस हासिल किया जा सकता है लेकिन अक्सर अक्षम होता है। इसलिए, हम उच्च दबाव वाले लाइसेस की सलाह देते हैं। विभिन्न प्रकार के उपकरणों का उपयोग करके उच्च दबाव वाले प्राप्त किए जा सकते हैं। हम समरूपता मशीनों का सुझाव देते हैं, जैसे फ्रांसीसी प्रेस या एमुसलिफ्लेक्स। हम कई प्रकार के ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के साथ काम करते हैं जिनकी प्रतिक्रिया उच्च ऑस्मोलर सुक्रोज समाधानों के लिए भिन्न होती है। उच्च दबाव समरूपता कदम दक्षता, प्रजनन क्षमता, और उपज में सुधार करता है।

  1. फ्रेंच प्रेस सेल को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रीचिल करें या बर्फ पर होमोजेनेर मशीन से मेटल कॉइल डालें।
  2. नमूना फ्रेंच-प्रेशर सेल या समरूप-नमूना सिलेंडर में डालें और सेल को वांछित समरूपता दबाव के तहत लाएं (10,000 साई फ्रेंच प्रेस या 20,000 साई का उपयोग करते समय पर्याप्त होना चाहिए) ।
  3. एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग करते समय दबाव बनाए रखते हुए आउटलेट प्रवाह दर को प्रति सेकंड लगभग एक बूंद तक समायोजित करें।
  4. बर्फ पर नमूने रखते हुए 50 मीटर शंकु ट्यूब में सेल लाइसेट लीजिए।
  5. पूरी तरह से लाइसिस प्राप्त करने के लिए चरण 4.2-4.4 तीन से पांच बार दोहराएं, आमतौर पर नमूने की पारदर्शिता में क्रमिक वृद्धि से संकेत मिलता है।
    नोट: नमूना कक्ष धोया और नमूनों के बीच में बफर बी के साथ समान किया जाना चाहिए ।
  6. बर्फ पर लिसेस की कोशिकाओं को रखें।

5. कुल झिल्ली आंशिकता

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 डिग्री सेल्सियस के लिए 6,169 x ग्राम पर lysed बैक्टीरियल नमूने को बरकरार कोशिका सामग्री शेष गोली के लिए केंद्रीकृत बैक्टीरियल नमूने। (जैसे, अलिसेस्ड बैक्टीरियल कोशिकाएं)।
  2. अधिनेता के शेष हिस्से को वितरित करें, जिसमें अब समरूप झिल्ली को अल्ट्रासेंट्रोनिफुगेशन के लिए पॉलीकार्बोनेट बोतल में शामिल किया गया है।
    सावधानी: यदि आवश्यक हो, तो बफर बी के साथ पतला करके सेल नमूनों को संतुलित किया जा सकता है।
  3. अल्ट्रासेंट्रिकफ्यूज सेल कम से कम 1 घंटे के लिए 184,500 x ग्राम पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर लिएट करता है। झिल्ली की गुणवत्ता को प्रभावित किए बिना यह कदम रातोंरात किया जा सकता है।
  4. अल्ट्रासेंट्रोफ्यूज ट्यूब में मौजूद शेष सुपरनेटेंट को त्यागें और बर्फ पर झिल्ली छर्रों को बनाए रखें(चित्रा 1)।
  5. कांच-ड्टॉल होमोजेनाइजर का उपयोग करके कम घनत्व वाले आसोपीनिक-सुक्रोज ग्रेडिएंट समाधान के 1 mL में झिल्ली छर्रों को फिर से निलंबित करें। नमूना समरूप को 1.5 मीटर माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने और बर्फ पर बनाए रखने के लिए ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: यदि केवल कुल झिल्ली संरचना विश्लेषण वांछित है, तो अलग-अलग झिल्ली भंडारण बफर के 1 मिलील के लिए कम घनत्व वाले आसोपीनिक-सुक्रोज ग्रेडिएंट समाधान का स्थानापन्न 1 mL। चरण 5.5 अलगाव का अंतिम बिंदु है यदि केवल कुल बैक्टीरियल झिल्ली नमूने वांछित हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें जब तक कि आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की आवश्यकता न हो।

6. दोहरी झिल्ली को अलग करने के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंटरिफुगेशन

  1. झूलते बाल्टी रोटर और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज के लिए निर्दिष्ट 13 मिलीएल पॉलीप्रोपाइलीन या अल्ट्रा-क्लियर ओपन-टॉप ट्यूबों की उचित संख्या इकट्ठा करें।
  2. ट्यूब को थोड़ी झुकी हुई स्थिति में रखें और धीरे-धीरे उच्च घनत्व से कम घनत्व के लिए सक्रोज समाधान जोड़कर सुक्रोज ढाल तैयार करें:
    73% w/v सुक्रोज, 1 एमएम ईटीए, 1 एमएम ट्रिस पीएच 7.5 का 2 एमएल
    53% w/v सुक्रोज, 1 एमएम ईटीए, 1 एमएम ट्रिस पीएच 7.5 का 4 एमएल
    1. इसके बाद, कुल झिल्ली अंश (1 mL), जो 20% w/v सुक्रोज समाधान (चरण ५.५) में फिर से निलंबित कर दिया गया है जोड़ें । इसके नीचे स्थित सुक्रोज समाधान के साथ झिल्ली अंश को मिलाने से बचें। इन परतों में से प्रत्येक के बीच विभाजन दिखाई देना चाहिए ।
    2. अंत में, ट्यूब को कम घनत्व वाले आइसोपीनिक-सुक्रोज ग्रेडिएंट सॉल्यूशन (लगभग 6 mL) से भरें। ट्यूब समर्थन के लिए पॉलीप्रोपाइलीन और अल्ट्रा-क्लियर ओपन-टॉप ट्यूबको यथासंभव पूर्ण (ट्यूब टॉप से 2 या 3 मिमी) भरा जाना चाहिए।
  3. एसिनेटोबैक्टर बौमैनी के लिए समायोजन 17978
    1. विभिन्न जीवाणु नमूनों के साथ उपयोग के लिए एक समायोजित सुक्रोज ढाल अनुकूलित करें। ए baumannii केलिए, निम्नलिखित सुक्रोज ढाल झिल्ली(चित्रा 2)के अधिक पूर्ण जुदाई वहन किया ।
      73% w/v सुक्रोज, 1 एमएम ईटीए, 1 एमएम ट्रिस पीएच 7.5 का 2 एमएल
      4 एमएल 45% w/v सुक्रोज, 1 एमएम ईटीए, 1 एमएम ट्रिस पीएच 7.5
    2. इसके बाद, कुल झिल्ली अंश (1 mL), जो 20% w/v सुक्रोज समाधान (चरण ५.५) में फिर से निलंबित कर दिया गया है जोड़ें । इसके नीचे स्थित सुक्रोज समाधान के साथ झिल्ली अंश को मिलाने से बचें। इन परतों में से प्रत्येक के बीच विभाजन दिखाई देना चाहिए ।
    3. अंत में, ट्यूब को कम घनत्व वाले आसोपिनिक-सुक्रोज ग्रेडिएंट सॉल्यूशन (लगभग 6 mL) से भरें। ट्यूब समर्थन के लिए पॉलीप्रोपाइलीन और अल्ट्रा-क्लियर ओपन-टॉप ट्यूबको यथासंभव पूर्ण (ट्यूब टॉप से 2 या 3 मिमी) भरा जाना चाहिए।
  4. अल्ट्रासेंट्रिकफ्यूज नमूनों को 288,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झूल-बाल्टी रोटर का उपयोग कर रात भर।
    नोट: पिछले चरणों में उपयोग की जाने वाली मात्राओं के लिए, हम 16 एच और 23 घंटे के बीच केंद्रीकरण समय की सलाह देते हैं।
  5. बिंदु से 5 मिमी के बारे में एक P1000 पिपेट टिप के अंत में कटौती करें। पिपेट का उपयोग करके ऊपरी-भूरे रंग की आईएम परत निकालें। अल्ट्रासेंट्रोइफिगेनेशन के लिए आईएम अंश को पॉलीकार्बोनेट बोतल में स्थानांतरित करें।
  6. 53-73% इंटरफ़ेस के ऊपर सुक्रोज समाधान के लगभग 2 मिलील को छोड़ दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि निचले सफेद ओम आईएम अंश से दूषित पार नहीं है। ओम अंश(चित्रा 1)के लिए चरण 6.4 से पाइपिंग प्रक्रिया दोहराएं।
    नोट: झिल्ली को सुई का उपयोग करके नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूबों को पंचर करके और झिल्ली को अंशों के रूप में इकट्ठा करके भी एकत्र किया जा सकता है।
  7. अल्ट्रासेंट्रोफ्यूज ट्यूब के शेष शून्य को अलग-अलग झिल्ली भंडारण बफर के साथ भरें और उलटा या पाइपटिंग द्वारा मिलाएं। बर्फ पर नमूनों को बनाए रखें।
  8. 1 घंटे और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 184,500 x ग्राम पर अल्ट्रासेंटरिफ्यूजेशन द्वारा अब धोए गए और अलग झिल्ली को एकत्र करें।
  9. अधिनेता को त्यागें और झिल्ली को धो-समरूपता द्वारा फिर से निलंबित करें। स्टोरेज बफर के 500-1000 माइक्रोन जोड़ें। 2 mL माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में नमूने लीजिए।
  10. बैक्टीरियल झिल्ली के नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. बिलेयर के अलग होने की पुष्टि

नोट: तकनीकी त्रुटि या कुछ प्रजातियों की अद्वितीय सेल लिफाफा संरचना के कारण bilayers का अधूरा पृथक्करण हो सकता है। अलगाव की पुष्टि करने के लिए, हम bilayers के बीच पार संदूषण की डिग्री की मात्रा निर्धारित करने के लिए दो स्वतंत्र परख का उपयोग करने की सलाह देते हैं । पहली परख NADH dehydrogenase की एंजाइमैटिक गतिविधि का पता लगाता है, जो आईएम में विशेष रूप से मौजूद है। दूसरा परख लॉस या एलपीएस की उपस्थिति का पता लगाता है, जो मुख्य रूप से ओम में मौजूद है ।

  1. इस बात की पुष्टि करते हुए कि ओएमएस आईएमएस से अलग-थलग हैं
    1. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रत्येक अलग झिल्ली अंश में प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
    2. एक खाली 2 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब के लिए प्रोटीन के 50 और 500 μg के बीच के लिए इसी नमूने की मात्रा जोड़ें। प्रजातियों के आधार पर एकाग्रता भिन्न होगी, लेकिन 50 μg आमतौर पर एंटेरोबैक्टीरिया के लिए पर्याप्त है। 990 माइक्रोन की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए 10 एमएम ट्रिस-बफर की उचित मात्रा जोड़ें। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के लिए सामग्री को एक क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
    3. नमूने में NADH के 10 मिलीग्राम/mL समाधान के 10 माइक्रोन जोड़ें और ३४० एनएम पर प्रारंभिक अवशोषण को मापने ।
    4. 5 मिन के लिए हर 30 एस अवशोष को मापने जारी रखें।
    5. डेटा संकलित करें और प्रत्येक झिल्ली अंश(चित्रा 3)के लिए समय (एक्स-एक्सिस) में परिवर्तन बनाम अवशोषक (वाई-एक्सिस) में परिवर्तन को संकलित करें।
  2. इस बात की पुष्टि करते हुए कि आईएमएस ओएमएस से अलग-थलग हैं
    1. एक खाली 2 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब के लिए प्रोटीन के 50 और 500 μg के बीच के लिए इसी नमूने की मात्रा जोड़ें। बैक्टीरियल प्रजातियों के आधार पर एकाग्रता भिन्न होगी, लेकिन 50 μg आमतौर पर एंटेरोबैक्टीरिया के लिए पर्याप्त है। फॉस्फेट बफर्ड खारा के साथ 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा भरें, जिसे इसके बाद जलीय चरण के रूप में जाना जाता है।
    2. जलीय चरण में प्रोटीनेस के 5 माइक्रोन जोड़ें (स्टॉक 800 यू/एमएल) और रात भर 59 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. 68 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए ट्रिस-सैचुरेटेड फिनॉल का 10 मिलीएल एलिकोट गर्म करें।
    4. जलीय चरण के नमूनों को स्पिन करें जिनका प्रोटीनेस कश्मीर के साथ इलाज किया गया था और जलीय चरण के साथ 1:1 अनुपात में "गर्म" ट्रिस-सैचुरेटेड फिनॉल जोड़ें, भंवर तेजी से और 10 मीटर के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    5. अब दूधिया-सफेद नमूनों को 68 डिग्री सेल्सियस से बर्फ-पानी स्नान और 10 किमी के लिए इनक्यूबेट में स्थानांतरित करें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 2,100 x ग्राम पर नमूने सेंट्रलाइज।
    7. ऊपरी जलीय चरण को एक नई ट्यूब पर स्थानांतरित करें और ट्यूब को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें यदि नमूने का तुरंत उपयोग नहीं किया जाना है।
    8. एसडीएस-लोडिंग बफर में नमूनों को पतला करें और 4-20% ट्रिस-ग्लाइसिन ग्रेडिएंट जेल के कुओं को लोड करें।
    9. 45 मिन के लिए इलेक्ट्रोफोरीज़ या जब तक रंग-सामने जेल के तल पर है।
    10. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एलपीएस धुंधला किट का उपयोग करके जेल को दाग दें।

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Representative Results

यह तकनीक ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए आईएमएस और ओएमएस को अलग-थलग करने का एक प्रभावी साधन प्रदान करती है। पूरी प्रक्रिया की एक रूपरेखा सचित्र है(चित्रा 1)। सामान्य तौर पर, मीडिया के 1 एल में 0.6-0.8 के ओडी600 में संस्कृतियों का सामान्यीकरण, या 6.0 और 8.0 x 1011 जीवाणु कोशिकाओं के बीच कटाई यह सुनिश्चित करेगी कि बाद में अलगाव के लिए झिल्ली सामग्री की उचित मात्रा एकत्र की जाती है।

बैक्टीरिया को ले जाने और lysate अल्ट्रासेंटिफ्यूज करने पर, अल्ट्रासेंट्रोफ्यूज ट्यूब के नीचे एक चिपचिपा भूरा कुल झिल्ली गोली दिखाई देगी। स्क्रैपिंग, ड्रोग-समरूपता, और असंतुलित सुक्रोज घनत्व ढाल पर झिल्ली को अल्ट्रासेंट्रोइंग करने के बाद, आईएम और ओम को चित्रित(चित्र ित 2)के रूप में अलग किया जाना चाहिए। हमने पाया कि 20%/53%/73% (w/v) सुक्रोज-घनत्व ढाल ए baumanniiके लिफाफे विभाजन के लिए अपर्याप्त था, जबकि एक 20%/45% /73% w/v ढाल पर्याप्त था45%(चित्रा 2)।

प्रत्येक झिल्ली अंश की गुणवत्ता और शुद्धता का आकलन करने के लिए विभिन्न विश्लेषणात्मक तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। NADH-dehydrogenase एक आंतरिक झिल्ली एंजाइम है जो नाद(चित्रा 3)के लिए NADH ऑक्सीकरण को उत्प्रेरक करता है। इसके सेलुलर स्थानीयकरण को देखते हुए, इसका उपयोग आईएमएस और ओएमएस के बीच क्रॉस संदूषण निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। दोनों अणुओं के अवशोषण स्पेक्ट्रा के अनुसार, एनएडी और NADH प्रत्येक में 260 एनएम पर एक चोटी का अवशोषण होता है, जबकि केवल NADH में अधिकतम 340 एनएम पर अवशोषण होता है। इस प्रकार, 340 एनएम पर अवशोषण में कमी नाद से एनएडी के ऑक्सीकरण का संकेत होगी और इसलिए नमूने में एंजाइम की उपस्थिति होगी। यदि झिल्ली ठीक से अलग होती है, तो अवशोषण में यह परिवर्तन केवल आईएम नमूनों(चित्रा 3)में होना चाहिए। ओम के नमूनों में अवशोषण में कमी आईएम सामग्रियों के साथ क्रॉस संदूषण का संकेत देगी। ए baumanniiके लिए, झिल्ली की मात्रा से तीन गुना, या प्रोटीन समकक्ष के 150 μg, क्या एंटेरोबैक्टीरियल उपभेदों के लिए मापा गया था के लिए NADH dehydrogenase गतिविधि के समान स्तर को प्रदर्शित करने की जरूरत थी(चित्रा 3)। इसलिए, यह संभव है कि ए बौमनी के लिए NADH ऑक्सीडेस का स्तर कम हो या एंजाइम की विशिष्ट गतिविधि कम हो जाए।

ओम का बाहरी पत्रक मुख्य रूप से लॉस या एलपीएस अणुओं से बना होता है। इसलिए, एलपीएस के अंशों की तुलना में एमएएम में इन संरचनाओं के संवर्धन को प्रतिबिंबित करेगा। लॉस और एलपीएस अणुओं का संश्लेषण साइटोप्लाज्म में शुरू होता है और आईएम5की सतह पर पूरा होता है । लॉस और एलपीएस संरचनाओं को एकदिशात्मक रूप से ओम तक ले जाया जाता है और बाहरी पत्रक में डाला जाता है। चूंकि बायोसिंथेसिस में आईएम के अग्रदूत लगाव शामिल हैं, इसलिए आईएम अंशों के लिए हमेशा एक बेहोश बैंडिंग पैटर्न मनाया जाता है। हालांकि, एलओएस/एलपीएस संरचनाओं(चित्रा 4)के संवर्धन के कारण ओम अंश में अणुओं की तीव्रता आईएम अंश की तुलना में बहुत अधिक है। प्राप्त झिल्ली की मात्रा निलंबन में प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करके मापा गया था। आंत्र जीवों(चित्रा 4)से एलपीएस अणुओं का पता लगाने के लिए आवश्यक राशि की तुलना में ए बौमनी से लॉस को निकालने और उनका पता लगाने के लिए झिल्ली की मात्रा छह गुना आवश्यक थी। हम कारण है कि यह प्रोटीन के स्तर की तुलना में इन जीवों के लिए ओम में लॉस अणुओं के एक कम स्तर को प्रतिबिंबित हो सकता है, लेकिन विस्तार से इस परिकल्पना का पीछा नहीं किया है ।

Figure 1
चित्रा 1: इस विधियों के लेख में वर्णित ग्राम-नकारात्मक जीवाणु झिल्ली अलगाव प्रक्रिया का चित्रण करने वाला एक योजनाबद्ध। दिखाया गया है कि बैक्टीरियल कोशिकाओं को इकट्ठा करने और कुल, आंतरिक (आईएम), और बाहरी झिल्ली (ओम) को अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया है। यह दृष्टिकोण आईएम बाइलेयर के घनत्व की तुलना में इन रोगाणुओं के लिए ओम बाइलेयर के बढ़ते घनत्व पर निर्भर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न ग्राम-नकारात्मक प्रजातियों के लिए प्रतिनिधि परिणाम जिनकी झिल्ली मानक और संशोधित सुक्रोज घनत्व ढाल का उपयोग करके अलग-थलग थीं। असतत सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट्स की छवियां आइसोपीनिक सेंटीरिफैगेशन(ए)जंगली प्रकार के साल्मोनेला आंत्रिका सेवर टाइथिमुरियम 14028s,(बी) गैले-उत्परिवर्तीएस के लिए आइसोपीनिक सेंटीरिफ्यूजेशन पोस्ट करती हैं। टाइथिमुरियम एलटी2, जो एलपीएस अणुओं का उत्पादन करता है जो ओ-एंटीजन से रहित हैं, और(सी) एस्चेरिचिया कोलाई K-12 DH5α, जो एलपीएस अणुओं का भी उत्पादन करता है जिसमें ओ-एंटीजन की कमी है । आंतरिक झिल्ली (आईएम) बाहरी झिल्ली (ओम) से अलग होती है और भूरे रंग की सामग्री के रूप में 20-53% सुक्रोज इंटरफेस में स्थानीयकृत होती है। सफेद ओम परत इस अंश के उच्च घनत्व के कारण 53-73% सुक्रोज इंटरफेस के लिए स्थानीयकृत करती है। (D)जंगली प्रकार के एसिनेटोबैक्टर बौमानी 17978 की कुल झिल्ली 20%/53%/73% (w/v) सुक्रोज ढाल,(ई)का उपयोग करके अलग नहीं हुई, लेकिन 20%/45%/73% (w/v) सुक्रोज ढाल का उपयोग करके अलग किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: बाहरी झिल्ली (ओम) शुद्धता का परीक्षण करने के लिए NADH dehydrogenase परख के लिए प्रतिनिधि परिणाम। एंजाइम, NADH-dehydrogenase की उपस्थिति, इनर (आईएम) और ओम नमूनों में परीक्षण के लिए जुदाई की दक्षता का परीक्षण किया गया । (A)नाद से एनएडी के ऑक्सीकरण को बैक्टीरियल आईएम में स्थित एंजाइम द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है । प्रतिक्रिया सब्सट्रेट (NADH) में 340 एनएम पर अधिकतम अवशोषण होता है; इसलिए, इस तरंगदैर्ध्य में ऑप्टिकल घनत्व में कमी नमूने में एंजाइम की उपस्थिति का संकेत है। आईएमएस और ओएमएस(बी)वाइल्ड टाइप एस के लिए मापा गया था । Typhimurium,(सी) ई. कोलाई कश्मीर-12 DH5α और(डी) gale-उत्परिवर्ती एस। टाइथिमुरियम। इन झिल्ली को 20%/53%/73% w/v सुक्रोज के आसोपिनिक सुक्रोज घनत्व ढाल का उपयोग करके अलग किया गया था । ए baumanniiके लिए, झिल्ली 20%/45%/73% w/v सुक्रोज के एक ढाल का उपयोग कर अलग थे । झिल्ली की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए NADH परखEएंटेरोबैक्टीरियल जीवों के लिए 50 μg और(एफ)ए baumanniiके लिए कुल प्रोटीन के 150 μg का उपयोग किया गया था। प्रोटीन की एक उच्च एकाग्रता(एफ)में जोड़ा गया था, क्योंकि वक्र के लिए(ई)ने सुझाव दिया कि कुल प्रोटीन की तुलना में NADH dehydrogenase के सापेक्ष स्तर एस के लिए की तुलना में ए baumannii के लिए कम थे । टाइथिमुरियम और ई. कोलाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आंतरिक झिल्ली (आईएम) शुद्धता का परीक्षण करने के लिए एलपीएस और लॉस निष्कर्षण और दृश्य प्रक्रिया के लिए प्रतिनिधि परिणाम। कुल प्रोटीन के 50 μg के अनुरूप झिल्ली के नमूने की मात्रा का उपयोग एस के आईएम और बाहरी झिल्ली (ओएम) से एलपीएस निकालने के लिए किया गया था। टाइथिमुरियम और ई कोलाई DH5-अल्फा। कुल प्रोटीन के 300 μg के अनुरूप झिल्ली के नमूने की मात्रा का उपयोग ए बौमनी की झिल्ली से एलपीएस निकालने के लिए किया गया था। वॉल्यूम को एंडोटॉक्सिन-फ्री वॉटर के साथ 100 माइक्रोन तक सामान्य किया गया और प्रोटीनेस के साथ इलाज किया गया। एलपीएस या लॉस को गर्म-फिनॉल निष्कर्षण (1:1 पानी: फिनॉल) और 21 माइक्रोन के अर्क द्वारा 4-20% ढाल पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर लोड किया गया था और ओएम सामग्रियों के साथ आईएम अंशों के क्रॉस संदूषण का आकलन करने के लिए प्रो-क्यू पन्ना 300 धुंधला द्वारा कल्पना की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह विधि बैक्टीरियल फिजियोलॉजी और रोगजनन में सेल लिफाफे की भूमिका को समझने में शोधकर्ताओं की सहायता जारी रखेगी। अनुक्रमिक अल्ट्रासेंट्रोइफिज़न के बाद एक शुद्ध कुल, आंतरिक और ओम अंश प्राप्त किया जा सकता है। इन झिल्ली को झिल्ली प्रोटीन स्थानीयकरण और कार्य, परिशोधन में परिवहन और तस्करी, और विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में व्यक्तिगत बाइलेयर की संरचना से संबंधित परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए अलगाव में परायोजन किया जा सकता है। रोगजनन में व्यक्तिगत ओम घटकों की भागीदारी की खोज करने वाले जैविक अध्ययन, ऐसे लॉस/एलपीएस और ओम प्रोटीन, इस तकनीक द्वारा एकत्र किए गए अलग झिल्ली अंशों का उपयोग करके पशु और सेलुलर मॉडलों में भी आयोजित किए जा सकते हैं ।

हमारी प्रक्रिया को एंटेरोबैक्टीरिया, विशेष रूप से एस के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। टाइथिमुरियम, जो एलपीएस अणुओं का उत्पादन करता है जिसमें चर श्रृंखला लंबाई के ओ-एंटीजन होते हैं। यह प्रोटोकॉल मॉडल जीवाणु, ई कोलाई के-12 के लिए भी काम करता है, जिसने ओ-एंटीजन को संश्लेषित करने की आनुवंशिक क्षमता खो दी है। जंगली प्रकार और ओ एंटीजन कमी एस का उपयोग करना। टाइथिमुरियम 14028s और ई कोलाई के-12 स्ट्रेन DH5α, हम बताते हैं कि इन रोगाणुओं के लिए झिल्ली को अलग करने की क्षमता ओ-एंटीजन की उपस्थिति से काफी प्रभावित नहीं होती है। हालांकि, लॉस उत्पादक जीवाणु, ए baumannii 17978 के लिफाफे को अलग करने के लिए, हमें बिलेयर(चित्रा 2)को अलग करने के लिए असतत ढाल में मध्य घनत्व सुक्रोज समाधान की एकाग्रता को कम करना पड़ा। विशेष रूप से, मध्य-घनत्व समाधान की एकाग्रता को 53 से 45% तक स्थानांतरित करना ओम को अनुकूलित ढाल में 45-73% इंटरफ़ेस में विभाजित करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त था। ए baumanniiके लिए 53-73% ढाल का उपयोग करते समय, ओम सामग्री का बहुमत अक्सर 20-53% इंटरफेस(चित्रा 2)पर आईएम अंश से थोड़ा नीचे देखा जाता था। विरल ओम सामग्री ए baumanniiके लिए 53-73% इंटरफेस पर मौजूद था । इन परिणामों ने सुझाव दिया कि इन शर्तों के तहत ए बौमनी के बाइलेयर को अलग करने के लिए 20%/53%/73% ढाल अपर्याप्त है ।

संक्षेप में, विभिन्न ओम-ग्लाइकोलिपिड सामग्री और स्तर वाले जीवों को समायोजित करने के लिए घनत्व ढाल में समायोजन किया जा सकता है, और दृष्टिकोण को अन्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं ।

Acknowledgments

इस काम को पी 20GM10344 और R01AI139248 द्वारा जेड डी डेलब्रोक्स को सम्मानित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 - IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma - Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

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References

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Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).

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