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Immunology and Infection

아시네토박터 바우만니에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 셀 봉투를 내부 및 외부 멤브레인 분획으로 분리

doi: 10.3791/60517 Published: April 10, 2020
* These authors contributed equally

Summary

그람 음성 박테리아는 두 개의 공간적으로 분리된 막을 일으킵니다. 외부 멤브레인은 자두 및 펩티도글리칸 층에 의해 내부 막으로부터 분할됩니다. 이 세균의 이중 이중 층을 격리하는 기능은 그들의 생리학 및 병인을 이해하는 것을 위해 중요했습니다.

Abstract

이 방법은 그람 음성 박테리아의 봉투를 총, 내부 및 외부 멤브레인 (OM) 분획으로 분할하여 작동하고 이중 층의 순도를 평가하기 위해 분석으로 결론을 내립니다. OM은 외부 리플렛 내 리풀리고당(LOS) 및 리포폴리당류(LPS)의 존재로 인해 내부 멤브레인에 비해 전체 밀도가 증가합니다. LOS 및 LPS 분자는 지질-A 디사카롤리피드 및 코어-올리고당 치환제으로 구성된 유사한 구조를 가지는 양과병성 글리콜리피피이다. 그러나, 오직 LPS 분자만이 O-다당류 또는 O 항원으로 알려진 제3 소단위로 장식된다. 존재하는 글리콜리파이드의 종류와 양은 유기체의 OM 밀도에 영향을 미칩니다. 따라서, 우리는 다양한 글리콜리파이드 함량을 가진 박테리아의 막이 우리의 기술을 사용하여 유사하게 분리될 수 있는지 시험했습니다. LPS 생산 유기체의 경우, 살모넬라 테네리카 혈청염 혈청염 및 대장균,막을 쉽게 분리하고 LPS O-항원 모이어티는 이중층 분할에 영향을 미치지 않았다. 아신토박터 바우마니는 LOS 분자를 생산, 이는 O 항원 결핍 LPS 분자와 유사한 질량을 갖는다; 그러나, 이 세균의 막은 처음에 분리될 수 없었습니다. 우리는 A. baumannii의 OM이 장내 세균과보다 밀도가 낮기 때문에 자당 그라데이션을 조정하고 막을 분리했다고 추론했습니다. 따라서 이 기술은 다른 유기체와 함께 사용하기 위해 조정 및 수정될 수 있습니다.

Introduction

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그람 음성 박테리아는 주변 공간과 펩티도글리칸 세포벽1에의해 분리되는 2개의 막을 일으킵니다. 내부 막 (IM) 사이토솔을 감싸고 인지질의 대칭 이중층이다. 펩티도글리칸은 터고 압력으로부터 보호하고 세포 형상을 가진 박테리아를 제공하며, 지단백질2,,3에의해 외부 막(OM)에 부착된다. OM은 주변을 둘러싸고 있으며 주로 비대칭입니다. 내부 리플렛은 인지질로 구성되며 외부 리플리피드(LOS) 또는 리포폴리당당(LPS)4,,5로구성된다. 외부 리플렛에서 LOS/LPS 분자의 지질 비대칭 및 생화학은 그 환경의 위험으로부터 박테리아를 보호하는 세포 표면에 장벽특성을부여한다6,7.

LPS 분자는 3개의 성분으로 구성됩니다: 지질 A 이시카롤리피드, 코어 올리고당, 및 O-다당류 또는 O 항원. 지질 A는 곱한 비실화 된 디실로리피드입니다. 코어 올리고당은 거친 LPS 또는 R-LPS로 알려진 10-15 개의 설탕으로 구성됩니다. 코어는 2-케토-3-데옥시-D-만노 옥투로소닉산(kdo) 및 하나 이상의 헵토스 잔류물, 그리고 일반적으로 육각(포도당 또는 갈락토제) 및 헥토스, 또는 아세타미도 당분5로구성된 외부 영역으로 구성된 내부 영역으로 세분화된다. 외부 코어 영역은 내부 코어보다 구성 요소 및 구조에서 더 가변적입니다. 살모넬라 spp.,오직 하나의 코어 구조만 기술되었다; 그러나, 대장균에는 다섯 가지 핵심 구조 (K-12, R1, R2, R3 및 R4)가8있습니다. 이 절차에서 사용하는 대장균 K-12 DH5α는 생산 R-LPS9의결과를 초래하는 돌연변이를 전달합니다. R-LPS 분자는 O 항원 moiety 부족 하 고 LOS 분자와 비슷한 분자량을 가지고.

R-LPS에 O 항원추가는 이 분자를 매끄러운 LPS, 또는 S-LPS로 바꿉니다. O 항원 짧은 3-4 탄수화물 하위 단위에서 구축 하 고 다양 한 체인 길이 여러 양식으로 구성10. 살모넬라 테네리카 혈로바르 티피무리움(S.S 티피무리움) 표면10,,11에LPS 분자의 트리모달 분포를 표시한다. 매우 긴 사슬 O 항원은 100개 이상의 하위 유닛을 포함하고 100킬로달톤 이상의 무게를 견딜 수 있습니다. O 항원 항생제저항, 박테리오파지에 의한 포식 회피, 질병 유발에 필요한 박테리아에 표면 특성을 제공합니다.

캄필로박터, 보르데텔라, 아시네토박터, 헤모필루스, 네이세리아 등의 종은 표면에서 LPS 분자 대신 LOS 분자를 생성한다12. LOS 분자는 지질 A및 코어 올리고당으로 이루어져 있지만 O 항원이 부족하다. 이러한 유형의 그람 음성 박테리아는 표면 특성을 변경하기 위해 추가의 설탕 및 당조합으로 그들의 핵심 올리고당을수정한다 12. LOS 및 LPS 생산 미생물 모두 지질 A에 인산염을 생성하고 양이온성 모아티7을가진 코어 분자. 이러한 추가는 항이온성 표면 전하를 중화하고 양이온 항균 펩티드로부터 보호함으로써 기능하는 인산화탄올아민, 갈락토사민 및 아미노아라비노스 치환을 포함한다. 그람 음성 박테리아는 또한 당분, 또는 여분의 kdo 분자의 가변 비-stoichiometric 치환으로 코어 올리고당 구조를 수정하고, 지질-A 디사카롤리피드에 아실 사슬의 수를변경7.

그람 음성 박테리아의 OM으로부터 IM을 분리하는 능력은 항균성 내성 및 질병 병인에서 세포 봉투의 역할을 이해하는 데 중요한 역할을 하고있다11,,12. 이 접근법의 유도체는 OM에 대한 단백질, 인지질 및 글리콜리파이드 성분의 조립, 유지 보수 및 리모델링의 메커니즘을 추론하는 데 사용되어 왔다.

저희 실험실은 정기적으로 세균성 지질 분석을 수행하여 다양한 그람 음성 종에서 단백질 매개 지질 조절 및 지질 기능을 연구합니다. 프로토콜에 사용되는 부피는 얇은 층 크로마토그래피 및 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법에 의해 비 방사성 표지 된 인지질을 분석하기 위해이 절차의 일상적인 사용을반영13,,14.

프로토콜은 그람 음성 박테리아의 차가운 현탁액을 자당의 높은 삼투압 용액에 노출시키고 기본 펩티도글리칸 층으로부터 OM을 해리시키기 위해 리소자임(lysozyme)을 첨가함으로써 시작된다(도1)12. EDTA는 리소자이메의 침투를 용이하게 하기 위해 첨가되는데, 이는 인접한 LOS/LPS분자(15)사이의 측면 정전기 브리징 상호작용을 방해하기 때문에 양이온 격리가 중단되기 때문에. 우리의 적응 된 원래 프로토콜은 구형의 형성을 필요로, 플라즈마 막과 시토솔로 구성된 그람 음성 세균 세포 형태, 하지만 펩티도글리칸 층과 OM부족. 구형 세포가 적응 된 방법에 의해 생성 될 수 있습니다. 그러나, 기술은 성공을 위해 그들의 형성에 의존하거나 의도하지 않습니다. 대신, 리소자임-EDTA 처리 된 박테리아는 원심 분리에 의해 빠르게 수확되고 가압 용해 전에 낮은 농도의 자당 용액에서 다시 중단됩니다. 구형 세포를 형성하여 방출되었을 수 있는 OM은 이론적으로 처리된 세포의 상황체로부터 수확할 수 있어야 하지만, 이 접근법은 여기에 상세히 설명되어 있지 않다. 궁극적으로, 처리된 세포는 종래의 균질화 및 용해를 행하며, 이는 막 분리절차(16)의효율 및 재현성을 향상시킨다.

용해 후, 총 멤브레인은 초원심분리에 의해 수집되고 EM 및 OM을 분별하기 위해 불연속 자당 밀도 구배를 적용합니다. 고전적인 접근법은 적어도 5개의 상이한 자당 용액11,,12로구성된 보다 연속적인 그라데이션을 사용한다. 우리의 프로토콜의 불연속 그라데이션은 세 가지 자당 솔루션으로 구성되며 이중 층을 두 개의 별개의 분획17로분할합니다. 그람 음성 박테리아의 OM 내의 LOS 및 LPS 분자는 봉투를 상부 갈색 저밀도 IM 분획 및 하부 백색 고밀도 OM 분획으로 분할하도록 유도한다(도1도 2).

아신토박터 바우만니는 그들의 OM에서 LOS 분자를 생성하고,18,19를분리하기 어려운 세포 봉투를 세우는 중요한 다제 내성 인간 병원체이다. 최근 연구는 우리가 여기에 존재하는 프로토콜의 유도가 이러한 유기체(20)의이중 층을 분할하는 데 사용될 수 있음을 시사한다. 따라서 A. baumannii 17978에서 프로토콜을 테스트했습니다. 처음에는 절차가 부적절했습니다. 그러나, 중간 밀도 용액의 자당 농도를 수정하고 분리를 크게 개선하였다(도2). NADH 탈수소 효소 분석 및 LOS/LPS 추출 및 검출 절차는 A. baumannii,야생형 S에 대한 분리를 확인하기 위해 사용되었다. 티피무륨 및 2개의 O-항원 결핍 장균 유전자형; 즉, galE-돌연변이 S. 티피무륨 및 실험실 균주, 대장균 DH5α(도3도 4).

이 작업의 의도는 그람 음성 박테리아의 막을 재현 하 게 격리에 대 한 간소화 된 접근 방식을 제공 하는. 프로토콜은 이 세균을 위한 막 관련분자의 많은 모형을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

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Protocol

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1. 멤브레인 추출을 위한 일반 시약 및 매체 준비

  1. 세균 성장 매체: 철저하게 세척하고 오토클레이브한 2 L 플라스크에서 국물 1L을 준비하고 살균합니다.
  2. 일반 재서스펜션 버퍼(1M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): H2O. 5M HCl로 pH를 7.5로 조정하는 30mL에 6.05g의 트리스 베이스를 용해하여 초순수 H2O로 최종 부피를 50mL로 조정합니다.
  3. divalent 양이온 킬레이션 용액 (0.5 M EDTA pH 8; 100 mL)의 마스터 스톡 : 18.6 g의 디틸렌 테트라 아세테이트 2H2O ~ 80 mLH2O. 격렬하게 저어주고 NaOH로 pH를 8.0으로 조정합니다. 초순수H2O로 최종 볼륨을 100mL로 조정합니다.
    참고: EDTA의 디소듐 염은 NaOH의 첨가에 의해 용액의 pH가 ~8.0으로 조정될 때까지 용해되지 않을 것이다.
  4. 삼투성 완충제 A (0.5 M 자당, 10 mM Tris pH 7.5; 1 L): 자당의 무게 171.15 g및 1 L 실린더로 옮긴다. 1M 트리스 pH 7.5의 10 mL를 추가합니다. 4 °C에서 초순수 H2O. 저장소로 1 L의 최종 부피에 적응하십시오.
  5. 리소자임 (10 mg/mL; 5 mL): 50 mg의 (닭 계란-흰자) 리소자임의 무게와 5 mL 초순수 H2O. 4 °C에서 저장소에 용해.
  6. 희석 된 디발렌트 양이온 킬레이션 용액 (1.5 mM EDTA; 500 mL): 0.5 M EDTA (단계 1.3)의 1.5 mL를 497.5 mL 초순수 H2O. 4 °C에서 저장합니다.
  7. 삼투성 완충액 B (0.2 M 자당, 10 mM Tris pH 7.5; 2 L): 자당의 무게 136.8 g및 2 L 실린더로 옮김. 1 M Tris pH 7.5의 20 mL를 추가합니다. 최종 부피를 4°C에서 초순수 H2O. 저장소로 2L로 조정합니다.
  8. 뉴클레아제 보조 인자 (1 M MgCl2; 10 mL): MgCl2·6H2O의 2.03 g을 초순수 H2O의 8 mL에 용해시면 부피가 10 mL로 조절됩니다. 실온에서 보관하십시오.
  9. RNase 및 DNase 효소를 포함한 뉴클레아제 용액 칵테일: 재료 표참조. -20 °C에서 보관하십시오.
  10. 프로테아제 억제제 칵테일: 재료 표를 참조하십시오. 4 °C에서 보관하십시오.
  11. 저밀도 이소피크산 자당 그라데이션 용액 (20 % w / v 자당, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 솔루션, 100 mL): 자당의 무게 20g을 무게와 200 mL 실린더로 옮김. 1M 트리스 버퍼 pH 7.5 및 0.5 M EDTA pH 8의 200 μL 100 μL을 추가합니다. 초순수H2O. Store를 실온에서 100mL로 조절합니다.
  12. 중간 밀도 isopycnic 이소평 상 자당 그라데이션 솔루션 (53% w /v 자당, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 솔루션; 100 mL): 자당의 53 g의 무게와 200 mL 졸업 실린더로 전송. 1M 트리스 버퍼 pH 7.5 및 0.5 M EDTA pH 8의 200 μL 100 μL을 추가합니다. 초순수H2O. Store를 실온에서 100mL로 조절합니다.
    참고: 자당의 높은 비율로 인해 정확성을 보장하기 위해 점진적 실린더에이 솔루션을 준비합니다. 마그네틱 교반 막대를 추가하고 자당이 용액에 완전히 용해될 때까지 저어줍니다. 이 프로세스는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
  13. 고밀도 이소피석 자당 그라데이션 용액 (73 % w / v 자당, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 솔루션; 100 mL): 자당의 73g의 무게와 200 mL 의 졸업 실린더로 옮김. 1M 트리스 버퍼 pH 7.5 및 0.5 M EDTA pH 8의 200 μL 100 μL을 추가합니다. 초순수H2O. Store를 실온에서 100mL로 조절합니다.
    참고: 자당의 높은 비율로 인해 정확성을 보장하기 위해 점진적 실린더에이 솔루션을 준비합니다. 마그네틱 교반 막대를 추가하고 자당이 완전히 녹을 때까지 저어줍니다. 이 프로세스는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
  14. 절연 막 저장 버퍼 (10 mM Tris Buffer pH 7.5; 1 L): 1 M Tris 버퍼 pH 7.5의 1 mL을 1 L 플라스크에 추가하고 초순수 H2O로 최종 부피를 1 L로 조정합니다.
  15. β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH) (10 mg/mL 용액): 초순수 H2O. 신선한 주식을 매주 준비하여 NADH 10 mg을 다시 일시 중단하십시오. -20 °C에서 보관하십시오.
  16. 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA와 평형 페놀 용액 : 재료 표를 참조하십시오. 용액을 4°C에 보관하십시오.
  17. 리포폴리사카라이드 젤 스테인 키트: 재료 표참조.
  18. 브래드포드 시약: 재료 표참조.
    참고: 모든 솔루션과 미디어는 일관된 결과를 보장하기 위해 분석 을 수행한 후 일주일 이내에 준비되어야 합니다.

2. 막 추출을위한 박테리아의 준비

  1. 냉동 글리세롤 주식에서 박테리아를 신선한 한천 접시에 줄무늬. 식민지가 발전하면 플레이트를 4 °C에서 보관하십시오. 단일 콜로니를 국물 배지로 채워진 5 mL 튜브로 접종하고 박테리아를 하룻밤 동안 원하는 대로 배양합니다.
  2. 하룻밤 세균 배양을 바람직한 국물 배지의 1 L로 백 희석시키고 원하는 광학 밀도가 달성될 때까지 박테리아를 배양한다.
    참고: 생육 표현형을 억제하는 경향이 있는 돌연변이 유전자형에 대해 단일 세균 성 콜로니를 1 L의 국물 매체로 접종하는 것이 좋습니다. 단일 콜로니 접종에 의해 충분한 배양 밀도를 달성할 수 없는 경우, 하룻밤 배양을 1L의 배지로 희석시키는 것은 성장을 동기화하는 하나의 전략이다. 세균막 조성물은 배양물의 성장기(로그학 대 고기상)의 성장기에 따라달라진다(13. 세균 배양에 대한 광학 밀도의 변화를 측정하는 성장 곡선은 시간의 함수로서 배양 밀도와 성장 상을 상관시키는 모든 균주와 함께 수행되어야 한다.
  3. 국물 배양액이 들어 있는 플라스크를 얼음 위에 놓는다. 600 nm (OD600)에서광학 밀도를 읽고 6.0 및 8.0 x 1011 세균 콜로니 형성 단위 (cfu)에 해당하는 배양량을 계산합니다. S용. 티피무리움은 1.0의 OD600이 약 1.0x109 cfu/mL과 같기 때문에 0.6-0.8 사이의 OD600에서 1L의 배양에 해당합니다. 이 부피를 원심분리기 튜브에 추가하고 나머지 배양이 얼음위에 남아 있게 합니다.
  4. 7,000-10,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 고정식 고속 원심분리기에서 4°C에서 박테리아를 펠렛한다.
    참고: 원심분리기를 저온에서 미리 식히고 유지합니다. 전체 절차 동안 얼음에 샘플을 유지합니다.
  5. 상급제를 조심스럽게 폐기하십시오.
    참고: 멤브레인 분획이 즉시 추출되지 않을 경우 펠렛은 플래시 냉동 및 /또는 -80 °C에서 보관될 수 있습니다. 그러나 세포가 수확되는 당일에 플라스모 용해로 직접 진행하는 것이 권장되며 특히 비 장균 종에 권장됩니다.

3. 외부 막 및 Plasmolysis의 해리

  1. 이전에 -80 °C에서 저장한 경우 얼음에 세포 펠릿을 해동하고 절차의 나머지 부분에 대한 얼음에 샘플을 유지합니다. 완충A의 12.5 mL에서 원심분리관 내의 각 세포 펠릿을 재중단하여 세포의 현탁액에 자기 교반 바를 추가한다.
  2. 각 세포 재현탁액에 10 mg/mL 리소자임(최종 농도 144 μg/mL)을 180 μL추가합니다. 2분 동안 저어주면서 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
  3. 각 세포 재서스펜션에 12.5 mM EDTA 용액 12.5 mL를 추가하고 추가로 7 분 동안 얼음에 저어 계속.
  4. 현탁액을 4°C에서 10분 동안 9,000-11,000 x g에서 50 mL 원뿔형 튜브 및 원심분리기에 데크로 처리한다.
  5. 빙하를 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리고 얼음에 펠릿을 유지하십시오.
  6. 세포 펠릿에 버퍼 B 25 mL를 추가합니다.
  7. 55 μL 의 1 MgCl2,RNase/DNase 뉴클레아제 시약의 1 μL (균질화 이전에 플라스모 용해를 겪고있는 박테리아와 관련된 점도 문제를 피하기 위해), 및 1 μL의 프로테아제 억제제 칵테일을 세포 펠릿 위에 놓는 버퍼 B의 부피에 추가하십시오.
  8. 완충제 B 혼합물에 펠릿을 다시 놓습니다. 균일 한 용액을 관찰 할 때까지 활발하게 피펫과 소용돌이.
    참고: 이 프로토콜의 4단계로 진행하기 전에 균일한 솔루션을 가지는 것이 매우 중요합니다. 다시 일시 중단 된 세포는 모양과 일관성과 같은 점성이있는 케이크 반죽이 있어야합니다.
  9. 15 s. 얼음에 현탁액을 유지 하 고 단계 4로 진행 하는 각 샘플 소용돌이 15 s.

4. 가압 균질화 및 리시스

참고: 용해를 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 초음파 처리는 열의 발생으로 인해 이상적이지 않습니다. 삼투성 포염은 달성 될 수 있지만 종종 비효율적입니다. 따라서 고압 용해를 권장합니다. 고압 용해는 다양한 계측기에서 달성될 수 있습니다. 우리는 프랑스 언론이나 에뮤즐리 플렉스와 같은 균질화 기계를 제안합니다. 우리는 높은 삼투압 자당 용액에 대한 반응이 다른 많은 유형의 그람 음성 박테리아와 함께 일합니다. 고압 균질화 단계는 효율성, 재현성 및 수율을 향상시킵니다.

  1. 프랑스 프레스 셀을 4°C에서 미리 냉각하거나 균질화 기에서 금속 코일을 얼음에 삽입합니다.
  2. 샘플을 프렌치 압력 셀 또는 균질화 샘플 실린더에 붓고 원하는 균질화 압력 하에 세포를 가져온다(10,000 psi는 균질화기를 사용할 때 프렌치 프레스 또는 20,000 psi를 사용할 때 적절해야 한다).
  3. 프렌치 프레스를 활용하는 경우 압력을 유지하면서 출구 유량을 초당 약 1방울로 조정합니다.
  4. 얼음에 샘플을 유지하면서 50 mL 원엽 튜브에서 세포 가해를 수집합니다.
  5. 완전한 용해를 달성하기 위해 4.2-4.4 단계를 3~5회 반복하며, 일반적으로 샘플의 투명도가 점진적으로 증가하여 표시됩니다.
    참고: 샘플 챔버는 시료 사이에 버퍼 B와 세척및 평형화되어야 합니다.
  6. 얼음에 lysed 세포를 유지합니다.

5. 총 막 분획

  1. 용해된 세균 샘플을 6,169 x g에서 4°C에서 10분 동안 그대로 유지된 세포 물질에 포동포동하게 한다. (예를 들어, 비해지지 않은 세균 세포).
  2. 이제 균질화 된 멤브레인을 포함하는 상판의 나머지 부분을 초원심분리를 위해 폴리 카보네이트 병에 분배하십시오.
    주의 사항: 필요한 경우, 세포 샘플은 버퍼 B로 희석하여 균형을 이룰 수 있습니다.
  3. 초원심분리기는 4°C에서 적어도 1시간 동안 184,500 x g에서 용해됩니다. 이 단계는 멤브레인의 품질에 영향을 주지 않고 하룻밤 동안 수행 될 수있다.
  4. 초원심지 튜브에 존재하는 남은 상상류를 버리고 얼음에 막 펠릿을 유지합니다(그림 1).
  5. 유리-dounce 균질화를 사용하여 저밀도 이소피닉스-수크로오스 그라데이션 용액의 1 mL에서 멤브레인 펠릿을 다시 중단한다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 시료 균질화를 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮기고 얼음 위에 유지하십시오.
    참고: 총 막 조성 분석만이 필요한 경우, 단막 저장 완충액의 1 mL에 대해 저밀도 이소피닉스-수크로오스 그라데이션 용액 1 mL을 대체한다. 5.5단계는 총 세균 막 샘플만 필요한 경우 격리의 종점입니다. 추가 다운스트림 분석이 필요할 때까지 샘플을 -20°C에서 저장합니다.

6. 이중 멤브레인을 분리하는 밀도 그라데이션 초원심분리

  1. 스윙 버킷 로터 및 초원심분리기에 지정된 13mL 폴리프로필렌 또는 초투명 오픈탑 튜브의 적절한 수를 모을 수 있습니다.
  2. 튜브를 약간 기울어진 자세로 잡고 다음 순서로 고밀도에서 낮은 밀도로 자당 솔루션을 천천히 추가하여 자당 그라데이션을 준비합니다.
    2 mL 73% w/v 자당, 1 mM EDTA, 1 mM 트리스 pH 7.5
    4 mL 의 53% w/v 자당, 1 mM EDTA, 1 mM 트리스 pH 7.5
    1. 다음으로, 20% w/v 자당 용액에서 재중단된 총 멤브레인 분획(1 mL)을 추가합니다(단계 5.5). 그 아래에 있는 자당 용액과 멤브레인 분획을 혼합하지 마십시오. 분할은 이러한 각 레이어 사이에 표시되어야 합니다.
    2. 마지막으로, 저밀도 이소피닉스-수크로오스 그라데이션 용액(약 6 mL)으로 튜브를 채웁니다. 폴리프로필렌과 울트라 클리어 오픈 탑 튜브는 튜브 지원을 위해 가능한 한 가득 채워야합니다 (튜브 상단에서 2 또는 3mm) 채워야합니다.
  3. 아시네토박터 바우마니 17978에 대한 조정
    1. 다른 세균 표본과 함께 사용하기 위해 조정된 자당 그라데이션을 조정합니다. A. baumannii의경우, 다음의 자당 그라데이션은 멤브레인의 보다 완전한 분리를 부여하였다(그림2).
      2 mL 73% w/v 자당, 1 mM EDTA, 1 mM 트리스 pH 7.5
      4mL 45% w/v 자당, 1 mM EDTA, 1 mM 트리스 pH 7.5
    2. 다음으로, 20% w/v 자당 용액에서 재중단된 총 멤브레인 분획(1 mL)을 추가합니다(단계 5.5). 그 아래에 있는 자당 용액과 멤브레인 분획을 혼합하지 마십시오. 분할은 이러한 각 레이어 사이에 표시되어야 합니다.
    3. 마지막으로, 저밀도 isopycnic-수크로오스 그라데이션 용액 (약. 6 mL)으로 튜브를 채웁니다. 폴리프로필렌과 울트라 클리어 오픈 탑 튜브는 튜브 지원을 위해 가능한 한 가득 채워야합니다 (튜브 상단에서 2 또는 3mm) 채워야합니다.
  4. 288,000 x g 및 4°C에서 스윙 버킷 로터를 사용하여 시료를 밤새 초음파 처리합니다.
    참고: 이전 단계에서 사용된 볼륨의 경우 16시간에서 23시간 사이의 원심분리 시간을 권장합니다.
  5. P1000 파이펫 팁의 끝을 지점에서 약 5mm 잘라냅니다. 파이펫을 사용하여 상부 갈색 IM 층을 제거합니다. IM 분획을 폴리카보네이트 병에 옮겨 초원심분리를 위해 옮김을 넣습니다.
  6. 하부 백색 OM이 IM 분획으로 교차되지 않도록 하기 위해 자당 용액의 약 2 mL를 53-73% 인터페이스 위에 둡니다. OM 분획에 대해 6.4 단계에서 파이펫팅 절차를 반복합니다(그림1).
    참고: 멤브레인은 또한 바늘을 사용하여 바닥에 있는 원심 분리기 관을 천공하고 분획으로 막을 집합하여 점액될 수 있습니다.
  7. 분리 막 저장 버퍼와 초원심분리튜브의 나머지 빈 공간을 채우고 반전 또는 파이펫팅으로 혼합합니다. 얼음에 샘플을 유지합니다.
  8. 1시간 및 4°C에 대해 184,500 x g에서 초원심분리에 의해 현재 세척및 분리된 멤브레인을 수집한다.
  9. 상급을 버리고 dounce 균질화에 의해 멤브레인을 다시 중단하십시오. 500-1000 μL의 저장소 버퍼를 추가합니다. 2 mL 미세 원심 분리튜브에서 샘플을 수집합니다.
  10. 세균막 샘플을 -20°C에 보관합니다.

7. 이중층분리 확인

참고: 이중층의 불완전한 분리는 기술적 오류 또는 일부 종의 독특한 세포 봉투 조성으로 인해 발생할 수 있다. 분리를 확인하기 위해 두 개의 독립적인 방법을 사용하여 이중층 간의 교차 오염 정도를 정량화하는 것이 좋습니다. 첫번째 분석실험은 IM에서독점적으로 존재하는 NADH 탈수소효소의 효소 활성을 검출한다. 두 번째 분석은 OM에 주로 존재하는 LOS 또는 LPS의 존재를 감지합니다.

  1. OM이 EM에서 격리되어 있는지 확인
    1. 브래드포드 단백질 분석측정을 사용하여 각 분리된 막 분획의 단백질 농도를 측정합니다.
    2. 50~500 μg의 단백질에 해당하는 시료의 부피를 빈 2 mL 미세원원지 튜브에 추가합니다. 농도는 종에 따라 달라지지만, 50 μg는 일반적으로 장내 세균과에 충분하다. 10 mM Tris 버퍼의 적절한 부피를 추가하여 총 부피 990 μL을 달성합니다. 분광광도측정을 위해 내용을 큐벳으로 전송합니다.
    3. NADH 10 mg/mL 용액 10 μL을 시료에 추가하고 340 nm에서 초기 흡광도를 측정합니다.
    4. 30초마다 5분 동안 흡광도를 계속 측정합니다.
    5. 데이터를 컴파일하고 각 멤브레인 분획에 대한 시간 변화(x축)와 흡광도(y축)의 변화를 그래프로 작성합니다(그림3).
  2. EM이 OM에서 격리되어 있는지 확인
    1. 50~500 μg의 단백질에 해당하는 시료의 부피를 빈 2 mL 미세원원지 튜브에 추가합니다. 농도는 세균 종에 따라 달라지지만, 50 μg는 일반적으로 장내 세균과에 충분하다. 인산완충식염염수로 최종 부피를 100 μL로 채우고, 이는 수성상이라고 한다.
    2. 수성 상에 5 μL의 단백질아제 K(스톡 800 U/mL)를 넣고 59°C에서 밤새 배양합니다.
    3. 68°C에서 10분 동안 트리스 포화 페놀10 mL 의 알리쿼트..
    4. 프로테날라제 K로 처리한 수성 상 샘플을 스핀다운하고 수성 상을 가진 1:1 비율로 "뜨거운" 트리스 포화 페놀을 추가하고, 와류를 격렬하게 68°C에서 10분 동안 배양한다.
    5. 현재 유백색 샘플을 68°C에서 얼음 수조로 옮기고 10분 동안 배양합니다.
    6. 4°C에서 10분 동안 2,100 x g에서 샘플을 원심분리한다.
    7. 상부 수성 상을 새로운 튜브로 옮기고 시료를 즉시 사용하지 않을 경우 튜브를 -20°C에서 저장합니다.
    8. 샘플을 SDS 로딩 버퍼에 희석하고 4-20% 트리스 글리신 그라데이션 젤의 웰을 로드합니다.
    9. 45 분 동안 또는 염료 전면이 젤의 바닥에 될 때까지 전기 조증.
    10. LPS 염색 키트를 사용하여 젤에 얼룩을 적시십시오.

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Representative Results

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이 기술은 그람 음성 박테리아에 대한 EM 및 OM을 분리하는 효과적인 수단을 제공합니다. 전체 절차의 개요가 도시되어있습니다(그림 1). 일반적으로, 배지의 1L에서 0.6-0.8의 OD600으로 배양물의 정상화, 또는 6.0 및 8.0 x10 11 세균 세포 사이에서 수확하는 것은 후속 분리를 위해 적절한 양의 막 물질이 수집되도록 할 것이다.

박테리아를 용해시키고 용해액을 초원심분리하면 끈적끈적한 갈색 총막 펠릿이 초원심분리관 의 바닥에 보입니다. 불연속 자당 밀도 구배를 통해 멤브레인을 긁어 내고 균질화하고 초원심분리한 후, IM 및 OM은 도시된 바와 같이 분리되어야한다(도 2). 우리는 20%/53%/73%(w/v) 자당 밀도 그라데이션이 A. baumannii의봉투를 분할하기에 충분하지 않은 반면, 20%/45% /73% w/v 그라데이션이 충분하다는 것을 발견했습니다(그림2).45%

각 멤브레인 분획의 품질과 순도를 평가하기 위해 다양한 분석 방법을 사용할 수 있습니다. NADH-탈수소효소는 NADH 산화를 NAD로 촉매하는 내막 효소이다(그림3). 그것의 셀방식 지역화를 감안할 때, 그것은 EM과 OM 사이 교차 오염을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 두 분자의 흡광도 스펙트럼에 따르면, NAD와 NADH는 각각 260 nm에서 피크 흡광도를 가지며 NADH만 340 nm에서 최대 흡광도를 가합니다. 따라서, 340 nm에서의 흡광도의 감소는 NADH에서 NAD로의 산화및 따라서 샘플 내의 효소의 존재를 나타낼 것이다. 멤브레인이 제대로 분리되면, 이러한 흡광도 의 변화는 IM 샘플에서만 발생합니다(그림3). OM 샘플의 흡광도가 감소하면 IM 물질과의 교차 오염을 나타낼 수 있습니다. A. baumannii의경우, 막의 3배, 또는 단백질 등가물의 150 μg, 장균 균주에 대해 측정된 것과 유사한 수준의 NADH 탈수소 효소 활성을 입증하는 데 필요하였다(그림3). 따라서, NaDH 옥시다아제의 수치가 A. 바우마니에 대해 더 낮거나 효소의 특이적 활성이 감소할 수 있다.

OM의 외부 전단지는 주로 LOS 또는 LPS 분자로 구성됩니다. 따라서, LPS 염색에 의한 후속 전기영동 및 시각화를 통해 IM 및 OM 샘플로부터 LPS/LOS를 추출하는 것은 IM 분획에 비해 OM에서 이들 구조물의 농축을 반영할 것이다. LOS 및 LPS 분자의 합성은 세포질에서 시작되어 IM5의표면에서 완료됩니다. LOS 및 LPS 구조는 단방향적으로 OM으로 이송되어 외부 리플렛에 삽입됩니다. 생합성은 IM에 대한 전구체 부착을 수반하기 때문에 IM 분획에 대해 희미한 밴딩 패턴이 항상 관찰됩니다. 그러나, OM 분획내의 분자의 세기는 LOS/LPS 구조의 농축으로 인해 IM 분획에서보다 훨씬크다(도 4). 수득된 막의 양은 현탁액내의 단백질 농도를 결정함으로써 측정하였다. 장내 유기체로부터 LPS 분자를 검출하는 데 필요한 양과 비교하여 A. baumannii로부터 LOS를 추출하고 검출하는 데 멤브레인의 6배가 필요하였다(도4). 우리는 이것이 단백질 수준에 비교된 이 유기체를 위한 OM에 있는 LOS 분자의 감소수준을 반영할 지도 모르다, 그러나 이 가설을 상세히 추구하지 않았다는 것을 이유.

Figure 1
도 1: 본 방법 문서에 기술된 그람 음성 세균막 분리 절차를 묘사하는 개략적. 도시된 것은 세균 세포를 수집하고 총, 내부(IM) 및 외부 막(OM)을 분리하는 데 사용되는 절차이다. 접근은 IM 이중층의 조밀도에 비교된 이 세균을 위한 OM 이중층의 증가한 밀도에 의존합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 본 문서에 설명된 표준 및 변형된 자당 밀도 구배를 사용하여 멤브레인을 분리한 다른 그람 음성 종에 대한 대표적인 결과. 불연속 자당 밀도 그라데이션의 이미지[1] [A]야생형 살모넬라 테네리카 혈청바르 티피무리움 14028s,(B) galE-돌연변이 S. O 항원이 없는 LPS 분자를 생성하는 티피무리움 LT2와(C) 대장균 K-12 DH5α는 O 항원이 결여된 LPS 분자를 생성합니다. 내부 멤브레인(IM)은 외부 멤브레인(OM)으로부터 분리되고 갈색 물질로서 20-53% 자당 계면으로 국소화된다. 백색 OM 층은 이 분획의 더 높은 밀도 때문에 53-73% 자당 인터페이스로 국소화됩니다. (D)야생형 아신토박터 바우아니 17978의 총 막은 20%/53%/73%(w/v) 자당 그라데이션(w/v)을 사용하여 분리되지 않았지만,(E)20%/45%/73%(w/v) 자당 그라데이션을 사용하여 분리하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 외부 막(OM) 순도를 시험하기 위해 NADH 탈수소 효소 분석실험에 대한 대표적인 결과. 효소의 존재, NADH 탈수소 효소, 분리의 효율을 테스트하기 위해 내부 (IM) 및 OM 샘플에서 테스트하였다. (a)NADH에서 NAD로의 산화는 세균 IM에 위치한 효소에 의해 촉매된다. 반응 기질(NADH)은 340 nm에서 최대 흡광도를 가지며; 따라서, 이 파장에서 광학 밀도의 감소는 샘플에 효소의 존재를 나타냅니다. 임스름및OM은(B)야생형 S에 대해 측정하였다. 티피무리움,(C) 대장균 K-12 DH5α 및(D) galE-돌연변이 S. 티피무리움. 이 막은 20%/53%/73% w/v 자당의 이소시크산 자당 밀도 구배를 사용하여 분리되었다. A. baumannii의경우, 멤브레인은 20 %/45 %/73 % w /v 자당의 구배를 사용하여 분리되었습니다. 상기 NADH 분석법은 장균 유기체에 대해(E)50 μg를사용하고(F) A. baumannii에대한 총 단백질의 150 μg를 사용하여 수행하였다. (F)에 더 높은F농도의 단백질이 첨가되었고,(E)에대한 곡선은 총 단백질에 비해 NADH 탈수소효소의 상대수준이 S에 비해 A. 바우만니에 비해 적었다는 것을 시사한다. 티피무리움과 대장균. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 내부 멤브레인(IM) 순도를 테스트하기 위한 LPS 및 LOS 추출 및 시각화 절차에 대한 대표적인 결과. 총 단백질 의 50 μg에 해당하는 막 샘플의 부피는 S의 IM 및 외부 막 (OM)으로부터 LPS를 추출하는 데 사용되었다. 티피무리움 및 대장균 DH5-알파. 총 단백질의 300 μg에 해당하는 막 샘플의 부피를 A. baumannii의 막으로부터 LPS를 추출하는데 사용되었다. 부피를 100 μl로 내독소가 없는 물로 정규화하고 단백질라제 K로 처리하였다. LPS 또는 LOS는 핫페놀 추출(1:1 물:페놀)에 의해 추출되었고 추출물의 21 μl을 4-20% 그라데이션 폴리아크릴아미드 겔에 적재하고 PRO-Q 에메랄드 300 염색에 의해 가시화하여 OM 물질로 IM 분획물의 교차 오염을 평가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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이 방법은 세균성 생리학 및 병인에 있는 세포 봉투의 역할을 이해에 있는 연구원을 돕기 위하여 계속할 것입니다. 순차적 초원심분리 단계에 이어 정제된 총, 내부 및 OM 분획을 얻을 수 있다. 이러한 멤브레인은 세포 단백질 국소화 및 기능, 주변을 가로지르는 수송 및 인신매매, 다양한 환경 조건 하에서 개별 이중층의 조성과 관련된 가설을 시험하기 위해 단독으로 분석될 수 있다. LOS/LPS 및 OM 단백질과 같은 병인에서 개별 OM 성분의 개입을 탐구하는 생물학적 연구는 이 기술에 의해 수집된 분리된 막 분획을 사용하여 동물 및 세포 모델에서도 수행될 수 있습니다.

우리의 절차는 장내 세균과, 특히 S와 함께 사용하도록 최적화되었습니다. 타이피무리움은 가변 사슬 길이의 O 항원을 포함하는 LPS 분자를 생성합니다. 이 프로토콜은 또한 O 항원을 합성하는 유전 능력을 잃은 모형 박테리아, 대장균 K-12를 위해 작동합니다. 야생형 및 O항원 결핍 S를 사용. 티피무륨 14028s 및 대장균 K-12 균주 DH5α, 우리는 이러한 미생물에 대한 멤브레인을 분리하는 능력이 O 항원의 존재에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다. 그러나, LOS-생산 박테리아의 봉투를 분리하기 위해, A. baumannii 17978, 우리는 이중층을 분리하기 위해 불연속 그라데이션에서 중간 밀도 자당 용액의 농도를 감소시킬 수 있었다(도 2). 특히, 중간 밀도 용액의 농도를 53%에서 45%로 이동하면 OM이 적응된 그라데이션에서 45-73% 인터페이스로 분할할 수 있도록 충분하였다. A. baumannii에대해 53-73% 그라데이션을 사용하는 경우, OM 물질의 대부분은 종종 20-53% 인터페이스에서 IM 분획보다 약간 낮게 관찰되었다(그림2). 희소 OM 재료는 A. baumannii에대한 53-73 % 인터페이스에 존재했다. 이러한 결과는 20%/53%/73% 그라데이션이 이러한 조건하에서 A. baumannii의 이중층을 분리하기에 부적절하다는 것을 시사했습니다.

요약하면, 다양한 OM-glycolipid 함량 및 수준을 가진 유기체를 수용하기 위해 밀도 구배를 조정할 수 있으며, 접근법은 다른 그람 음성 박테리아에 적응될 수 있다.

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Disclosures

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Acknowledgments

이 작품은 P20GM10344 및 R01AI139248에 의해 Z. D. Dalebroux에 수여되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 - IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma - Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

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References

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<em>아시네토박터 바우만니에</em> 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 셀 봉투를 내부 및 외부 멤브레인 분획으로 분리
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Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).More

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).

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