Summary
Bu makalede, influenza virüs enfeksiyonunun fare modelinde Tfh ve GC B yanıtını değerlendirme protokolleri açıklanmaktadır.
Abstract
T Foliküler Yardımcı (Tfh) hücreleri, germinal merkez (GC) gelişimi ve yüksek benzeşimli antikorların üretimi için yardım sağlama konusunda uzmanlaşmış bağımsız bir CD4+ T hücre alt kümesidir. grip virüsü enfeksiyonunda, etkili virüs eradikasyonunu kolaylaştırmak için sağlam Tfh ve GC B hücre yanıtları indüklenir, bu da Tfh ile ilişkili çalışma için nitelikli bir fare modeli sağlar. Bu yazıda, farelerde influenza virüsü enfeksiyonu sırasında temel Tfh ilişkili immün yanıtın tespitinde protokolleri açıkladık. Bu protokoller şunlardır: influenza virüsünün intranazal infülasyonu; akış sitometrisi boyama ve poliklonal ve antijene özgü Tfh hücrelerinin, GC B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin analizi; GC'lerin immünofluoresans tespiti; serumda influenza virüsüne özgü antikorun enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA). Bu tahliller temel olarak influenza virüs enfeksiyonunda Tfh hücrelerinin farklılaşmasını ve işlevini ölçerek farklılaşma mekanizması ve manipülasyon stratejisinin aydınlatıcı çalışmalarında yardımcı olunmaktadır.
Introduction
Son on yılda, germinal center (GC) B gelişimindeki temel rolleri için yeni tanımlanan CD4+ T hücre alt kümesi olan Tfh hücre alt kümesi üzerinde çok sayıda çalışma odaklanmıştır. Esas olarak bir gen represörü olarak kabul edilen B hücreli lenfoma 6 (Bcl6), Bcl6'nın ektopik ekspresyonunun Tfh farklılaşmasına yol açmanın yeterli olduğu ve Bcl6'nın eksikliğinin kaybolan Tfh farklılaşması 1 ,2,3ile sonuçladığı kanıtı için Tfh hücrelerinin soyu belirleyici faktörüdür. Diğer CD4+ T yardımcı alt kümelerinin aksine, iltihap bölgelerine göç ederek efektör işlevlerini yerine getirirken, Tfh hücreleri B hücresi yardımını esas olarak dalak ve lenf düğümünün B hücre foliküler bölgesinde sağlar. Ortak uyarıcı moleküller ICOS ve CD40L, Tfh ve GC B hücreleri arasındaki etkileşimde önemli roller oynar. Tfh farklılaşması sırasında, ICOS konyak B hücrelerinden gerekli sinyalleri iletir ve ayrıca B hücre bölgesi lokalizasyonu4,5için seyirci B hücrelerinden geçiş sinyalleri alan bir reseptör görevi görür. CD40L, B hücrelerinin çoğalması ve sağkalım için Tfh hücrelerinden gelen sinyallerin arabulucusudur6. CD40L ile benzer rolü oynayan bir diğer faktör, esas olarak Tfh hücreleri tarafından salgılanan sitokin IL21'dir. IL21, GC B hücrelerinin gelişimini ve yüksek benzeşimli antikorların üretimini doğrudan düzenler, ancak Tfh farklılaşmasındaki rolü hala tartışmalıdır7,8. Akış sitometrisi analizinde Tfh hücrelerinin tanımlanmasında en sık kullanılan PD-1 ve CXCR5 de bu alt kümenin farklılaşmasında ve işlevinde önemli roller oynamaktadır. CXCR5, B hücre foliküler kemokinin reseptörüdür ve B hücre foliküllerinde Tfh hücrelerinin lokalizasyonuna aracılık eder9. PD-1 artık sadece foliküler rehberlik işlevine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda GC B hücrelerinin benzeşim olgunlaşması sürecinde kritik sinyalleri iletir10. Bu bulgulara dayanarak, bu moleküllerin ekspresyonunu değerlendirmek temel olarak Tfh hücrelerinin olgunlaşmasını ve işlevini yansıtabilir.
GC, sekonder lenfoid organlarda indüklenmiş geçici bir mikroanatomik yapıdır ve Tfh hücrelerine oldukça bağımlıdır, bu nedenle Tfh yanıtını değerlendirmek için mükemmel bir okumadır. GC'de, sitokinler ve ko-uyarıcı moleküller tarafından aracılık edilen sinyalleri aldıktan sonra, B hücreleri yüksek benzeşimli antikorlar oluşturmak için sınıf değiştirme ve somatik hipermütasyona tabidir11. Diferansiyel antikor sınıfı anahtarlama, IL4 ve IL21'in IgG1 sınıfının değiştirilmesine neden olduğu diferansiyel sitokin nişinde gerçekleşirken, IFNφ IgG2 sınıfının12'yegeçmesine neden olur. Plazma hücreleri salgılanan antikorların üreticileridir ve ölümcül olarak farklılaştırılmış hücrelerdir. Tfh hücreleri gibi, GC'deki B hücrelerinin gelişimi de birçok önemli molekülün dinamik ekspresykülü ile ilişkilidir. Mevcut çalışmaya dayanarak, GC B hücreleri B220+PNA+Fas+ veya B220+GL7+Fas+ hücreler ve plazma hücreleri olarak tanımlanabilir, öncüllerine kıyasla, B220'nin downregulate ekspresyolu ve upregulate CD138 ifadesi13. Dahası, bu özelliklerin her ikisi de akış sitometrisinde ve immünofluoresans analizinde tespit edilebilir, böylece GC yanıtının uygun değerlendirmesidir.
Grip virüsü enfeksiyonunda sağlam hücresel ve humoral yanıtlar indüklenir, Tfh ve Th1 hücreleri CD4+ T hücre yanıtı14'e hakimdir, bu da onu Tfh hücreleri farklılaşma çalışması için mükemmel bir model haline getirir. Influenza A/Porto Riko/8/34 Fareye uyarlanmış bir suş olan H1N1 (PR8), bu çalışmada sıklıkla14,15,16. Burada, influenza virüsü enfeksiyonunda Tfh çalışması ile ilgili tahlillerin bazı temel protokollerini açıklıyoruz: 1) PR8 virüsünün intranazal infülasyonu; 2) antijene özgü Tfh hücreleri, GC B ve plazma hücreleri ve akış sitometrisi ile IL21 tespiti; 3) GC'nin histolojik görselleştirilmesi; 4) ELISA ile serumda antijene özgü antikor titresinin tespiti. Bu protokoller, Tfh ile ilişkili çalışmada yeni araştırmacılar için gerekli teknikleri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, Çin'in Şanghay kentindeki Institut Pasteur Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı hayvan protokolleri esas alınarak gerçekleştirildi.
NOT: Farelerin virüs enfeksiyonu ve organların izolasyonu ABSL2 durumu altında yapılmalıdır.
1. PR8 influenza virüsünün aşılenmesi ve fare ağırlığının kaydedilmesi
- ABSL2 odasında 8 haftalık erkek C57BL/6 fareleri enfeksiyon için hazırlayın.
NOT: Bu protokol dişi farelerle yapılan deneylerde de uygundur. - PR8 virüsünün seyreltilmesi: virüsü -80 ° C dondurucudan alın ve sıvı haline gelene kadar buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Stok virüsünü iyice girdaplayın ve önceden soğutulmuş 1,5 mL tüpte steril fosfat tamponlu salin (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH 2 PO4)ile virüsü2PFU/μL'ye seyreltin.
-
Fare uyuşturma: her fareyi tartın ve kullanılacak sodyum pentobarbital (2 mg/mL) fare ağırlığını (g)) (4 kat (μL) hesaplayın. Hesaplanan sodyum pentobarbital intraperitoneal hacmini enjekte edin.
NOT: Bu adım, farelerin istikrarlı ve huzurlu bir şekilde nefes almasını sağlamaktır, böylece doğru virüs titresi intranazal olarak aşılanabilir. Çok hızlı veya yavaş kalp atışları uygunsuz anesteziye işaret eder. Ek olarak, göz kuruluğundan kaçınmak için veteriner merhem kullanılması önerilir. - İntranazal Aşılama: seyreltilmiş PR8 virüsünü iyice girdap. Pipet 10 μL ve bir tarafta damla damla intranazal aşılamayı dikkatlice gerçekleştirin. Bu taraftaki tüm farelerin bir kafesteki (maksimum 5 fare) aşısını bitirdikten sonra, diğer tarafta aşılamayı tekrarlayın (farenin nefes almasını aşı boyunca huzurlu ve sabit tutun). Her fare toplamda PR8 virüsünün 40 PFU ile enfekte.
- Fareleri daha iyi canlanma için sıcak kafeslere sternal reumbency yerleştirin.
- Fare ağırlığını 10 gün boyunca günlük olarak izleyin. (Enfeksiyon günü 0. gün olarak kaydedilir).
2. Lenfositlerin dalak ve mediastinal lenf düğümünden (mLN) izolasyonu
- Fare ötenazisi: fareleri küçük bir odaya koyun ve odanın dibinden co2'ye barışçıl bir şekilde pompalayarak fareleri ötenazi edin. Hareket etmediklerinde fareleri dışarı atın ve farelerin tamamen ölmesini sağlamak için servikal çıkık yapın. Fareleri% 75 etanol ile batırın ve biyogüvenlik başlığına aktarın.
- Fareleri emici kağıt kaplı diseksiyon köpük plakasına diseksiyon iğneleri ile hareketsiz hale koyun. Karın orta çizgisi ve arka bacaklar boyunca cildi diseksiyon makası ile kesin ve cildi cımbızla gerin. Gerilen cildi diseksiyon iğneleri ile hareketsiz hale ederim.
- Her fare için iki adet 6 cm'lik tabak hazırlayın ve buzda saklayın. Her yemeğe 70-μm hücre süzgeci koyun ve% 1 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 5 mL DMEM ekleyin (DMEM (% 1 FBS))
- Dalak izolasyonu: karın boşluğunu diseksiyon makası ile açığa çıkarmak için peritonu kesin. Dalağını al ve hazırlanan yemeğe koy.
- mLN izolasyonu: diyaframı ve kafes kaburgasının altını timus çevresine kesin. Kaburgayı kenara çekin ve torasik boşluğu açığa çıkarmak için diseksiyon iğneleriyle sabitleyin. Akciğeri sağ tarafa çekin ve mLN almak için cımbız kullanın, kalbin altında ve nefes borusunun ventral tarafının yakınında.
- MLN'yi hazırlanan yemeğe koyun.
- Tek hücreli süspansiyonları elde edin: dalak veya mLN'yi 70-μm hücre süzgecinden 3 mL şırıngan pistonla hafifçe mesh edin. Hücre süzgecini 1 mL taze DMEM (%1 FBS) ile durulayın. Hücre süspansiyonu yeniden ıslatın ve 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- Hücre süspansiyonu 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve 1 mL DMEM (%1 FBS) ekleyin.
- Hücre peletini 1 mL-pipet ile iyice yeniden ıslatın. Dalak hücresi süspansiyonlarına 4 mL DMEM (%1 FBS) ekleyin ve aşağıdaki işlemler için buzda tutun.
NOT: Tek hücreleri peletten tamamen izole etmek için hücre peletini öncelikle 5 mL değil, 1 mL orta ile yeniden depolamak gerekir.
Bu adımdan itibaren tüm işlemler normal laboratuvarda gerçekleştirilebilir. -
Dalak hücre sayımı
- Tüpleri birkaç kez yukarı ve aşağı çevirerek hücreleri yeniden biriktirin. 10 μL'yi 90 μL kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponuna alın (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 155mM NH4Cl). Oda sıcaklığında (RT) 3 dakika kuluçkaya yatırın ve reaksiyonun sonlandırılması için 900 μL soğuk PBS ekleyin.
- 4 °C'de 6 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. 100 μL soğuk PBS ile yeniden depola. 10 μL hücreyi 10 μL w/v trippan mavisine alın ve hemositometre ile hücre sayımı için karışımdan 10 μL alın.
- Hesaplama: hücreleri normal yöntem olarak hesaplayın. Kısacası, hemositometredeki iki çapraz köşe karesinde hücre numaralarını sayın ve her köşe karesi için N1, N2 alın. 5 mL hücre süspansiyonunun hücre konsantrasyonu (N1+N2)/2 x 104 /mL olarak hesaplanmalıdır.
3. PD-1 ve CXCR5 ile Poliklonal Tfh hücrelerinin immünostainingi
- Biotin-anti-CXCR5 antikor ile boyama.
- Tüpü yukarı ve aşağı çevirerek hücre süspansiyonlarını yeniden dirsindirin. FACS tüpüne 2 x10 6 hücre alın ve 2 mL boyama tamponu ekleyin (PBS (%1 FBS, 1 mM EDTA)). Girdap salınım cihazında girdapla yıkayın.
- 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj. Sıvıyı dökerek süpernatantı atın ve tüp ağzını emici kağıda iki kez batırın.
- Tüp tabanına dokunarak hücre peletini kalıntı sıvısı ile gevşetin. Tüpü buzun üzerindeki tüp tutucusuna koyun.
NOT: Kalıntı sıvı hacmi yaklaşık 25 μL'dir. - Her tüp için 0,2 μL fare önleyici CD16/CD32 (Fc-reseptör engelleyici) ekleyin. Tüp tabanına hafifçe dokunarak girdap ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yaslanın.
NOT: Her tüp için 5μL boyama tamponu ile seyrelterek birden fazla numune için antikor karışımı hazırlayın. Karışım tarifi seyreltilerek (n/10+1) x 0,2 μL Fc-reseptör bloker (n/10+1) x 5 μL boyama tamponuna hazırlanmalı ve her tüpe 5,2 μL karışım eklenmelidir. - Tüp tabanına dokunarak her tüp ve girdap için 30 μL boyama tamponu kalıntısına 0,3 μL biotin-anti fare CXCR5 ekleyin.
NOT: Karışımı adım 3.1.4'te açıklandığı gibi hazırlayın. - Tüpe 30 dakikada dokunarak hafifçe ıslatıcı hücrelerle 1 saat boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
NOT: 30 dakikada girdap, daha iyi boyama için hücre agregalarını önlemektir. - Girdap salınım cihazına 2 mL boyama tamponu ve girdap ekleyin. 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj ve 3.1.2 adımında açıklandığı gibi süpernatantı atın. Tüpe dokunarak girdap ve sonraki boyama için buz üzerinde kuluçkaya yaslanın.
- Diğer yüzey işaretleyicilerle boyama.
- Adım3.1.4'teaçıklandığı gibi antikor karışımını ( Tablo 1 ) hazırlayın.
- Her tüpe antikor karışımı ekleyin. Tüp tabanına dokunarak girdap ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yaslanın.
- Hücreleri 2 mL boyama tamponu ile yıkayın. 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj.
- Süpernatant atın ve 400 μL boyama tamponu ekleyin. Girdap salınım cihazındaki tüpü girdaplayın ve akış sitometri analizine kadar tüpü karanlıkta tutun.
4. PR8 influenza virüsünün NP'ye özgü Tfh hücrelerinin immünostainingi
NOT: NP'ye özgü Tfh hücrelerini boyamanın bu protokolü önceki çalışmalardan15,17.
- 3.1. adımda açıklandığı gibi biotin-CXCR5 boyama gerçekleştirin, ancak boyama için alınan hücre numarasının akış sitometrisinde kaydedilecek kadar antijene özgü hücre için 3 x10 6 olması dışında.
- Tüpe 3.1.7'den 0.3 μL APC-konjuge-IAbNP311-325 MHC sınıf II(NP 311-325)tetramer ekleyin. 3.1.4 adımında olduğu gibi birden fazla numune için karışım hazırlayın
NOT: CD4 ve anti-CD4 antikor arasındaki bağ optimal tetramer lekesini engelleyeceğinden, anti-CD4 antikorunun eklenmesinden önce tetramer lekesi önemlidir. - Tüpe hafifçe dokunarak hücre karışımını yeniden saklayın ve RT'de 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın.
NOT: Buharlaşmayı azaltmak için tüplerin ağzına ıslak bir kağıt örtün - Diğer yüzey işaretleyicilerinin karışımını ekleyin (Tablo 1) ve 30 dakika boyunca RT'de inkübasyona devam edin.
- Hücreleri 3.2.3 ve 3.2.4 adımlarında açıklandığı gibi yıkayın ve yeniden uygulayın.
5. Poliklonal Tfh hücrelerinde Bcl6'nın immünostainingi
- Boyama tamponu yerine2mL PBS ile son yıkama dışında bölüm 3'te açıklandığı gibi yüzey işaretleyicileri ( Tablo 2 ) boyama gerçekleştirin.
- 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj. Tüp tabanına hafifçe dokunarak süpernatant ve resuspend hücre peletlerini atın.
- Hücre fiksasyonu için tüpe 300 μL% 3.7 formaldehit çözeltisi (PBS ile% 37 formaldehitten seyreltilmiş) ekleyin. Girdap salınım cihazında girdap ve RT'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Yıkama için 2 mL boyama tamponu ve 4 °C'de 6 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ekleyin. Tüpe hafifçe dokunarak süpernatant ve resuspend hücrelerini atın.
- %0,2 Triton-X 100'ün 300 μL'sini ekleyin ve vorteks salınım cihazına girdapla hücreleri yeniden depoleyin. RT'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Yıkama için 2 mL boyama tamponu ekleyin. 4 °C'de 6 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj. Tüp tabanına hafifçe dokunarak süpernatant ve resuspend hücrelerini atın.
- Her tüp için 1,5 μL PE-anti-Bcl6 antikoru ekleyin. Karışımı yeniden çıkarmak için tüp tabanına hafifçe dokunarak ve her 30 dakikada bir tüpe hafifçe dokunarak RT'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Karışım buharlaşmasını azaltmak için tüplerin ağzına ıslak bir kağıt örtün. - Tüpe %0,01 Triton-X 100 ile desteklenmiş 2 mL PBS ekleyin. Vorteks ve santrifüj 500 x g'da 4 °C'de 6 dakika.
- Yıkamayı adım 5.8 olarak tekrarlayın. Hücreleri 400 μL boyama tamponu ile yeniden biriktirin. Akış sitometrisi analizine kadar hücreleri buzun üzerinde karanlıkta tutun.
6. IL21'in hücre içi boyanma
- PMA (phorbol 12-myristate 13-asetat) ve iyonomisit ile hücreleri uyarın.
- Dalak hücre süspansiyonundan 2 x10 6 hücre alın ve 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj alın. 500 μL tam T hücre ortamı ile süpernatant ve resuspend hücre pelet atın. Hücreleri 24 kuyu plakasına aktarın.
- 500 μL tam orta18'e 20 nmol PMA ve 2 μmol iyonomisin ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın.
- 6.2. adımda hazırlanan çözeltiyi 24 kuyu plakasındaki hücre süspansiyonuna ekleyin ve plakayı sallayarak karıştırın. Hücrelere PMA ve iyonomisinin eklenmesi olmadan 500 μL komple T hücre ortamı ekleyerek uyarılmamış kontrolü ayarlayın. 4 saat boyunca 37°C'de bir CO2 inkübatörde kuluçkaya yaslanın.
- Golgi aparat aracılı protein taşımacılığını engellemek için her kuyuya 10 μmol BFA (metanol ile çözünmüş Brefeldin A) ekleyin. Plakayı hücre inkübatörüne geri koyun ve 2 saat kuluçkaya yatırın.
- Hücre yüzeyi işaretçisi boyama gerçekleştirin.
- Hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyarak yeniden biriktirin ve hücreleri bir FACS tüpüne aktarın. Tüpe 1 mL boyama tamponu ekleyin ve 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj ekleyin.
- Adım 3.1.4 olarak Fc-reseptör engelleyici boyama gerçekleştirin.
- 2 mL PBS'li hücreleri yıkamak dışında, 3.2.1 ile 3.2.3 adımlarında açıklandığı gibi hücre yüzeyi işaretleyicileri boyama (Tablo3 ) gerçekleştirin.
- 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj. Tüp tabanına dokunarak süpernatant ve resuspend hücrelerini atın.
- Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell boyama kitinden 0,2 μL reaktif ekleyin ve ölü hücrelerin lekelenmesini gerçekleştirmek için tüpü RT'de 10 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın.
- Tüpe 2 mL PBS ve girdap salınım cihazına vorteks ekleyin. 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj ve süpernatantı atın.
- Hücre sabitlemesini 5.3 ve 5.4 adımlarında açıklandığı gibi gerçekleştirin.
- Hücreleri yeniden depolamak için 300 μL boyama tamponu ekleyin ve tüpleri gece boyunca 4 °C buzdolabında saklayın. Süpernatantı çıkarmak için 4 °C'de 6 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj.
NOT: Bu adım atlanabilir ve 6.5 adımdan hemen sonra 6.7 adımına devam edebilir. - Girdap salınım cihazındaki tüpe ve girdabın içine 1 mL saponin tamponu (%0,2(w/v) saponin ile desteklenmiş boyama tamponu) ekleyin. Hücre permeabilizasyonunu gerçekleştirmek için buz üzerinde 20 dakika kuluçkaya yatırın.
- 4 °C'de 6 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ve supernatant atın.
- Her tüpe 0,5 μL insan Fc-IL21 reseptörü ekleyin. Antikor karışımını, lekeleme tamponu yerine saponin tamponu ile seyreltin dışında, adım 3.1.4 olarak çoklu olarak hazırlayın.
- Hücreleri 30 dakikada yeniden çıkarmak için tüp tabanına hafifçe dokunarak RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri yıkamak için 2 mL saponin tamponu ekleyin ve 6 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ekleyin. Süpernatant atın ve tekrar yıkamayı bir kez tekrarlayın.
- Her tüpe 0,1 μL APC-anti-insan Ig(H+L) ekleyin. Birden fazla örnek için karışımı adım 3.1.4 olarak hazırlayın, ancak antikoru boyama tamponu yerine saponin tamponu ile seyreltin.
- Numuneleri 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve adım 6.11 olarak yıkayın.
- Hücreleri 400 μL boyama tamponu ile yeniden biriktirin. Akış sitometrisi analizine kadar numuneyi buzun üzerinde karanlıkta tutun.
7. GC B ve plazma hücrelerinin boyanma
- Hücreleri alın ve anti-Fc-reseptör antikor boyamasını 3.1.1 ile 3.1.4 arasında adımlar olarak gerçekleştirin.
- Kuluçka süresinin 1 saat yerine 30 dakika olması dışında, yüzey işaretleyicileri boyamayı (Tablo 4) 3,1,5 ila 3,1,7 arasında adımlar olarak gerçekleştirin.
- Hücreleri 400 μL boyama tamponu ile yeniden biriktirin. Akış sitometrisi analizine kadar numuneleri buzun üzerinde karanlıkta tutun.
8. Serumun kandan izolasyonu
- Enfeksiyon sonrası 14. günde (d.p.i 14), kanı yüz damarından toplayın ve kan örneklerini gece boyunca 4 °C'lik bir buzdolabında saklayın.
NOT: ABSL2 durumunda kan alma işlemi gerçekleştirin ve bu adımdan itibaren tüm prosedürler normal laboratuvarda yapılabilir. - Kanı 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj edin. Kırmızı hücrelerin kirlenmesini önlemek için serumu 200 μL pipetle dikkatlice izole edin. Aliquot her örnek için 3 tüp içine ve -80 ° C'de saklayın.
9. ELISA ile HA'ya özgü antikor titresinin tahlili
- ELISA plakalarını kuyu başına 50 μL 2 μg/mL HA protein çözeltisi ile kaplayın ve bir gecede 4 °C buzdolabında kuluçkaya yatırın.
- 200 μL PBS seyreltilmiş %0,05 ara (PBST) ile üç kez yıkayın. Her kuyuya 100 μL PBST seyreltilmiş %5 yağsız süt ekleyin ve spesifik olmayan bağlamayı engellemek için RT'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
- Serum seyreltme ve inkübasyon: PBS'de seyreltme tamponu olarak %3 BSA hazırlayın. Serumu seyreltme tamponunda 1:50, 1:150, 1:450, ...... 1:36450'ye kadar (3 kat seri seyreltme önerilir). Her kuyuya 50 μL seyreltilmiş serum ekleyin ve bir gecede 4°C buzdolabında kuluçkaya yatırın.
- Serumu atın ve her kuyuya 200 μL PBST ekleyerek kuyuları bir kez hızlıca yıkayın (yavaşça çalkalayın, sonra atın). Daha sonra plakaları her biri 5 dakika boyunca üç kez 200 μL PBST ile çalkalayıcıda yavaşça yıkayın.
- Toplam IgG, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, PBST ile seyreltilmiş) için özel 100 μL HRP etiketli ikincil antikor ekleyin ve RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Plakaları 9.4'te açıklandığı gibi PBST ile yıkayın.
- 4 °C depolama alanından eşit miktarda A ve Tampon B (TMB) çıkartın ve kullanmadan önce RT'de en az 30 dakika ısıtın. A ve B'yi karıştırın ve her kuyuya 100 μL TMB ekleyin ve yumuşakça sallayarak RT'de 10-30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu, TMB Substrat Reaktif Seti (BD,555214) kılavuzunun kısa bir açıklamasıdır. - Reaksiyonun sonlandırılması için her kuyuya pipet 100μL 2MH 2 SO4. OD450 değerini enstrüman aracılığıyla okuyun.
- Veri Analizi: arka plan sinyalini (boş kuyunun OD450 değeri) çıkararak son OD450 değerini alın. X eksenindeki seyreltme faktörü ve Y eksenindeki OD450 değeri ile her numunenin antikor izotipine karşılık gelen eğriyi çizin.
10. Histoloji
- Dalakları D.P.I. 10'da izole et. RT'de 1 saat boyunca %3,7 formaldehit çözeltisinde sabitleyin.
- PBS'deki dalakları (%10 sakkaroz) 1 saat boyunca 4°C'de sulandırın ve daha sonra dalaklar 15 mL tüpün dibine batana kadar yumuşakça sallayarak 4°C'de PBS'de (%30 sakkaroz) susuz kalın.
- Susuz dalakları çıkar, optimum kesme sıcaklığı bileşiği ve kriyoseksiyona gömün.
- Asetonları -20°C'de önceden soğutun. Doku bölümlerini önceden soğutulmuş aseton ile 10 dakika kuluçkaya yatırın. Dokuyu PBS ile üç kez yıkayın.
- %0,2 Triton X-100 içeren PBS ile doku bölümlerini 20 dakika boyunca permeabilize edin ve PBS ile üç kez yıkayın.
- Spesifik olmayan bağlamayı RT'de 1 saat boyunca %10 normal keçi serumu (blokaj tamponu) içeren PBS ile engelleyin ve doku bölümlerini pbs ile bir kez yıkayın.
- STREPTAVIDIN/BIOTIN engelleme kiti ile spesifik olmayan bağlamayı engelleyin.
NOT: Bu adımdan itibaren numunelerin kurumasına izin vermeyin. - Birincil antikor ile boyama: doku bölümlerine bloke tampon seyreltilmiş biotin-PNA (25 μg / mL) ve sıçan anti-fare IgD (2.5 μg / mL) ekleyin. Islak odadaki doku bölümlerini bir gecede 4 °C dondurucuda kuluçkaya yatırın.
- Doku bölümlerini PBST ile bir kez hızlıca yıkayın. PBST'deki doku bölümlerini 5 dakika boyunca yavaşça sallayarak hızlı bir şekilde yıkayın. Üç kez yıkamayı tekrarlayın.
- Alexa Fluor 488-streptavidin (1:500) ve Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG (1:500) antikorlarını bloke tampon ile seyreltin ve doku bölümlerine dikkatlice ekleyin
- RT'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
- Doku bölümlerini adım 10.8 olarak yıkayın ve uzun süreli çözelti ile dikkatlice monte edin. Dokuyu kapakçıklarla dikkatlice örtün ve konfokal analize kadar 4°C'de karanlıkta tutun.
- Alan boyutu başına GC numaralarını sayarak GC reaksiyonunun büyüklüğünü analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnfluenza virüsü enfeksiyonunda fare morbiditesinin karakterizasyonu
İnfluenza virüsü enfeksiyonundan sonra, fareler, fare morbiditesini izlemek için yaygın olarak kullanılan bir semptom olan şiddetli kilo kaybı ile yansıyan hastalık nedeniyle daha az aktif ve anoreksiktir19. Şekil 1'degösterildiği gibi, PR8 virüs bulaşmış fareler 6. günde kilo vermeye başladı, 8. günde en yüksek kayıp seviyesine ulaştı ve 10. günde başlangıç seviyesine geri döndü. Beklendiği gibi, PBS ile tedavi edilen kontrol farelerinde dönem boyunca kilo kaybı gözlenmedi. In vivo semptomlar için, virüs enfeksiyonu, bu durumda mLN olan drenajan lenf nodunda sağlam lenfosit genişlemesine yol açar. Bu nedenle, PR8 virüs bulaşmış farelerde kontrol farelerinden önemli ölçüde daha büyük boyutlu mLN'ler gözlenmiştir (Şekil 1b). Birlikte ele alındığında, bu farelerin hepsi beklenen semptomları gösterdi ve sonraki Tfh ilişkili immün yanıt çalışması için nitelikliydi.
Tfh farklılaşması ve fonksiyonla ilişkili moleküllerin tespiti
Tfh farklılaşmasını analiz etmek için, fareler enfeksiyondan sonra 5, 7, 10 ve 14. Şekil 2a ve Şekil 2b, Tfh popülasyonu gating stratejisini gösterir, Tfh PD-1hi CXCR5hi hücreleri ve Tfh olmayanlar PD-1düşükCXCR5düşük hücreler olarak kapılıdır. Bu gating stratejisi ile influenza virüs enfeksiyonu sırasında Tfh farklılaşmasının kinetiği test edilmiştir. Şekil 2c'de gösterildiği gibi, Tfh farklılaşması 5. Biz de daha fazla analiz için 10. Şekil 3a'dagösterildiği gibi, influenza virüslü farelerde kontrol fareleriyle karşılaştırıldığında sağlam Tfh hücre farklılaşması indüklenmiştir. Influenza virüsüne özgü Tfh hücrelerini analiz etmek için, florokrom etiketli IAbNP311–325 MHC sınıf II tetramerler (NP311-325)poliklonal Tfh hücreleri boyama paneline eklendi (Tablo 1). Hem mLN'lerde hem de influenza virüslü farelerden dalaklarda, NP311-325-spesifikCD4+ T hücreleri önemli ölçüde indüklendi ve NP311-325-spesifikTfh hücreleri PD-1 ve CXCR5'in analize eklenmesiyle analiz edilebilir (Şekil 3e). Bcl6'nın Tfh farklılaşmasındaki temel rolleri nedeniyle, Bcl6+CXCR5+ hücreleri de Tfh popülasyonunu temsil edebilir. Sürekli olarak, bu strateji ile tanımlanan Tfh hücreleri de sağlam bir şekilde indüklenmiştür (Şekil 3b). Tfh ve Tfh olmayan hücrelerde Bcl6 ekspresyonunun ifadesini daha da analiz ettik. Şekil 3c'degösterildiği gibi, Tfh hücrelerinde Bcl6'nın Tfh olmayan hücrelerdekinden daha yüksek ifadesi başarılı Bcl6 lekeleme gösterir. Benzer strateji ile, ICOS, başka bir Tfh ilişkili molekül de analiz edildi (Şekil 3d). Tfh hücrelerinin B hücrelerine yardım sağlamadaki özel rolü nedeniyle, esas olarak Tfh hücreleri tarafından salgılanan ve B hücrelerinin hayatta kalmasını ve çoğalmasını doğrudan düzenlediği gösterilen IL21 ifadesinin test etmesi, Tfh hücrelerinin işlevini bir dereceye kadar ortaya koyabilir. Şekil 3f'degösterildiği gibi, IL21'in hücre içi lekelenmesi, PR8 enfeksiyonunun bu sitokinin önemli ölçüde daha yüksek üretimine neden olduğunu ve uyarılmamış hücrelerin gating kontrolü olduğunu ortaya koydu. Birlikte ele alındığında, bu tahliller Tfh farklılığının temel bilgilerini yansıtabilir ve B hücre yardım yeteneği hakkında içgörüler sağlayabilir.
Serumda GC B ve plazma hücrelerinin gelişimi ve influenza virüsüne özgü antikorların tespiti
Tfh hücrelerinin temel işlevi, antikor sınıfı anahtarlama ve benzeşim olgunlaşmasının meydana geldiği GC'lerde B hücre yardımı sağlamaktır. Yani GC B gelişimi dolaylı olarak Tfh hücrelerinin farklılaşma ve işlevini yansıtabilir. GC B hücreleri B220 + PNA+Fas+hücreler (Şekil 2d) olarak kapılanabilir. Bu gating stratejisi ile, GC B hücre yanıtının kinetiğini test ettik ve GC B yanıtının 10. PR8 virüs bulaşmış ve kontrol fareleri arasındaki karşılaştırma, PRB virüs bulaşmış farelerde indüklenen Tfh farklılaşması ile tutarlı olan influenza virüsü enfeksiyonundan sonra hem mLN hem de dalakta sağlam GC B indüklendiğini göstermiştir(Şekil 4a). Ek olarak, IgD ve PNA ile immunofluoresans boyama, PR8 virüs bulaşmış farelerde indüklenmiş GC reaksiyonunu (yeşil alanlar) gösteren görselleştirilmiş görüntüler sağlar (Şekil 4d). IgDdüşükCD138+ hücreler olarak tanımlanan plazma hücreleri (Şekil 2d), PR8 virüs bulaşmış farelerde de üretilmişlerdir (Şekil 4b). Önceki çalışmalar, IFNƳ ve IL21'in virüs enfeksiyonunda hem Th1 hem de Tfh hücrelerinden salgılanabileceğini vesırasıylaIgG2 ve IgG1 sınıf değiştirmesini teşvik edebileceğini tanımlamıştır. Şekil 4c, HA'ya özgü IgM, total IgG, IgG1, IgG2b ve IgG2C'nin ELISA testi ile influenza virüsüne özgü antikorun neslini tasvir eder. Birlikte, tüm bu tahliller influenza virüs enfeksiyonunda Tfh ilişkili B hücre yanıtlarını yansıtır.
Şekil 1: Fare morbiditesinin karakterizasyonu. 8 haftalık erkek farelere intranazal aşılama ile 40 PFU PR8 influenza virüsü bulaştı. Fareler 10 gün boyunca her gün tartıldı (a) ve mLN'ler d.p.i 10(b)üzerinde izole edildi. (a)içindeki hata çubukları ortalama ± SD'± temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tfh hücrelerinin ve GC B hücrelerinin gating stratejisi. (a) Lenfositler FSC-A ve SSC-A tarafından tanımlanır ve hücre singlet'ları FSC-A, FSC-H ve SSC-A, SSC-W ile kapılır. (b) CD4+ T hücrelerinde gating yaptıktan sonra, naif T hücrelerini (CD44loCD62Lhi)ve aktif T hücrelerini (CD44hiCD62Llo)ayırt etmek için CD62L ve CD44 yüzey belirteçleri kullanılır. Poliklonal Tfh hücreleri aktif T hücrelerinden PD-1hi CXCR5hi popülasyonu olarak, tersine, Tfh olmayan hücreler PD-1düşükCXCR5düşükolarak kapılanabilir. PR8 virüse özgü Tfh hücreleri CD4+CD44+ NP311-325 tetramer+PD-1hi CXCR5hi hücreleri olarak tanımlanır. (c,e) Aktif hücrelerde Tfh frekansının kinetiği (c) ve B220+ hücrelerde GC B frekansı (e). (d) GC B hücreleri B220+ PNA+FAS+ hücreleri olarak kapılı ve plazma hücreleri IgD-CD138+ hücrelerdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PR8 virüs bulaşmış farelerde Tfh farklılaşmasının analizi. D.p.i 10'da fareler kurban edildi ve MLN'ler ve dalaklar Tfh farklılaşma analizi için izole edildi. (a) PR8 virüs bulaşmış farelerde ve PBS ile tedavi edilen farelerde (üst panel) mLN'lerde ve dalaklarda Tfh yüzdesi. Tfh hücrelerinin istatistikleri (alt panel). (b) CD4+CD44hi T hücrelerinde (üst panel) Bcl6'nın hücre içi boyanma. Bcl6+CXCR5+ hücrelerin (alt panel) istatistikleri. (c) Bcl6 ve (d) Tfh (çizgi kırmızısı) ve Tfh olmayan hücrelerde (düz-gri) ICOS ifadesi. (e) PR8 virüslü ve PBS ile tedavi edilen farelerin (sol panel) mLN'lerinde ve dalaklarındaNP 311-325-spesifikCD4+ T hücrelerinin gating'i. MLN'lerde ve dalaklarda (orta panel) PR8 virüse özgü Tfh hücrelerinin yüzdesi. "İzotip", alakasız tetramer kontrolü ile boyamayı gösterir. NP311-325'eözgü CD4+ T hücrelerinin istatistikleri (sağ panel). (f) PR8 virüs bulaşmış ve PBS ile tedavi edilen farelerden gelen splenik CD4+ T hücrelerinde IL-21'in hücre içi lekelenmesi, kontrol olarak gösterilen uyarılma (solda). IL-21 boyama istatistikleri (sağda). **P < 0.01, ***P < 0.001 ve **** P < 0.0001 (iki kuyruklu Öğrenci t-testi). Hata çubukları ortalama ± SD'± temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: PR8 virüs bulaşmış farelerde GC B hücre ilişkili yanıtın analizi. D.p.i 10'da fareler kurban edildi ve MLN'ler ve dalaklar analiz için izole edildi. (a) GC B hücrelerinin yüzdesi (üst panel). GC B hücrelerinin istatistikleri (alt panel). (b) Plazma hücrelerinin yüzdesi (üst panel). Plazma hücrelerinin istatistikleri (alt panel). (c) PR8 virüs bulaşmış farelerin ve PBS ile tedavi edilen farelerin serumunda (d.p.i 14) PR8 virüsüne özgü IgG, IgM, IgG1, IgG2b ve IgG2c'nin nicelleştirilmesi. (d) PR8 virüs bulaşmış farelerin ve PBS ile tedavi edilen farelerin dalak örneklerinde (IgD+, Kırmızı) ve GC'lerin (PNA+, Yeşil) konfokal mikroskopisi (d.p.i 10). *P < 0.5, **P < 0.01 ve ***P < 0.001 (iki kuyruklu Öğrenci t testi). Hata çubukları ortalama ± SD'± temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| yüzey işaretçisi | florokrom | Klon | örnek başına hacim(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | eVolve 605 | IM7 | 0.2 |
| CD62L | FITC | MEL-14 | 0.2 |
| ICOS | BV421 | 7E.17G9 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidin | Pe | 0.2 |
Tablo 1: Yüzey işaretleyici (CXCR5 hariç) Tfh hücrelerini boyamak için antikor paneli (PD-1hiCXCR5hi).
| yüzey işaretçisi | florokrom | Klon | örnek başına hacim(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | IM7 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidin | BV421 | 0.5 |
Tablo 2: Tfh hücrelerinde Bcl6'yı boyamak için yüzey işaretleyici antikorlar (CXCR5 hariç) paneli.
| yüzey işaretçisi | florokrom | Klon | örnek başına hacim(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | IM7 | 0.2 |
Tablo 3: IL21'in hücre içi boyanma için yüzey işaretleyici antikor paneli.
| yüzey işaretçisi | florokrom | Klon | örnek başına hacim(ul) |
| B220 | Apc | RA3-6B2 | 0.2 |
| ıgd | eFluor 450 | 11-26c | 0.2 |
| CD95 | PE/Cy7 | Jo2 | 0.3 |
| Pna | FITC | 0.3 | |
| CD138 | Pe | 281-2 | 0.2 |
Tablo 4: GC B ve plazma B hücrelerini boyamak için yüzey işaretleyici antikor paneli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yüksek benzeşimli antikorlar üretmek için B hücre yardımı sağlamada özel roller nedeniyle, Tfh hücreleri aşı tasarımı için yeni stratejiler sağlamak için farklılaşma ve manipülasyon mekanizmalarında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. İnfluenza virüsü enfeksiyonu güçlü Tfh ve GC B hücreleri yanıtlarına neden olarak bu araştırma alanı için uygun bir modeldir. Bu yazıda influenza virüsü enfeksiyonunun intranazal aşılama, Tfh ilişkili yanıtın akış sitometrisi, immünoresans ve ELISA ile değerlendirilmesi ile ilgili protokoller açıklanmıştır. Bu tahliller, Tfh farklılaşması, GC B gelişimi ve influenza virüsüne özgü antikorların tespitini kolaylaştıracak ve araştırmacıların bağışıklık yanıtında yeni önemli molekülleri keşfetmelerine ve tanımlamalarına yardımcı olacaktır.
Grip virüsü ile enfekte fare modelleri ile yapılan çalışmalarda, kilo kaybı fare morbiditesinin yaygın olarak kullanılan bir göstergesidir. Grip virüsü ile enfekte farelerde beklenen kilo değişimi kinetiği Şekil 1a'da açıklandığı gibi farelerde indüklenen uygun bağışıklık yanıtını yansıtır. Bununla birlikte, farelerin kilolarını kaybettiği veya gözlem süresi boyunca herhangi bir kilo düşüşü göstermediği anormal vakalar düzenli olarak ortaya çıkar. Deneyimlerimize göre, bu fareler çoğunlukla anormal daha düşük veya daha yüksek bağışıklık tepkisi taşıyacak ve böylece deney sonuçlarını bozacaktı. Bu tür varyasyonları önlemek için, öncelikle deneyde kullanılan fareler, virüse benzer duyarlı yeteneği garanti etmek için cinsiyet ve yaşla eşleştirilmelidir. Her fare için tutarlı virüs titre de önemlidir21. Bu protokolde kullanılan virüs titresi 40 PFU'dur. Bununla birlikte, her laboratuvarda uygun kilo değişimi kinetiğini indüklemesi için virüs titresi değerlendirme prosedüründeki tutarsızlık ve deneyde kullanılan fare suşları nedeniyle değişken olabilir. Bu nedenle, immün yanıtla ilgili çalışmadan önce enfeksiyon için virüs titresinin titrasyonunun gerekli olduğunu tavsiye ediyoruz.
Bu protokolde, sık kullanılan PD-1, CXCR5 ve temel transkripsiyon faktörü Bcl6 olan Tfh hücrelerini tanımladık. Her iki PD-1merhabaCXCR5merhaba ve Bcl6+CXCR5+ hücreler Tfh hücreleri olarak belirtilebilir olsa da, farklı popülasyonu temsil ederler ve tüm PD-1merhabaCXCR5hi hücrelerinin Bcl6+ olmadığı ve tüm Bcl6+CXCR5hi hücrelerinin PD-1hiCXCR5hiolmadığı gerçeğine dayanan öncül-soy ilişkisine sahip değildirler. Bu fenotip, Tfh hücrelerinde Bcl6 ekspresyonunun heterojenliği ile açıklanabilir22. Hem Tfh farklılaşması hem de göç için kritik bir molekül olan ICOS da Tfh farklılaşması analizine dahil edilmelidir. Ek olarak, OX40 ve CD40L gibi işlevle ilişkili diğer ko-uyarıcı moleküller de bu protokole dahil olmasa da ifade düzeyleri için tespit edilmelidir. IL21 ve IL4, IgG1 sınıf değiştirmenin teşvikinde rol oynayan Tfh salgılı sitokinlerdir. IL21 ifadesini algılama protokolü bu makalede açıklanmıştır. Bununla birlikte, Tfh hücrelerinde IL4'ün tespitinde zorluk nedeniyle, il4-GFP muhabir fareleri önceki çalışmalarda kullanılmıştır23. Bu protokolde, NP311-325'eözgü Tfh hücrelerini tespit etmek için florokrom etiketli NP tetramerleri de kullandık. Bununla birlikte, NP311-325-spesifikTfh hücrelerinin miktarındaki sınır, daha fazla analizde zorluk çeker. Bu nedenle, TS-1 farelerinden izole edilebilen influenza hemagglutinin spesifik-TCR transgenik (Tg) CD4+ (TS-1) T hücrelerinin benimsenen transfer deneyi, bu sorunun çözümünde alternatif bir stratejidir24.
Burada GC B'yi akışsitometrisi boyamada B220 + PNA+Fas+ hücreler olarak tanımladık. GC B'yi GL7hiFashi hücreleri olarak tanımlamak için alternatif bir işaretleyici kombinasyon stratejisi de diğer makalelerdekullanılır 14,16. Ayrıca, ANTI-IgD ve PNA kombinasyonu ile GC'leri görselleştirmek için immünofluoresans kullanıyoruz. Burada CD3 antikorunun eklenmesi Tfh hücrelerinin görselleştirilmesine yardımcı olabilir, böylece bu iki hücre tipi arasındaki etkileşimin incelenmesini sağlar10.
Tfh hücrelerinin farklılaşması çok aşamalı ve çok yönlü bir süreç olduğu göz önüne alındığında, Tfh farklılaşmasında daha ayrıntılı mekanizmayı ortaya çıkarmak için birden fazla zaman noktasındaki diğer önemli moleküllerin ek tahlilleri gereklidir. Ek olarak, burada algılanan parametreler diğer modellerde de yaygın olarak kullanılmaktadır18. Bu nedenle, influenza virüs enfeksiyonlarının yanı sıra, burada açıklanan protokoller, özellikle immünostaining kısmı, diğer modellerle Tfh ilişkili çalışmada da talimatlar sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Debi sitometri tesisi, ABSL2 tesisi ve Şanghay Institut Pasteur SPF hayvan tesisi personeline teknik yardımları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklendi: Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelikli Araştırma Programı (XDB29030103), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2016YFA0502202), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31570886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
- Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
- Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
- Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
- Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
- Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
- Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
- Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
- Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
- Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
- Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
- He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
- León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
- Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
- Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
- Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).
