Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Adskillelse af cellekonvolutten for Gram-negative bakterier i indre og ydre membranfraktioner med tekniske justeringer for Acinetobacter baumannii

doi: 10.3791/60517 Published: April 10, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Gram-negative bakterier producerer to rumligt adskilte membraner. Den ydre membran er opdelt fra den indre membran af en periplasm og et peptidoglycan lag. Evnen til at isolere de dobbelte tolag af disse mikrober har været afgørende for at forstå deres fysiologi og patogenese.

Abstract

Denne metode virker ved at opdele kuverten af Gram-negative bakterier i total, indre og ydre membran (OM) fraktioner og slutter med analyser til at vurdere renheden af de tolage. OM har en øget samlet tæthed i forhold til den indre membran, hovedsagelig på grund af tilstedeværelsen af lipooligosaccharider (LOS) og lipopolysaccharider (LPS) i den ydre folder. LOS og LPS molekyler er amøse glycolipider, der har en lignende struktur, som består af en lipid-A disaccharolipid og core-oligosaccharid substituent. Men kun LPS molekyler er dekoreret med en tredje underenhed kendt som O-polysaccharid, eller O-antigen. Typen og mængden af glycolipider til stede vil påvirke en organismes OM tæthed. Derfor testede vi, om membranerne af bakterier med varieret glycolipid indhold kunne være tilsvarende isoleret ved hjælp af vores teknik. For de LPS-producerende organismer, Salmonella enterica serovar Typhimurium og Escherichia coli, var membranerne let isolerede, og LPS O-antigenmoiety påvirkede ikke tolagsopdelingen. Acinetobacter baumannii producerer LOS molekyler, som har samme masse som O-antigen mangelfuld LPS molekyler; membranerne i disse mikrober kunne dog ikke i første omgang adskilles. Vi ræsonnerede, at OM af A. baumannii var mindre tæt end enterobakterier, så saccharosegradienten blev justeret, og membranerne blev isoleret. Teknikken kan derfor tilpasses og ændres til brug sammen med andre organismer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gram-negative bakterier producerer to membraner, der er adskilt af en periplasmic rum og en peptidoglycan celle væg1. Den indre membran (IM) omslutter cytosol og er en symmetrisk tolags af fosfolipider. Peptidoglycan beskytter mod turgor tryk og giver bakterien med en celleform, og er knyttet til den ydre membran (OM) af lipoproteiner2,3. OM omgiver periplasm og er overvejende asymmetrisk. Den indre folder består af fosfolipider og den ydre folder består af glycolipider kendt som lipooligosaccharider (LOS) eller lipopolysaccharider (LPS)4,5. Lipidasymmetrien og biokemien af LOS/LPS-molekylerne i den ydre folder giver barriereegenskaber til celleoverfladen , som beskytter bakterien mod farer i omgivelserne6,7.

LPS molekyler består af tre bestanddele: lipid en disaccharolipid, kernen oligosaccharid, og O-polysaccharid eller O-antigen. Lipid A er en formere acylated disaccharolipid. Core-oligosaccharider består af 10-15 sukkerarter kendt som ru LPS eller R-LPS. Kernen er opdelt i den indre region, der består af 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic syre (kdo) og en eller flere heptose rester, og en ydre region, der består generelt af hexoses (glukose eller galactose) og heptoses, eller acetamido sukker5. Den ydre kerneregion er mere variabel i sine komponenter og struktur end den indre kerne. I Salmonella spp., kun én kernestruktur er blevet beskrevet; I Escherichia coli er der dog fem forskellige kernestrukturer (kaldet K-12, R1, R2, R3 og R4)8. E. coli K-12 DH5α, som vi bruger i denne procedure bærer en mutation, der resulterer i produktion R-LPS9. R-LPS molekyler mangler O-antigen moiety og har en lignende molekylvægt til LOS molekyler.

Tilføjelsen af O-antigen til R-LPS forvandler dette molekyle til glat LPS, eller S-LPS. O-antigenerne er bygget af korte 3-4 kulhydratunderenheder og består af flere modaliteter med varierende kædelængder10. Nogle LPS-producerende bakterier, som Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), vise en trimodal fordeling af LPS molekyler på deres overflade10,11. Meget lange kæde O-antigener kan indeholde over hundrede underenheder og vejer over hundrede kilodalton. O-antigener giver overflade egenskaber til bakterien, der er nødvendige for at modstå antibiotika, undgå predation af bakteriofager, og forårsage sygdom.

Arter af Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria og andre genererer LOS molekyler i stedet for LPS molekyler på deres overflade12. LOS molekyler består af lipid A og kerne oligosaccharider, men mangler O-antigen. Disse typer af Gram-negative bakterier ændre deres kerne oligosaccharider med yderligere sukker og kombinationer af sukker til at ændre overflade egenskaber12. Både LOS- og LPS-producerende mikrober derivatiserer fosfaterne på lipid A og kernemolekyler med kationiske moieties7. Disse tilføjelser omfatter fosforethanolamin, galactosamin og aminoarabinose substitutioner, som fungerer ved at neutralisere anioniske overflade ladning og dermed beskytte mod kationiske antimikrobielle peptider. Gram-negative bakterier også ændre kernen oligosaccharid struktur med variable ikke-stoichiometric substitutioner af sukker, eller ekstra kdo molekyler, og ændre antallet af acyl kæder på lipid-A disaccharolipider7.

Evnen til at isolere iM fra OM af Gram-negative bakterier har været medvirkende til at forstå den rolle, som cellen kuvert i antimikrobiel resistens og sygdom patogenese11,12. Afledning af denne fremgangsmåde er blevet brugt til at udlede mekanismer til samling, vedligeholdelse og remodeling af protein, fosfolipid, og glycolipid bestanddele for OM.

Vores laboratorium udfører rutinemæssigt bakterielle lipidomiske analyser for at studere proteinmedieret lipidregulering og lipidfunktion i en række Gram-negative arter. De mængder , der anvendes i protokollen , afspejler den rutinemæssige anvendelse af denne procedure til at analysere ikke-radioaktivt mærkede fosfolipider ved tyndt lag kromatografi og flydende kromatografi tandem massespektrometri13,14.

Protokollen begynder med at udsætte en kølet suspension af Gram-negative bakterier for en høj osmolar opløsning af saccharose og tilføje lysozym at adskille OM fra det underliggende peptidoglycan lag (Figur 1)12. EDTA tilsættes derefter for at lette indtrængningen af lysozymen, da divalent kationbinding forstyrrer de laterale elektrostatiske overgangsinteraktioner mellem tilstødende LOS/LPS-molekyler15. Den oprindelige protokol, hvorfra vores er blevet tilpasset krævede dannelsen af sfærolaster, en Gram-negativ bakteriecelleform, der består af en plasmamembran og cytosol, men mangler peptidoglycan lag og en OM. Det er muligt, at sfæroplaster fremstilles ved hjælp af den tilpassede metode. men teknikken ikke stole eller har til hensigt at deres dannelse for succes. I stedet høstes de lysozyme-EDTA-behandlede bakterier hurtigt ved centrifugering og resuspenderes i en saccharoseopløsning med mindre koncentration før tryklysis. De OEM'er, der kunne være blevet frigivet ved at danne sfærolaster, bør i teorien kunne høstes fra supernatanterne i de behandlede celler, men denne fremgangsmåde er ikke beskrevet heri. I sidste ende udsættes de behandlede celler for konventionel homogenisering og lysis, hvilket øger effektiviteten og reproducerbarheden af membranseparationsproceduren16.

Efter lysis opsamles de tosamlede membraner ved ultracentrifugering og påføres en diskontinuerlig saccharosetæthedsgradient for at brøkse IMs og OEM'er. Den klassiske tilgang anvender en mere kontinuerlig gradient , der består af mindst fem forskellige saccharoseopløsninger11,12. Den diskontinuerlige gradient i vores protokol består af tre saccharoseopløsninger og partitionerer de to lag i to forskellige fraktioner17. LOS- og LPS-molekylerne i de gramnegative bakteriers OEM-bakteriers OEM-kortskaber driver konvolutten til at opdele den i en øvre brun imfraktion med lav densitet og en lavere hvid OM-fraktion med høj densitet (figur 1 og figur 2).

Acinetobacter baumannii er vigtige multiresistente humane patogener , der producerer LOS molekyler i deres OM og opføre en celle kuvert, der er vanskeligt at adskille18,19. Nylige arbejde tyder på, at en afledning af den protokol, vi præsenterer her, kan bruges til at opdele de tolag af disse organismer20. Derfor testede vi vores protokol på A. baumannii 17978. I første omgang var proceduren utilstrækkelig. Vi har imidlertid ændret saccharosekoncentrationen af mellemtæthedsopløsningen og forbedret separationen betydeligt (figur 2). En NADH dehydrogenase analyse og en LOS / LPS udvinding og detektion procedure blev brugt til at bekræfte adskillelse for A. baumannii, vilde type S. Typhimurium og to O-antigen mangelfuld enterobakterielle genotyper; nemlig galE-mutant S. Typhimurium og en laboratoriestamme, E. coli DH5α (Figur 3 og Figur 4).

Hensigten med dette arbejde er at levere en strømlinet tilgang til reproducerbart isolere membraner af Gram-negative bakterier. Protokollen kan bruges til at studere mange typer af membran-associerede molekyler til disse mikrober.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Almene reagenser og medieforberedelse til membranekstraktion

  1. Bakterievækst medier: Forbered og sterilisere 1 L bouillon medier i en grundigt rengjort og autoclaved 2 L kolbe.
  2. Generel resuspensionsbuffer (1 M Tris Buffer pH 7,5; 50 ml): Opløs 6,05 g Tris base i 30 ml H2O. Juster pH til 7,5 med 5 M HCl. Juster det endelige volumen til 50 ml med ultraren H2O.
  3. Stambouillon af divalent kationkelationopløsning (0,5 M EDTA pH 8; 100 ml): Der tilsættes 18,6 g dinatriumethylentetraacetat·2H2O til 80 ml H2O. Rør kraftigt rundt og pH justeres til 8,0 med NaOH. Den endelige lydstyrke justeres til 100 ml med ultrarent H2O.
    BEMÆRK: Dinatriumsaltet i EDTA opløses ikke, før opløsningens pH-værdien er justeret til ~8,0 ved tilsætning af NaOH.
  4. Osmotisk buffer A (0,5 M saccharose, 10 mM Tris pH 7.5; 1 L): Vejes 171,15 g saccharose og overføres til en 1 L cylinder. Der tilsættes 10 ml 1 M Tris pH 7.5. Tilslut til et endeligt volumen på 1 L med ultraren H2O. Opbevares ved 4 °C.
  5. Lysozym (10 mg/ml; 5 ml): Der afvejes 50 mg (kyllingæggehvide) lysozym og opløses i 5 ml ultrarent H2O. Opbevares ved 4 °C.
  6. Fortyndet divalent kationopløsning (1,5 mM EDTA; 500 ml): Der tilsættes 1,5 ml 0,5 M EDTA (trin 1.3) til 497,5 ml ultrarent H2O. Opbevares ved 4 °C.
  7. Osmotisk buffer B (0,2 M saccharose, 10 mM Tris pH 7.5; 2 L): Vejes 136,8 g saccharose og overføres til en 2 L cylinder. Der tilsættes 20 ml 1 M Tris pH 7.5. Den endelige volumen justeres til 2 L med ultraren H2O. Opbevares ved 4 °C.
  8. Nuclease co-faktor (1 M MgCl2; 10 ml): Opløses 2,03 g MgCl2·6H2O i 8 ml ultraren H2O. Juster volumen til 10 ml. Opbevares ved stuetemperatur.
  9. Nuclease løsning cocktail herunder RNase og DNase enzymer: Se Tabel over materialer. Opbevares ved -20 °C.
  10. Protease hæmmer cocktail: se tabel af materialer. Opbevares ved 4 °C.
  11. Isopycnic saccharosegradientopløsning med lav densitet (20% w/v saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Opløsning; 100 ml): Vejes 20 g saccharose og overføres til en 200 ml cylinder. Der tilsættes 100 μL 1 M Tris Buffer pH 7,5 og 200 μL på 0,5 M EDTA pH 8. Den endelige lydstyrke justeres til 100 ml med ultraren H2O. Opbevares ved stuetemperatur.
  12. Mellemdende isopycnic saccharosegradientopløsning (53% w/v saccharose, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Solution; 100 ml): Vejes 53 g saccharose og overføres til en 200 ml gradueret cylinder. Der tilsættes 100 μL 1 M Tris Buffer pH 7,5 og 200 μL på 0,5 M EDTA pH 8. Den endelige lydstyrke justeres til 100 ml med ultraren H2O. Opbevares ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Forbered denne løsning i en gradueret cylinder for at sikre nøjagtighed på grund af den høje procentdel af saccharose. Tilsæt en magnetisk rørstang og rør rundt, indtil saccharosen er helt opløst i opløsning. Denne proces kan tage flere timer.
  13. Isopycnic saccharosegradientopløsning med høj densitet (73% w/v saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Solution; 100 ml): Vejes 73 g saccharose og overføres til en 200 ml gradueret cylinder. Der tilsættes 100 μL 1 M Tris Buffer pH 7,5 og 200 μL på 0,5 M EDTA pH 8. Den endelige lydstyrke justeres til 100 ml med ultraren H2O. Opbevares ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Forbered denne løsning i en gradueret cylinder for at sikre nøjagtighed på grund af den høje procentdel af saccharose. Tilsæt en magnetisk rørstang og rør rundt, indtil saccharosen er helt opløst. Denne proces kan tage flere timer.
  14. Isoleret membran-lagringsbuffer (10 mM Tris Buffer pH 7.5; 1 L): Der tilsættes 1 ml 1 M Tris Buffer pH 7.5 til en 1 L kolbe, og det endelige rumfang justeres til 1 L med ultraren H2O.
  15. β-Nicotinamid adenin dinucleotid (NADH) (10 mg/ml opløsning): Resuspend10 mg NADH i ultraren H2O. Forbered friske lagre, ugentligt. Opbevares ved -20 °C.
  16. Phenolopløsning ekvilibreret med 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA: Se Materialetabel. Opløsningen opbevares ved 4 °C.
  17. Lipopolysaccharid gel plet kit: Se tabel af materialer.
  18. Bradford reagens: se tabel over materialer.
    BEMÆRK: Alle løsninger og medier skal forberedes inden for den uge, hvor analysen udføres, for at sikre ensartede resultater.

2. Forberedelse af bakterier til membranekstraktion

  1. Stribe bakterierfra frosne glycerol bestande på friske agar plader. Pladerne opbevares ved 4 °C, når kolonierne udvikler sig. Inokulere en enkelt koloni i en 5 ml rør fyldt med bouillon medier og kultur bakterierne som ønsket natten over.
  2. Back-fortynde natten bakteriekultur i 1 L af foretrukne bouillon medier og kultur bakterierne, indtil den ønskede optiske tæthed er opnået.
    BEMÆRK: Inokulere en enkelt bakteriekoloni i 1 L bouillon medier anbefales til mutant genotyper, der er tilbøjelige til at undertrykke vækst fænotyper, men nogle Gram-negative bakterier simpelthen vokse langsommere end andre. Hvis det ikke er muligt at opnå en tilstrækkelig kulturtæthed ved enkeltkolonipodning, er tilbagevanding af en natkultur i 1 L af medier en strategi for at synkronisere vækst. Bakteriemembranens sammensætning varierer afhængigt af kulturens vækstfase (logaritmisk vs. stationær fase)13. Vækstkurver, der måler ændringen i den optiske tæthed for bakteriekulturerne som funktion af tid, skal udføres med alle stammer for at korrelere kulturtæthed med vækstfase.
  3. Sæt kolberne med bouillonkulturerne på is. Læs den optiske massefylde ved 600 nm (OD600) og beregne mængden af kultur, der svarer til mellem 6,0 og 8,0 x 1011 bakteriekoloni danner enheder (cfu). For S. Typhimurium, dette svarer til 1 L kultur på en OD600 på mellem 0,6-0,8, da en OD600 på 1,0 er lig med omkring 1,0x109 cfu / ml. Der tilsættes dette volumen til et centrifugerør, og sørg for, at de resterende kulturer forbliver på is, indtil de skal anvendes.
  4. Pellet bakterierne ved centrifugering ved 4 °C ved 7.000-10.000 x g i en fast vinkel højhastighedscentrifuge i 10 min.
    BEMÆRK: Forkøles og centrifugerne holdes ved lav temperatur. Prøverne opbevares på is under hele proceduren.
  5. Dekanter og kassér supernatanten omhyggeligt.
    BEMÆRK: Pellet kan blinke frosset og / eller opbevares ved -80 °C, hvis membranfraktionerne ikke vil blive ekstraheret straks. Det anbefales dog at fortsætte direkte med plasmolyse samme dag, som cellerne høstes, og anbefales især til ikke-enterobakterielle arter.

3. Dissociation af den ydre membran og plasmolyse

  1. Tø cellepillerne op på is, hvis de tidligere opbevares ved -80 °C, og opbevar prøverne på is i resten af proceduren. Resuspender hver cellepellet i centrifugerøret i 12,5 ml buffer A. Tilføj en magnetisk omrøringsstang til cellernes suspension.
  2. Der tilsættes 180 μL 10 mg/ml lysozym (sidste koncentration på 144 μg/ml) til hver celleresuspension. Prøverne opbevares på is under omrøring i 2 min.
  3. Der tilsættes 12,5 ml 1,5 mM EDTA-opløsning til hver celleresuspension, og omrøring en yderligere 7 min.
  4. Suspensionen dekanterles i et konisk 50 ml rør og centrifugeres ved 9.000-11.000 x g i 10 min ved 4 °C.
  5. Overnatantanter kasseres i en beholder til biofarligt affald, og pillerne opbevares på is.
  6. Der tilsættes 25 ml buffer B til cellepelleten.
  7. Der tilsættes 55 μL på 1 M MgCl2, 1 μL RNase/DNase nuclease reagens (for at undgå viskositetsproblemer forbundet med bakterier, der gennemgår plasmolyse før homogenisering), og 1 μL proteasehæmmercocktail til mængden af buffer B, der sidder oven på cellepellet
  8. Resuspender pellet i buffer B blandingen. Kraftigt pipet og vortex indtil observere en homogen opløsning.
    BEMÆRK: Det er meget vigtigt at have en ensartet løsning, før man går videre til trin 4 i denne protokol. De resuspended celler skal have en tyktflydende kage-dej som udseende og konsistens.
  9. Vortex hver prøve i 15 s. Bevar suspensioner på is og fortsæt til trin 4.

4. Tryk homogenisering og Lysis

BEMÆRK: Flere metoder kan bruges til lysis. Sonikering er ikke ideel på grund af den generation af varme. Osmotisk lysis kan opnås, men er ofte ineffektiv. Derfor anbefaler vi højtrykslysis. Højtrykslysis kan opnås ved hjælp af en række forskellige instrumenter. Vi foreslår homogeniseringsmaskiner, såsom den franske presse eller Emusliflex. Vi arbejder med mange typer af Gram-negative bakterier, hvis reaktion på høje osmolar saccharose opløsninger varierer. Højtrykshomogeniseringstrinnet forbedrer effektiviteten, reproducerbarheden og udbyttet.

  1. Prechill den franske Presse celle ved 4 °C eller indsætte metalspolen fra homogenisator maskinen på is.
  2. Prøven hældes i den franske trykcelle eller homogenisatorprøvecylinderen, og cellen bringes under det ønskede homogeniseringstryk (10.000 psi skal være tilstrækkelig, når der anvendes en fransk presse eller 20.000 psi, når der anvendes en homogenisator).
  3. Juster udløbsstrømningshastigheden til ca. et fald pr. sekund, mens trykket opretholdes, hvis der udnyttes en fransk presse.
  4. Cellelysatet opsamles i koniske 50 ml rør, mens prøverne opbevares på is.
  5. Gentag trin 4.2-4.4 tre til fem gange for at opnå fuldstændig lysis, typisk indikeret ved gradvis forøgelse af prøvens gennemsigtighed.
    BEMÆRK: Prøvekammeret skal vaskes og ekvilibreres med buffer B mellem prøverne.
  6. Hold lysed celler på is.

5. Samlet membranfraktionering

  1. De lysede bakterieprøver centrifugeres ved 6.169 x g i 10 minutter ved 4 °C for at pelletere det resterende intakte cellemateriale. (f.eks. ulyserede bakterieceller).
  2. Fordel den resterende del af supernatanten, som nu indeholder de homogeniserede membraner, i en polycarbonatflaske til ultracentrifugering.
    FORSIGTIG: Hvis det er nødvendigt, kan celleprøver afbalanceres ved fortynding med buffer B.
  3. Cellelysaterne må ultracentrifugeres ved 184.500 x g i mindst 1 time ved 4 °C. Dette trin kan udføres natten over uden at påvirke kvaliteten af membranerne.
  4. Kassér resterende supernatant til stede i ultracentrifugerøret og opbevar membranpellets på is (Figur 1).
  5. Resuspender membranpillerne i 1 ml af den lavdensitetsisopycnic-saccharosegradientopløsning ved hjælp af en glas-dounce homogenisator. Brug en pasteurpipetter til at overføre prøven homogenat til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares på is.
    BEMÆRK: Hvis der kun ønskes en total membransammensætningsanalyse, erstattes 1 ml med lav densitet isopycnic-saccharosegradientopløsning til 1 ml isoleret membranlagringsbuffer. Trin 5.5 er isolationens endepunkt, hvis der kun ønskes samlede bakteriemembranprøver. Prøverne opbevares ved -20 °C, indtil der kræves yderligere efterfølgende analyse.

6. Densitet gradient ultracentrifugering at adskille de dobbelte membraner

  1. Det relevante antal 13 ml polypropylen eller ultraklare åbne rør, der er specificeret til en svingende skovlrotor og ultracentrifuge, samles.
  2. Hold røret i en let vippet position, og forbered saccharosegradienten ved langsomt at tilsætte saccharoseopløsninger fra højere tæthed til lavere massefylde i følgende rækkefølge:
    2 ml 73% w/v saccharose,1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    4 ml 53% w/v saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    1. Dernæst tilsættes den samlede membranfraktion (1 ml), som er blevet opslæmmet i 20% w/v saccharoseopløsningen (trin 5.5). Undgå at blande membranfraktionen med den saccharoseopløsning, der ligger under den. Inddelinger skal være synlige mellem hvert af disse lag.
    2. Fyld til sidst røret med den lavdensitetsisopycnic-saccharosegradientopløsning (ca. 6 ml). Polypropylen og ultraklare åbne rør skal fyldes så fyldet som muligt (2 eller 3 mm fra rørtoppen) til rørstøtte.
  3. Justering for Acinetobacter baumannii 17978
    1. Tilpas en justeret saccharosegradient til brug med forskellige bakterieprøver. For A. baumanniigav følgende saccharosegradient en mere fuldstændig adskillelse af membranerne (figur 2).
      2 ml 73% w/v saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
      4 ml 45% w/v saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    2. Dernæst tilsættes den samlede membranfraktion (1 ml), som er blevet opslæmmet i 20% w/v saccharoseopløsningen (trin 5.5). Undgå at blande membranfraktionen med den saccharoseopløsning, der ligger under den. Inddelinger skal være synlige mellem hvert af disse lag.
    3. Fyld til sidst røret med lav densitet isopycnic-saccharosegradientopløsning (ca. 6 ml). Polypropylen og ultraklare åbne rør skal fyldes så fyldet som muligt (2 eller 3 mm fra rørtoppen) til rørstøtte.
  4. Prøverne centrifugeres ved hjælp af en svingende spandrotor ved 288.000 x g og 4 °C natten over.
    BEMÆRK: For de mængder, der anvendes i de foregående trin, anbefaler vi centrifugeringstider mellem 16 timer og 23 timer.
  5. Skær enden af en P1000 pipettespids ca. 5 mm fra punktet. Fjern det øverste brune IM-lag ved hjælp af pipetten. IM-fraktionen overføres til en polycarbonatflaske til ultracentrifugering.
  6. Lad ca. 2 ml af saccharoseopløsningen over grænsefladen på 53-73 % for at sikre, at den nederste hvide OM ikke krydses forurenet med IM-fraktionen. Rørproceduren gentages fra trin 6.4 for OM-fraktionen (Figur 1).
    BEMÆRK: Membranerne kan også opsamles ved at punktere centrifugerørene i bunden ved hjælp af en nål og indsamle membranerne som fraktioner dråbevis.
  7. Fyld det resterende tomrum af ultracentrifugerøret med isoleret membranopbevaringsbuffer og bland ved inversion eller pipettering. Hold prøverne på is.
  8. De nu vaskede og isolerede membraner opsamles ved ultracentrifugering ved 184.500 x g i 1 time og 4 °C.
  9. Supernatanten kasseres, og membranerne suspenderes igen ved dounce-homogenisering. Der tilsættes 500-1000 μL lagerbuffer. Prøverne samles i 2 ml mikrocentrifugerør.
  10. Prøverne af bakteriemembranen opbevares ved -20 °C.

7. Bekræftelse adskillelse af bilag

BEMÆRK: Ufuldstændig adskillelse af de tolage kan forekomme på grund af tekniske fejl eller den unikke cellekuvertsammensætning af nogle arter. For at bekræfte adskillelsen anbefaler vi, at der ved hjælp af to uafhængige analyser foretages kvantificering af graden af krydskontaminering mellem de tolage. Den første analyse registrerer den enzymatiske aktivitet af NADH dehydrogenase, som udelukkende findes i IM. Den anden analyse registrerer tilstedeværelsen af LOS eller LPS, som overvejende findes i OM.

  1. Bekræftelse af, at OEM'erne er isoleret fra ims
    1. Proteinkoncentrationen i hver isoleret membranfraktion måles ved hjælp af en Bradford-proteinanalyse.
    2. Der tilsættes et prøvevolumen på mellem 50 og 500 μg protein til et tomt 2 ml mikrocentrifugerør. Koncentrationen vil variere afhængigt af arten, men 50 μg er typisk tilstrækkelig for enterobakterier. Der tilsættes et passende volumen på 10 mM Tris-buffer for at opnå et samlet volumen på 990 μL. Overfør indholdet til en kuvette for spektrofotometri.
    3. Der tilsættes 10 μL af en 10 mg/ml-opløsning af NADH til prøven, og den oprindelige absorbans måles ved 340 nm.
    4. Fortsæt med at måle absorbansen hver 30 s i 5 min.
    5. Kompilering af data og graf ændringen i absorbans (y-akse) vs. ændringen i tid (x-akse) for hver membran fraktion (Figur 3).
  2. Bekræftelse af, at iMs er isoleret fra OEM'er
    1. Der tilsættes et prøvevolumen på mellem 50 og 500 μg protein til et tomt 2 ml mikrocentrifugerør. Koncentrationen vil variere afhængigt af bakteriearterne, men 50 μg er typisk tilstrækkelig for enterobakterier. Fyld til et endeligt rumfang på 100 μL med fosfatbufferet saltvand, i det følgende benævnt den vandige fase.
    2. Der tilsættes 5 μL Proteinase K (stam800 U/ml) til den vandige fase og inkuberes natten over ved 59 °C.
    3. En 10 ml prøve af Tris-mættet Phenol opvarmes i 10 minutter ved 68 °C.
    4. Spin ned vandige fase prøver, der blev behandlet med Proteinase K og tilsæt "hot" Tris-mættet Phenol på en 1:1 forhold med den vandige fase, vortex kraftigt og inkubere ved 68 °C i 10 min.
    5. De nu mælkehvide prøver overføres fra 68 °C til et isvandsbad og inkuberes i 10 min.
    6. Prøverne centrifugeres ved 2.100 x g i 10 min ved 4 °C.
    7. Den øverste vandige fase overføres til et nyt rør, og røret opbevares ved -20 °C, hvis prøven ikke skal anvendes med det samme.
    8. Fortynd prøverne i SDS-læssebuffer og læs brøndene på en 4-20% Tris-glycingradientgel.
    9. Elektroforse i 45 min eller indtil farvestof-front er i bunden af gelen.
    10. Plette gelen ved hjælp af LPS-farvningssættet efter producentens anvisninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne teknik giver et effektivt middel til at isolere IMs og OEM'er for Gram-negative bakterier. En oversigt over hele proceduren er illustreret (Figur 1). Generelt vil normalisering af kulturer til en OD600 på 0,6-0,8 i 1 L af medier, eller høst mellem 6,0 og 8,0 x 1011 bakterieceller sikre, at den passende mængde membranmateriale indsamles til efterfølgende adskillelse.

Ved lysing af bakterierne og ultracentrifugering af lysatet vil en klæbrig brun totalmembranpellet være synlig i bunden af ultracentrifugerøret. Efter skrabning, dounce-homogenisering og ultracentrifugering af membranen over den diskontinuerlige saccharosetæthedsgradient skal im' en og om'en adskilles som afbildet (figur 2). Vi konstaterede, at hældningen på 20%/53%/73% (w/v) var utilstrækkelig til at opdele kuverten af A. baumannii, mens en 20%/45%/73% w/v gradient var tilstrækkelig (figur 2).

Forskellige analysemetoder kan anvendes til at vurdere kvaliteten og renheden af hver membranfraktion. NADH-dehydrogenase er et indre membranenzym, der katalyserer NADH oxidation til NAD (Figur 3). I betragtning af dens cellulære lokalisering kan den bruges til at bestemme krydskontaminering mellem ims og OEM'er. Ifølge absorbansspektre af begge molekyler har NAD og NADH hver især en maksimal absorbans ved 260 nm, mens kun NADH har en maksimal absorbans ved 340 nm. Et fald i absorbansen ved 340 nm ville således være tegn på oxidation af NADH til NAD og dermed tilstedeværelsen af enzymet i prøven. Hvis membranerne adskilles korrekt, bør denne ændring i absorbansen kun forekomme i IM-prøver (figur 3). Et fald i absorbansen i OM-prøver ville indikere krydskontaminering med im-materialer. For A. baumanniivar det nødvendigt med tre gange så meget membran eller 150 μg proteinækvivalenter for at påvise samme grad af NADH-dehydrogenaseaktivitet som det, der blev målt for enterobakterielle stammer (figur 3). Det er derfor muligt, at niveauet af NADH oxidase er lavere for A. baumannii, eller at enzymets specifikke aktivitet er faldet.

Den ydre folder af OM er hovedsageligt sammensat af LOS eller LPS molekyler. Derfor vil udvindingen af LPS/LOS fra IM- og OM-prøverne med efterfølgende elektroforese og visualisering ved LPS-farvning afspejle berigelsen af disse strukturer i OM sammenlignet med IM-fraktionerne. Syntesen af LOS- og LPS-molekyler begynder i cytoplasmaet og færdiggøres på overfladen af IM5. LOS- og LPS-strukturertransporteres envejs til OM'en og indsættes i den ydre folder. Da biosyntese indebærer prækursor tilknytning til IM, en svag banding mønster er altid observeret for IM fraktioner. Molekylets intensitet i OM-fraktionen er imidlertid meget større end i IM-fraktionen på grund af tilsætningen af LOS/LPS-strukturerne (figur 4). Den opnåede mængde membran blev målt ved at bestemme proteinkoncentrationen i suspensionen. Seks gange mængden af membran var nødvendig for at udvinde og detektere LOS fra A. baumannii sammenlignet med den mængde, der var nødvendig for at detektere LPS-molekyler fra de enteriske organismer (figur 4). Vi grunden til, at dette kan afspejle et nedsat niveau af LOS molekyler i OM for disse organismer i forhold til proteinniveauer, men har ikke forfulgt denne hypotese i detaljer.

Figure 1
Figur 1: Et skema, der viser den Gram-negative bakterielle membranisolationsprocedure, der er beskrevet i denne metodeartikel. Vist er den procedure, der anvendes til indsamling af bakterieceller og isolering af den samlede, indre (IM), og ydre membraner (OM). Tilgangen er baseret på den øgede tæthed af OM tolags for disse mikrober i forhold til tætheden af IM tolags. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative resultater for forskellige Gram-negative arter, hvis membraner blev isoleret ved hjælp af standarden og de modificerede saccharosetæthedsgradienter, der er beskrevet i denne artikel. Billeder af diskontinuerlige saccharose tæthed gradienter post isopycnic centrifugering for (A) vild-type Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028s, (B) galE-mutant S. Typhimurium LT2, som producerer LPS molekyler, der er blottet for O-antigener, og (C) Escherichia coli K-12 DH5α, som også producerer LPS molekyler, der mangler O-antigener. Den indre membran (IM) er adskilt fra den ydre membran (OM) og lokaliseres til 20-53% saccharose interface som et brunt materiale. Det hvide OM-lag lokaliserer til 53-73% saccharosegrænsefladen på grund af den højere tæthed af denne brøk. DD) De totale membraner i den vilde type Acinetobacter baumanii 17978 blev ikke adskilt ved hjælp af 20%/53%/73% (w/v) saccharosegradient, (E), men adskilte ved hjælp af saccharosegradienten på 20%/45%/73% (w/v). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative resultater for NADH dehydrogenase-analysen for at teste ydre membran (OM) renhed. Tilstedeværelsen af enzymet NADH-dehydrogenase blev testet i indre (IM) og OM prøver for at teste effektiviteten af adskillelsen. (A) Oxidationen af NADH til NAD katalyseres af et enzym, der er placeret i den bakterielle im. Reaktionssubstratet (NADH) har en maksimal absorbans ved 340 nm; derfor er et fald i den optiske massefylde ved denne bølgelængde tegn på tilstedeværelsen af enzymet i prøven. IMs og OEM'er blev målt for (B) vildtype S. Typhimurium, (C) E. coli K-12 DH5α og (D) galE-mutant S. Typhimurium. Disse membraner blev isoleret ved hjælp af en isopycnic saccharose tæthed gradient på 20% /53%/73% w / v saccharose. For A. baumanniiblev membranerne isoleret ved hjælp af en gradient på 20%/45%/73% w/v saccharose. NADH-analysen til at teste membranernes renhed blev udført ved hjælp af (E) 50 μg for de enterobakterielle organismer og (F) 150 μg samlede proteiner for A. baumannii. En højere koncentration af protein blev tilsat i (F), da kurven for (E) tydede på, at de relative niveauer af NADH dehydrogenase sammenlignet med det samlede protein var mindre for A. baumannii end for S. Typhimurium og E. coli. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative resultater for LPS- og LOS-ekstraktions- og visualiseringsproceduren for afprøvning af renhed i den indre membran (IM). Mængden af membranprøve svarende til 50 μg totalprotein blev anvendt til at udvinde LPS fra IM og ydre membran (OM) af S. Typhimurium og E. coli DH5-alpha. Mængden af membranprøve svarende til 300 μg totalprotein blev anvendt til at udvinde LPS fra membranerne i A. baumannii. Mængderne blev normaliseret til 100 μl med endotoksinfrit vand og behandlet med Proteinase K. LPS eller LOS blev ekstraheret ved hot-phenolekstraktion (1:1 vand:phenol), og 21 μl af ekstrakterne blev læsset på en 4-20% gradient polyacrylamidgel og visualiseret af PRO-Q Emerald 300 farvning for at vurdere krydskontaminering af IM-fraktioner med materialer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne metode vil fortsætte med at hjælpe forskere med at forstå cellekuvertens rolle i bakteriel fysiologi og patogenese. Efter de sekventielle ultracentrifugeringstrin kan der opnås en renset total, indre og OM-fraktion. Disse membraner kan assayes isoleret for at teste hypoteser relateret til membran protein lokalisering og funktion, transport og menneskehandel på tværs af periplasm, og sammensætningen af de enkelte bilag under forskellige miljøforhold. Biologiske undersøgelser, der undersøger inddragelsen af individuelle OM-komponenter i patogenese, såsom LOS/ LPS og OM-proteiner, kan også udføres i dyre- og cellemodeller ved hjælp af isolerede membranfraktioner indsamlet ved denne teknik.

Vores procedure er optimeret til brug med Enterobacteriaceae, specielt S. Typhimurium, som producerer LPS molekyler, der indeholder O-antigener af variabel kædelængde. Denne protokol virker også for modellen bakterie, E. coli K-12, som har mistet den genetiske evne til at syntetisere O-antigener. Brug af vild type og O-antigen mangelfuld S. Typhimurium 14028s og E. coli K-12 stamme DH5α, viser vi, at evnen til at adskille membraner for disse mikrober ikke i væsentlig grad påvirket af tilstedeværelsen af O-antigener. Men for at adskille kuverten af den LOS-producerende bakterie, A. baumannii 17978, måtte vi reducere koncentrationen af midtertæthedsssaccharoseopløsningen i den diskontinuerlige gradient for at isolere de tolage (figur 2). Især var det tilstrækkeligt at flytte koncentrationen af mellemtæthedsopløsningen fra 53 til 45 %, så OM kunne opdeles til grænsefladen på 45-73 % i den tilpassede gradient. Ved brug af 53-73% gradient for A. baumanniiblev størstedelen af OM-materialet ofte observeret lidt under IM-fraktionen ved grænsefladen på 20-53 % (figur 2). Sparsomme OM materiale var til stede på 53-73% interface til A. baumannii. Disse resultater tydede på, at hældningen på 20%/53%/73% er utilstrækkelig til at adskille de tolage a. baumannii under disse betingelser.

Sammenfattende kan der foretages justeringer af tæthedsgradienten for at imødekomme organismer med varieret OM-glycolipidindhold og -niveau, og tilgangen kan tilpasses andre Gram-negative bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter anmeldt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af P20GM10344 og R01AI139248 tildelt Z. D. Dalebroux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 - IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma - Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
  2. Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
  3. Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
  4. Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
  5. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  6. Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
  7. Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
  8. Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
  9. Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140, (1), 49-57 (1994).
  10. Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
  11. Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
  12. Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
  13. Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. (2019).
  14. Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
  15. Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
  16. Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
  17. Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
  18. Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
  19. Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
  20. Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).
Adskillelse af cellekonvolutten for Gram-negative bakterier i indre og ydre membranfraktioner med tekniske justeringer for <em>Acinetobacter baumannii</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).More

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter