Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Separasjon av cellekonvolutten for gram-negative bakterier i indre og ytre membranfraksjoner med tekniske justeringer for acinetobacter baumannii

doi: 10.3791/60517 Published: April 10, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Gram-negative bakterier produserer to romlig segregerte membraner. Den ytre membranen er partisjonert fra den indre membranen av en periplasme og et peptidoglykansk lag. Evnen til å isolere de to bilagene av disse mikrobene har vært avgjørende for å forstå deres fysiologi og patogenese.

Abstract

Denne metoden fungerer ved å partisjonere konvolutten av Gram-negative bakterier i totalt, indre og ytre membran (OM) fraksjoner og konkluderer med analyser for å vurdere renheten til bilagene. OM har en økt total tetthet sammenlignet med den indre membranen, hovedsakelig på grunn av tilstedeværelsen av lipooligosakkarider (LOS) og lipopolysakkarider (LPS) i det ytre pakningsvedlegget. LOS og LPS molekyler er amhipatiske glykolipider som har en lignende struktur, som består av en lipid-A disaccharolipid og kjerne-oligosakkarid substituent. Imidlertid er bare LPS molekyler dekorert med en tredje underenhet kjent som O-polysakkarid, eller O-antigen. Typen og mengden glykolipider til stede vil påvirke organismens OM-tetthet. Derfor testet vi om membranene av bakterier med variert glykolipidinnhold kunne isoleres på samme måte ved hjelp av vår teknikk. For de LPS-produserende organismene, Salmonella enterica serovar Typhimurium og Escherichia coli, ble membranene lett isolert og LPS O-antigen moiety påvirket ikke bilayer partisjonering. Acinetobacter baumannii produserer LOS molekyler, som har en lignende masse til O-antigen mangelfullLPS molekyler; Imidlertid kunne membranene til disse mikrobene i utgangspunktet ikke skilles. Vi begrunnet at OM av A. baumannii var mindre tett enn enterobacteriaceae, så sukrosegradienten ble justert og membranene ble isolert. Teknikken kan derfor tilpasses og endres for bruk med andre organismer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gram-negative bakterier produserer to membraner som er adskilt av et periplasmisk rom og en peptidoglykancellevegg1. Den indre membranen (IM) omslutter cytosolog er et symmetrisk bilayer av fosfolipider. Peptidoglykan beskytter mot turgor trykk og gir bakterien med en celleform, og er festet til den ytre membranen (OM) av lipoproteiner2,3. OM omgir periplasmaog er overveiende asymmetrisk. Det indre pakningsvedlegget består av fosfolipider, og det ytre pakningsvedlegget består av glykolipider kjent som lipooligosakkarider (LOS) eller lipopolysakkarider (LPS)4,5. Lipidasymmetrien og biokjemien til LOS/LPS-molekylene i det ytre pakningsvedlegget gir barriereegenskaper til celleoverflaten som beskytter bakterien mot farer i sitt miljø6,7.

LPS molekyler består av tre bestanddeler: lipid A disaccharolipid, kjernen oligosakkarid, og O-polysakkarid eller O-antigen. Lipid A er en multiplisert dissakolipid. Kjerne-oligosakkarider består av 10–15 sukkerarter kjent som grov LPS eller R-LPS. Kjernen er delt inn i den indre regionen, bestående av 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid (kdo) og en eller flere heptose rester, og en ytre region som består generelt av hexoses (glukose eller galaktose) og heptoser, eller acetamido sukker5. Den ytre kjerneregionen er mer variabel i sine komponenter og struktur enn den indre kjernen. I Salmonella spp., bare en kjernestruktur har blitt beskrevet; Men i Escherichia coli er det fem forskjellige kjernestrukturer (utpekt K-12, R1, R2, R3 og R4)8. E. coli K-12 DH5α, som vi bruker i denne prosedyren bærer en mutasjon som resulterer i produksjon R-LPS9. R-LPS-molekylene mangler O-antigen moiety og har en lignende molekylvekt som LOS-molekyler.

Tillegg av O-antigen til R-LPS gjør dette molekylet til glatt LPS, eller S-LPS. O-antigenene er bygget av korte 3-4 karbohydratunderenheter og består av flere modaliteter med varierende kjedelengder10. Noen LPS-produserende bakterier, som Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), vise en trimodal fordeling av LPS molekyler på overflaten10,11. Svært lange kjede O-antigens kan inneholde over hundre underenheter og veie over hundre kilodaltons. O-antigenene gir overflateegenskaper til bakterien som er nødvendige for å motstå antibiotika, unngå predasjon av bakteriofager og forårsake sykdom.

Arter av Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria og andre genererer LOS molekyler i stedet for LPS molekyler på overflaten12. LOS molekyler består av lipid A og kjerne oligosakkarider, men mangler O-antigenet. Disse typer Gram-negative bakterier modifiserer sine kjerneoligosakkarider med ekstra sukker og kombinasjoner av sukker for å endre overflateegenskaper12. Både LOS og LPS-produserende mikrober avledninger fosfatene på lipid A og kjernemolekyler med kationiske moieties7. Disse tilleggene inkluderer fosforetanolamin, galaktosamin og aminoarabinose substitusjoner, som fungerer ved å nøytralisere anioniske overflateladning og dermed beskytte mot kationiske antimikrobielle peptider. Gram-negative bakterier endrer også kjerneoligosakkaridstrukturen med variable ikke-stoichiometriske substitusjoner av sukker, eller ekstra kdomolekyler, og endre antall acylkjeder på lipid-A dissakkarilipider7.

Evnen til å isolere IM fra OM av Gram-negative bakterier har vært medvirkende for å forstå cellekonvoluttens rolle i antimikrobiell resistens og sykdomspatogenese11,12. Avledninger av denne tilnærmingen har blitt brukt til å utlede mekanismer for montering, vedlikehold og ombygging av protein, fosfolipid og glykolipid bestanddeler for OM.

Laboratoriet vårt utfører rutinemessig bakterielle lipidanalyse for å studere proteinmediert lipidregulering og lipidfunksjon i en rekke Gram-negative arter. Volumene som brukes i protokollen gjenspeiler rutinemessig bruk av denne prosedyren for å analysere ikke-radiomerkede fosfolipider ved tynt lag kromatografi og flytende kromatografi tandem massespektrometri13,14.

Protokollen begynner med å utsette en kjølt suspensjon av Gram-negative bakterier til en høy osmolar løsning av sukrose og legge lysozyme å dissosiere OM fra det underliggende peptidoglykanlaget (Figur 1)12. EDTA blir deretter lagt til for å lette penetrasjon av lysozym, siden divalent kation sekvestrasjon forstyrrer lateral elektrostatisk bro interaksjoner mellom tilstøtende LOS / LPS molekyler15. Den opprinnelige protokollen som vår har blitt tilpasset krevde dannelsen av spheroplasts, en Gram-negativ bakteriell celleform som består av en plasmamembran og cytosol, men mangler peptidoglykanlaget og en OM. Det er mulig at spheroplast produseres ved den tilpassede metoden; Teknikken er imidlertid ikke avhengig eller har til hensikt å bli dannet for å lykkes. I stedet høstes de lysozyme-EDTA-behandlede bakteriene raskt av sentrifugering og re-suspendert i en sukroseløsning av mindre konsentrasjon før trykklysis. OMene som kan ha blitt utgitt ved å danne spheroplast, bør i teorien høstes fra supernatants av de behandlede cellene, men denne tilnærmingen er ikke detaljert heri. Til syvende og sist blir de behandlede cellene utsatt for konvensjonell homogenisering og lyse, noe som forbedrer effektiviteten og reproduserbarheten til membranseparasjonsprosedyren16.

Etter lysis samles de totale membranene ved ultracentrifugering og brukes på en diskontinuitet sukrosetetthetsgradient for å fraksjonere IMs og OEM-er. Den klassiske tilnærmingen bruker en mer kontinuerlig gradient som består av minst fem forskjellige sukroseløsninger11,,12. Den diskontinuerlige gradienten i vår protokoll består av tre sukroseløsninger og partisjonerer bilagene i to forskjellige fraksjoner17. LOS- og LPS-molekylene i OEM-ene til Gram-negative bakterier driver konvolutten til å partisjonere seg i en øvre brun im-brøk med lav tetthet og en lavere hvit LAVtetthetom-fraksjon (figur 1 og figur 2).

Acinetobacter baumannii er viktige multidrug resistente menneskelige patogener som produserer LOS molekyler i deres OM og oppreist en celle konvolutt som er vanskelig å skille18,19. Nyere arbeid tyder på at en avledning av protokollen vi presenterer her kan brukes til å partisjonere bilayers av disse organismene20. Derfor testet vi vår protokoll på A. baumannii 17978. I utgangspunktet var prosedyren utilstrekkelig. Vi endret imidlertid sukrosekonsentrasjonen av mellomtetthetsløsningen og sterkt forbedret separasjon (figur 2). En NADH dehydrogenase analyse og en LOS / LPS ekstraksjon og deteksjon prosedyre ble brukt til å bekrefte separasjon for A. baumannii, wild-type S. Typhimurium og to O-antigen mangelfulle enterobakterielle genotyper; nemlig galE-mutant S. Typhimurium og en laboratoriestamme, E. coli DH5α (Figur 3 og figur 4).

Hensikten med dette arbeidet er å levere en strømlinjeformet tilnærming for reproduserbart isolere membranene til Gram-negative bakterier. Protokollen kan brukes til å studere mange typer membranassosierte molekyler for disse mikrobene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Generelle reagenser og medieforberedelse for membranekstraksjon

  1. Bakteriellvekstmedia: Forbered og steriliser 1 L buljongmedier i en grundig rengjort og autoklet 2 L kolbe.
  2. Generell resuspensjonsbuffer (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 ml): Oppløs 6,05 g Tris-sokkel i 30 ml H2O. Juster pH til 7,5 med 5 M HCl. Juster siste volum til 50 ml med ultraren H2O.
  3. Master lager av divalent kation chelation løsning (0,5 M EDTA pH 8; 100 ml): Tilsett 18,6 g dinatriumetylen tetraacetate·2H2O til 80 ml H2O. Rør kraftig og juster pH til 8,0 med NaOH. Juster siste volum til 100 ml med ultraren H2O.
    MERK: Dinidinassaltet til EDTA vil ikke oppløses før pH av oppløsningen er justert til ~ 8.0 ved tilsetning av NaOH.
  4. Osmotisk buffer A (0,5 M sukrose, 10 mM Tris pH 7.5; 1 L): Vei 171,15 g sukrose og overfør til en 1 L sylinder. Tilsett 10 ml 1 M Tris pH 7.5. Juster til et siste volum på 1 l med ultraren H2O. Oppbevares ved 4 °C.
  5. Lysozyme (10 mg/ml; 5 ml): Vei 50 mg (kyllingegghvit) lysozym og oppløs i 5 ml ultraren H2O. Oppbevares ved 4 °C.
  6. Fortynnet oppløsning for divalent kation (1,5 mM EDTA; 500 ml): Tilsett 1,5 ml EDTA (trinn 1,3) til 497,5 ml ultrapure H2O. Oppbevars ved 4 °C.
  7. Osmotisk buffer B (0,2 M sukrose, 10 mM Tris pH 7.5; 2 L): Vei 136,8 g sukrose og overfør til en 2 L sylinder. Tilsett 20 ml 1 M Tris pH 7.5. Juster siste volum til 2 L med ultraren H2O. Oppbevares ved 4 °C.
  8. Kjernekjernekofaktor (1 M MgCl2; 10 ml): Oppløs 2,03 g MgCl2·6H2O i 8 ml ultraren H2O. Juster volumet til 10 ml. Oppbevares ved romtemperatur.
  9. Nuclease løsning cocktail inkludert RNase og DNase enzymer: Se Tabell over materialer. Oppbevares ved -20 °C.
  10. Protease hemmer cocktail: Se Tabell over materialer. Oppbevares ved 4 °C.
  11. Lav tetthet isopycnic sukrose gradient løsning (20% w / v sukrose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Løsning; 100 ml): Veie 20 g sukrose og overføre til en 200 ml sylinder. Tilsett 100 μL av 1 M Tris Buffer pH 7,5 og 200 μL på 0,5 M EDTA pH 8. Juster det siste volumet til 100 ml med ultraren H2O. Oppbevares ved romtemperatur.
  12. Middels tetthet isopycnic sukrose gradient løsning (53% w / v sukrose, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Løsning; 100 ml): Veie 53 g sukrose og overføre til en 200 ml uteksaminert sylinder. Tilsett 100 μL av 1 M Tris Buffer pH 7,5 og 200 μL på 0,5 M EDTA pH 8. Juster det siste volumet til 100 ml med ultraren H2O. Oppbevares ved romtemperatur.
    MERK: Forbered denne løsningen i en gradert sylinder for å sikre nøyaktighet på grunn av den høye prosentandelen av sukrose. Tilsett en magnetisk rørestang og rør til sukrose er fullstendig oppløst i oppløsning. Denne prosessen kan ta flere timer.
  13. Høy tetthet isopycnic sukrose gradient løsning (73% w / v sukrose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Løsning; 100 ml): Veie 73 g sukrose og overføre til en 200 ml uteksaminert sylinder. Tilsett 100 μL av 1 M Tris Buffer pH 7,5 og 200 μL på 0,5 M EDTA pH 8. Juster det siste volumet til 100 ml med ultraren H2O. Oppbevares ved romtemperatur.
    MERK: Forbered denne løsningen i en gradert sylinder for å sikre nøyaktighet på grunn av den høye prosentandelen av sukrose. Tilsett en magnetisk rørestang og rør til sukrose er helt oppløst. Denne prosessen kan ta flere timer.
  14. Isolert membranlagringsbuffer (10 mM Tris Buffer pH 7.5; 1 L): Tilsett 1 ml 1 M Tris Buffer pH 7,5 til en 1 L kolbe og juster det endelige volumet til 1 L med ultraren H2O.
  15. β-Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) (10 mg/ml oppløsning): Resuspend10 mg NADH i ultraren H2O. Forbered friske bestander, ukentlig. Oppbevares ved -20 °C.
  16. Phenol løsning likestilt med 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA: Se materialtabellen. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C.
  17. Lipopolysakkarid gel flekk kit: Se Tabell over materialer.
  18. Bradford reagens: Se materialtabellen.
    MERK: Alle løsninger og medier bør være forberedt i løpet av uken for å utføre analysen for å sikre konsistente resultater.

2. Tilberedning av bakterier for membranekstraksjon

  1. Strekk bakteriene fra frosne glyserolbestander på ferske agarplater. Oppbevar platene ved 4 °C når koloniene utvikler seg. Inokuleren en enkelt koloni i et 5 ml rør fylt med kjøttkraft media og kultur bakteriene som ønsket over natten.
  2. Tilbakefortynner den over natten bakteriell kultur i 1 L av foretrukne kjøttkraft media og kultur bakteriene til ønsket optisk tetthet er oppnådd.
    MERK: Inokulerer en enkelt bakteriell koloni i 1 L av buljongmedier anbefales for muterte genotyper som er utsatt for å undertrykke vekstfenotyper, men noen Gram-negative bakterier vokser bare langsommere enn andre. Hvis det ikke er mulig å oppnå en tilstrekkelig kulturtetthet ved enkoloniinokulasjon, er det en strategi for å synkronisere vekst. Bakteriemembransammensetningen varierer avhengig av kulturens vekstfase (logaritmisk vs stasjonær fase)13. Vekstkurver som måler endringen i optisk tetthet for bakteriekulturene som en funksjon av tid, bør utføres med alle stammer for å korrelere kulturtetthet med vekstfase.
  3. Sett kolbene som inneholder kjøttkraftkulturene på isen. Les den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) og beregn kulturvolumet som tilsvarer mellom 6,0 og 8,0 x 1011 bakterielle koloniformingsenheter (cfu). For S. Typhimurium, dette tilsvarer 1 L kultur på en OD600 på mellom 0,6-0,8, siden en OD600 på 1,0 er lik omtrent 1,0x109 cfu / ml. Legg dette volumet til et sentrifugerør og sørg for at de resterende kulturene holder seg på is til de skal brukes.
  4. Pellet bakteriene ved sentrifugering ved 4 °C ved 7.000-10.000 x g i en fast vinkel høyhastighets sentrifuge i 10 min.
    MERK: Forkjøl og vedlikehold sentrifugene ved lav temperatur. Vedlikehold prøvene på is under hele prosedyren.
  5. Dekanter og kast supernatanten nøye.
    MERK: Pelleten kan bli snark og/eller oppbevares ved -80 °C hvis membranfraksjonene ikke skal trekkes ut umiddelbart. Det anbefales imidlertid å fortsette direkte med plasmolyse samme dag cellene høstes, og anbefales spesielt for ikke-enterobakterielle arter.

3. Dissosiasjon av ytre membran og plasmolysis

  1. Tin cellepellets på is hvis den tidligere er lagret ved -80 °C og behold prøvene på is resten av prosedyren. Resuspender hver cellepellet i sentrifugerøret i 12,5 ml buffer A. Tilsett en magnetisk rørestang til suspensjon av celler.
  2. Tilsett 180 μL av 10 mg/ml lysozym (endelig konsentrasjon på 144 μg/ml) til hver celleresuspensjon. Hold prøvene på is under omrøring i 2 min.
  3. Tilsett 12,5 ml 1,5 mM EDTA-løsning til hver celleresuspensjon og fortsett å røre på is i ytterligere 7 min.
  4. Dekanter suspensjonen i et 50 ml konisk rør og sentrifuge ved 9000-11 000 x g i 10 min ved 4 °C.
  5. Kast supernativa i en biohazard avfallsbeholder og hold pellets på is.
  6. Legg til 25 ml buffer B i cellepelleten.
  7. Tilsett 55 μL av 1 M MgCl2, 1 μL rNase/DNase nuclease reagens (for å unngå viskositetsproblemer forbundet med bakterier som gjennomgår plasmolysis før homogenisering), og 1 μL proteasehemmercocktail til volumet av buffer B som sitter på toppen av cellepelleten
  8. Resuspender pelleten i buffer B-blandingen. Kraftig rør og virvel til du observerer en homogen løsning.
    MERK: Det er svært viktig å ha en homogen løsning før du går videre til trinn 4 i denne protokollen. De resuspenderte cellene bør ha en viskøs kake-røre som utseende og konsistens.
  9. Vortex hver prøve for 15 s. Oppbevar suspensjoner på is og fortsett til trinn 4.

4. Trykkhomogenisering og lysis

MERK: Flere metoder kan brukes til lysis. Sonikering er ikke ideelt på grunn av generering av varme. Osmotisk lysis kan oppnås, men er ofte ineffektiv. Derfor anbefaler vi høytrykkslyse. Høytrykkslysis kan oppnås ved hjelp av en rekke instrumenter. Vi foreslår homogeniseringsmaskiner, for eksempel den franske pressen eller Emusliflex. Vi samarbeider med mange typer Gram-negative bakterier hvis respons på høye osmolar sukroseløsninger varierer. Høytrykkshomogeniseringstrinnet forbedrer effektivitet, reproduserbarhet og utbytte.

  1. Forkjøl den franske pressecellen ved 4 °C eller sett metallspolen fra homogenisatormaskinen på is.
  2. Hell prøven i den franske trykkcellen eller homogenisatorprøvesylinderen og bring cellen under ønsket homogeniseringstrykk (10.000 psi bør være tilstrekkelig når du bruker en fransk presse eller 20.000 psi når du bruker en homogenisator).
  3. Juster utløpsstrømningshastigheten til omtrent ett fall per sekund, samtidig som trykket opprettholdes ved bruk av fransk presse.
  4. Samle cellen lysate i 50 ml koniske rør mens du holder prøver på is.
  5. Gjenta trinn 4.2-4.4 tre til fem ganger for å oppnå fullstendig lysis, vanligvis indikert ved gradvis økning i gjennomsiktighet av prøven.
    MERK: Prøvekammeret skal vaskes og likeres med buffer B mellom prøvene.
  6. Hold lysed celler på isen.

5. Total membranfraksjon

  1. Sentrifugerer de lysed bakterielle prøvene på 6169 x g i 10 min ved 4 °C til pellet gjenværende intakt cellemateriale. (f.eks. ulysed bakterielle celler).
  2. Fordel den gjenværende delen av supernatanten, som nå inneholder homogeniserte membraner i en polykarbonatflaske for ultracentrifugering.
    FORSIKTIG: Om nødvendig kan celleprøver balanseres ved å fortynne sbuffer B.
  3. Ultracentrifuge cellen lysates på 184 500 x g i minst 1 time, ved 4 °C. Dette trinnet kan utføres over natten uten å påvirke kvaliteten på membranene.
  4. Kast gjenværende supernatant til stede i ultracentrifugerøret og hold membranpellets på is (figur 1).
  5. Resuspender membranpellets i 1 ml av den lavtetthetsiske sukrosegradientløsningen ved hjelp av en glassavkallhomogenisator. Bruk en glass Pasteur pipette til å overføre prøven homogenat til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og hold på isen.
    MERK: Hvis det bare er ønskelig med total membransammensetning, er det ønskelig med 1 ml lav tetthet i isopycnic-sukrose gradientløsning for 1 ml isolert membranlagringsbuffer. Trinn 5.5 er endepunktet for isolasjon hvis bare total-bakteriellmembranprøver er ønsket. Lagre prøvene ved -20 °C inntil ytterligere nedstrømsanalyse er nødvendig.

6. Tetthet Gradient Ultracentrifugation å skille de doble membranene

  1. Samle riktig antall 13 ml polypropylen eller ultra-klare åpne rør spesifisert for en svingende bøtte rotor og ultracentrifuge.
  2. Hold røret i en litt vippet posisjon og klargjør sukrosegradienten ved å sakte legge til sukroseløsninger fra høyere tetthet til lavere tetthet i følgende rekkefølge:
    2 ml 73 % m/v sukrose,1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    4 ml 53 % m/v sukrose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    1. Deretter legger du til den totale membranfraksjonen (1 ml), som er suspendert på nytt i 20 % w/v sukroseoppløsning (trinn 5.5). Unngå å blande membranfraksjonen med sukroseløsningen som ligger under den. Divisjoner skal være synlige mellom hvert av disse lagene.
    2. Til slutt fyller du røret med den lavtetthetsiske sukrosegradientløsningen (ca. 6 ml). Polypropylen og ultraklare åpne rør skal fylles så fulle som mulig (2 eller 3 mm fra rørtoppen) for rørstøtte.
  3. Justering for Acinetobacter baumannii 17978
    1. Tilpass en justert sukrosegradient for bruk med forskjellige bakterielle prøver. For A. baumanniiga følgende sukrosegradient mer fullstendig separasjon av membranene (figur 2).
      2 ml 73 % m/v sukrose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
      4 ml 45 % m/v sukrose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    2. Deretter legger du til den totale membranfraksjonen (1 ml), som er suspendert på nytt i 20 % w/v sukroseoppløsning (trinn 5.5). Unngå å blande membranfraksjonen med sukroseløsningen som ligger under den. Divisjoner skal være synlige mellom hvert av disse lagene.
    3. Til slutt fyller du røret med isopycnic-sukrosegradientløsning med lav tetthet (ca. 6 ml). Polypropylen og ultraklare åpne rør skal fylles så fulle som mulig (2 eller 3 mm fra rørtoppen) for rørstøtte.
  4. Ultracentrifuge prøvene ved hjelp av en svingende bøtte rotor på 288.000 x g og 4 °C over natten.
    MERK: For volumene som brukes i de foregående trinnene, anbefaler vi sentrifugeringstider mellom 16 timer og 23 timer.
  5. Klipp enden av en P1000 pipettespiss ca. 5 mm fra punktet. Fjern det øvrebrune IM-laget med pipetten. Overfør IM-fraksjonen til en polykarbonatflaske for ultracentrifugering.
  6. La ca 2 ml av sukroseoppløsningen over 53-73% grensesnittet for å sikre at den nedre hvite OM ikke krysses forurenset med IM-fraksjonen. Gjenta pipetteringsprosedyren fra trinn 6.4 for OM-fraksjonen (figur 1).
    MERK: Membranene kan også samles ved å punktere sentrifugerørene nederst ved hjelp av en nål og samle membranene som fraksjoner dropwise.
  7. Fyll det gjenværende tomrommet til ultracentrifugerøret med isolert membranlagringsbuffer og bland ved inversjon eller pipettering. Oppbevar prøvene på is.
  8. Samle de nå vaskede og isolerte membranene ved ultracentrifugering ved 184 500 x g i 1 t og 4 °C.
  9. Kast supernatanten og resuspend membranene ved å avstå-homogenisering. Tilsett 500-1000 μL lagringsbuffer. Samle prøver i 2 ml mikrocentrifuge rør.
  10. Oppbevar bakteriemembranprøvene ved -20 °C.

7. Bekrefte separasjon av bilayers

MERK: Ufullstendig separasjon av bilayers kan oppstå på grunn av teknisk feil eller den unike celle konvoluttsammensetningen av noen arter. For å bekrefte separasjon anbefaler vi å bruke to uavhengige analyser for å kvantifisere graden av krysskontaminering mellom bilagene. Den første analysen oppdager den enzymatiske aktiviteten til NADH dehydrogenase, som eksisterer utelukkende i im. Den andre analysen oppdager tilstedeværelsen av LOS eller LPS, som hovedsakelig eksisterer i OM.

  1. Bekrefter at mMs er isolert fra iM-ene
    1. Mål proteinkonsentrasjonen i hver isolerte membranfraksjon ved hjelp av en Bradford-proteinanalyse.
    2. Tilsett volumet av prøven som tilsvarer mellom 50 og 500 μg protein til et tomt 2 ml mikrocentrifugerør. Konsentrasjonen vil variere avhengig av arten, men 50 μg er vanligvis tilstrekkelig for Enterobacteriaceae. Legg til riktig volum på 10 mM Tris-buffer for å oppnå et totalt volum på 990 μL. Overfør innholdet til en cuvette for spektrotometri.
    3. Tilsett 10 μL av en 10 mg/ml oppløsning av NADH i prøven og mål den første absorbansen ved 340 nm.
    4. Fortsett å måle absorbansen hver 30 s i 5 min.
    5. Kompilere dataene og grafendringen i absorbans (y-aksen) i forhold til endringen i tid (x-aksen) for hver membranfraksjon (figur 3).
  2. Bekrefter at iM-ene er isolert fra
    1. Tilsett volumet av prøven som tilsvarer mellom 50 og 500 μg protein til et tomt 2 ml mikrocentrifugerør. Konsentrasjonen vil variere avhengig av bakterieartene, men 50 μg er vanligvis tilstrekkelig for Enterobacteriaceae. Fyll til et endelig volum på 100 μL med fosfatbufret saltvann, som heretter kalles den vandige fasen.
    2. Tilsett 5 μL Proteinase K (lager 800 E/ml) i vandig fase og inkuber over natten ved 59 °C.
    3. Varm en 10 ml aliquot av Tris-mettet Fenol i 10 min ved 68 °C.
    4. Spinn ned vandige faseprøver som ble behandlet med Proteinase K og legg til "hot" Tris-mettet Fenol på et 1:1-forhold med vandig fase, vortex kraftig og inkuber ved 68 °C i 10 min.
    5. Overfør de nå melkehvite prøvene fra 68 °C til et isvannsbad og inkuber i 10 min.
    6. Sentrifugerprøvene ved 2100 x g i 10 min ved 4 °C.
    7. Overfør den øvre vandige fasen til et nytt rør og oppbevar røret ved -20 °C hvis prøven ikke skal brukes umiddelbart.
    8. Fortynn prøver i SDS-lasting buffer og laste brønnene på en 4-20% Tris-glycine gradient gel.
    9. Elektroforese i 45 min eller til dye-fronten er på bunnen av gelen.
    10. Beis gelen ved hjelp av LPS-fargesettet etter produsentens instruksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne teknikken gir et effektivt middel for å isolere im-er og OEM-er for Gram-negative bakterier. En omriss av hele prosedyren er illustrert (Figur 1). Generelt vil normalisering av kulturer til en OD600 på 0,6-0,8 i 1 L medier, eller høsting mellom 6,0 og 8,0 x 1011 bakterieceller sikre at riktig mengde membranmateriale samles inn for etterfølgende separasjon.

Ved å lysing bakterier og ultracentrifuging lysate, en klebrig brun total membran pellet vil være synlig på bunnen av ultracentrifuge røret. Etter skraping, avkall-homogenisering og ultracentrifuging membranen over den usammenhengende sukrosetetthetgradienten, bør IM og OM skilles som avbildet (Figur 2). Vi fant at 20%/53%/73% (w/v) sukrose-tetthet gradient var utilstrekkelig til å partisjonere konvolutten av A. baumannii, mens en 20%/45%/73% w/ v gradient var tilstrekkelig (Figur 2).

Ulike analytiske metoder kan brukes til å vurdere kvaliteten og renheten til hver membranfraksjon. NADH-dehydrogenase er et indre membranenzym som katalyserer NADH oksidasjon til NAD (Figur 3). Gitt sin cellulære lokalisering, kan den brukes til å bestemme krysskontaminering mellom iMs og OEM.Given its cellular localization, it can be used to determine cross contamination between IMs and MMs. Ifølge absorbansspektra av begge molekylene, NAD og NADH hver har en topp absorbans på 260 nm, mens bare NADH har en maksimal absorbans på 340 nm. Dermed vil en reduksjon i absorbansen ved 340 nm være et tegn på oksidasjon av NADH til NAD og derfor tilstedeværelsen av enzymet i prøven. Hvis membranene skilles riktig, bør denne endringen i absorbans bare forekomme i IM-prøver (figur 3). En reduksjon i absorbans i OM-prøver vil indikere krysskontaminering med IM-materialer. For A. baumanniivar det tre ganger så mye membran, eller 150 μg proteinekvivalenter, nødvendig for å demonstrere lignende nivåer av NADH dehydrogenase aktivitet til det som ble målt for enterobakterielle stammer (figur 3). Derfor er det mulig at nivåene av NADH oksidase er lavere for A. baumannii eller at den spesifikke aktiviteten til enzymet reduseres.

Den ytre brosjyren av OM består hovedsakelig av LOS eller LPS molekyler. Derfor vil ekstraksjon av LPS/ LOS fra IM- og OM-prøvene med påfølgende elektroforese og visualisering av LPS-farging gjenspeile berikelsen av disse strukturene i OM sammenlignet med IM-fraksjonene. Syntese av LOS- og LPS-molekyler begynner i cytoplasma og fullføres på overflaten av IM5. LOS- og LPS-strukturer transporteres enveis til OM og settes inn i det ytre pakningsvedlegget. Siden biosyntese innebærer forløpertilknytning til im, observeres alltid et svakt båndmønster for im-fraksjonene. Intensiteten av molekylene i OM-fraksjonen er imidlertid mye større enn i IM-fraksjonen, på grunn av berikelsen av LOS/LPS-strukturene (figur 4). Mengden membran oppnådd ble målt ved å bestemme proteinkonsentrasjonen i suspensjonen. Seks ganger mengden membran var nødvendig for å trekke ut og oppdage LOS fra A. baumannii sammenlignet med mengden som er nødvendig for å oppdage LPS molekyler fra de enteriske organismene (Figur 4). Vi grunner til at dette kan gjenspeile et redusert nivå av LOS molekyler i OM for disse organismene sammenlignet med proteinnivåer, men har ikke forfulgt denne hypotesen i detalj.

Figure 1
Figur 1: En skjematisk som viser gram-negativ bakteriell membranisolasjonsprosedyre beskrevet i denne metodeartikkelen. Vist er prosedyren som brukes til å samle bakterielle celler og isolere den totale, indre (IM) og ytre membraner (OM). Tilnærmingen er avhengig av den økte tettheten av OM bilayer for disse mikrobene sammenlignet med tettheten av IM bilayer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater for ulike Gram-negative arter hvis membraner ble isolert ved hjelp av standarden og de modifiserte sukrosetetthetsgradientene som er beskrevet i denne artikkelen. Bilder av diskontinuitet sukrose tetthet gradienter post isopycnic sentrifugering for (A) villtype Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028s, (B) galE-mutant S. Typhimurium LT2, som produserer LPS molekyler som er blottet for O-antigener, og (C) Escherichia coli K-12 DH5α, som også produserer LPS molekyler som mangler O-antigener. Den indre membranen (IM) er skilt fra den ytre membranen (OM) og lokaliserer til 20-53% sukrosegrensesnittet som et brunt materiale. Det hvite OM-laget lokaliserer til 53-73% sukrose-grensesnittet på grunn av den høyere tettheten av denne fraksjonen. (D) De totale membranene i den ville Acinetobacter baumanii 17978 ble ikke separert ved hjelp av 20%/53%/73% (w/v) sukrosegradient, (E), men ble separert ved hjelp av den 20%/45%/73% (w/v) sukrosegradienten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative resultater for NADH dehydrogenase analyse for å teste ytre membran (OM) renhet. Tilstedeværelsen av enzymet, NADH-dehydrogenase, ble testet i indre (IM) og OM-prøver for å teste effektiviteten av separasjonen. (A) Oksidasjonen av NADH til NAD katalyseres av et enzym som ligger i bakterien IM. Reaksjonssubstratet (NADH) har en maksimal absorbans ved 340 nm; Derfor er en reduksjon i optisk tetthet ved denne bølgelengden et tegn på tilstedeværelsen av enzymet i prøven. IMs og OEM ble målt for (B) wild-type S. Typhimurium, (C) E. coli K-12 DH5α og (D) galE-mutant S. Typhimurium. Disse membranene ble isolert ved hjelp av en isofycnic sukrose tetthet gradient på 20%/53%/73% m/v sukrose. For A. baumanniible membranene isolert ved hjelp av en gradient på 20%/45%/73% m/v sukrose. NADH-analysen for å teste renheten av membraner ble gjort ved hjelp av (E) 50 μg for enterobakterielle organismer og (F) 150 μg av totale proteiner for A. baumannii. En høyere konsentrasjon av protein ble tilsatt i (F), siden kurven for (E) antydet at de relative nivåene av NADH dehydrogenase sammenlignet med totalt protein var mindre for A. baumannii enn for S. Typhimurium og E. coli. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater for LPS- og LOS-ekstraksjons- og visualiseringsprosedyren for å teste indre membran (IM) renhet. Volumet av membranprøve tilsvarende 50 μg totalt protein ble brukt til å trekke ut LPS fra IM og ytre membran (OM) av S. Typhimurium og E. coli DH5-alfa. Volumet av membranprøve tilsvarende 300 μg totalt protein ble brukt til å trekke ut LPS fra membranene i A. baumannii. Volumene ble normalisert til 100 μl med endotoksinfritt vann og behandlet med Proteinase K. LPS eller LOS ble ekstrahert av varmfenolekstraksjon (1:1 vann:fenol) og 21 μl av ekstraktene ble lastet på en 4-20% gradient polyakrylamidgel og visualisert av PRO-Q Emerald 300 farging for å vurdere krysskontaminering av IM fraksjoner med OM-materialer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne metoden vil fortsette å hjelpe forskere i å forstå rollen til cellekonvolutten i bakteriell fysiologi og patogenese. Etter sekvensielle ultracentrifugeringstrinnene kan en renset total, indre og OM-fraksjon oppnås. Disse membranene kan assibles isolert for å teste hypoteser knyttet til membranproteinlokalisering og funksjon, transport og menneskehandel på tvers av periplasmen, og sammensetningen av de enkelte bilagene under ulike miljøforhold. Biologiske studier som utforsker involvering av individuelle OM-komponenter i patogenese, slike LOS / LPS og OM-proteiner, kan også utføres i dyre- og cellulære modeller ved hjelp av isolerte membranfraksjoner samlet inn av denne teknikken.

Vår prosedyre er optimalisert for bruk med Enterobacteriaceae, spesielt S. Typhimurium, som produserer LPS molekyler som inneholder O-antigener av variabel kjedelengde. Denne protokollen fungerer også for modellbakterien, E. coli K-12, som har mistet den genetiske evnen til å syntetisere O-antigener. Ved hjelp av vill type og O-antigen mangelfull S. Typhimurium 14028s og E. coli K-12 stamme DH5α, viser vi at evnen til å skille membranene for disse mikrobene ikke er vesentlig påvirket av tilstedeværelsen av O-antigenene. Men for å skille konvolutten til den LOS-produserende bakterien, A. baumannii 17978, måtte vi redusere konsentrasjonen av den midterste tettheten sukroseløsning i den diskontinuerlige gradienten for å isolere bilagene (figur 2). Spesielt var det tilstrekkelig å flytte konsentrasjonen av middeltetthetsløsningen fra 53 til 45% for å tillate OM å partisjonere til 45-73% grensesnittet i den tilpassede gradienten. Ved bruk av 53-73% gradient for A. baumannii, ble flertallet av OM-materialet ofte observert litt under IM-fraksjonen ved 20-53% grensesnitt (figur 2). Sparsomt OM-materiale var til stede på 53-73% grensesnitt for A. baumannii. Disse resultatene antydet at 20%/53%/73% gradient er utilstrekkelig for å skille bilayers av A. baumannii under disse forholdene.

Oppsummert kan justeringer gjøres i tetthetsgradienten for å imøtekomme organismer med variert OM-glykolipidinnhold og nivå, og tilnærmingen kan tilpasses andre Gram-negative bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av P20GM10344 og R01AI139248 tildelt Z. D. Dalebroux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 - IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma - Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
  2. Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
  3. Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
  4. Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
  5. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  6. Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
  7. Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
  8. Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
  9. Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140, (1), 49-57 (1994).
  10. Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
  11. Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
  12. Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
  13. Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. (2019).
  14. Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
  15. Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
  16. Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
  17. Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
  18. Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
  19. Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
  20. Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).
Separasjon av cellekonvolutten for gram-negative bakterier i indre og ytre membranfraksjoner med tekniske justeringer for <em>acinetobacter baumannii</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).More

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter