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Immunology and Infection

アシネトバクターバウマンニの技術的調整によるグラム陰性細菌の細胞エンベロープの内膜および外膜分画への分離

doi: 10.3791/60517 Published: April 10, 2020
* These authors contributed equally

Summary

グラム陰性細菌は、2つの空間的に分離された膜を生成する。外膜は、内膜から、ペリプラズムとペプチドグリカン層によって分割される。これらの微生物の二重二重層を単離する能力は、その生理学と病因を理解するために重要であった。

Abstract

この方法は、グラム陰性細菌のエンベロープを総、内膜、および外膜(OM)分数に分割することによって機能し、二重層の純度を評価するためのアッセイで終了する。OMは、内膜に比べて全体的な密度が増加しており、主に外縁葉内にリプーリゴ糖(LOS)およびリポ多糖類(LPS)が存在するためである。LOSとLPS分子は、脂質-A二糖脂質とコアオリゴ糖置換基からなる類似の構造を有する両生性糖脂質である。しかし、LPS分子だけがO-多糖、またはO抗原として知られている第三のサブユニットで修飾されています。存在する糖脂質の種類と量は、生物のOM密度に影響を与えます。そこで、多様な糖脂質含量を有する細菌の膜が、我々の技術を用いて同様に単離できるかどうかを試験した。LPS産生生物のサルモネラ・エンテロニカ・チフィムリウムおよび大腸菌の場合、膜は容易に単離され、LPS O抗原部分は二重層の分割に影響を与えなかった。アシネトバクターバウマンニは、O抗原欠損LPS分子と同様の質量を有するLOS分子を産生する。しかし、これらの微生物の膜は最初は分離できませんでした。我々は、A.バウマンニのOMは腸内細菌科のOMよりも密度が低いと推論したので、スクロース勾配を調整し、膜を単離した。したがって、この技術は、他の生物と一緒に使用するために適応および変更することができる。

Introduction

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グラム陰性菌は、周膜空間とペプチドグリカン細胞壁1によって分離された2つの膜を産生する。内膜(IM)は、細胞質ゾルを包み込み、リン脂質の対称的な二重層である。ペプチドグリカンは、ターゴール圧から保護し、細胞形状を有する細菌を提供し、そしてリポタンパク質22、33によって外膜(OM)に付着している。OM は周辺を取り囲み、主に非対称です。内側のリーフレットはリン脂質から成り、外葉はリプーリゴ糖(LOS)またはリポ多糖類(LPS)4,5として知られる糖脂質からなる。4,5外リーフレット中のLOS/LPS分子の脂質非対称性および生化学は、その環境における危険から細菌を保護する細胞表面に対するバリア性を与える66,7。

LPS分子は、脂質A二糖脂質、コアオリゴ糖、およびO-多糖類またはO抗原の3つの構成成分で構成されています。脂質Aは、増殖アシル化二糖分脂質である。コアオリゴ糖は、ラフLPSまたはR-LPSとして知られている10〜15の糖で構成されています。コアは、内領域に細分化され、2-ケト-3-デオキシ-D-マンノ-オクチュロソニック酸(kdo)および1つ以上のヘプトーゼ残基と、ヘキソス(グルコースまたはガラクトース)およびヘプトーゼ、またはアセタミド糖からなる外側領域から構成される。外側のコア領域は、内部コアよりもコンポーネントと構造の中で変数が多くなります。サルモネラ属のspp.では、1つのコア構造のみが記載されている。しかし、大腸菌には5つの異なるコア構造(K-12、R1、R2、R3、およびR4)があります。腸菌K-12 DH5αは、この手順で使用し、生産R-LPS9をもたらす突然変異を運ぶ。R-LPS分子はO抗原部分を欠き、LOS分子と同様の分子量を有する。

R-LPSにO抗原を加えて、この分子は滑らかなLPS、またはS-LPSに変わります。O抗原は短い3-4炭水化物サブユニットから構築され、様々な鎖の長さを持つ複数のモダリティで構成されています10.いくつかの LPS 産生細菌,サルモネラ腸内細菌セロバー ティフィムリウム (S.チフィムリウム)は、その表面10,11にLPS分子の三様分布11表示する。非常に長い鎖O-抗原は100個以上のサブユニットを含み、100キロダルトン以上の重量を量ることができる。O抗原は、抗生物質に抵抗し、バクテリオファージによる食前を回避し、病気を引き起こすのに必要な細菌に表面特性を提供する。

カンピロバクターの種は、ボルデテラアシネトバクターヘモフィルスネイセリア等が、その表面12にLPS分子の代わりにLOS分子を生成する。LOS分子は、脂質Aとコアオリゴ糖で構成されていますが、O抗原は欠いています。グラム陰性細菌のこれらのタイプは、表面特性を変更するために、追加の糖と糖の組み合わせでそれらのコアオリゴ糖を変更します12.LOSとLPS産生微生物の両方が、カチオン部分7で脂質Aとコア分子のリン酸塩を誘導体化する。これらの添加物には、ホスホエタノールアミン、ガラクトサミンおよびアミノアラビノース置換が含まれ、アニオン性表面電荷を中和し、それによってカチオン性抗菌ペプチドから保護することによって機能する。グラム陰性細菌はまた、糖の可変的な非ストキシオメトリック置換、または余分なkdo分子を用いてコアオリゴ糖構造を修飾し、脂質A二糖鎖にアシル鎖の数を変える7。

グラム陰性細菌のOMからIMを単離する能力は、抗菌性および疾患病態の病態の細胞エンベロープの役割を理解するのに役立った11,12。11,このアプローチの導出は、OMのタンパク質、リン脂質、および糖脂質成分の組み立て、維持、およびリモデリングのメカニズムを推測するために使用されてきました。

当社の研究室では、細菌性リピドミック解析を日常的に行い、様々なグラム陰性種におけるタンパク質媒介脂質調節と脂質機能を研究しています。プロトコルで使用される体積は、薄層クロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィータンデム質量分析13,14による非放射性標識リン脂質を分析するためのこの手順の日常的な使用を反映13している

このプロトコルは、グラム陰性細菌の冷やされた懸濁液をスクロースの高い浸透膜溶液に曝露し、基底のペプチドグリカン層からOMを解離するためにリソザイムを加えることによって始まる(図1)12。EDTAは、次いでリゾチームの浸透を促進するために添加され、二価カチオンの隔離は隣接するLOS/LPS分子15間の横静電橋合動を破壊するので。私たちの適応された元のプロトコルは、球形膜とサイトゾルで構成されるグラム陰性細菌細胞形態である球体の形成を必要としましたが、ペプチドグリカン層とOMを欠いています。球状体は適合した方法で作り出される可能性があります。しかし、この技術は成功のために彼らの形成に依存したり、意図していません。代わりに、リソチームEDTA処理細菌は遠心分離によって急速に収穫され、加圧溶解の前にスクロース溶液中でより少ない濃度で再懸濁される。球形突体を形成して放出された可能性のあるOEMは、理論的には、処理された細胞の上清から収穫可能であるべきであるが、このアプローチは本明細書では詳述されていない。最終的に、処理された細胞は、従来の均質化および溶解に供され、膜分離手順16の効率および再現性を高める。

リシスの後、全膜は超遠心分離によって収集され、不連続なスクロース密度勾配に適用され、DMおよびOEMを分画する。古典的なアプローチは、少なくとも5つの異なるショ糖溶液11、12,12で構成される、より連続的なグラデーションを使用します。プロトコルの不連続勾配は、3つのスクロース溶液で構成され、二重層を2つの異なる分数17に分割します。グラム陰性細菌のOEM内のLOSおよびLPS分子は、エンベロープを駆動して上部茶色の低密度IM画分と下白高密度OM分率に分割する(図1および図2)。

アシネトバクターバウマンニーは、そのOMでLOS分子を産生し、18、19,19を分離することが困難である細胞エンベロープを建てる重要な多剤耐性ヒト病原体である。最近の研究は、我々がここで提示するプロトコルの派生は、これらの生物20の二重層を分割するために使用することができることを示唆している。したがって、我々はA.バウマンニ17978で私たちのプロトコルをテストしました。当初、手順は不十分でした。しかし、中密度溶液のスクロース濃度を大幅に改善し、分離を大幅に改善した(図2)。NADHデヒドロゲナーゼアッセイとLOS/LPS抽出および検出手順を使用して、野生型SであるA.バウマンニの分離を確認した腸炎と2つのO抗原欠損腸菌遺伝子型;すなわち、galE-変異体S.腸炎と実験室株,大腸菌DH5α(図3および図4)。

この研究の目的は、グラム陰性細菌の膜を再現的に単離するための合理化されたアプローチを提供することです。プロトコルは、これらの微生物のための膜関連分子の多くのタイプを研究するために使用することができます。

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Protocol

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1. 膜抽出のための一般的な試薬とメディアの調製

  1. 細菌増殖培地:完全に洗浄され、2 Lフラスコをオートクレーブにした1Lのスープ培地を調製し、殺菌します。
  2. 一般リサスペンションバッファ(1 MトリスバッファpH 7.5;50 mL):H2 Oの30 mLでトリス2ベースの6.05 gを溶解し、5M HClでpHを7.5に調整し、超純粋なH2Oで50 mLに最終体積を調整します。
  3. 二価カチオンキレート溶液のマスターストック(0.5 M EDTA pH 8;100 mL):18.6 gのエチレンテトラ酢酸二ナトリウムを加え、H 2 Oの80 mLに2H2Oを加え、NaOHでpHを8.0に調整します。超純粋なH2Oで100 mLに最終容積を調節します。
    注:EDTAの二ナトリウム塩は、NaOHを添加することによって溶液のpHが〜8.0に調整されるまで溶解しない。
  4. 浸透バッファーA(0.5 Mショ糖、10 mMトリスpH 7.5;1 L):171.15 gのショ糖を計量し、1 Lシリンダに移します。1 M トリス pH 7.5 の 10 mL を追加します。4 °Cで超純粋なH2O.ストアで1 Lの最終容積に合わせて調整します。
  5. リゾチーム(10mg/mL;5 mL):50mgの(鶏卵白)リゾチームの重量を量り、4°Cで5mL超純粋H2O.ストアに溶解する。
  6. 希釈二価カチエーションキレート溶液(1.5 mM EDTA;500 mL):0.5 M EDTA(ステップ1.3)の1.5 mLを4°Cで497.5 mL超純粋H2O.ストアに加えます。
  7. 浸透バッファー B (0.2 M スクロース, 10 mM トリス pH 7.5; 2 L): 136.8 gのスクロースを重量を量り、2 L シリンダに移します。1 M トリス pH 7.5 の 20 mL を追加します。4 °Cで超純粋なH2O.ストアで2 Lに最終容積を調整します。
  8. ヌクレアーゼ共因子(1 M MgCl2;10mL):MgCl 2·6H2Oの2.03 gを8mLの超純粋H2Oで溶解し、体積を10mLに調整します。2室温で保管してください。
  9. RNaseおよびDNase酵素を含むヌクレアーゼ溶液カクテル:材料表を参照してください。-20°Cで保管してください。
  10. プロテアーゼ阻害剤カクテル:材料表を参照してください。4 °Cで保管。
  11. 低密度イソピクニックショ糖勾配溶液(20%w/vショ糖、1 mM EDTA、1 mM Tris pH 7.5溶液;100 mL):20gのショ糖を重量を量り、200 mLシリンダーに移す。1 M トリス バッファ pH 7.5 の 100 μL と 0.5 M EDTA pH 8 の 200 μL を加えます。超純粋なH2Oストアで最終体積を100 mLに調整します。
  12. 中密度イソピクニクスショ糖勾配溶液(53%w/vショ糖、1mM EDTA、1mM Tris pH 7.5溶液;100 mL):53gのショ糖を量り、200 mLの等級シリンダーに移す。1 M トリス バッファ pH 7.5 の 100 μL と 0.5 M EDTA pH 8 の 200 μL を加えます。超純粋なH2Oストアで最終体積を100 mLに調整します。
    注:スクロースの割合が高いため、精度を確保するために、このソリューションを段階的なシリンダーで準備してください。磁気攪拌棒を加え、スクロースが溶液に完全に溶解するまでかき混ぜます。このプロセスには数時間かかることがあります。
  13. 高密度イソピクニックショ糖勾配溶液(73%w/vショ糖、1 mM EDTA、1 mM Tris pH 7.5溶液;100 mL):73gのショ糖を量り、200 mLの等級シリンダーに移す。1 M トリス バッファ pH 7.5 の 100 μL と 0.5 M EDTA pH 8 の 200 μL を加えます。超純粋なH2Oストアで最終体積を100 mLに調整します。
    注:スクロースの割合が高いため、精度を確保するために、このソリューションを段階的なシリンダーで準備してください。磁気攪拌棒を加え、スクロースが完全に溶解するまでかき混ぜます。このプロセスには数時間かかることがあります。
  14. 単離膜貯蔵バッファー (10 mM トリスバッファー pH 7.5; 1 L): 1 M トリス バッファー pH 7.5 の 1 mL を 1 L フラスコに加え、超純度 H2O で最終体積を 1 L に調整します。
  15. β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)(10 mg/mL溶液):超純粋なH2OでNADHの10mgを再懸濁し、新鮮な在庫を毎週準備する。-20°Cで保管してください。
  16. フェノール溶液は、10 mMトリスHCl、pH 8.0、1 mM EDTAと平衡化:材料の表を参照してください。溶液を4°Cで保存してください。
  17. リポ多糖類ゲル染色キット:材料表を参照してください。
  18. ブラッドフォード試薬:材料表を参照してください。
    注:すべてのソリューションとメディアは、一貫した結果を確保するために、アッセイを実行してから1週間以内に準備する必要があります。

2. 膜抽出のための細菌の調製

  1. 冷凍グリセロールストックから新鮮な寒天プレートに細菌をストリーク。コロニーが発達したら、プレートを4°Cに保管してください。一つのコロニーを5mLのチューブに浸入し、一晩好きなように細菌を培養します。
  2. 一晩細菌培養物を好ましいブロス培地の1Lにバック希釈し、所望の光学密度が達成されるまで細菌を培養する。
    注:単一細菌コロニーを1Lのスープ培地に接種することは、成長の型を抑制しやすい変異型遺伝子型に推奨されるが、グラム陰性細菌の中には他の細菌よりも成長が遅いものもある。単コロニー接種により十分な培養密度を達成することができない場合、一晩培養を1Lの培地に希釈することは、成長を同期させる一つの戦略である。細菌膜組成物は、培養物の成長期(対数対静止期)13によって異なる。細菌培養物の光学密度の変化を時間の関数として測定する成長曲線は、培養密度と成長期を相関させるためにすべての株で行われるべきである。
  3. 氷の上にスープ文化を含むフラスコを設定します。光学密度を600 nm(OD600)で読み取り、6.0~8.0 x 1011の細菌コロニー形成ユニット(cfu)の間で同等の培養量を計算します。Sの場合腸炎は、1.0のOD600がおよそ1.0x109 cfu/mLに等しいので、これは0.6-0.8の間のOD600で1 Lの培養に相当する。この体積を遠心管に加え、残りの培養物が使用されるまで氷の上にとどまるようにします。
  4. ペレット菌は、固定角度の高速遠心分離機で7,000~10,000xgでg4°Cで10分間の遠心分離を行う。
    注:予冷し、低温で遠心分離機を維持します。サンプルを氷の上に保持します。
  5. 上清を慎重に捨てる。
    注:ペレットは、膜分画がすぐに抽出されない場合は、フラッシュ冷凍および/または-80°Cで保存することができます。しかし、細胞が収穫された同じ日に直接プラスモリシスを進めることが推奨され、特に非腸細菌種に推奨されます。

3. 外膜の解離とプラスモリシス

  1. 以前に-80°Cで保存した場合は氷上の細胞ペレットを解凍し、残りの手順のために氷の上にサンプルを保持します。遠心分離管内の各細胞ペレットをバッファーAの12.5 mLに再懸濁し、細胞の懸濁液に磁気攪拌棒を追加します。
  2. 各細胞再懸濁液に10 mg/mLリソザイム(最終濃度144μg/mL)を180 μL加えます。2分間かき混ぜながら、サンプルを氷の上に置いておく。
  3. 各細胞再懸濁液に1.5 mM EDTA溶液の12.5 mLを加え、さらに7分間氷上で攪拌を続けます。
  4. サスペンションを50 mLの円錐形チューブと遠心分離機に9,000-11,000 x gで4°Cで10分間デカントします。
  5. 上清をバイオハザード廃棄物容器に捨て、氷の上にペレットを保持します。
  6. 細胞ペレットに25mLのバッファーBを加える。
  7. 1 M MgCl2の55 μL、RNase/DNaseヌクレアーゼ試薬の1 μL(均質化前にプラスモ分解を起こしている細菌に関連する粘性の問題を避けるために)、1 μLのプロテアーゼ阻害剤カクテルを細胞ペレットの上に座るバッファBの体積に加える
  8. バッファーB混合物中のペレットを再懸濁する。均質な溶液を観察するまで、激しくピペットと渦を引き起た。
    注:このプロトコルのステップ 4 に進む前に、同種のソリューションを持つことは非常に重要です。再懸濁された細胞は、外観と一貫性のような粘性のあるケーキバッターを持っている必要があります。
  9. 各サンプルを15 sの渦は氷上の懸濁液を保持し、ステップ4に進みます。

4. 加圧均質化とリシス

注:いくつかの方法は、ライシスに使用することができます。超音波処理は、熱の発生に理想的ではありません。浸透性の分解は達成できるが、しばしば非効率的である。そのため、高圧のリシスをお勧めします。高圧のリシスはいろいろな器械を使用して達成することができる。フランスのプレスやエミスリフなどの均質化機械を提案します。私たちは、高い浸透圧スクロース溶液への応答が異なるグラム陰性細菌の多くのタイプで動作します。高圧均質化ステップは効率、再現性および収率を改善する。

  1. 4°Cでフランスプレスセルをプレチルするか、氷の上のホモジナイザーマシンから金属コイルを挿入します。
  2. サンプルをフランス圧セルまたはホモジナイザーサンプルシリンダーに注ぎ、目的の均質化圧力下にセルを持ち込みます(フランス語プレス機を使用する場合は10,000 psi、ホモジナイザーを使用する場合は20,000 psi)。
  3. フレンチプレスを利用する場合は、圧力を維持しながら、1秒あたり約1ドロップに出口流量を調整します。
  4. 氷の上にサンプルを保ちながら、50 mL円錐管で細胞ライセートを収集します。
  5. ステップ 4.2~4.4 を 3~ 5 回繰り返して完全なリシスを達成し、通常はサンプルの透明性の緩やかな増加によって示されます。
    注:サンプルチャンバは、サンプル間でバッファBで洗浄し平衡化する必要があります。
  6. 氷の上に細胞を取り付けます。

5. 総膜分画

  1. 4°Cで10分間6,169xgの菌試料g を遠心分離し、そのままの細胞材料をペレットに残す。(例えば、非糖化細菌細胞)。
  2. 上清の残りの部分を分配し、現在は均質化膜を含むが、超遠心分離のためのポリカーボネートボトルに入れ替える。
    注意:必要に応じて、細胞サンプルは、緩衝Bで希釈することによってバランスをとることができる。
  3. 細胞の超遠心分離は、少なくとも1時間、4°Cで184,500 x gでライセートする。このステップは、膜の品質に影響を与えることなく一晩行うことができる。
  4. 超遠心チューブに残った上清を捨て、氷の上に膜ペレットを保持する(図1)。
  5. ガラスダウンホモジナイザーを使用して、低密度イソピクニックショ糖勾配溶液の1mLで膜ペレットを再懸濁します。ガラス製のパスツールピペットを使用して、サンプルホモジネートを1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、氷の上に保持します。
    注:全膜組成分析のみが望ましい場合は、1mLの単離膜貯蔵緩衝液に対して低密度イソピクニクス・ショ糖勾配溶液の1mLを置換する。ステップ 5.5 は、全細菌膜サンプルのみが必要な場合の分離の終点です。さらに下流の分析が必要になるまで、-20°Cでサンプルを保存します。

6. 二重膜を分離する密度勾配超遠心分離

  1. スイングバケットローターと超遠心分離機に指定された13 mLポリプロピレンまたは超クリアオープントップチューブの適切な数を収集します。
  2. チューブを少し傾けた位置に保持し、スクロース溶液を次の順序で高密度から低密度にゆっくりと追加してショ糖勾配を準備します。
    2 mL 73% w/v スクロース,1 mM EDTA, 1 mM トリス pH 7.5
    4 mL 53%w/v スクロース、1 mM EDTA、1 mM トリス pH 7.5
    1. 次に、20%w/vショ糖溶液中に再懸濁された全膜画分(1mL)を加える(ステップ5.5)。膜分率を、その下にあるスクロース溶液と混ぜないようにしてください。これらの各レイヤー間に分割が表示されます。
    2. 最後に、低密度イソピクニクスショ糖勾配溶液(約6 mL)でチューブを充填します。ポリプロピレンと超透明のオープントップチューブは、チューブサポートのために可能な限りいっぱい(チューブ上部から2または3ミリメートル)充填する必要があります。
  3. アシネトバクター・バウマンニ17978の調整
    1. 異なる細菌標本での使用のために調整されたスクロースの勾配を適応させる。A. バウマンニの場合、以下のスクロース勾配は膜のより完全な分離を与えた(図2)。
      2 mL 73%w/v スクロース、1 mM EDTA、1 mM トリス pH 7.5
      45%の45%の4/vショ糖、1 mM EDTA、1 mMトリスpH 7.5
    2. 次に、20%w/vショ糖溶液中に再懸濁された全膜画分(1mL)を加える(ステップ5.5)。膜分率を、その下にあるスクロース溶液と混ぜないようにしてください。これらの各レイヤー間に分割が表示されます。
    3. 最後に、低密度イソピクニクスショ糖勾配溶液(約6 mL)でチューブを充填します。ポリプロピレンと超透明のオープントップチューブは、チューブサポートのために可能な限りいっぱい(チューブ上部から2または3ミリメートル)充填する必要があります。
  4. 一晩で288,000 x gおよび4 °Cのスイングバケツローターを使用してサンプルを超遠回しにする。
    注:前の手順で使用したボリュームについては、16 時間から 23 時間の間の遠心時間をお勧めします。
  5. P1000ピペットチップの端をポイントから約5mm切ります。ピペットを使用して上茶色のIM層を取り除きます。IM分をポリカーボネートボトルに移し、超遠心分離を行います。
  6. スクロース溶液の約2 mLを53-73%のインターフェースの上に残して、下の白色OMがIM分率で交差しないようにします。OM の分数 (図 1)に対して、ステップ 6.4 のピペット処理を繰り返します。
    注:膜はまた、針を使用して下部の遠心管を穿刺し、分画として膜を滴下して集めることによって収集することができる。
  7. 超遠心チューブの残りの空隙を単離膜貯蔵バッファーで満たし、反転またはピペットによって混合します。氷の上にサンプルを保持します。
  8. 184,500 x g で 184,500 x gで 1 時間および 4 °C の超遠心分離によって洗浄され、単離された膜を収集します。
  9. 上清を捨て、ドウンス均質化によって膜を再懸濁する。500~1000 μLのストレージバッファを追加します。2 mLマイクロ遠心チューブでサンプルを収集します。
  10. 細菌膜サンプルを-20°Cに保存します。

7. 二重層の分離の確認

注:二重層の不完全な分離は、技術的な誤りまたはいくつかの種のユニークな細胞エンベロープ組成物のために発生する可能性があります。分離を確認するために、二重層間の交差汚染の程度を定量化するために、2つの独立したアッセイを使用することをお勧めします。最初のアッセイは、IMに排他的に存在するNADHデヒドロゲナーゼの酵素活性を検出する。第2アッセイは、主にOMに存在するLOSまたはLPSの存在を検出する。

  1. OEM が、OEM から分離されていることを確認する
    1. ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて、各単離膜画分中のタンパク質濃度を測定する。
    2. 50~500μgのタンパク質に対応するサンプルの体積を、空の2 mLマイクロ遠心チューブに加えます。濃度は種によって異なりますが、腸内細菌科では通常50μgで十分です。10 mM Tris バッファの適切なボリュームを追加して、合計 990 μL のボリュームを実現します。分光光度測定のためにキュベットにコンテンツを転送します。
    3. NADHの10 mg/mL溶液を10μL加え、340nmで初期吸光度を測定します。
    4. 吸光度を30sごとに5分間測定し続けます。
    5. 各膜分の時間(x軸)の変化と吸光度の変化をデータをコンパイルしグラフ化する(図3)。
  2. OEM から IM が分離されていることを確認する
    1. 50~500μgのタンパク質に対応するサンプルの体積を、空の2 mLマイクロ遠心チューブに加えます。濃度は細菌種によって異なりますが、腸内細菌科では通常50μgで十分です。100 μL の最終体積にリン酸緩衝生理食塩水を充填し、以下水相と呼びます。
    2. 水相に5μLのプロテイナーゼK(ストック800 U/mL)を加え、59°Cで一晩インキュベートします。
    3. トリス飽和フェノールの10 mLアリコートを68°Cで10分間温める。
    4. プロテイナーゼKで処理した水相サンプルをスピンダウンし、水相との1:1比で「ホット」トリス飽和フェノールを加え、渦を激しく、68°Cで10分間インキュベートします。
    5. 68°Cから氷水浴に今ミルキの白色のサンプルを移し、10分間インキュベートします。
    6. サンプルを4°Cで10分間2,100xgで遠心します。 g
    7. 上部水相を新しいチューブに移し、サンプルがすぐに使用されない場合は-20°Cでチューブを保管します。
    8. サンプルをSDSローディングバッファーに希釈し、4-20%トリスグリシン勾配ゲルのウェルをロードします。
    9. エレクトロフォアを45分間、または色素前面がゲルの底部に入るまで。
    10. メーカーの指示に従ってLPS染色キットを使用してゲルを染色します。

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Representative Results

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この技術は、グラム陰性細菌のDMとOEMを単離する効果的な手段を提供します。手順全体の概要を示します (図 1)。一般に、培養物を1Lの培地中の0.6-0.8のOD600に正規化するか、または6.0〜8.0 x10 11細菌細胞の間で収穫することで、その後の分離のために適切な量の膜材料が収集されることを保証する。

細菌を拭き取り、リゼートを超遠回しにすると、超遠心チューブの底部に粘着性の茶色の全膜ペレットが見えます。不連続なショ糖密度勾配を超して膜を削り取り、ダウンスホモジナイジング、および超遠心分離した後、IMとOMを描かされているように分離する必要があります(図2)。20%/53%/73%のショ糖密度勾配はA.バウマンニのエンベロープを分割するには不十分であり、20%/45%/73%w/v勾配で十分であることがわかった(図2)。45%

様々な分析方法を使用して、各膜分率の品質と純度を評価することができます。NADH-デヒドロゲナーゼはNADにNADH酸化を触媒する内膜酵素である(図3)。細胞の局在性を考えると、それは、AMとOEM間の交差汚染を決定するために使用することができる。両方の分子の吸光度スペクトルによると、NADとNADHはそれぞれ260nmでピーク吸光度を有し、NADHだけが340nmで最大の吸光度を有する。したがって、340 nmでの吸光度の低下は、NADHからNADへの酸化、したがってサンプル中の酵素の存在を示すであろう。膜が正しく分離する場合、この吸光度の変化はIMサンプルでのみ起こるはずです(図3)。OMサンプルの吸光度の低下は、IM材料との交差汚染を示すであろう。A. バウマンニの場合、膜の3倍の量、またはタンパク質等価物の150μgが、腸内細菌株について測定されたものと同様のレベルのNADHデヒドロゲナーゼ活性を実証するために必要であった(図3)。したがって、A.バウマンニのNADHオキシダーゼのレベルが低い、または酵素の比活性が低下する可能性があります。

OMの外葉は、主にLOSまたはLPS分子で構成される。したがって、LPS染色による後の電気泳動および可視化を伴うIMおよびOMサンプルからのLPS/LOSの抽出は、IM画分と比較してOMにおけるこれらの構造の濃縮を反映する。LOSおよびLPS分子の合成は細胞質で始まり、IM5の表面で完了する。LOS および LPS 構造体は、一方向に OM に転送され、外部リーフレットに挿入されます。生合成はIMへの前駆体付着を伴うため、IM画分にはかすかなバンディングパターンが常に観察される。しかし、OM分率中の分子の強度は、LOS/LPS構造の濃縮によりIM画分よりもはるかに大きい(図4)。得られた膜の量は、懸濁液中のタンパク質濃度を求めることにより測定した。腸内生物からLPS分子を検出するのに必要な量と比較して、A.バウマンニからLOSを抽出して検出するために必要な膜の量は6倍でした(図4)。これは、タンパク質レベルと比較して、これらの生物のOMにおけるLOS分子のレベルの低下を反映している可能性があると考えていますが、この仮説を詳細に追求していません。

Figure 1
図1:この方法記事に記載のグラム陰性細菌膜分離手順を描写した模式図。図示は、細菌細胞を採取し、全体、内膜(IM)、および外膜(OM)を単離するために使用される手順である。このアプローチは、IM二重層の密度と比較して、これらの微生物のOM二重層の密度の増加に依存する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:この記事で説明した標準および改変スクロース密度勾配を用いて膜を単離した異なるグラム陰性種の代表的な結果。不連続なスクロース密度勾配の画像は、(A)野生型サルモネラ・エンテロニカ・セロバー・ティフィムリウム14028sに対するイソピセン性遠心分離後、(B)galE-突然変異体S。 B galEO抗原を欠いたLPS分子を産生するチフィムリウムLT2と、O抗原を欠くLPS分子も産生する(C)大腸菌K-12 DH5α。内膜(IM)は外膜(OM)から分離され、褐色材料として20〜53%のスクロース界面に局部化する。白いOM層は、この画分の高密度のために53-73%のスクロースインターフェースに局部化します。(D) 野生型アシネトバクターバウマニ17978の全膜は、20%/53%/73%(w/v)スクロース勾配を用いてE分離しなかったが、20%/45%/73%(w/v)スクロース勾配を用いて分離した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:外膜(OM)の純度を試験するためのNADHデヒドロゲナーゼアッセイの代表的な結果。酵素の存在であるNADH-デヒドロゲナーゼを、内部(IM)およびOMサンプルで試験し、分離の効率を試験した。(A) NADHからNADへの酸化は、細菌IMに位置する酵素によって触媒される。反応基質(NADH)は340 nmで最大吸光度を有する。したがって、この波長での光学密度の低下は、サンプル中の酵素の存在を示す。DMとOEMは、野生型S(B)について測定したチフィムリウム, (C)大腸菌K-12 DH5αおよび (D) galE-変異体 S.ティフィムリウム。これらの膜は、20%/53%/73%w/vショ糖のイソピクニクスショ糖密度勾配を用いて単離した。A. バウマンニの場合、膜は20%/45%/73%w/vスクロースの勾配を用いて単離された。膜の純度をテストするためのNADHアッセイは、腸内細菌性生物に対して(E)50μgを用いて、A.バウマンニの全タンパク質の150μgを用いて行った。EF(F)の曲線は、全タンパク質に比べてNADHデヒドロゲナーゼの相対的なレベルがSよりもA.バウマンニの方が少ないことを示唆したので、より高い濃度のタンパク質が(F)に加えられた。タイフィムリウムと大腸菌.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:内膜(IM)純度を試験するためのLPSおよびLOS抽出および可視化手順の代表的な結果。総タンパク質の50μgに相当する膜試料の体積を用いて、SのIMおよび外膜(OM)からLPSを抽出した。タイフィムリウムおよび大腸菌DH5アルファ。総タンパク質の300 μgに相当する膜サンプルの体積を使用して、A. バウマンニの膜から LPS を抽出した。体積を内毒素を含まない水で100μlに正規化し、ホットフェノール抽出(1:1水:フェノール)で抽出し、21μlの抽出物を4-20%の勾配ポリアクリルアミドゲルにロードし、PRO-Q Emerald 300染色染色によって視覚化した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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この方法は、細菌生理学および病因における細胞エンベロープの役割を理解する研究者を引き続き支援する。逐次超遠心分離工程に続いて、精製された総量、内面、およびOM画分が得られる。これらの膜は、膜タンパク質の局在化および機能、周囲の輸送および人身売買、および様々な環境条件下での個々の二重層の組成に関連する仮説を試験するために、単独でアッセイすることができる。また、この技術により採取した単離膜画分を用いて、病原体における個々のOM成分の関与を探る生物学的研究(LOS/LPSおよびOMタンパク質など)を、動物および細胞モデルで行うこともできます。

我々のプロシージャは腸内細菌科、特にSとの使用のために最大限に活用されたチフィムリウムは、可変鎖長のO抗原を含むLPS分子を産生する。このプロトコルは、O抗原を合成する遺伝的能力を失ったモデル細菌、大腸菌K-12にも作用する。野生型及びO抗原欠損Sを用いたタイフィムリウム14028sおよび大腸菌K-12株DH5αは、これらの微生物に対する膜を分離する能力がO抗原の存在によって実質的に影響されないことを示す。しかし、LOS産生細菌のエンベロープを分離するために、A.バウマンニ17978は、二重層を単離するために不連続勾配における中密度スクロース溶液の濃度を低減しなければならなかった(図2)。特に、中密度溶液の濃度を53%から45%にシフトすることで、適合勾配の45-73%界面にOMが分割できるように十分であった。A. バウマンニの 53-73% 勾配を使用する場合、OM材料の大部分は、20-53% インターフェイスの IM 分数よりわずかに下に観察されることが多い (図 2)。疎な OM マテリアルは、A. バウマンニの 53-73% インターフェイスに存在していました。これらの結果は、20%/53%/73%の勾配がこれらの条件下でA.バウマンニの二重層を分離するのに不十分であることを示唆した。

要約すると、さまざまなOM-糖脂質含有量およびレベルを有する生物を収容するために密度勾配を調整することができ、そのアプローチは他のグラム陰性細菌に適応することができる。

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Disclosures

利益相反は宣言されていません。

Acknowledgments

この作品は、P20GM10344とR01AI139248がZ.D.デールブルーに授与することによって資金提供されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 - IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma - Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

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References

  1. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
  2. Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
  3. Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
  4. Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
  5. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  6. Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
  7. Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
  8. Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
  9. Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140, (1), 49-57 (1994).
  10. Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
  11. Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
  12. Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
  13. Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. (2019).
  14. Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
  15. Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
  16. Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
  17. Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
  18. Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
  19. Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
  20. Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).
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Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).More

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).

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