Scheiding van de celenvelop voor gramnegatieve bacteriën in binnen- en buitenste membraanfracties met technische aanpassingen voor Acinetobacter baumannii

Summary

Gram-negatieve bacteriën produceren twee ruimtelijk gescheiden membranen. Het buitenste membraan wordt van het binnenste membraan verdeeld door een periplasma en een peptidoglycanlaag. Het vermogen om de dubbele tweelagen van deze microben te isoleren is van cruciaal belang geweest voor het begrijpen van hun fysiologie en pathogenese.

Abstract

Deze methode werkt door het verdelen van de envelop van Gram-negatieve bacteriën in totaal, binnenste, en buitenste membraan (OM) fracties en eindigt met tests om de zuiverheid van de tweelagen te beoordelen. Het OM heeft een verhoogde totale dichtheid in vergelijking met het binnenste membraan, grotendeels te wijten aan de aanwezigheid van lipooligosachariden (LOS) en lipopolysachariden (LPS) in de buitenste bijsluiter. LOS en LPS moleculen zijn amphipathic glycolipids die een vergelijkbare structuur hebben, die bestaat uit een lipide-A disaccharolipide en core-oligosaccharide substituent. Echter, alleen LPS moleculen zijn versierd met een derde subeenheid bekend als de O-polysaccharide, of O-antigeen. Het type en de hoeveelheid aanwezige glycolipiden zullen de OM-dichtheid van een organisme beïnvloeden. Daarom hebben we getest of de membranen van bacteriën met een gevarieerd glycolgehalte op dezelfde manier kunnen worden geïsoleerd met behulp van onze techniek. Voor de LPS-producerende organismen, Salmonella enterica serovar Typhimurium en Escherichia coli, werden de membranen gemakkelijk geïsoleerd en had de LPS O-antigeenmoiety geen invloed op tweelaagse scheidingen. Acinetobacter baumannii produceert LOS moleculen, die een vergelijkbare massa hebben als O-antigeen deficiënte LPS moleculen; de membranen van deze microben konden echter aanvankelijk niet worden gescheiden. We redeneerden dat de OM van A. baumannii minder dicht was dan die van Enterobacteriaceae, dus de sacharosegradiënt werd aangepast en de membranen werden geïsoleerd. De techniek kan dus worden aangepast en aangepast voor gebruik met andere organismen.

Introduction

Gram-negatieve bacteriën produceren twee membranen die worden gescheiden door een periplasmische ruimte en een peptidoglycan celwand¹. Het binnenste membraan (IM) omhult de cytosol en is een symmetrische tweelaag van fosfolipiden. Peptidoglycan beschermt tegen turgordruk en voorziet de bacterie van een celvorm en is bevestigd aan het buitenste membraan (OM) door lipoproteïnen^2,3. Het OM omringt het periplasma en is overwegend asymmetrisch. De binnenste bijsluiter bestaat uit fosfolipiden en de buitenste bijsluiter bestaat uit glycolipiden bekend als lipooligosachariden (LOS) of lipopolysachariden (LPS)^4,5. De lipideasymmetrie en de biochemie van de LOS/LPS-moleculen in de buitenste bijsluiter geven barrière-eigenschappen aan het celoppervlak die de bacterie beschermen tegen gevaren in zijn omgeving^6,7.

LPS moleculen bestaan uit drie bestanddelen: de lipide A disaccharolipide, de kern oligosaccharide, en de O-polysaccharide of O-antigeen. Lipide A is een vermenigvuldig acylated disaccharolipide. Core-oligosachariden bestaan uit 10-15 suikers die bekend staan als ruwe LPS of R-LPS. De kern is onderverdeeld in het binnenste gebied, samengesteld uit 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonzuur (kdo) en een of meer heptoseresiduen, en een buitengebied dat over het algemeen bestaat uit hexoses (glucose of galactose) en heptoses, of paracetamolsuikers⁵. Het buitenste kerngebied is variabeler in zijn componenten en structuur dan de binnenste kern. In Salmonella spp., slechts een kernstructuur is beschreven; echter, in Escherichia coli zijn er vijf verschillende kernstructuren (aangewezen K-12, R1, R2, R3, en R4)⁸. E. coli K-12 DH5α, die we gebruiken in deze procedure draagt een mutatie die resulteert in de productie R-LPS⁹. De R-LPS moleculen missen de O-antigeen moiety en hebben een vergelijkbaar moleculair gewicht als LOS moleculen.

De toevoeging van O-antigeen aan R-LPS maakt van dit molecuul een gladde LPS, of S-LPS. De O-antigenen zijn opgebouwd uit korte 3-4 koolhydraatsubeenheden en bestaan uit meerdere modaliteiten met verschillende ketenlengtes^10. Sommige LPS-producerende bacteriën, zoals Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), tonen een trimodale verdeling van LPS moleculen op hun oppervlak^10,11. Zeer lange keten O-antigenen kunnen meer dan honderd subeenheden bevatten en meer dan honderd kilodaltons wegen. De O-antigenen bieden oppervlakte-eigenschappen aan de bacterie die nodig zijn om antibiotica te weerstaan, predatie te ontwijken door bacteriofagen en ziekte te veroorzaken.

Soorten Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria en anderen genereren LOS moleculen in plaats van LPS moleculen op hun oppervlak¹². LOS moleculen bestaan uit lipide A en kern oligosachariden, maar missen het O-antigeen. Deze soorten gramnegatieve bacteriën wijzigen hun kernoligosachariden met extra suikers en combinaties van suikers om de oppervlakte-eigenschappen te veranderen¹². Zowel LOS als LPS-producerende microben derivatize de fosfaten op lipide A en kernmoleculen met kationische moieties⁷. Deze toevoegingen omvatten fosfoethanolamine, galactosamine en aminoarabinose substitutie, die functioneren door het neutraliseren van anionische oppervlakte lading en daarmee te beschermen tegen kationische antimicrobiële peptiden. Gram-negatieve bacteriën wijzigen ook de kern oligosaccharide structuur met variabele niet-stoichiometrische vervangingen van suikers, of extra kdo moleculen, en veranderen het aantal acylketens op lipide-A disaccharolipiden⁷.

De mogelijkheid om het IM te isoleren van de OM van gram-negatieve bacteriën is instrumenteel geweest voor het begrijpen van de rol van de celenvelop in antimicrobiële resistentie en ziektepathogenese^11,12. Afleidingen van deze aanpak zijn gebruikt om mechanismen van assemblage, onderhoud en remodelleren van het eiwit, fosfolipiden en glycolipid bestanddelen voor de OM af te leiden.

Ons lab voert routinematig bacteriële lipidomische analyses uit om eiwitgemedieerde lipideregulatie en lipidefunctie te bestuderen in een verscheidenheid van gramnegatieve soorten. De volumes die in het protocol worden gebruikt, weerspiegelen het routinematige gebruik van deze procedure om niet-radiolabelfolipiden te analyseren door dunne laagchromatografie en vloeibare chromatografie tandemmassaspectrometrie^13,14.

Het protocol begint met het blootstellen van een gekoelde suspensie van Gram-negatieve bacteriën aan een hoge osmolar oplossing van sacharose en het toevoegen van lysozyme om de OM te scheiden van de onderliggende peptidoglycan laag (Figuur 1)¹². EDTA wordt vervolgens toegevoegd om penetratie van de lysozyme te vergemakkelijken, omdat divalentkation kation equestration verstoort de laterale elektrostatische overbrugging interacties tussen aangrenzende LOS / LPS moleculen¹⁵. Het oorspronkelijke protocol waaruit de onze is aangepast vereiste de vorming van sferoplasten, een Gram-negatieve bacteriële celvorm die bestaat uit een plasmamembraan en cytosol, maar ontbreekt de peptidoglycan laag en een OM. Het is mogelijk dat sferoplasten worden geproduceerd volgens de aangepaste methode; echter, de techniek is niet afhankelijk of van plan op hun vorming voor succes. In plaats daarvan worden de met lysozyme-EDTA behandelde bacteriën snel geoogst door centrifugeren en opnieuw opgehangen in een sacharoseoplossing van mindere concentratie voordat ze onder druk staan. De OEM's die kunnen zijn vrijgegeven door het vormen van sferoplasten moeten in theorie kunnen worden geoogst uit de supernatants van de behandelde cellen, maar deze aanpak is hierin niet gedetailleerd. Uiteindelijk worden de behandelde cellen onderworpen aan conventionele homogenisatie en lysis, wat de efficiëntie en reproduceerbaarheid van de membraanscheidingsprocedure^{verbetert 16}.

Na lysis worden de totale membranen verzameld door ultracentrifugatie en toegepast op een discontinu sacharosedichtheidgradiënt om de OEM's en OEM's te fractioneren. De klassieke benadering maakt gebruik van een meer continue gradiënt die bestaat uit ten minste vijf verschillende sacharose oplossingen^11,12. De discontinu gradiënt in ons protocol bestaat uit drie sacharoseoplossingen en verdeelt de tweelagen in twee verschillende breuken¹⁷. De LOS- en LPS-moleculen in de OEM's van gramnegatieve bacteriën drijven de envelop naar een bovenste bruine IM-fractie met lage dichtheid en een lagere witte OM-fractie met hoge dichtheid(figuur 1 en figuur 2).

Acinetobacter baumannii zijn belangrijke multiresistente menselijke pathogenen die LOS moleculen produceren in hun OM en een celenvelop oprichten die moeilijk te scheiden is^18,19. Recent werk suggereert dat een afleiding van het protocol dat we hier presenteren kan worden gebruikt om de tweelagen van deze organismen te verdelen²⁰. Daarom hebben we ons protocol getest op A. baumannii 17978. Aanvankelijk was de procedure ontoereikend. We hebben echter de sacharoseconcentratie van de middendichtheidsoplossing gewijzigd en de scheiding aanzienlijk verbeterd(figuur 2). Een NADH dehydrogenase test en een LOS/LPS extractie- en detectieprocedure werden gebruikt om de scheiding voor A. baumannii, wild-type S te bevestigen. Typhimurium en twee O-antigeentekorten van enterobacteriële genotypen; namelijk galE-mutant S. Typhimurium en een laboratoriumstam, E. coli DH5α (figuur 3 en figuur 4).

De bedoeling van dit werk is om een gestroomlijnde aanpak te leveren voor het reproduceerend isoleren van de membranen van gramnegatieve bacteriën. Het protocol kan worden gebruikt om vele soorten membraan-geassocieerde moleculen voor deze microben te bestuderen.

Protocol

1. Algemene reagentia en mediavoorbereiding voor membraanextractie

1. Bacteriële groei media: Bereid en steriliseren 1 L bouillon media in een grondig gereinigden en autoclaved 2 L kolf.
2. Algemene resuspension buffer (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): Los 6,05 g Tris base op in 30 mL van H₂O. Pas de pH aan op 7,5 met 5 M HCl. Pas het eindvolume aan tot 50 mL met ultrazuivere H₂O.
3. Hoofdvoorraad van divalent kationchelatieoplossing (0,5 M EDTA pH 8; 100 mL): Voeg 18,6 g dinatriumethyleentetraacetaat·2H₂O tot 80 mL van H₂O toe. Roer krachtig en pas de pH aan 8,0 aan met NaOH. Pas het eindvolume aan op 100 mL met ultrapure H₂O.
   LET OP: Het dinatriumzout van EDTA lost niet op totdat de pH van de oplossing is aangepast aan ~8,0 door toevoeging van NaOH.
4. Osmotische buffer A (0,5 M sacharose, 10 mM Tris pH 7.5; 1 L): Weeg 171,15 g sacharose en breng over op een 1 L cilinder. Voeg 10 mL van 1 M Tris pH 7.5 toe. Pas aan op een eindvolume van 1 L met ultrapure H₂O. Bewaar op 4 °C.
5. Lysozyme (10 mg/mL; 5 mL): Weeg 50 mg (kippeneiwit) lysozyme en los op in 5 mL ultrapure H₂O. Bewaar bij 4 °C.
6. Verdunde divalente kationchelatieoplossing (1,5 mM EDTA; 500 mL): Voeg 1,5 mL van 0,5 M EDTA (stap 1.3) toe aan 497,5 mL ultrapure H₂O. Store bij 4 °C.
7. Osmotische buffer B (0,2 M sacharose, 10 mM Tris pH 7.5; 2 L): Weeg 136,8 g sacharose en breng over naar een 2 L cilinder. Voeg 20 mL van 1 M Tris pH 7.5 toe. Pas het eindvolume aan op 2 L met ultrapure H₂O. Bewaar op 4 °C.
8. Nuclease co-factor (1 M MgCl₂; 10 mL): Los 2,03 g MgCl₂·6H₂O in 8 mL ultrapure H₂O. Pas het volume aan op 10 mL. Bewaar op kamertemperatuur.
9. Nuclease solution cocktail inclusief RNase en DNase enzymen: Zie Table of Materials. Bewaar op -20 °C.
10. Proteaseremmer cocktail: Zie Tabel van materialen. Bewaar bij 4 °C.
11. Low-density isopycnic sucrose gradient solution (20% w/v sacharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Solution; 100 mL): Weeg 20 g sacharose en breng over naar een 200 mL cilinder. Voeg 100 μL van 1 M Tris Buffer pH 7,5 en 200 μL van 0,5 M EDTA pH 8 toe. Pas het eindvolume aan op 100 mL met ultrapure H₂O. Bewaar bij kamertemperatuur.
12. Gemiddelde dichtheid isopycnic sucrose gradiënt oplossing (53% w/v sacharose, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Oplossing; 100 mL): Weeg 53 g sacharose en overdracht naar een 200 mL afgestudeerde cilinder. Voeg 100 μL van 1 M Tris Buffer pH 7,5 en 200 μL van 0,5 M EDTA pH 8 toe. Pas het eindvolume aan op 100 mL met ultrapure H₂O. Bewaar bij kamertemperatuur.
    LET OP: Bereid deze oplossing voor in een gegradueerde cilinder om de nauwkeurigheid te garanderen vanwege het hoge percentage sacharose. Voeg een magnetische roerstaaf toe en roer tot de sacharose volledig in oplossing is opgelost. Dit proces kan enkele uren duren.
13. High-density isopycnic sucrose gradient solution (73% w/v sacharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Solution; 100 mL): Weeg 73 g sacharose en breng over naar een 200 mL gegradueerde cilinder. Voeg 100 μL van 1 M Tris Buffer pH 7,5 en 200 μL van 0,5 M EDTA pH 8 toe. Pas het eindvolume aan op 100 mL met ultrapure H₂O. Bewaar bij kamertemperatuur.
    LET OP: Bereid deze oplossing voor in een gegradueerde cilinder om de nauwkeurigheid te garanderen vanwege het hoge percentage sacharose. Voeg een magnetische roerstaaf toe en roer tot de sacharose volledig is opgelost. Dit proces kan enkele uren duren.
14. Geïsoleerde membraanopslagbuffer (10 mM Tris Buffer pH 7.5; 1 L): Voeg 1 mL van 1 M Tris Buffer pH 7,5 toe aan een 1 L-kolf en pas het uiteindelijke volume aan 1 L aan met ultrazuivere H₂O.
15. β-Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) (10 mg/mL-oplossing): Resuspend 10 mg NADH in ultrapure H₂O. Bereid wekelijks verse voorraden voor. Bewaar op -20 °C.
16. Fenoloplossing gelijkgemaakt met 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA: Zie Materiaaltafel. Bewaar de oplossing op 4 °C.
17. Lipopolysaccharide gel vlek kit: Zie Tabel van materialen.
18. Bradford reagens: zie tabel van materialen.
    OPMERKING: Alle oplossingen en media moeten worden voorbereid binnen de week na het uitvoeren van de test om consistente resultaten te garanderen.

2. Bereiding van bacteriën voor membraanextractie

1. Streep de bacteriën uit bevroren glycerol voorraden op verse agar platen. Bewaar de platen op 4 °C zodra kolonies zich ontwikkelen. Inenting een enkele kolonie in een 5 mL buis gevuld met bouillon media en cultuur van de bacteriën zoals gewenst 's nachts.
2. Back-verdunde de nachtelijke bacteriële cultuur in 1 L van de voorkeur bouillon media en cultuur van de bacteriën tot de gewenste optische dichtheid is bereikt.
   LET OP: Inenting van een enkele bacteriële kolonie in 1 L van bouillon media wordt aanbevolen voor mutant genotypes die gevoelig zijn voor het onderdrukken van groei fenotypes, maar sommige Gram-negatieve bacteriën gewoon langzamer groeien dan anderen. Als het niet mogelijk is om een voldoende cultuurdichtheid te bereiken door single-colony inenting, terug verdunnen van een 's nachts cultuur in 1 L van de media is een strategie om de groei te synchroniseren. Bacteriële membraansamenstelling varieert afhankelijk van de groeifase van de cultuur (logaritmische versus stationaire fase)¹³. Groeicurven die de verandering in optische dichtheid voor de bacteriële culturen als functie van de tijd meten, moeten worden uitgevoerd met alle stammen om de cultuurdichtheid te correleren met de groeifase.
3. Zet de kolven met de bouillonculturen op ijs. Lees de optische dichtheid op 600 nm (OD₆₀₀₎en bereken het volume van de cultuur dat gelijk is aan tussen 6,0 en 8,0 x 10¹¹ bacteriële kolonie vormen eenheden (cfu). Voor S. Typhimurium, dit komt overeen met 1 L van cultuur bij een OD₆₀₀ van tussen 0.6-0.8, aangezien een OD₆₀₀ van 1.0 gelijk is aan ongeveer 1.0x10⁹ cfu/mL. Voeg dit volume toe aan een centrifugebuis en zorg ervoor dat de resterende culturen in het ijs blijven totdat ze worden gebruikt.
4. Pellet de bacteriën door centrifugering bij 4 °C bij 7.000-10.000 x g in een vaste hoek hoge snelheid centrifuge gedurende 10 min.
   LET OP: Verwarm en houd de centrifuges op een lage temperatuur. Houd de monsters gedurende de gehele procedure op ijs.
5. Decanter en gooi de supernatant voorzichtig weg.
   LET OP: De pellet kan worden geflasht bevroren en/of opgeslagen bij -80 °C als de membraanfracties niet onmiddellijk worden geëxtraheerd. Het wordt echter aanbevolen om direct verder te gaan met plasmolyse op dezelfde dag dat de cellen worden geoogst, en wordt vooral aanbevolen voor niet-enterobacteriële soorten.

3. Dissociatie van het buitenste membraan en plasmolyse

1. Ontdooi de celpellets op ijs indien deze eerder bij -80 °C zijn opgeslagen en bewaar de monsters op ijs voor de rest van de procedure. Resuspend elke celpellet in de centrifugebuis in 12,5 mL buffer A. Voeg een magnetische roerbalk toe aan de suspensie van cellen.
2. Voeg 180 μL van 10 mg/mL lysozyme (eindconcentratie van 144 μg/mL) toe aan elke celresussing. Houd de monsters op ijs onder het roeren gedurende 2 min.
3. Voeg 12,5 mL van 1,5 mM EDTA-oplossing toe aan elke celresuspensie en blijf nog 7 m in het ijs roeren op ijs.
4. Decanter de suspensie in een conische buis van 50 mL en centrifugeer bij 9.000-11.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
5. Gooi supernatants in een biohazard afvalcontainer en bewaar de pellets op ijs.
6. Voeg 25 mL buffer B toe aan de celpellet.
7. Voeg 55 μL van 1 M MgCl_2,1 μL RNase/DNase nuclease reagens toe (om viscositeitproblemen te voorkomen die verband houden met bacteriën die plasmolyse ondergaan voorafgaand aan de homogenisatie) en 1 μL proteaseremmercocktail aan het volume van buffer B dat bovenop de pellet zit
8. De pellet opnieuw opschorten in het meng-B-buffer. Krachtig pipet en vortex tot het observeren van een homogene oplossing.
   LET OP: Het is zeer belangrijk om een homogene oplossing te hebben voordat u overgaat tot stap 4 van dit protocol. De geresuspendeerde cellen moeten een viskeuze cake-beslag achtige verschijning en consistentie.
9. Vortex elk monster voor 15 s. Behouden schorsingen op ijs en ga naar Stap 4.

4. Homogenisatie onder druk en lysis

LET OP: Verschillende methoden kunnen worden gebruikt voor lysis. Sonicatie is niet ideaal vanwege de warmteopwekking. Osmotische lyse kan worden bereikt, maar is vaak inefficiënt. Daarom raden we hogedruklyse aan. Hoge druk lyse kan worden bereikt met behulp van een verscheidenheid van instrumenten. Wij stellen homogenisatiemachines voor, zoals de Franse Pers of de Emusliflex. We werken met vele soorten Gram-negatieve bacteriën waarvan de respons op hoge osmolar sacharose oplossingen varieert. De hogedrukhomogenisatiestap verbetert de efficiëntie, reproduceerbaarheid en opbrengst.

1. Verwarm de Franse perscel bij 4 °C of steek de metalen spoel van de homogenisatormachine op ijs.
2. Giet het monster in de Franse drukcel of de homogenisator-monstercilinder en breng de cel onder de gewenste homogenisatiedruk (10.000 psi moet voldoende zijn bij het gebruik van een Franse pers of 20.000 psi bij gebruik van een homogenisator).
3. Pas de uitlaatstroomsnelheid aan op ongeveer één druppel per seconde met behoud van de druk als u gebruik maakt van een Franse pers.
4. Verzamel het cellysaat in conische buizen van 50 mL terwijl de monsters op ijs worden gehouden.
5. Herhaal stap 4.2-4.4 drie tot vijf keer om volledige lysis te bereiken, meestal aangegeven door een geleidelijke toename van de transparantie van de steekproef.
   LET OP: De monsterkamer moet worden gewassen en gelijkgesteld met Buffer B tussen de monsters.
6. Houd lysed cellen op ijs.

5. Totale membraanfractionatie

1. Centrifugeer de gelyseerde bacteriële monsters op 6.169 x g gedurende 10 min bij 4 °C tot pellet intact celmateriaal. (bijvoorbeeld onlyseerde bacteriële cellen).
2. Verdeel het resterende deel van de supernatant, die nu de gehomogeniseerde membranen bevat in een polycarbonaatfles voor ultracentrifugatie.
   LET OP: Indien nodig kunnen celmonsters worden gebalanceerd door te verdunnen met buffer B.
3. Ultracentrifugeert de cel met 184.500 x g gedurende ten minste 1 uur, bij 4 °C. Deze stap kan 's nachts worden uitgevoerd zonder de kwaliteit van de membranen te beïnvloeden.
4. Gooi de resterende supernatant aanwezig in de ultracentrifugebuis en houd membraankorrels op ijs (Figuur 1).
5. De membraanpellets opnieuw opschorten in 1 mL van de isopycnic-sacharosegradiëntoplossing met een glas-dounce homogenisator. Gebruik een glazen Pasteur pipet om het monster te homogenaat over te brengen op een microcentrifugebuis van 1,5 mL en op ijs te bewaren.
   LET OP: Als alleen de totale membraansamenstellingsanalyse gewenst is, vervang 1 mL van isopycnic-sacharosegradiëntoplossing met een lage dichtheid voor 1 mL van geïsoleerde membraanopslagbuffer. Stap 5.5 is het eindpunt van isolatie als alleen totaalbacteriële membraanmonsters gewenst zijn. Bewaar monsters bij -20 °C totdat verdere downstream analyse nodig is.

6. Dichtheidgradiënt Ultracentrifugatie om de dubbele membranen te scheiden

1. Verzamel het juiste aantal polypropyleen van 13 mL of ultraheldere open-top buizen die zijn opgegeven voor een slingerende emmerrotor en ultracentrifuge.
2. Houd de buis in een licht gekantelde positie en bereid de sacharosegradiënt voor door langzaam sacharoseoplossingen toe te voegen van hogere dichtheid naar lagere dichtheid in de volgende volgorde:
   2 mL van 73% w/v sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
   4 mL van 53% w/v sacharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
   1. Voeg vervolgens de totale membraanfractie (1 mL) toe, die opnieuw is opgehangen in de 20% w/v sacharose-oplossing (stap 5.5). Vermijd het mengen van de membraanfractie met de sacharoseoplossing die eronder ligt. Er moeten verdelingen zichtbaar zijn tussen elk van deze lagen.
   2. Vul ten slotte de buis met de low-density isopycnic-sacharose gradiënt oplossing (ca. 6 mL). Polypropyleen en ultraheldere open-top buizen moeten zo vol mogelijk (2 of 3 mm van de buistop) worden gevuld voor buisondersteuning.
3. Aanpassing voor Acinetobacter baumannii 17978
   1. Pas een aangepast sacharoseverloop aan voor gebruik met verschillende bacteriële exemplaren. Voor A. baumanniibood de volgende sacharosegradiënt een completere scheiding van de membranen (figuur 2).
      2 mL van 73% w/v sacharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
      4 mL van 45% w/v sacharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
   2. Voeg vervolgens de totale membraanfractie (1 mL) toe, die opnieuw is opgehangen in de 20% w/v sacharose-oplossing (stap 5.5). Vermijd het mengen van de membraanfractie met de sacharoseoplossing die eronder ligt. Er moeten verdelingen zichtbaar zijn tussen elk van deze lagen.
   3. Vul ten slotte de buis met een isopycnic-sacharosegradiëntoplossing met een lage dichtheid (ca. 6 mL). Polypropyleen en ultraheldere open-top buizen moeten zo vol mogelijk (2 of 3 mm van de buistop) worden gevuld voor buisondersteuning.
4. Ultracentrifugeer de monsters met een swingende-emmer rotor op 288.000 x g en 4 °C 's nachts.
   LET OP: Voor de volumes die in de vorige stappen zijn gebruikt, raden we centrifugatietijden aan tussen 16 uur en 23 uur.
5. Snijd het uiteinde van een P1000 pipet tip ongeveer 5 mm van het punt. Verwijder de bovenste bruine IM-laag met behulp van de pipet. Breng de IM-fractie in een polycarbonaatfles voor ultracentrifugatie.
6. Laat ongeveer 2 mL van de sacharose-oplossing boven de 53-73% interface om ervoor te zorgen dat de lagere witte OM niet besmet is met de IM-fractie. Herhaal de pipetterprocedure vanaf stap 6.4 voor de OM-fractie (figuur 1).
   LET OP: De membranen kunnen ook worden verzameld door de centrifugebuizen aan de onderkant met behulp van een naald te prikken en de membranen als breuken druppelwijs te verzamelen.
7. Vul de resterende leegte van de ultracentrifugebuis met een geïsoleerde membraanopslagbuffer en meng door inversie of pipettering. Bewaar de monsters op ijs.
8. Verzamel de nu gewassen en geïsoleerde membranen door ultracentrifugatie bij 184.500 x g voor 1 uur en 4 °C.
9. Gooi de supernatant weg en storing de membranen opnieuw op door te dounce-homogenisatie. Voeg 500-1000 μL opslagbuffer toe. Verzamel monsters in 2 mL microcentrifuge buizen.
10. Bewaar de bacteriële membraanmonsters op -20 °C.

7. Bevestiging van de scheiding van de tweelagen

LET OP: Onvolledige scheiding van de tweelagen kan optreden als gevolg van technische fouten of de unieke cel envelop samenstelling van sommige soorten. Om de scheiding te bevestigen, adviseren we het gebruik van twee onafhankelijke testen om de mate van kruisbesmetting tussen de tweelagen te kwantificeren. De eerste test detecteert de enzymatische activiteit van NADH dehydrogenase, die uitsluitend bestaat in de IM. De tweede test detecteert de aanwezigheid van LOS of LPS, die voornamelijk bestaat in de OM.

1. Bevestigen dat de OEM's geïsoleerd zijn van de chatberichten
   1. Meet de eiwitconcentratie in elke geïsoleerde membraanfractie met behulp van een Bradford-eiwittest.
   2. Voeg het monstervolume tussen 50 en 500 μg eiwit toe aan een lege microcentrifugebuis van 2 mL. De concentratie zal variëren afhankelijk van de soort, maar 50 μg is meestal voldoende voor Enterobacteriaceae. Voeg het juiste volume van 10 mM Tris-buffer toe om een totaal volume van 990 μL te bereiken. Breng de inhoud over naar een cuvette voor spectrofotometrie.
   3. Voeg 10 μL van een 10 mg/mL-oplossing van NADH toe aan het monster en meet de initiële absorptie op 340 nm.
   4. Blijf de absorptie om de 30 s gedurende 5 min meten.
   5. Stel de gegevens samen en grafiek de verandering in absorptie (y-as) versus de verandering in tijd (x-as) voor elke membraanfractie (Figuur 3).
2. Bevestigen dat de chatberichten geïsoleerd zijn van de OEM's
   1. Voeg het monstervolume tussen 50 en 500 μg eiwit toe aan een lege microcentrifugebuis van 2 mL. De concentratie zal variëren afhankelijk van de bacteriële soort, maar 50 μg is meestal voldoende voor Enterobacteriaceae. Vul tot een eindvolume van 100 μL met fosfaatgebufferde zoutoplossing, hierna de waterige fase genoemd.
   2. Voeg 5 μL Proteinase K (voorraad 800 U/mL) toe aan de waterfase en incubeer 's nachts bij 59 °C.
   3. Verwarm een aliquot van 10 mL van tris-verzadigd Fenol gedurende 10 min bij 68 °C.
   4. Draai de waterige fasemonsters die met de Proteinase K werden behandeld en voeg het "hete" Tris-verzadigde Fenol toe bij een 1:1 verhouding met de waterige fase, vortex krachtig en incubeer bij 68 °C gedurende 10 min.
   5. Breng de nu melkwitte monsters van 68 °C over naar een ijswaterbad en broed gedurende 10 min.
   6. Centrifugeer de monsters op 2.100 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
   7. Breng de bovenste waterige fase over op een nieuwe buis en bewaar de buis op -20 °C als het monster niet onmiddellijk moet worden gebruikt.
   8. Verdun monsters in sds-loading buffer en laad de putten van een 4-20% Tris-glycine gradiënt gel.
   9. Elektrofore gedurende 45 minuten of tot het kleurstoffront zich aan de onderkant van de gel bevindt.
   10. Bevlek de gel met behulp van de LPS-kleuringkit volgens de instructies van de fabrikant.

Representative Results

Deze techniek biedt een effectief middel om de OEM's en OEM's te isoleren voor gramnegatieve bacteriën. Een overzicht van de gehele procedure wordt geïllustreerd (figuur 1). In het algemeen zal de normalisatie van culturen tot een OD₆₀₀ van 0,6-0,8 in 1 L van de media, of het oogsten tussen 6,0 en 8,0 x 10¹¹ bacteriële cellen ervoor zorgen dat de juiste hoeveelheid membraanmateriaal wordt verzameld voor latere scheiding.

Bij het lyseren van de bacteriën en het ultracentrifuging van het lysaat, zal een kleverige bruine totale membraankorrel zichtbaar zijn aan de onderkant van de ultracentrifugebuis. Na het schrapen, dounce-homogeniseren en ultracentrifuging van het membraan over de discontinu sacharosedichtheidgradiënt, moeten de IM en OM worden gescheiden zoals afgebeeld (figuur 2). We stelden vast dat het sucrose-dichtheidsverloop van 20%/53%/73% (w/v) onvoldoende was om de envelop van A. baumanniite verdelen , terwijl een verloop van 20%/45% /73% w/v voldoende was (figuur 2).45%

Verschillende analysemethoden kunnen worden gebruikt om de kwaliteit en zuiverheid van elke membraanfractie te beoordelen. NADH-dehydrogenase is een binnenmembraanenzym dat nadh-oxidatie katalyseert naar NAD (Figuur 3). Gezien de cellulaire lokalisatie, kan het worden gebruikt om kruisbesmetting tussen OEM's en OEM's te bepalen. Volgens de absorptiespectra van beide moleculen hebben NAD en NADH elk een piekabsorptie op 260 nm, terwijl alleen NADH een maximale absorptie heeft op 340 nm. Een afname van de absorptie bij 340 nm zou dus wijzen op oxidatie van NADH naar NAD en dus de aanwezigheid van het enzym in het monster. Als de membranen goed scheiden, mag deze verandering in absorptie alleen plaatsvinden in IM-monsters (figuur 3). Een afname van de absorptie in OM-monsters zou wijzen op kruisbesmetting met IM-materialen. Voor A. baumanniiwas drie keer de hoeveelheid membraan, of 150 μg eiwitequivalenten, nodig om vergelijkbare niveaus van NADH-dehydrogenaseactiviteit aan te tonen als voor de enterobacteriële stammen (figuur 3). Daarom is het mogelijk dat de niveaus van NADH oxidase lager zijn voor A. baumannii of dat de specifieke activiteit van het enzym wordt verminderd.

De buitenste bijsluiter van het OM bestaat voornamelijk uit LOS- of LPS-moleculen. Daarom zal de extractie van LPS/LOS uit de IM- en OM-monsters met daaropvolgende elektroforese en visualisatie door LPS-kleuring de verrijking van deze structuren in de OM weerspiegelen in vergelijking met de IM-breuken. Synthese van LOS en LPS moleculen begint in het cytoplasma en wordt voltooid aan het oppervlak van de IM⁵. LOS- en LPS-structuren worden unidirectioneel naar de OM getransporteerd en in de buitenste bijsluiter geplaatst. Aangezien biosynthese betrekking heeft op precursorgehechtheid aan de IM, wordt altijd een zwak bandingpatroon waargenomen voor de IM-breuken. De intensiteit van de moleculen in de OM-fractie is echter veel groter dan in de IM-fractie, als gevolg van de verrijking van de LOS/LPS-structuren (figuur 4). De hoeveelheid membraan verkregen werd gemeten door het bepalen van de eiwitconcentratie in de suspensie. Zes keer de hoeveelheid membraan was nodig om LOS uit A. baumannii te extraheren en te detecteren in vergelijking met de hoeveelheid die nodig is om LPS-moleculen uit de enterische organismen te detecteren (figuur 4). We redeneren dat dit een verlaagd niveau van LOS-moleculen in de OM voor deze organismen zou kunnen weerspiegelen in vergelijking met eiwitniveaus, maar deze hypothese niet in detail hebben nagestreefd.

Figuur 1: Een schema tische beeltenis van de Gram-negatieve bacteriële membraan isolatie procedure beschreven in dit methoden artikel. Getoond wordt de procedure die wordt gebruikt voor het verzamelen van bacteriële cellen en het isoleren van de totale, innerlijke (IM) en buitenste membranen (OM). De aanpak is gebaseerd op de verhoogde dichtheid van de OM-tweelaag voor deze microben in vergelijking met de dichtheid van de IM-bilayer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Representatieve resultaten voor verschillende gramnegatieve soorten waarvan de membranen werden geïsoleerd met behulp van de standaard en de gewijzigde sacharosedichtheidsgradiënten beschreven in dit artikel. Afbeeldingen van discontinu sacharosedichtheidsgradiënten na isopycnic centrifugatie voor (A) wild-type Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028s,b) galE-mutant S. Typhimurium LT2, dat LPS-moleculen produceert die verstoken zijn van O-antigenen, en (C) Escherichia coli K-12 DH5α, die ook LPS-moleculen produceert die o-antigenen missen. Het binnenste membraan (IM) wordt gescheiden van het buitenste membraan (OM) en lokaliseert naar de 20-53% sacharose-interface als bruin materiaal. De witte OM-laag lokaliseert naar de 53-73% sacharose-interface vanwege de hogere dichtheid van deze fractie. (D) De totale membranen van de wilde acinetobacter baumanii 17978 niet gescheiden met behulp van 20%/53%/73% (w/v) sacharose gradiënt, (E) maar wel gescheiden met behulp van de 20%/45%/73% (w/ v) sacharose gradiënt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Representatieve resultaten voor de NADH dehydrogenase test zuiverheid van het buitenste membraan (OM). De aanwezigheid van het enzym, NADH-dehydrogenase, werd getest in monsters van inner (IM) en OM om de efficiëntie van de scheiding te testen. (A) De oxidatie van NADH naar NAD wordt gekatalyseerd door een enzym in de bacteriële IM. Het reactiesubstraat (NADH) heeft een maximale absorptie bij 340 nm; Daarom is een afname van de optische dichtheid op deze golflengte indicatief voor de aanwezigheid van het enzym in het monster. De chatberichten en OEM's werden gemeten voor (B) wild-type S. Typhimurium, (C) E. coli K-12 DH5α en (D) galE-mutant S. Typhimurium. Deze membranen werden geïsoleerd met behulp van een isopycnic sucrose dichtheid gradiënt van 20%/53%/73% w/v sacharose. Voor A. baumanniiwerden de membranen geïsoleerd met behulp van een gradiënt van 20%/45%/73% w/v sacharose. De NADH-test om de zuiverheid van membranen te testen, werd gedaan met behulp van (E) 50 μg voor de enterobacteriële organismen en (F) 150 μg totale eiwitten voor A. baumannii. Een hogere concentratie eiwit werd toegevoegd in (F), omdat de curve voor (E) suggereerde dat de relatieve niveaus van NADH dehydrogenase in vergelijking met het totale eiwit minder waren voor A. baumannii dan voor S. Typhimurium en E. coli. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Representatieve resultaten voor de LPS- en LOS-extractie- en visualisatieprocedure om de zuiverheid van het binnenste membraan (IM) te testen. Het volume membraanmonster dat overeenkomt met 50 μg totaal eiwit werd gebruikt om LPS uit het IM- en buitenste membraan (OM) van S te extraheren. Typhimurium en E. coli DH5-alpha. Het volume membraanmonster dat overeenkomt met 300 μg totaal eiwit werd gebruikt om LPS uit de membranen van A. baumannii te extraheren. De volumes werden genormaliseerd tot 100 μl met endotoxinevrij water en werden behandeld met Proteinase K. LPS of LOS werden geëxtraheerd door warmfenolextractie (1:1 water:fenol) en 21 μl van de extracten werden geladen op een 4-20% gradiënt polyacrylamidegel en gevisualiseerd door PRO-Q Emerald 300-kleuring om de kruisverontreiniging van IM-fracties met OM-materialen te beoordelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Deze methode zal onderzoekers blijven helpen bij het begrijpen van de rol van de celenvelop in bacteriële fysiologie en pathogenese. Na de sequentiële ultracentrifugatiestappen kan een gezuiverd totaal-, binnen- en OM-fractie worden verkregen. Deze membranen kunnen afzonderlijk worden getest om hypothesen te testen met betrekking tot membraaneiwitlokalisatie en -functie, transport en handel over het periplasma en de samenstelling van de individuele tweelagen onder verschillende omgevingsomstandigheden. Biologische studies naar de betrokkenheid van individuele OM-componenten bij pathogenese, zoals LOS/ LPS en OM-eiwitten, kunnen ook worden uitgevoerd in dier- en cellulaire modellen met behulp van geïsoleerde membraanfracties die door deze techniek worden verzameld.

Onze procedure is geoptimaliseerd voor gebruik met Enterobacteriaceae, in het bijzonder S. Typhimurium, dat LPS-moleculen produceert die O-antigenen van variabele kettinglengte bevatten. Dit protocol werkt ook voor de modelbacterie E. coli K-12, die het genetische vermogen heeft verloren om O-antigenen te synthetiseren. Met behulp van wild type en O-antigeen deficiënte S. Typhimurium 14028s en E. coli K-12 stam DH5α, tonen we aan dat de mogelijkheid om de membranen voor deze microben te scheiden niet wezenlijk wordt beïnvloed door de aanwezigheid van de O-antigenen. Echter, om de envelop van de LOS-producerende bacterie, A. baumannii 17978, te scheiden, moesten we de concentratie van de middendichtheid sucrose oplossing in de discontinu gradiënt te verminderen om de tweelagen te isoleren (Figuur 2). Met name het verschuiven van de concentratie van de oplossing met de middendichtheid van 53 naar 45% was voldoende om de OM in staat te stellen te verdelen naar de 45-73% interface in de aangepaste gradiënt. Bij het gebruik van de 53-73% gradiënt voor A. baumannii, werd het grootste deel van het OM-materiaal vaak iets onder de IM-fractie waargenomen bij de 20-53% interface (figuur 2). Spaarzaam OM materiaal was aanwezig op de 53-73% interface voor A. baumannii. Uit deze resultaten bleek dat de 20%/53%/73% gradiënt onvoldoende is voor het scheiden van de tweelagen van A. baumannii onder deze omstandigheden.

Samengevat kunnen aanpassingen worden aangebracht aan de dichtheidsgradiënt om organismen met een gevarieerd OM-glycolipidgehalte en -niveau tegemoet te komen, en de aanpak kan worden aangepast voor andere gramnegatieve bacteriën.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene	VWR	525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap	VWR	10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth	VWR	10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well	BIORAD	4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL	BIORAD	1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes	VWR	89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles	VWR	71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355622
Agar Powder	VWR	A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe	VWR	89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)	ThermoFisher Scientific	50136146
Benzonase Nuclease	MilliporeSigma	70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker	VWR	4040-01
EmulsiFlex-C3	Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor	ThermoFisher Scientific	75006526
Hydrochloric acid 6.0 N	VWR	BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker	Fischer Scientific	15-453-211
LB Broth Miller	VWR	214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade	VWR	VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
NADH	Sigma Aldrich	10107735001
Optima XPN-80 - IVD	Beckman Coulter Life Sciences	A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS	Fischer Scientific	NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology	Sigma - Millipore	P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit	Thermofisher	23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit	Thermofisher	P20495
Proteacease -50, EDTA free	G Biosciences	786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade	New England Biolabs	P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99%	VWR	AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge	ThermoFisher Scientific	36-101-0816
Sucrose	MilliporeSigma	SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter Life Sciences	331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker	VWR	JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	Beckman Coulter Life Sciences	339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm	Beckman Coulter Life Sciences	344059
Vortex-Genie 2	VWR	102091-234