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Immunology and Infection

Separação do envelope celular para bactérias gram-negativas em frações de membrana interna e externa com ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

Published: April 10, 2020 doi: 10.3791/60517
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Bactérias gram-negativas produzem duas membranas espacialmente segregadas. A membrana externa é particionada da membrana interna por um periplasma e uma camada peptidoglicana. A capacidade de isolar as bicamadas duplas desses micróbios tem sido fundamental para a compreensão de sua fisiologia e patogênese.

Abstract

Este método funciona dividindo o envelope de bactérias Gram-negativas em frações totais, internas e externas (OM) e conclui com ensaios para avaliar a pureza das bicamadas. O OM tem uma densidade global aumentada em comparação com a membrana interna, em grande parte devido à presença de lipooligossacarídeos (LOS) e lipopolissacarídeos (LPS) dentro do folheto externo. As moléculas de LOS e LPS são glicrarídeos anfipáticos que possuem uma estrutura semelhante, que consiste em um lipídio-A disaccharolipid e core-oligossacarídeo substitutivo. No entanto, apenas as moléculas de LPS são decoradas com uma terceira subunidade conhecida como O-polissacarídeo, ou O-antígeno. O tipo e a quantidade de glicolipídios presentes afetarão a densidade de OM de um organismo. Portanto, testamos se as membranas de bactérias com conteúdo glicolilílipídico variado poderiam ser isoladas da mesma forma usando nossa técnica. Para os organismos produtores de LPS, Salmonella enterica serovar Typhimurium e Escherichia coli,as membranas foram facilmente isoladas e a moiety de o-antígeno LPS não impactou a particionamento bicamada. Acinetobacter baumannii produz moléculas de LOS, que têm uma massa semelhante às moléculas de LPS deficientes de O-antígeno; no entanto, as membranas desses micróbios não puderam ser inicialmente separadas. Nós raciocinamos que o OM de A. baumannii era menos denso que o de Enterobacteriaceae, de modo que o gradiente de sacarose foi ajustado e as membranas foram isoladas. A técnica pode, portanto, ser adaptada e modificada para uso com outros organismos.

Introduction

As bactérias gram-negativas produzem duas membranas que são separadas por um espaço periplasmático e uma parede celular peptidoglicana1. A membrana interna (IM) envolve o citosol e é um bicamada simétrico de fosfolipídeos. Peptidoglicano protege contra a pressão de turgor e fornece a bactéria com uma forma celular, e é anexado à membrana externa (OM) por lipoproteínas2,3. O OM envolve o periplasma e é predominantemente assimétrico. O folheto interno consiste em fosfolipídios e o folheto externo consiste de glicolipídios conhecidos como lipooligossacarídeos (LOS) ou lipopolissacarídeos (LPS)4,5. A assimetria lipídica e a bioquímica das moléculas de LOS/LPS no folheto externo conferem propriedades de barreira à superfície celular que protegem a bactéria contra perigos em seu ambiente6,7.

As moléculas de LPS são compostas por três constituintes: o lipídio A disaccharolipid, o oligossacarídeo central, e o O-polissacarídeo ou o-antígeno. Lipídico A é um disaccharolipídeo acylado multiplicado. Os oligossacarídeos principais consistem de 10-15 açúcares conhecidos como LPS bruto ou R-LPS. O núcleo é subdividido na região interna, composto por ácido 2-keto-3-desoxi-d-manno-octulosônico (kdo) e um ou mais resíduos de heptose, e uma região externa que consiste geralmente de hexoses (glicose ou galactose) e heptoses, ou açúcares de acetamido5. A região do núcleo externo é mais variável em seus componentes e estrutura do que o núcleo interno. Em Salmonella spp., apenas uma estrutura central foi descrita; no entanto, em Escherichia coli existem cinco estruturas centrais diferentes (designadas K-12, R1, R2, R3 e R4)8. E. coli K-12 DH5α, que usamos neste procedimento, carrega uma mutação que resulta na produção R-LPS9. As moléculas de R-LPS não possuem o moiety de antígeno O e têm um peso molecular semelhante às moléculas de LOS.

A adição de o-antígeno ao R-LPS transforma esta molécula em LPS suave, ou S-LPS. Os antígenos O são construídos a partir de subunidades curtas de 3-4 carboidratos e consistem em múltiplas modalidades com comprimentos de cadeia variados10. Algumas bactérias produtoras de LPS, como Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Tipilásurio), apresentar uma distribuição trimodal de moléculas de LPS em sua superfície10,11. Os antígenos O de cadeia muito longa podem conter mais de cem subunidades e pesar mais de cem kilodaltons. Os antígenos O fornecem propriedades superficiais à bactéria que são necessárias para resistir aos antibióticos, evitar a predação por bacteriófagos e causar doenças.

Espécies de Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria e outras geram moléculas de LOS em vez de moléculas de LPS em sua superfície12. As moléculas de LOS consistem em lipídios A e oligossacarídeos do núcleo, mas não possuem o antígeno O. Estes tipos de bactérias Gram-negativas modificam seus oligossacarídeos centrais com açúcares adicionais e combinações de açúcares para alterar as propriedades superficiais12. Tanto os micróbios produtores de LOS quanto os de LPS derivam os fosfatos em lipídios A e moléculas do núcleo com moieties cationic7. Essas adições incluem substituições de fosfoetanolamina, galactosamina e aminoarabinose, que funcionam neutralizando a carga de superfície aniônica e, assim, protegendo contra peptídeos antimicrobianos catínicos. As bactérias gram-negativas também modificam a estrutura do oligossacarídeo central com substituições variáveis não estequiométricas de açúcares, ou moléculas extras de kdo, e alteram o número de cadeias de acilem nos disaccharolipídioslipídicos 7.

A capacidade de isolar o IM do OM das bactérias Gram-negativas tem sido fundamental para compreender o papel do envelope celular na resistência antimicrobiana e na patogênese da doença11,12. Derivações dessa abordagem têm sido utilizadas para deduzir mecanismos de montagem, manutenção e remodelação dos constituintes proteicos, fosfolipídios e glicolipídicos para o OM.

Nosso laboratório realiza rotineiramente análises lipidomicas bacterianas para estudar a regulação lipídica mediada por proteínas e a função lipídica em uma variedade de espécies Gram-negativas. Os volumes utilizados no protocolo refletem o uso rotineiro deste procedimento para analisar fosfolipídeos não rotulados por cromatografia de camada fina e cromatografia líquida tandem espectrometria de massa13,14.

O protocolo começa expondo uma suspensão refrigerada de bactérias Gram-negativas a uma solução osmolar alta de sacarose e adicionando lysozyme para dissociar o OM da camada peptidoglicana subjacente(Figura 1)12. O EDTA é então adicionado para facilitar a penetração do lisozime, uma vez que o sequestro de cátion divalente interrompe as interações de ponte eletrostática lateral entre moléculas de LOS/LPS adjacentes15. O protocolo original do qual o nosso foi adaptado exigiu a formação de esheroplastos, uma forma de célula bacteriana Gram-negativa que consiste em uma membrana plasmática e citosol, mas não possui a camada peptidoglicana e um OM. É possível que os esheroplastos sejam produzidos pelo método adaptado; no entanto, a técnica não confia ou pretende sua formação para o sucesso. Em vez disso, as bactérias tratadas com lysozyme-EDTA são rapidamente colhidas pela centrifugação e re-suspensas em uma solução de sacarose de menor concentração antes da lse pressurizada. Os OMs que poderiam ter sido liberados formando esferoplastos devem, em teoria, ser colhidos dos sobrenatantes das células tratadas, mas esta abordagem não é detalhada aqui. Em última análise, as células tratadas são submetidas à homogeneização e lice convencional, o que aumenta a eficiência e a reprodutibilidade do procedimento de separação da membrana16.

Após a lyse, as membranas totais são coletadas por ultracentrifugação e aplicadas a um gradiente de densidade de sacarose descontínua para fracionar os IMs e OMs. A abordagem clássica utiliza um gradiente mais contínuo que consiste em pelo menos cinco soluções diferentes de sacarose11,12. O gradiente descontínuo em nosso protocolo consiste em três soluções de sacarose e divide as bicamadas em duas frações distintas17. As moléculas de LOS e LPS dentro dos OMs de bactérias Gram-negativas levam o envelope à partição em uma fração de IM de baixa densidade marrom superior e uma fração OM branca inferior de alta densidade(Figura 1 e Figura 2).

Acinetobacter baumannii são importantes patógenos humanos multidroga resistentes que produzem moléculas de LOS em seu OM e erguem um envelope celular difícil de separar18,19. Trabalhos recentes sugerem que uma derivação do protocolo que apresentamos aqui pode ser usada para particionar as bicamadas desses organismos20. Portanto, testamos nosso protocolo em A. baumannii 17978. Inicialmente, o procedimento foi inadequado. No entanto, modificamos a concentração de sacarose da solução de densidade média e melhoramos muito a separação(Figura 2). Um ensaio de nadh desidrogenase e um procedimento de extração e detecção de LOS/LPS foram utilizados para confirmar a separação para A. baumannii, tipo selvagem S. Tipilásurio e dois genótipos enterobacterianos deficientes de oantígeno; ou seja, gale-mutante S. Typhimurium e uma cepa de laboratório, E. coli DH5α (Figura 3 e Figura 4).

A intenção deste trabalho é fornecer uma abordagem simplificada para isolar reprodutivelmente as membranas das bactérias Gram-negativas. O protocolo pode ser usado para estudar muitos tipos de moléculas associadas à membrana para esses micróbios.

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Protocol

1. Reagentes gerais e preparação de mídia para extração de membrana

  1. Mídia de crescimento bacteriano: Prepare e esterilize 1 L de caldo em um frasco de 2 L completamente limpo e autoclavdo.
  2. Tampão de resuspensão geral (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): Dissolver 6,05 g de base tris em 30 mL de H2O. Ajuste pH para 7.5 com 5 M HCl. Ajuste o volume final para 50 mL com Ultrapure H2O.
  3. Estoque mestre da solução de quelação divalente (0,5 M EDTA pH 8; 100 mL): Adicionar 18,6 g de tetraacetato de etileno dissódico·2H2O a 80 mL de H2O. Mexa vigorosamente e ajuste o pH a 8,0 com NaOH. Ajuste o volume final para 100 mL com H2O ultrapuro.
    NOTA: O sal dissódico de EDTA não se dissolverá até que o pH da solução seja ajustado para ~8.0 pela adição de NaOH.
  4. Tampão osmótico A (0,5 M sacarose, 10 mM Tris pH 7.5; 1 L): Pesar 171,15 g de sacarose e transferir para um cilindro de 1 L. Adicione 10 mL de 1 M Tris pH 7.5. Ajuste para um volume final de 1 L com ultrapure H2O. Armazenar a 4 °C.
  5. Lysozyme (10 mg/mL; 5 mL): Pesar 50 mg de lysozyme (ovo de galinha) e dissolver em 5 mL ultrapure H2O. Armazenar a 4 °C.
  6. Solução diluída de quelação divalente (1,5 mM EDTA; 500 mL): Adicione 1,5 mL de 0,5 M EDTA (Passo 1.3) a 497,5 mL ultrapuro H2O. Store a 4 °C.
  7. Tampão osmótico B (0,2 M sacarose, 10 mM Tris pH 7.5; 2 L): Pesar 136,8 g de sacarose e transferir para um cilindro de 2 L. Adicione 20 mL de 1 M Tris pH 7.5. Ajuste o volume final para 2 L com o ultrapuro H2O. Armazenar a 4 °C.
  8. Co-fator nuclease (1 M MgCl2; 10 mL): Dissolver 2,03 g de MgCl2·6H2O em 8 mL de H2O. Ajuste o volume a 10 mL. Armazene à temperatura ambiente.
  9. Coquetel de solução de nuclease, incluindo enzimas RNase e DNase: Ver Tabela de Materiais. Loja a -20 °C.
  10. Coquetel inibidor de protease: veja Tabela de Materiais. Armazene a 4 °C.
  11. Solução de gradiente de sacarose isopycnic de baixa densidade (20% w/v sacarose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Solução; 100 mL): Pesar 20 g de sacarose e transferir para um cilindro de 200 mL. Adicione 100 μL de 1 M Tris Buffer pH 7.5 e 200 μL de 0.5 M EDTA pH 8. Ajuste o volume final para 100 mL com o ultrapuro H2O. Armazenar à temperatura ambiente.
  12. Solução de gradiente de sacarose isopycnic de densidade média (53% w/v sacarose, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Solução; 100 mL): Pesar 53 g de sacarose e transferir para um cilindro graduado de 200 mL. Adicione 100 μL de 1 M Tris Buffer pH 7.5 e 200 μL de 0.5 M EDTA pH 8. Ajuste o volume final para 100 mL com o ultrapuro H2O. Armazenar à temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare esta solução em um cilindro graduado para garantir a precisão devido ao alto percentual de sacarose. Adicione uma barra de agitação magnética e mexa até que a sacarose esteja completamente dissolvida em solução. Esse processo pode levar várias horas.
  13. Solução de gradiente de sacarose isopycnic de alta densidade (73% w/v sacarose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Solução; 100 mL): Pesar 73 g de sacarose e transferir para um cilindro graduado de 200 mL. Adicione 100 μL de 1 M Tris Buffer pH 7.5 e 200 μL de 0.5 M EDTA pH 8. Ajuste o volume final para 100 mL com o ultrapuro H2O. Armazenar à temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare esta solução em um cilindro graduado para garantir a precisão devido ao alto percentual de sacarose. Adicione uma barra de agitação magnética e mexa até que a sacarose esteja completamente dissolvida. Esse processo pode levar várias horas.
  14. Tampão de armazenamento de membrana isolada (10 mM Tris Buffer pH 7.5; 1 L): Adicione 1 mL de 1 M Tris Buffer pH 7.5 a um frasco de 1 L e ajuste o volume final para 1 L com H2O ultrapuro.
  15. β-Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) (10 mg/mL solução): Resuspender 10 mg de NADH em h ultrapuro2O. Prepare novos estoques, semanalmente. Loja a -20 °C.
  16. Solução fenol equilibrada com 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA: Ver Tabela de Materiais. Armazene a solução a 4 °C.
  17. Kit de mancha de gel lipopolissacarídeo: Ver Tabela de Materiais.
  18. Reagente bradford: ver Tabela de Materiais.
    NOTA: Todas as soluções e mídias devem ser preparadas na semana de realização do ensaio para garantir resultados consistentes.

2. Preparação de bactérias para extração de membrana

  1. Seque as bactérias dos estoques de glicerol congelados em placas de ágar frescas. Armazene as placas a 4 °C assim que as colônias se desenvolverem. Inocular uma única colônia em um tubo de 5 mL cheio de caldo de mídia e cultura as bactérias como desejado da noite para o dia.
  2. Diluir a cultura bacteriana da noite para o dia em 1 L da mídia de caldo preferido e cultivar as bactérias até que a densidade óptica desejada seja alcançada.
    NOTA: A inoculação de uma única colônia bacteriana em 1 L de caldo de mídia é recomendada para genótipos mutantes que são propensos a suprimir fenótipos de crescimento, mas algumas bactérias Gram-negativas simplesmente crescem mais lentamente do que outras. Se não for possível alcançar uma densidade cultural suficiente por inoculação de uma única colônia, voltar a diluir uma cultura noturna em 1 L de mídia é uma estratégia para sincronizar o crescimento. A composição da membrana bacteriana varia dependendo da fase de crescimento da cultura (fase logarítmica vs estacionária)13. As curvas de crescimento que medem a mudança na densidade óptica para as culturas bacterianas em função do tempo devem ser realizadas com todas as cepas para correlacionar a densidade da cultura com a fase de crescimento.
  3. Coloque os frascos contendo as culturas de caldo no gelo. Leia a densidade óptica a 600 nm (OD600) e calcule o volume de cultura equivalente a entre 6,0 e 8,0 x 1011 unidades de formação de colônias bacterianas (cfu). Para S. Typhimurium, isso corresponde a 1 L de cultura em um OD600 entre 0,6-0,8, uma vez que um OD600 de 1,0 é igual a aproximadamente 1,0x109 cfu/mL. Adicione este volume a um tubo de centrífuga e certifique-se de que as culturas restantes permaneçam no gelo até que sejam usadas.
  4. Pelota a bactéria por centrifugação a 4 °C a 7.000-10.000 x g em um ângulo fixo centrífuga de alta velocidade por 10 min.
    NOTA: Pré-esfriar e mantenha as centrífugas a uma temperatura baixa. Mantenha as amostras no gelo durante todo o procedimento.
  5. Decante e descarte o sobrenadante cuidadosamente.
    NOTA: A pelota pode ser congelada e/ou armazenada a -80 °C se as frações de membrana não forem extraídas imediatamente. No entanto, recomenda-se proceder diretamente com plasmolysis no mesmo dia em que as células são colhidas, e é especialmente recomendado para espécies não enterobacterianas.

3. Dissociação da Membrana Externa e Plasmolysis

  1. Descongele as pelotas de células no gelo se armazenadas anteriormente a -80 °C e retenha as amostras no gelo durante o restante do procedimento. Ressuspensão de cada pelota celular dentro do tubo de centrífuga em 12,5 mL de tampão A. Adicione uma barra de agitação magnética à suspensão das células.
  2. Adicione 180 μL de 10 mg/mL de llásime (concentração final de 144 μg/mL) a cada resuspensão celular. Mantenha as amostras no gelo enquanto mexe por 2 min.
  3. Adicione 12,5 mL de 1,5 mM de solução EDTA para cada resuspensão celular e continue mexendo no gelo por mais 7 min.
  4. Decante a suspensão em um tubo cônico de 50 mL e centrífuga a 9.000-11.000 x g por 10 min a 4 °C.
  5. Descarte os sobrenatantes em um recipiente de resíduos de risco biológico e retenha as pelotas no gelo.
  6. Adicione 25 mL de tampão B à pelota celular.
  7. Adicione 55 μL de 1 M MgCl2, 1 μL de reagente de nuclease RNase/DNase (para evitar problemas de viscosidade associados a bactérias submetidas à plasmolyse antes da homogeneização) e 1 μL de coquetel inibidor de protease ao volume de tampão B que fica no topo da pelota celular
  8. Resuspenda a pelota na mistura de tampão B. Pipeta vigorosamente e vórtice até observar uma solução homogênea.
    NOTA: É muito importante ter uma solução homogênea antes de prosseguir para a Etapa 4 deste protocolo. As células resuspensas devem ter uma massa de bolo viscosa como aparência e consistência.
  9. Vórtice cada amostra para 15 s. Reter suspensões no gelo e seguir para o Passo 4.

4. Homogeneização pressurizada e Lysis

NOTA: Vários métodos podem ser usados para lysis. A sonicação não é ideal devido à geração de calor. A lyse osmótica pode ser alcançada, mas muitas vezes é ineficiente. Por isso, recomendamos a lse de alta pressão. A lse de alta pressão pode ser alcançada usando uma variedade de instrumentos. Sugerimos máquinas de homogeneização, como a Imprensa Francesa ou a Emusliflex. Trabalhamos com muitos tipos de bactérias Gram-negativas cuja resposta a altas soluções de sacarose osmolar varia. A etapa de homogeneização de alta pressão melhora a eficiência, a reprodutibilidade e o rendimento.

  1. Pré-frite a célula francesa Pressione a 4 °C ou insira a bobina metálica da máquina homogeneizadora no gelo.
  2. Despeje a amostra na célula de pressão francesa ou no cilindro homogeneizador-amostra e leve a célula sob a pressão de homogeneização desejada (10.000 psi deve ser adequado ao usar uma prensa francesa ou 20.000 psi ao usar um homogeneizador).
  3. Ajuste a taxa de fluxo de saída para aproximadamente uma gota por segundo, mantendo a pressão se utilizando uma prensa francesa.
  4. Coletar o licato celular em tubos cônicos de 50 mL mantendo amostras no gelo.
  5. Repita as etapas 4.2-4.4 três a cinco vezes para alcançar a llyse completa, tipicamente indicada pelo aumento gradual da transparência da amostra.
    NOTA: A câmara de amostra deve ser lavada e equilibrada com o Buffer B entre as amostras.
  6. Mantenha células lysed no gelo.

5. Fracionamento total da membrana

  1. Centrifugação as amostras bacterianas lysed a 6.169 x g por 10 min a 4 °C para pellet permanecendo material celular intacto. (por exemplo, células bacterianas não lysed).
  2. Distribua a porção restante do sobrenadante, que agora contém as membranas homogeneizadas em uma garrafa de policarbonato para ultracentrifugação.
    ATENÇÃO: Se necessário, as amostras celulares podem ser equilibradas diluindo com tampão B.
  3. Ultracentrifuge as células a 184.500 x g por pelo menos 1 h, a 4 °C. Esta etapa pode ser realizada durante a noite sem afetar a qualidade das membranas.
  4. Descarte o sobrenadante remanescente presente no tubo de ultracentrifugação e retenha pelotas de membrana no gelo (Figura 1).
  5. Resuspenda as pelotas de membrana em 1 mL da solução de gradiente isopycnic-sacarose de baixa densidade usando um homogeneizador de gota de vidro. Use uma pipeta pasteur de vidro para transferir a amostra homogeneizar para um tubo de microcentrífuge de 1,5 mL e reter no gelo.
    NOTA: Se desejar apenas a análise total da composição da membrana, substitua 1 mL da solução de gradiente isopycnic-sacarose de baixa densidade por 1 mL de tampão de armazenamento de membrana isolada. O passo 5.5 é o ponto final do isolamento se apenas amostras de membrana bacteriana total forem desejadas. Armazene amostras a -20 °C até que seja necessária uma análise mais a jusante.

6. Ultracentrifugação do gradiente de densidade para separar as membranas duplas

  1. Reúna o número apropriado de tubos de polipropileno de 13 mL ou ultra-claros de topo aberto especificados para um rotor de balde balançando e ultracentrifuge.
  2. Segure o tubo em uma posição ligeiramente inclinada e prepare o gradiente de sacarose adicionando lentamente soluções de sacarose de maior densidade para menor densidade na seguinte ordem:
    2 mL de 73% de sacarose,1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
    4 mL de 53% de sacarose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
    1. Em seguida, adicione a fração total da membrana (1 mL), que foi resuspensa na solução de sacarose de 20% w/v (etapa 5.5). Evite misturar a fração da membrana com a solução de sacarose que está abaixo dela. As divisões devem ser visíveis entre cada uma dessas camadas.
    2. Por fim, encha o tubo com a solução de gradiente isopycnic-sacarose de baixa densidade (aproximadamente 6 mL). Os tubos de polipropileno e ultra-claro devem ser preenchidos o mais completo possível (2 ou 3 mm da parte superior do tubo) para suporte ao tubo.
  3. Ajuste para Acinetobacter baumannii 17978
    1. Adapte um gradiente de sacarose ajustado para uso com diferentes amostras bacterianas. Para A. baumannii,o seguinte gradiente de sacarose proporcionou uma separação mais completa das membranas(Figura 2).
      2 mL de 73% de sacarose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
      4 mL de 45% de sacarose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
    2. Em seguida, adicione a fração total da membrana (1 mL), que foi resuspensa na solução de sacarose de 20% w/v (etapa 5.5). Evite misturar a fração da membrana com a solução de sacarose que está abaixo dela. As divisões devem ser visíveis entre cada uma dessas camadas.
    3. Por fim, encha o tubo com uma solução de gradiente isopycnic-sacarose de baixa densidade (aproximadamente 6 mL). Os tubos de polipropileno e ultra-claro devem ser preenchidos o mais completo possível (2 ou 3 mm da parte superior do tubo) para suporte ao tubo.
  4. Ultracentrifugar as amostras usando um rotor de balde balançando a 288.000 x g e 4 °C durante a noite.
    NOTA: Para os volumes utilizados nas etapas anteriores, recomendamos tempos de centrifugação entre 16 h e 23 h.
  5. Corte a extremidade de uma ponta de pipeta P1000 cerca de 5 mm do ponto. Remova a camada de IM marrom superior usando a pipeta. Transfira a fração de IM para uma garrafa de policarbonato para ultracentrifugação.
  6. Deixe cerca de 2 mL da solução de sacarose acima da interface de 53-73% para garantir que o OM branco inferior não esteja contaminado com a fração IM. Repita o procedimento pipetting da etapa 6.4 para a fração OM (Figura 1).
    NOTA: As membranas também podem ser coletadas perfurando os tubos de centrífuga na parte inferior usando uma agulha e coletando as membranas como frações em sentido dropwise.
  7. Preencha o vazio restante do tubo de ultracentrifugação com tampão de armazenamento de membrana isolada e misture por inversão ou pipetting. Guarde as amostras no gelo.
  8. Coletar as membranas agora lavadas e isoladas por ultracentrifugação a 184.500 x g por 1 h e 4 °C.
  9. Descarte o sobrenadante e resuspenda as membranas por dounce-homogeneização. Adicione 500-1000 μL de buffer de armazenamento. Coletar amostras em tubos de microcentrífuga de 2 mL.
  10. Armazene as amostras de membrana bacteriana a -20 °C.

7. Confirmando a Separação das Bicamadas

NOTA: A separação incompleta das bicamadas pode ocorrer devido a erro técnico ou à composição única do envelope celular de algumas espécies. Para confirmar a separação, aconselhamos usar dois ensaios independentes para quantificar o grau de contaminação cruzada entre os bicamadas. O primeiro ensaio detecta a atividade enzimática da nadh desidrogenase, que existe exclusivamente no IM. O segundo ensaio detecta a presença de LOS ou LPS, que predominantemente existe no OM.

  1. Confirmando que os OMs estão isolados dos IMs
    1. Medir a concentração de proteínas em cada fração de membrana isolada usando um ensaio de proteína bradford.
    2. Adicione o volume da amostra correspondente a entre 50 e 500 μg de proteína a um tubo de microcentrífuga vazio de 2 mL. A concentração vai variar dependendo da espécie, mas 50 μg é tipicamente suficiente para Enterobacteriaceae. Adicione o volume apropriado de 10 mM Tris-buffer para atingir um volume total de 990 μL. Transfira o conteúdo para uma cuvette para espectrofotometria.
    3. Adicione 10 μL de uma solução de 10 mg/mL de NADH à amostra e meça a absorvância inicial a 340 nm.
    4. Continue medindo a absorvência a cada 30 s por 5 min.
    5. Compilar os dados e grafar a alteração na absorção (eixo y) versus a mudança no tempo (x-eixo) para cada fração de membrana(Figura 3).
  2. Confirmando que os IMs estão isolados das OMs
    1. Adicione o volume da amostra correspondente a entre 50 e 500 μg de proteína a um tubo de microcentrífuga vazio de 2 mL. A concentração vai variar dependendo das espécies bacterianas, mas 50 μg é tipicamente suficiente para Enterobacteriaceae. Preencha para um volume final de 100 μL com solução salina tamponada de fosfato, que é a seguir referida como a fase aquosa.
    2. Adicione 5 μL de Proteinase K (estoque 800 U/mL) à fase aquosa e incubar durante a noite a 59 °C.
    3. Aqueça uma alíquota de 10 mL de Fenol tris-saturado por 10 min a 68 °C.
    4. Gire para baixo as amostras de fase aquosa que foram tratadas com o Proteinase K e adicione o Phenol "quente" tris-saturado em uma razão 1:1 com a fase aquosa, vórtice vigorosamente e incubar a 68 °C por 10 min.
    5. Transfira as amostras agora brancas leitosas de 68 °C para um banho de água gelada e incubar por 10 min.
    6. Centrifugar as amostras a 2.100 x g por 10 min a 4 °C.
    7. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo e armazene o tubo a -20 °C se a amostra não for usada imediatamente.
    8. Diluir amostras em tampão de carga SDS e carregar os poços de um gel de gradiente tris-glicina de 4-20%.
    9. Eletroforese por 45 min ou até que a frente de corantes esteja na parte inferior do gel.
    10. Manche o gel usando o kit de coloração LPS seguindo as instruções do fabricante.

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Representative Results

Esta técnica fornece um meio eficaz para isolar os IMs e OMs para bactérias Gram-negativas. Ilustra-se um esboço de todo o procedimento (Figura 1). Em geral, a normalização das culturas para um OD600 de 0,6-0,8 em 1 L de mídia, ou a colheita entre 6,0 e 8,0 x 1011 células bacterianas garantirá que a quantidade apropriada de material de membrana seja coletada para posterior separação.

Ao averiar as bactérias e ultracentrifugiar o lysato, uma pelota de membrana total marrom pegajosa será visível na parte inferior do tubo de ultracentrifugação. Após a raspagem, a homogeneização de dounce e a ultracentrifugação da membrana sobre o gradiente de densidade de sacarose descontínua, o IM e o OM devem ser separados conforme retratado(Figura 2). Verificou-se que o gradiente de densidade de sacarose 20%/53%/73% (w/v) era insuficiente para particionar o envelope de A. baumannii,enquanto um gradiente de 20%/45%/73% w/v era suficiente(Figura 2).

Vários métodos analíticos podem ser utilizados para avaliar a qualidade e pureza de cada fração de membrana. NADH-desidrogenase é uma enzima de membrana interna que catalisa a oxidação nadh ao NAD (Figura 3). Dada a sua localização celular, pode ser usada para determinar a contaminação cruzada entre IMs e OMs. De acordo com os espectros de absorvância de ambas as moléculas, NAD e NADH têm um pico de absorção a 260 nm, enquanto apenas o NADH tem uma absorvância máxima de 340 nm. Assim, uma diminuição da absorvência em 340 nm seria indicativo de oxidação de NADH ao NAD e, portanto, da presença da enzima na amostra. Se as membranas se separarem adequadamente, essa mudança na absorvência só deve ocorrer em amostras de IM (Figura 3). Uma diminuição da absorvância em amostras de OM indicaria contaminação cruzada com materiais de IM. Para A. baumannii,três vezes a quantidade de membrana, ou 150 μg de equivalentes proteicos, foi necessária para demonstrar níveis semelhantes de atividade desidrogenase nadh ao que foi medido para as cepas enterobacterianas(Figura 3). Portanto, é possível que os níveis de NADH oxidase sejam menores para A. baumannii ou que a atividade específica da enzima seja diminuída.

O folheto externo do OM é composto principalmente de moléculas de LOS ou LPS. Portanto, a extração de LPS/LOS das amostras de IM e OM com eletroforese subseqüente e visualização por coloração LPS refletirá o enriquecimento dessas estruturas no OM em comparação com as frações de IM. A síntese de moléculas de LOS e LPS começa no citoplasma e é concluída na superfície do IM5. As estruturas los e LPS são transportadas unidirecionalmente para o OM e inseridas no folheto externo. Uma vez que a biossíntese envolve apego precursor ao IM, um padrão de banda fraca é sempre observado para as frações de IM. No entanto, a intensidade das moléculas na fração OM é muito maior do que na fração IM, devido ao enriquecimento das estruturas los/LPS(Figura 4). A quantidade de membrana obtida foi medida pela determinação da concentração proteica na suspensão. Seis vezes a quantidade de membrana foi necessária para extrair e detectar LOS de A. baumannii em comparação com a quantidade necessária para detectar moléculas de LPS dos organismos entéricos (Figura 4). Nós razotestamos que isso pode refletir um nível reduzido de moléculas de LOS no OM para esses organismos em comparação com os níveis de proteína, mas não temos perseguido essa hipótese em detalhes.

Figure 1
Figura 1: Um esquema que retrata o procedimento de isolamento da membrana bacteriana Gram-negativa descrito neste artigo método. É mostrado o procedimento utilizado para a coleta de células bacterianas e para isolar as membranas totais, internas (IM) e externas (OM). A abordagem baseia-se no aumento da densidade da bicamada OM para esses micróbios em comparação com a densidade da bicamada IM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos para diferentes espécies Gram-negativas cujas membranas foram isoladas utilizando o padrão e os gradientes modificados de densidade de sacarose descritos neste artigo. Imagens de gradientes de densidade de sacarose descontínua pós centrifugação isopycnic para (A) tipo selvagem Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028s,(B) galE-mutante S. Typhimurium LT2, que produz moléculas de LPS desprovidas de antígenos O, e(C) Escherichia coli K-12 DH5α, que também produz moléculas de LPS que não possuem antígenos O. A membrana interna (IM) é separada da membrana externa (OM) e localiza-se à interface de 20-53% de sacarose como um material marrom. A camada OM branca localiza-se na interface de sacarose de 53-73% devido à maior densidade desta fração. (D) As membranas totais do tipo selvagem Acinetobacter baumanii 17978 não se separaram usando 20%/53%/73% (w/v) gradiente de sacarose,(E)mas se separaram usando o gradiente de sacarose 20%/45%/73% (w/v). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados representativos do ensaio nadh desidrogenase para testar a pureza da membrana externa (OM). A presença da enzima, NADH-desidrogenase, foi testada em amostras internas (IM) e OM para testar a eficiência da separação. (A) A oxidação do NADH ao NAD é catalisada por uma enzima localizada no IM bacteriano. O substrato de reação (NADH) tem uma absorção máxima de 340 nm; portanto, uma diminuição da densidade óptica neste comprimento de onda é indicativo da presença da enzima na amostra. Os IMs e OMs foram medidos para (B) tipo selvagem S. Typhimurium, (C) E. coli K-12 DH5α e (D) galE -mutante S. Typhimurium. Estas membranas foram isoladas utilizando um gradiente de densidade de sacarose isopycnic de 20%/53%/73% de sacarose. Para A. baumannii,as membranas foram isoladas utilizando um gradiente de 20%/45%/73% de sacarose. O ensaio NADH para testar a pureza das membranas foi feito utilizando-( E) 50 μg para os organismos enterobacterianos e (F) 150 μg de proteínas totais para A. baumannii. Uma maior concentração de proteína foi adicionada em (F), uma vez que a curva para (E) sugeriu que os níveis relativos de nadh desidrogenase em comparação com a proteína total foram menores para A. baumannii do que para S. Typhimurium e E. coli. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados representativos para o procedimento de extração e visualização de LPS e LOS para testar a pureza da membrana interna (IM). O volume de amostra de membrana correspondente a 50 μg de proteína total foi utilizado para extrair LPS do IM e membrana externa (OM) de S. Typhimurium e E. coli DH5-alfa. O volume de amostra de membrana correspondente a 300 μg de proteína total foi utilizado para extrair LPS das membranas de A. baumannii. Os volumes foram normalizados a 100 μl com água livre de endotoxinas e tratados com Proteinase K. LPS ou LOS foram extraídos por extração de fenol quente (1:1 água:fenol) e 21 μl dos extratos foram carregados em um gel de poliacrilamida de 4-20% gradiente e visualizados por coloração PRO-Q Esmeralda 300 para avaliar a contaminação cruzada de frações de IM com materiais OM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Esse método continuará auxiliando os pesquisadores na compreensão do papel do envelope celular na fisiologia bacteriana e na patogênese. Seguindo os passos sequenciais de ultracentrifugação, pode-se obter uma fração total purificada, interna e OM. Essas membranas podem ser submetidas isoladamente para testar hipóteses relacionadas à localização e função da proteína da membrana, transporte e tráfico através do periplasma e à composição dos bicamadas individuais sob várias condições ambientais. Estudos biológicos explorando o envolvimento de componentes individuais de OM em patogênese, tais como proteínas LOS/LPS e OM, também podem ser realizados em modelos animais e celulares utilizando frações de membrana isoladacoletadas por essa técnica.

Nosso procedimento foi otimizado para uso com Enterobacteriaceae, especificamente S. Typhimurium, que produz moléculas de LPS que contêm antígenos O de comprimento de cadeia variável. Este protocolo também funciona para a bactéria modelo, E. coli K-12, que perdeu a capacidade genética de sintetizar antígenos O. Usando tipo selvagem e o-antígeno deficiente S. Typhimurium 14028s e E. coli K-12 cepa DH5α, mostramos que a capacidade de separar as membranas para esses micróbios não é substancialmente influenciada pela presença dos antígenos O. No entanto, para separar o envelope da bactéria produtora de LOS, A. baumannii 17978, tivemos que reduzir a concentração da solução de sacarose de densidade média no gradiente descontínuo para isolar as bicamadas(Figura 2). Em particular, mudar a concentração da solução de densidade média de 53 para 45% foi suficiente para permitir que o OM particionasse para a interface de 45-73% no gradiente adaptado. Ao utilizar o gradiente de 53-73% para A. baumannii, a maioria do material OM foi frequentemente observada ligeiramente abaixo da fração IM na interface 20-53%(Figura 2). O material Esparso OM esteve presente na interface de 53-73% para A. baumannii. Esses resultados sugeriram que o gradiente de 20%/53%/73% é inadequado para separar as bicamadas de A. baumannii nessas condições.

Em resumo, ajustes podem ser feitos no gradiente de densidade para acomodar organismos com conteúdo e nível de OM-glicolisídicos variados, e a abordagem pode ser adaptada para outras bactérias Gram-negativas.

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Disclosures

Nenhum conflito de interesse declarado.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por P20GM10344 e R01AI139248 concedido a Z. D. Dalebroux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 - IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma - Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

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References

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Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).

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