Summary
革兰氏阴性细菌产生两个空间隔离膜。外膜由围皮层和气膜层从内膜分割。分离这些微生物的双层的能力对于了解它们的生理和发病机制至关重要。
Abstract
该方法通过将Gram阴性细菌的包络分为全膜、内膜和外膜（OM）分数，最后进行检测，以评估双层的纯度。OM 与内膜相比，整体密度增加，这主要是由于外张中存在脂糖 （LOS） 和脂多糖 （LPS）。LOS 和 LPS 分子是具有类似结构的两栖糖脂，它由脂质-A 脱沙脂和核寡糖基物组成。然而，只有LPS分子用第三个子单位（称为O-多糖，或O抗原）装饰。存在的糖脂的类型和量将影响生物体的OM密度。因此，我们测试了糖脂含量变化的细菌膜是否可以使用我们的技术进行类似的分离。对于产生LPS的生物体，沙门氏菌血清型典型和大肠杆菌，膜很容易分离，LPS O抗原莫伊蒂不影响双层分裂。鲍曼尼阿辛托细菌产生LOS分子，其质量与O抗原不足的LPS分子相似;然而，这些微生物的膜最初无法分离。我们推断，A. Baumannii的OM比肠杆菌的密度小，因此对蔗糖梯度进行了调整，并分离了膜。因此，该技术可以进行调整和修改，以便与其他生物体一起使用。
Introduction
革兰氏阴性细菌产生两个膜，由围皮空间和肽多基细胞壁1分离。内膜 （IM） 包裹细胞醇，是磷脂的对称双层。Peptidoglycan 可防止黄土压，并为细菌提供细胞形状，并通过脂蛋白2、33连接到外膜 （OM）。OM 环绕着周围，主要是不对称的。内单由磷脂组成，外单由被称为脂质糖（LOS）或脂质糖（LPS）4、5的糖脂组成。4,5外文中LOS/LPS分子的脂质不对称和生物化学赋予了细胞表面屏障特性，保护细菌免受其环境中的危害。,7
LPS分子由三个成分组成：脂质A脱糖脂、核心寡糖和O-多糖或O抗原。脂质A是一种成倍的青化脱糖脂。核心寡糖由 10-15 种糖组成，称为粗糙 LPS 或 R-LPS。核心被细分为内区，由2-keto-3-脱氧-D-八氯苯酚酸（kdo）和一个或多个异丙酮残留物组成，外区域通常由异丙酮（葡萄糖或乳糖）和异糖组成，或乙酰氨基糖5。外芯区域的组成和结构比内核更可变。在沙门氏菌中，只描述了一个核心结构;然而，在大肠杆菌中有五种不同的核心结构（指定K-12、R1、R2、R3和R4）8。8大肠杆菌K-12 DH5+，我们在这个过程中使用携带突变，导致生产R-LPS9。9R-LPS分子缺乏O抗原多性，其分子量与LOS分子相似。
在R-LPS中加入O抗原，使这种分子变成平滑的LPS，或S-LPS。O抗原由短3-4碳水化合物亚单位组成，由不同链长10的多种形态组成。一些产生LPS的细菌，如沙门氏菌肠血清菌型（S.典型，在其表面10，11,11上显示LPS分子的三模态分布。超长链O抗原可以包含超过一百个子单位，重量超过一百千元。O抗原为细菌提供表面特性，这些特性是抵抗抗生素、逃避噬菌体捕食和引起疾病所必需的。
弯曲杆菌、博尔德泰拉、阿辛托细菌、血友、奈塞利亚等物种在其表面12上产生LOS分子，而不是LPS分子。LOS分子由脂质A和核心寡糖组成，但缺乏O抗原。这些类型的克拉姆阴性细菌修改其核心寡糖与额外的糖和糖的组合，以改变表面属性12。LOS和LPS产生的微生物都衍生出脂质A和核心分子上的磷酸盐，具有阳离子莫伊酸7。这些添加物包括磷脂胺、乳糖胺和氨基拉比诺替代物，它们通过中和阴离子表面电荷发挥作用，从而防止阳离子抗菌肽。革兰氏阴性细菌还用糖的可变非糖基法替代或额外的kdo分子来改变核心寡糖结构，并改变脂质-A脱糖脂7上的acyl链的数量。
将IM从克拉姆阴性细菌的OM中分离的能力有助于了解细胞包络在抗微生物药物耐药性和疾病发病机制中的作用。,12该方法的推导用于推断OM的蛋白质、磷脂和糖脂成分的组装、维护和重塑机制。
我们的实验室定期进行细菌性脂质分析，以研究各种克拉姆阴性物种中蛋白质介导的脂质调节和脂质功能。协议中使用的体积反映了这个程序的常规使用，通过薄层色谱和液色谱串质谱13，14,14分析非放射性标记的磷脂。
该协议首先将克拉姆阴性细菌的冷冻悬浮液暴露在蔗糖的高渗透溶液中，并加入溶酶酶，将OM与底层的肽多解酶层分离（图1）12。然后添加EDTA以方便淋酶的渗透，因为二价阳离子固固会破坏相邻LOS/LPS分子15之间的横向静电桥接相互作用。我们原来的协议已经适应需要形成球蛋白，一种由血浆膜和细胞溶质组成的Gram阴性细菌细胞形式，但缺乏肽多解层和OM。有可能由经过调整的方法产生球体;然而，该技术并不依赖或打算依靠它们的形成来取得成功。相反，在加压淋液之前，通过离心和重新悬浮在浓度较低的蔗糖溶液中，解压酶-EDTA处理的细菌会迅速收获。理论上，可能通过形成球蛋白释放的OEM应该从经过处理的细胞的超钠中收集，但这种方法在这里没有详细说明。最终，经过处理的细胞受到传统的均质化和赖塞，提高了膜分离程序16的效率和可重复性。
在镇理作用后，通过超离心采集总膜，并应用于不连续蔗糖密度梯度，以分馏IM和OEM。经典方法使用一个更连续的梯度，包括至少五个不同的蔗糖溶液11，12。11,我们协议中的不连续梯度由三个蔗糖解组成，并将双层划分为两个不同的分数17。Gram阴性细菌的OM中的LOS和LPS分子驱动包络分割成上棕色低密度IM分数和低白色高密度OM分数（图1和图2）。
甲酸杆菌是重要的耐多药人类病原体，在OM中产生LOS分子，并竖立一个难以分离的,细胞包络。最近的研究表明，我们在这里介绍的协议的推导可以用来分割这些生物体的两层20。因此，我们在A. baumannii 17978 上测试了我们的协议。最初，程序不够充分。然而，我们修改了中密度溶液的蔗糖浓度，并大大提高了分离（图2）。NADH脱氢酶测定和LOS/LPS提取和检测程序用于确认野生S型A.baumannii的分离。典型和两个O抗原缺乏肠细菌基因型;即，加仑-突变S。典型和实验室菌株，大肠杆菌DH5+（图3和图4）。
这项工作的目的是提供一种简化的方法，以可重现地隔离Gram阴性细菌的膜。该协议可用于研究这些微生物的多种膜相关分子。
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Protocol
1. 膜提取的一般试剂和介质制备
- 细菌生长介质：在彻底清洁和自洗的2 L烧瓶中制备和消毒1升肉汤。
- 一般重新悬浮缓冲液（1 M Tris 缓冲 pH 7.5;50 mL）：在 30 mL 的 H2O. 将 pH 调整到 7.5 与 5 M HCl2的 Tris 基 6.05 g。
- 二价阳化溶液（0.5 M EDTA pH 8;100 mL）主库存：加入18.6克二钠乙酸乙烯*2H2O至80 mLH2O.大力搅拌，用NaOH将pH调整至8.0。使用超纯 H2O 将最终体积调整到 100 mL。
注：EDTA的二钠盐不会溶解，直到溶液的pHH通过添加NaOH调整到+8.0。 - 渗透缓冲液 A （0.5 M 蔗糖， 10 mM Tris pH 7.5; 1 L）： 重量 171.15 克蔗糖并转移到 1 L 气缸。添加 10 mL 的 1 M Tris pH 7.5。在 4 °C 下使用超纯 H2O. 储存，调整至 1 L 的最终体积。
- 溶酶（10毫克/mL;5 mL）：重50毫克（鸡蛋-白）溶酶，溶解在5 mL超纯H2O.储存在4°C。
- 稀释二价阳离子结合溶液（1.5 mM EDTA;500 mL）：在4°C下将0.5 M EDTA（步骤1.3）的1.5 mL加入到497.5 mL超纯H2O.储存。
- 渗透缓冲液 B （0.2 M 蔗糖， 10 mM Tris pH 7.5; 2 L）： 重量 136.8 克蔗糖并转移到 2 L 气缸。添加 20 mL 的 1 M Tris pH 7.5。在 4 °C 下，将超纯 H2O. 储存将最终体积调整为 2 L。
- 核酸联因子（1 M MgCl2; 10 mL）：溶解 2.03 g MgCl2+6H2O 在 8 mL 的超纯 H2O. 调整体积到 10 mL。在室温下存放。
- 核酸溶液鸡尾酒，包括RNase和DNas酶：参见材料表。储存在-20°C。
- 蛋白酶抑制剂鸡尾酒：参见材料表。储存在 4 °C。
- 低密度异丙烯蔗糖梯度溶液（20%v蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.5 溶液;100 mL）：重20克蔗糖，并转移到200 mL气缸。加入 100 μL 的 1 M 三聚三酯缓冲 pH 7.5 和 200 μL 的 0.5 M EDTA pH 8.在室温下，使用超纯 H2O. 存储将最终体积调整至 100 mL。
- 中等密度异丙烯蔗糖梯度溶液（53%v蔗糖，1 mM EDTA，1mM Tris pH 7.5 溶液;100 mL）：重53克蔗糖，并转移到200 mL分级气缸。加入 100 μL 的 1 M 三聚三酯缓冲 pH 7.5 和 200 μL 的 0.5 M EDTA pH 8.在室温下，使用超纯 H2O. 存储将最终体积调整至 100 mL。
注：在分级气缸中准备此解决方案，以确保由于蔗糖比例高而准确。加入磁性搅拌棒并搅拌，直到蔗糖完全溶解在溶液中。此过程可能需要几个小时。 - 高密度异丙烯蔗糖梯度溶液（73%v蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.5 溶液;100 mL）：重73克蔗糖，并转移到200 mL分级气缸。加入 100 μL 的 1 M 三聚三酯缓冲 pH 7.5 和 200 μL 的 0.5 M EDTA pH 8.在室温下，使用超纯 H2O. 存储将最终体积调整至 100 mL。
注：在分级气缸中准备此解决方案，以确保由于蔗糖比例高而准确。加入磁性搅拌棒，搅拌至蔗糖完全溶解。此过程可能需要几个小时。 - 隔离膜存储缓冲液（10 mM Tris 缓冲器 pH 7.5;1 L）：将 1 mL 的 1 M Tris 缓冲器 pH 7.5 添加到 1 L 瓶中，并将最终体积调整为 1 L，超纯 H2O。
- β-烟酰胺腺苷二氯苷酸（NADH）（10毫克/mL溶液）：在超纯H2O中重新悬浮10毫克的NADH。每周准备新鲜库存。储存在-20°C。
- 苯酚溶液与10 mM Tris HCl、pH 8.0、1 mM EDTA等平衡：参见材料表。将溶液储存在 4 °C。
- 脂多糖凝胶染色试剂盒：参见材料表。
- 布拉德福德试剂：参见材料表。
注：所有解决方案和媒体都应在执行测定后的一周内准备好，以确保结果一致。
2. 膜提取细菌的制备
- 将冷冻甘油中的细菌转移到新鲜的加盘上。一旦菌落形成，将板储存在4°C。将单个菌群接种成5 mL管，里面装满了肉汤介质，并一夜之间培养细菌。
- 将隔夜细菌培养物反冲成1L的首选肉汤介质，培养细菌，直到达到所需的光学密度。
注：建议将单个细菌菌群接种到1L的肉汤介质中，建议用于容易抑制生长表型的突变基因型，但一些克拉姆阴性细菌的生长速度比其他细菌慢。如果不可能通过单一菌接种达到足够的培养密度，则将过夜文化稀释成1升介质是同步生长的策略之一。细菌膜组成因培养物的生长阶段（对数与固定相）13而异。测量细菌培养物光学密度变化作为时间函数的生长曲线应与所有菌株进行，以将培养密度与生长阶段相关联。 - 将装有冰汤培养物的烧瓶放在冰上。读取 600 nm （OD600） 处的光学密度，并计算相当于 6.0 和 8.0 x 1011细菌菌群形成单元 （cfu） 之间的培养量。对于S。Typhimurium，这对应于 OD600在 0.6-0.8 之间的 1 L 文化，因为 OD600的 1.0 等于大约 1.0x109 cfu/mL。将此体积添加到离心管中，并确保剩余的培养物保持在冰上，直到它们被使用。
- 在固定角度高速离心机中，在7，000-10，000 x g下，在4°C下离心，将细菌中丸10分钟。
注：预热并保持离心机在低温下。在整个过程中，将样品保持在冰上。 - 小心地丢弃上清剂。
注：如果膜分数不能立即提取，颗粒可以闪光冷冻和/或储存在-80°C。然而，建议在细胞收获的同一天直接进行质质化，特别推荐用于非肠道细菌物种。
3. 外膜和质解的分离
- 如果以前储存在-80°C，将细胞颗粒解冻在冰上，并将样品保留在冰上，以完成手术的剩余部分。在12.5mL的缓冲液A中重新悬浮离心管内的每一个细胞颗粒。
- 在每个细胞重新悬浮中加入180μL的10mg/mL淋酶（最终浓度为144微克/米L）。搅拌2分钟时，将样品放在冰上。
- 在每个电池重新悬浮中加入 12.5 mL 的 1.5 mM EDTA 溶液，并在冰上继续搅拌 7 分钟。
- 将悬浮液在9，000-11，000 x g下，在4°C下将悬浮液分离成50 mL锥形管和离心机10分钟。
- 将超钠物丢弃到生物危害废物容器中，并将颗粒保留在冰上。
- 将 25 mL 的缓冲液 B 添加到细胞颗粒中。
- 加入55 μL的1 M MgCl2，1μL的RNase/DNase核酸酶试剂（以避免粘度问题与细菌在均质化前进行质解相关），和1 μL蛋白酶抑制剂鸡尾酒的体积，位于细胞颗粒之上的缓冲B
- 重新悬浮缓冲液 B 混合物中的颗粒。大力移液和涡流，直到观察均匀溶液。
注：在继续执行此协议的步骤 4 之前，拥有同质解决方案非常重要。重新悬浮的细胞应该有粘性蛋糕饼，像外观和一致性。 - 涡旋每个样品为15 s. 保持悬浮在冰上，并进入步骤4。
4. 加压均质化和Lysis
注：有几种方法可用于lysis。由于产生热量，声波并不理想。可实现渗透性溶质，但效率往往不高。因此，我们建议高压压水解决。可以使用各种仪器实现高压压水压。我们建议同质化机器，如法国出版社或Emusliflex。我们处理多种类型的克拉姆阴性细菌，其对高蔗糖溶液的反应各不相同。高压均质化步骤提高了效率、可重复性和产量。
- 在 4°C 下预热法国压榨机芯，或将金属线圈从均质机插入冰上。
- 将样品倒入法国压力单元或均质样品气缸中，使该电池处于所需的均质化压力下（使用法国印刷机时应有足够的 10，000 psi 或使用均质器时 20，000 psi）。
- 将出口流速调整到大约每秒一滴，同时保持使用法国印刷机时的压力。
- 将细胞水凝液收集在50mL锥形管中，同时将样品放在冰上。
- 重复步骤 4.2-4.4 三到五次以实现完全的抽回，通常通过逐步提高样品的透明度来指示。
注：样品室应在样品之间用缓冲液B进行清洗和平衡。 - 将细胞保持在冰上。
5. 膜总分馏
- 将压网细菌样品在 6，169 x g下离心 10 分钟，在 4 °C 下与颗粒保持完整的细胞材料。（例如，未解解的细菌细胞）。
- 将上清液的剩余部分分配，现在含有均质膜，放入聚碳酸酯瓶中，用于超中心化。
注意事项：如果需要，细胞样本可以通过稀释缓冲液B来平衡。 - 在4°C下，细胞在184，500 x g下进行超离心机，至少1小时。此步骤可在不影响膜质量的情况下过夜。
- 丢弃超离心管中剩余的超清液，并将膜颗粒留在冰上（图1）。
- 使用玻璃脱质均匀器将膜颗粒重新悬浮在低密度异构体-蔗糖梯度溶液的 1 mL 中。使用玻璃巴斯德移液器将样品均匀转移到 1.5 mL 微离心管并保留在冰上。
注：如果只需要总膜组合分析，则用1 mL的低密度异糖-蔗糖梯度溶液代替1 mL的隔离膜储存缓冲液。步骤 5.5 是隔离的终点，如果只需要全细菌膜样本。将样品储存在-20°C，直到需要进一步下游分析。
6. 密度梯度超中心化，分离双膜
- 收集适用于摆动铲斗转子和超离心机的 13 mL 聚丙烯或超透明开顶管的适当数量。
-
将管保持稍微倾斜的位置，按照以下顺序缓慢地将蔗糖溶液从高密度增加到低密度，从而制备蔗糖梯度：
2 mL 73% 带 v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM 三轮车 pH 7.5
4 mL 53% 带 v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM 三轮车 pH 7.5- 接下来，添加总膜分数 （1 mL），该分数已在 20% w/v 蔗糖溶液中重新悬浮（步骤 5.5）。避免将膜部分与位于其下方的蔗糖溶液混合。每个层之间应可见分区。
- 最后，用低密度异环-蔗糖梯度溶液（约6 mL）填充管。聚丙烯和超透明开顶管应尽可能充满（从管顶部2或3毫米）用于管支撑。
- 17978年，卡曼尼阿辛托巴斯特·鲍曼尼的调整
- 调整经调整的蔗糖梯度，用于不同的细菌标本。对于A.鲍曼尼，以下蔗糖梯度提供了更完整的膜分离（图2）。
2 mL 73% 带 v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM 三轮车 pH 7.5
4 mL 45% 带 v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM 三轮车 pH 7.5 - 接下来，添加总膜分数 （1 mL），该分数已在 20% w/v 蔗糖溶液中重新悬浮（步骤 5.5）。避免将膜部分与位于其下方的蔗糖溶液混合。每个层之间应可见分区。
- 最后，用低密度异环-蔗糖梯度溶液（约6 mL）填充管。聚丙烯和超透明开顶管应尽可能充满（从管顶部2或3毫米）用于管支撑。
- 调整经调整的蔗糖梯度，用于不同的细菌标本。对于A.鲍曼尼，以下蔗糖梯度提供了更完整的膜分离（图2）。
- 在 288，000 x g和 4 °C 的温度下使用摆动铲斗转子超离心样品。
注：对于上述步骤中使用的卷，我们建议在 16 小时到 23 小时之间的离心时间。 - 从该点切下 P1000 移液器尖端的末端约 5 mm。使用移液器拆下上棕色 IM 层。将 IM 馏分转移到聚碳酸酯瓶中，进行超中心化。
- 将约 2 mL 的蔗糖溶液留在 53-73% 接口上方，以确保较低的白色 OM 不会交叉受 IM 分数污染。对 OM 分数的步骤 6.4 重复移液过程（图 1）。
注：膜也可以收集通过刺穿底部的离心管使用针和收集膜作为分数下降。 - 用隔离膜存储缓冲液填充超离心管的剩余空隙，并通过反转或移液混合。将样品保留在冰上。
- 以 184，500 x g的超中心聚美收集现在洗涤和分离的膜，1 小时和 4 °C。
- 丢弃上清液，通过脱质均匀重新悬浮膜。添加 500-1000 μL 的存储缓冲液。在2 mL微离心管中收集样品。
- 将细菌膜样品储存在-20°C。
7. 确认双层分离
注：由于技术错误或某些物种独特的细胞包络组成，可能发生两层不完全分离。为了确认分离，我们建议使用两个独立的检测来量化双层之间的交叉污染程度。第一次检测检测了NADH脱氢酶的酶活性，该酶完全存在于IM中。第二个检测检测存在 LOS 或 LPS，这主要存在于 OM 中。
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确认 OEM 与 OEM 隔离
- 使用布拉德福德蛋白测定测量每个分离膜馏分中的蛋白质浓度。
- 将对应于 50 到 500 μg 蛋白质的样品体积添加到空的 2 mL 微离心管中。浓度会因物种而异，但50μg通常足以治疗肠杆菌。添加 10 mM 三酯缓冲器的相应体积，实现总体积 990 μL。将内容传输到光谱仪进行分光测量。
- 在样品中加入10μL的10mg/mLNADH溶液，并在340nm处测量初始吸收率。
- 继续每 30 秒测量一次吸光度 5 分钟。
- 编译数据并绘制每个膜分数的吸收率（y 轴）与时间变化（x 轴）的变化（图3）。
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确认 OEM 与 OEM 隔离
- 将对应于 50 到 500 μg 蛋白质的样品体积添加到空的 2 mL 微离心管中。浓度会因细菌种类而异，但50μg通常足以治疗肠杆菌。用磷酸盐缓冲盐水填充到100μL的最终体积，后者称为水相。
- 将5μL蛋白酶K（库存800 U/mL）加入水相，并在59°C下孵育过夜。
- 在68°C下加热10 mL三酸饱和酚的10分钟。
- 旋转用蛋白酶K处理的水相样品，与水相1：1比加入"热"三酸饱和酚，大力涡旋，在68°C孵育10分钟。
- 将现在乳白色样品从68°C转移到冰水浴，孵育10分钟。
- 在 2，100 x g下离心样品，在 4 °C 下 10 分钟。
- 如果样品不能立即使用，则将上水相转移到新管，并将管储存在-20°C。
- 稀释SDS加载缓冲液中的样品，并加载4-20%三酯-甘氨酸梯度凝胶的井。
- 电道45分钟或直到染料正面位于凝胶底部。
- 按照制造商的说明使用 LPS 染色套件染色凝胶。
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Representative Results
该技术为灭尔巴氏阴性细菌的IM和OEM分离提供了一种有效的方法。说明了整个过程的大纲（图1）。一般来说，培养物的正常化到OD600的OD 600为0.6-0.8，在1升介质中，或在6.0×1011细菌细胞之间收获，将确保收集适量的膜材料，以便随后分离。
在裂化细菌和超脱乳时，超离心管底部会可以看到粘性棕色总膜颗粒。在刮擦、脱质均匀和超心化膜后，在不连续的蔗糖密度梯度上，IM 和 OM 应如图所示分开（图 2）。我们发现，20%/53%/73%（w/v）蔗糖密度梯度不足以分割A.鲍曼尼的包络，而20%/45%/73%的45%v梯度就足够了（图2）。
各种分析方法可用于评估每个膜馏分的质量和纯度。NADH-脱氢酶是一种内膜酶，能催化NADH氧化到NAD（图3）。由于其细胞定位，它可用于确定 IM 和 OEM 之间的交叉污染。根据两种分子的吸收光谱，NAD和NADH在260nm时都有峰值吸收率，而只有NADH的最大吸收率在340nm。因此，在340nm下吸收率的降低将指示NADH氧化为NAD，因此表明该酶在样品中的存在。如果膜分离正确，吸光率的这种变化应只发生在 IM 样品中（图 3）。OM 样品的吸收率降低表示 IM 材料交叉污染。对于A.baumannii来说，需要三倍于膜的含量，即150微克的蛋白质当量，以证明与肠细菌菌株测量的NADH脱氢酶活性水平相似（图3）。因此，NADH氧化酶水平可能较低，或酶的特定活性降低。
OM 的外单主要由 LOS 或 LPS 分子组成。因此，从IM和OM样品中提取LPS/LOS，并随后进行电泳，并通过LPS染色进行可视化，将反映这些结构在OM中的浓缩与IM分数相比。LOS 和 LPS 分子的合成始于细胞质，并在 IM5的表面完成。LOS 和 LPS 结构被单向传送到 OM 并插入外部传单中。由于生物合成涉及IM的前体附件，因此始终观察到 IM 分数的微弱带状模式。然而，由于LOS/LPS结构的丰富性，OM分数中的分子强度远远大于IM分数（图4）。通过确定悬浮液中的蛋白质浓度来测量获得的膜量。与从肠道生物体中检测LPS分子所需的量相比，从A.baumannii中提取和检测LOS所需的膜量是6倍（图4）。我们有理由认为，这可能反映了与蛋白质水平相比，这些生物体的OM中LOS分子水平下降，但没有详细追求这一假设。
图1：本文中描述的Gram阴性细菌膜隔离过程的示意图。所示是用于收集细菌细胞和隔离整体、内膜 （IM） 和外膜 （OM） 的过程。与 IM 双层的密度相比，该方法依赖于这些微生物 OM 双层层密度的增加。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：使用本文中描述的标准及经过修改的蔗糖密度梯度分离的不同Gram阴性物种的代表性结果。不连续蔗糖密度梯度的图像后异物离心 （A） 野生型沙门氏菌典型 14028s， （B） galE-突变S.双型LT2，它产生没有O抗原的LPS分子， 和 （C）大肠杆菌K-12 DH5+， 这也产生缺乏O抗原的 LPS 分子.内膜 （IM） 与外膜 （OM） 分离，并作为棕色材料本地化到 20-53% 的蔗糖界面。由于该分数的密度较高，白色 OM 层本地化到 53-73% 蔗糖接口。（D） 野生型阿辛托巴基17978的总膜没有分离使用20%/53%/73%（w/v）蔗糖梯度，（E），但使用20%/45%/73%（w/v）蔗糖梯度分离。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：NADH脱氢酶测定的代表性结果，以测试外膜（OM）纯度。在内部（IM）和OM样品中测试了该酶，NADH-脱氢酶的存在，以测试分离的效率。（A） NADH 对 NAD 的氧化是由位于细菌 IM 中的酶催化的。反应基板（NADH）的最大吸收率为340nm;因此，此波长的光密度下降表示样品中存在酶。对（B）野生型 S 的 IM 和 OEM 进行了测量.典型， （C）大肠杆菌K-12 DH5+和 （D）加仑- 突变S.典型。这些膜是使用异卵糖密度梯度20%/53%/73%的乳糖分离的。对于A.鲍曼尼，膜被隔离使用梯度20%/45%/73%的乳糖。NADH测定测试膜的纯度是使用 （E） 50 μg 的肠细菌生物和（F） 150 μg 的总蛋白质为 A. baumannii.在（F）中加入一个更高的蛋白质浓度，因为（E）的曲线表明，NADH脱氢酶与总蛋白质的相对水平比S的低。典型菌和大肠杆菌。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 4：LPS 和 LOS 提取和可视化过程的代表性结果，以测试内膜 （IM） 纯度。用于从S的IM和外膜（OM）中提取相当于总蛋白50μg的膜样品量。典型和大肠杆菌DH5-α。用于从A.baumannii膜中提取与总蛋白质300μg对应的膜样品量。体积与无内毒素水一致为100μl，并通过热酚萃取（1：1水：酚）提取蛋白酶K.LPS或LOS处理，21μl提取物被装入4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶上，并通过PRO-Q翡翠300染色进行可视化，以评估IM分数与OM材料的交叉污染。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
该方法将继续帮助研究人员了解细胞包络在细菌生理学和发病机制中的作用。在顺序超中心化步骤之后，可以获得纯化的总、内和OM分数。这些膜可以单独检测，以测试与膜蛋白的定位和功能、跨近质的运输和贩运以及不同环境条件下单个双层的组成相关的假设。探索单个OM成分在发病机制（如LOS/LPS和OM蛋白）中的参与的生物研究，也可以使用该技术收集的分离膜分数在动物和细胞模型中进行。
我们的程序经过优化，可用于肠杆菌，特别是S。典型，它产生含有可变链长度的O抗原的LPS分子。该协议也适用于模型细菌，大肠杆菌K-12，已经失去了合成O抗原的基因能力。使用野生型和O抗原不足S。典型14028s和大肠杆菌K-12菌株DH5+，我们表明，这些微生物的膜分离的能力不受O抗原的存在实质性影响。然而，为了分离LOS生成细菌A.baumannii 17978的包络，我们必须减少中密度蔗糖溶液在不连续梯度中的浓度，以分离双层（图2）。特别是，将中密度溶液的浓度从 53% 转移到 45% 足以使 OM 在自适应梯度中分区到 45-73% 的接口。当对A. baumannii使用 53-73% 梯度时，大多数 OM 材料通常被观察到略低于 20-53% 接口的 IM 分数（图 2）。稀疏OM材料存在于A.baumannii的53-73%接口。这些结果表明，20%/53%/73%梯度不足以在这些条件下分离A.baumannii的双层。
总之，可以调整密度梯度，以适应不同OM-糖脂含量和水平的生物体，该方法可以适用于其他革兰氏阴性细菌。
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Disclosures
未声明任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由P20GM10344和R01AI139248资助，授予Z.D.Dalebroux。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene | VWR | 525-0466 | |
| 1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap | VWR | 10416-312 | |
| 2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth | VWR | 10545-844 | |
| 4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89049-174 | |
| 7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles | VWR | 71000-518 | |
| 70 mL polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355622 | |
| Agar Powder | VWR | A10752 | |
| B10P Benchtop pH Meter with pH Probe | VWR | 89231-664 | |
| Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) | ThermoFisher Scientific | 50136146 | |
| Benzonase Nuclease | MilliporeSigma | 70746-3 | |
| EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | 4040-01 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin, Inc. | ||
| Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor | ThermoFisher Scientific | 75006526 | |
| Hydrochloric acid 6.0 N | VWR | BDH7204 | |
| IBI Scientific Orbital Platform Shaker | Fischer Scientific | 15-453-211 | |
| LB Broth Miller | VWR | 214906 | |
| Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade | VWR | VWRV0063 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| NADH | Sigma Aldrich | 10107735001 | |
| Optima XPN-80 - IVD | Beckman Coulter Life Sciences | A99839 | |
| Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS | Fischer Scientific | NC1624582 | |
| Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology | Sigma - Millipore | P4557 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | Thermofisher | 23238 | |
| Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Thermofisher | P20495 | |
| Proteacease -50, EDTA free | G Biosciences | 786-334 | |
| Proteinase K, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium hydroxide ≥99.99% | VWR | AA45780-22 | |
| Sorval RC 6 Plus Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 36-101-0816 | |
| Sucrose | MilliporeSigma | SX1075-3 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | JT4109-6 | |
| Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 339160 | |
| Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm | Beckman Coulter Life Sciences | 344059 | |
| Vortex-Genie 2 | VWR | 102091-234 |
References
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