Drahtlose elektrophysiologische Aufzeichnung von Neuronen durch bewegliche Tetrodes in frei schwimmenden Fischen

Summary

Eine neuartige drahtlose Technik zur Aufzeichnung extrazellulärer neuronaler Signale aus dem Gehirn frei schwimmender Goldfische wird vorgestellt. Das Aufnahmegerät besteht aus zwei Tetrodes, einem Microdrive, einem neuronalen Datenlogger und einem wasserdichten Gehäuse. Alle Teile sind mit Ausnahme des Datenloggers und seines Anschlusses maßgeschneidert.

Abstract

Die neuronalen Mechanismen, die das Fischverhalten regeln, bleiben weitgehend unbekannt, obwohl Fische die Mehrheit aller Wirbeltiere ausmachen. Die Fähigkeit, die Gehirnaktivität von frei beweglichen Fischen aufzuzeichnen, würde die Forschung auf der neuronalen Basis des Fischverhaltens erheblich voranbringen. Darüber hinaus ist eine präzise Kontrolle der Aufnahmeposition im Gehirn entscheidend für die Untersuchung koordinierter neuronaler Aktivität über Regionen im Fischhirn hinweg. Hier präsentieren wir eine Technik, die drahtlos aus dem Gehirn frei schwimmender Fische aufzeichnet und gleichzeitig die Tiefe des Aufnahmeortes steuert. Das System basiert auf einem neuronalen Logger, der mit einem neuartigen wasserkompatiblen Implantat verbunden ist, das die Aufnahmeposition durch mikroantriebsgesteuerte Tetrodes einstellen kann. Die Fähigkeiten des Systems werden durch Aufnahmen aus dem Telencephalon von Goldfischen veranschaulicht.

Introduction

Fische sind die größte und vielfältigste Gruppe von Wirbeltieren, und wie andere Wirbeltiere zeigen sie komplexe kognitive Fähigkeiten wie Navigieren, Geselligkeit, Schlafen, Jagen, etc. Dennoch bleiben die neuronalen Mechanismen, die das Fischverhalten regeln, größtenteils unbekannt.

In den letzten Jahrzehnten wurden vor allem extrazelluläre Aufnahmen von immobilisierten Fischen implementiert, um verschiedene Aspekte der neuronalen Basis des Verhaltens^1,2zu untersuchen. Obwohl diese Technik für einige sensorische Systeme geeignet ist, ist die Untersuchung des gesamten Spektrums der neuronalen Verhaltensgrundlage bei immobilisierten Tieren schwierig, wenn nicht gar unmöglich. Die ersten Fortschritte betrafen die Aufnahme von gefesselten Schwimmfischen aus den Mauthner-Zellen^3,4. Mauthner-Zellen sind jedoch überproportional groß und die aufgezeichneten Wirkungspotentialamplituden, die bis zu wenige mV erreichen können, erleichtern die Aufnahme. Später beschrieben Canfield et al. einen Proof of Concept, wenn er ein gefesseltes Tier benutzte, um aus dem Telencephalon von Fischen⁵aufzunehmen. Eine weitere neuere Technik zur Aufzeichnung der neuronalen Aktivität von Fischen ist die Kalzium-Bildgebung (siehe Rezensionen von Orger und de Polavieja⁶und Vanwalleghem et al.⁷). Diese Technik wurde für den Einsatz mit Zebrafischlarven entwickelt, da Haut und Schädel während der Larvenphase transparent sind. Diese Technik kann jedoch nicht verwendet werden, um komplexe Verhaltensweisen in späteren Entwicklungsstadien zu untersuchen.

Hier präsentieren wir eine neuartige Technik zur Erfassung extrazellulärer neuronaler Aktivität aus dem Gehirn frei schwimmender Fische. Dies ist eine modifizierte Version des Protokolls, das in Vinepinsky et al.⁸beschrieben wird. Die wichtigste Innovation ist die Zugabe eines Mikroantriebs, der es ermöglicht, die Position der Elektroden nach der Operation zu steuern. Die Technik wurde für die Aufzeichnung aus dem Telencephalon von Goldfischen mit einer Reihe von Tetroden entwickelt, die über einen Microdrive mit einem neuronalen Datenlogger verbunden sind. Das gesamte Setup ist kabellos und am Schädel des Fisches verankert. Das spezifische Gewicht des Systems wird dem wasserspezifischen Gewicht durch Zugabe eines kleinen Schwimmers ausgeglichen, der es den Fischen ermöglicht, frei zu schwimmen.

Die Technik basiert auf der Verwendung eines neuronalen Datenloggers, der das Signal in einem onboard-Speichergerät verstärkt, digitalisiert und speichert. Das Logger-Telemetriesystem wird verwendet, um die Aufnahmen zu starten und zu stoppen und für die Synchronisation mit der Videokamera. In diesem Protokoll wird ein 16-Kanal-Neural-Logger verwendet, eingebettet in eine wasserdichte Box zusammen mit dem Microdrive.

Die Microdrive-Baugruppe besteht aus zwei Hauptkomponenten: dem Microdrive selbst und dem Microdrive-Gehäuse (Abbildung 1A,B). Das Gehäuse hält den Microdrive und die Tetrodes und fungiert auch als Anker zwischen dem Schädel und der Logger-Box (Abbildung 1C). Die PVC-Loggerbox wird mit einem Maschinenverfahren hergestellt und mit einem O-Ring versiegelt(Abbildung 1E-G, siehe auch Ergänzende Abbildung 1, Ergänzende Abbildung 2und Ergänzende Abbildung 3 für ein dreidimensionales [3D]-Diagramm). An einem Ende wird ein Stück Polystyrolschaum an der Loggerbox befestigt, um das Gewicht des Implantats zu kompensieren und den Fischen ein auftriebsneutrales Implantat zu geben. Die Konstruktion des im Protokoll beschriebenen Mikroantriebs folgt dem von Vandecasteele et al.⁹ vorgestellten Verfahren mit einer Modifikation, um den Mikroantrieb am Gehäuse zu befestigen (Abbildung 1A). Alle wichtigen Schritte werden vorgestellt.

Das im Protokoll zur Herstellung des Fischschädels beschriebene Verfahren ähnelt dem in Vinepinsky et al.⁸ vorgestellten verfahren und wird kurz im Protokoll beschrieben. Einen Tag nach der Operation werden die Fische in der Regel vollständig von den Auswirkungen der Anästhesie erholt und sind bereit für die Verhaltensexperimente. Beachten Sie, dass die Tetrode-Position durch Drehen der Microdrive-Schraube eingestellt werden kann. Die Schraube hat einen Abstand von 300 m pro Volldrehung und es wird eine Weiterentwicklung von 75 m empfohlen, bis die Ziel-Gehirnposition erreicht ist. Ein geeigneter Hirnatlas sollte konsultiert werden, um die spezifische Hirnregion von Interesse anzusprechen. Es ist ratsam, die Elektrodenimpedanz jedes Mal zu testen, wenn der Fisch für batterie- oder Speicherkartenersatz beäpftiert wird.

Protocol

Alle chirurgischen Verfahren müssen von den örtlichen Ethikkommissionen für den Tierschutz (z. B. IACUC) genehmigt werden.

1. Bau des Microdrive-Gehäuses

1. Um das Gehäuse zu konstruieren, schneiden Sie eine 1 mm breite Messingplatte mit einer Säge in eine 19 mm x 29 mm x 1 mm Platte. Schneiden Sie zwei 5,5 mm Schlitze auf jeder der langen Seiten senkrecht zur Kante, so dass jeder Schlitz 6,5 mm von den schmalen Seiten entfernt ist (Abbildung 2A).
2. Falten Sie mit einer Zange den Bereich zwischen den Schlitzen auf den langen Seiten nach innen, dann falten Sie den unteren Teil nach innen und die obere Seite nach außen, um das Gehäuse zu erhalten (Abbildung 2B,C).
3. Mit einem 3 mm Bohrer, machen Löcher für Schrauben im Microdrive-Gehäuse.
   HINWEIS: Diese Löcher werden später verwendet, um das Gehäuse an der Logger-Box zu befestigen (Abbildung 2D).
4. Löten Sie die Seiten des Gehäuses.
5. Erzeugen Sie mit einer feinen kreisförmigen Datei einen kleinen, 1,5 mm Groß-/Kleinlichtschlitz am unteren Rand des Gehäuses (Abbildung 2E).
   HINWEIS: Dies wird später verwendet, um das Edelstahlrohr einzufügen, um die Elektroden zu führen.
6. Verwenden Sie einen 1 mm Bohrer, um ein Loch in der Rückseite des Gehäuses für die Tetrodes zu machen (Abbildung 2F).
   HINWEIS: Ein 3D-Modell des Gehäuses befindet sich in der Datei Supplementary housing.stl.

2. Bau des Microdrive

1. Brechen Sie mit einem Fräser ein dreipoliges Stück von einem einreihigen männlichen Stiftleistenstreifen ab (Abbildung 1H). Ziehen Sie mit der Zange den mittleren Stift heraus.
2. Mit einem Fräser die verbleibenden Stifte auf 10 mm Länge schneiden (2 mm kleiner als die Schneckenlänge). Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung einer längeren Schraube (siehe Schritt 2.4).
3. Bohren Sie ein Loch mit einem #65 Bohrer durch die mittlere Stiftbohrung. Bohren Sie einen Thread mit einem 00-99-Tap.
4. Montieren Sie den Mikroantrieb und die Messingplatten (7,5 mm x 2,5 mm x 0,6 mm, siehe Zusatzabbildung 4), so dass die Messingplatten die Stifte berühren. Legen Sie eine Schraube (#00-90 Rundkopf, 12 mm, Messing) durch die erste Messingplatte, dann durch das Stiftkopfgewinde und die zweite Messingplatte. Schließlich legen Sie eine Mutter auf die Schraube und ziehen Sie den montierten Microdrive vorsichtig fest.
5. Löten Sie die Stifte zusammen mit den Messingplatten und die Mutter mit der Spitze der Schraube.
6. Löten Sie den Microdrive an vier Stellen an den Seiten der Microdrive-Messingplatten in das Microdrive-Gehäuse.
7. Schneiden Sie ein Edelstahlrohr 6 mm lang mit einem Innendurchmesser von 1,5 mm und ein weiteres Edelstahlrohr 3 mm lang mit einem Innendurchmesser von 1,2 mm. Polieren Sie die Enden der Rohre, um scharfe Enden zu vermeiden.
8. Kleben Sie das 6 mm lange Rohr mit Epoxid an den kleinen halbkreisförmigen Schlitz an der Unterseite des Mikroantriebsgehäuses. Kleben Sie den 3 mm langen Edelstahl an den Stiftkopf, aufgereiht mit dem 6 mm langen Rohr am Gehäuse.
9. Schneiden Sie zwei 5 cm lange Silikonrohrsegmente mit einem Durchmesser von 0,64 mm und ein 5 cm langes Polyimidrohr mit einem Durchmesser von 0,250 mm.
10. Setzen Sie die drei Rohre in die beiden Edelstahlrohre ein. Kleben Sie die Rohre mit Cyanoacrylatkleber an das am Stiftkopf befestigte Edelstahlrohr. Schrauben Sie den Microdrive ganz nach oben und schneiden Sie die überschüssigen Schläuche von oben und unten der beiden Stahlrohre ab.
    HINWEIS: Der Microdrive mit dem Gehäuse ist nun einsatzbereit (Abbildung 1C).

3. Vorbereiten des Tetrode-Arrays

1. Um ein Zwei-Tetrode-Implantat mit vier Elektroden auf jeder Tetrode herzustellen, bereiten Sie acht Drähte, jeweils 12 cm lang, Formvar isoliert, aus 25 m Durchmesser Wolframdraht.
   HINWEIS: Das gleiche Design bietet Platz für vier Tetrodes.
2. Stellen Sie einen Halter für eine 16-Kanal-Elektroden-Schnittstellenplatine (EIB-16) Leiterplatte (siehe Materialtabelle) unter das Mikroskop.
3. Entfernen Sie mit einer weich gekippten Pinzette und einem Feuerzeug die Beschichtung von jedem der acht Drähte auf einer Seite mit der Flamme.
   HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass der Draht später ordnungsgemäß an den Leiterplattenstecker angeschlossen wird.
4. Schieben Sie einen Draht in eines der Löcher in der EIB-16 mit der beschichteten Seite in das Loch. Legen Sie einen Stift und drücken Sie ihn mit einer Zange. Überprüfen Sie die Konnektivität, indem Sie den Widerstand zwischen dem Stift und der unbeschichteten Seite des Drahtes messen.
   HINWEIS: Der Widerstand ist in der Größenordnung von Dutzenden von Ohms.
5. Wiederholen Sie Schritt 3.4 mit allen acht Drähten.
6. Band zwei Gruppen von vier Drähten zusammen mit Kanalband am Ende jedes Drahtes.
   HINWEIS: Jede Gruppe wird später zu einer Tetrode zusammengeklebt.
7. Schneiden Sie ein Stück Wolframdraht 12 cm lang mit einem Durchmesser von 50 m. Schließen Sie es an eine der EIB-16-Verbindungen an.
   HINWEIS: Dieser Draht dient als Referenzelektrode.
8. Schneiden Sie zwei blanke Silberdrähte mit einer Länge von 12 cm und einem Durchmesser von 75 m, die als Grund für den Aufnahmelogger dienen. Löten Sie die beiden Drähte an den Bodenanschluss in der EIB-16.
9. Halten Sie die EIB-16 über einer motorisierten Drehvorrichtung und legen Sie das Kanalbandende einer Gruppe von vier Drähten auf das motorisierte Tuninggerät. 130 Runden im Uhrzeigersinn auftragen, gefolgt von 20 Gegen-Uhrzeigerumdrehungen. Cyanoacrylatkleber auftragen, um die Tetrode zu bedecken.
10. Warten Sie, bis der Kleber aushärtet. Schneiden Sie die Tetrode in der Nähe des Klebebandes.
11. Wiederholen Sie die Schritte 3.9 und 3.10 mit der zweiten Tetrode.
    HINWEIS: Dadurch entsteht das fertige Zwei-Tetrode-Array (Abbildung 1D).

4. Montage des Implantats

1. Schrauben Sie den Microdrive ganz nach unten.
2. Befestigen Sie die EIB-16 mit 1 x 3M Phillips-Rundkopfschrauben an der PVC-Platte.
3. Ziehen Sie mit soft end Pinzette alle Tetrodes und Drähte durch das Loch in der Vorderseite der Loggerbox-Abdeckung.
4. Befestigen Sie die PVC-Platte mit den 2 x 6M Phillips-Flachkopfschrauben an der Logger-Box-Abdeckung. Halten Sie den EIB-16-Stecker in der richtigen Ausrichtung, damit der Logger auf der EIB-16 montiert werden kann. Stellen Sie sicher, dass die EIB-16 fixiert ist, um Bewegungsartefakte im aufgezeichneten Signal zu vermeiden.
5. Versiegeln Sie die Drähte mit Epoxid an die Box. Tragen Sie so wenig wie möglich auf, da die primäre Abdichtung später durch Raumtemperaturvulkanisieren (RTV) erfolgt.
6. Befestigen Sie das Microdrive-Gehäuse mit 2 mm Schrauben an der Logger-Box-Abdeckung.
7. Gewinden Sie die Tetrodes und alle Drähte durch das Loch an der Rückseite des Microdrive-Gehäuses. Verfädeln Sie die Tetroden durch die beiden Silikonrohre im Microdrive. Gewinden Sie den 50-m-Wolframdraht durch das Polyimidrohr im Mikroantrieb.
8. Kleben Sie die Tetrodes und Drähte an ihre Rohre, indem Sie Cyanoacrylatkleber am oberen Ende der Rohre auftragen, um sicherzustellen, dass die Bewegung mit dem Mikroantrieb übereinstimmt. Schrauben Sie den Microdrive bis ganz nach oben.
9. Tragen Sie weiches Erdöl (siehe Materialtabelle) auf die freiliegende Tetrode und Drähte im Mikroantriebsgehäuse auf, um Bewegung zu verhindern.
10. Schneiden Sie ein 12 mm x 14,5 mm Petrischalenbodenfenster mit einer beheizten Rasierklinge. Befestigen Sie das Fenster mit Epoxid an der Vorderseite des Microdrive-Gehäuses. Halten Sie die Erddrähte außerhalb des Fensters.
11. Tragen Sie die RTV-Beschichtung auf die freiliegenden Tetrodes und Drähte zwischen der Loggerbox-Abdeckung und dem Microdrive-Gehäuse auf.
12. Nachdem der RTV ausgehärtet ist, schließen Sie die Box mit einem kleinen Gewicht im Inneren, und tauchen Sie in Wasser über Nacht, um sicherzustellen, dass kein Wasser in die Box austritt.
13. Schneiden Sie die Tetrodes und Referenzdraht auf die gewünschte Länge mit scharfen Scheren.
14. Befestigen Sie den markierten extrudierten Polystyrolschaum (siehe Materialtabelle)an der Box. Passen Sie seine Größe so an, dass sein Auftrieb ausgeglichen ist, wenn er in ein Wasserbad getaucht wird.
15. Tauchen Sie die Tetrode-Spitzen in platinschwarze Lösung und verwenden Sie einen Gleichstrom (-0,2 A), um die Elektroden zu beschichten und die Impedanz der Elektroden nach Belieben einzustellen. Verwenden Sie einen Multielektrodenimpedanztester (siehe Materialtabelle) für Beschichtungs- und Impedanzmessungen.
    HINWEIS: Im Goldfisch pallium ist ein Wert von 40 kOhm am besten. Je nach Anwendung kann die Elektrodenimpedanz durch Modifizieren der platinschwarzen Beschichtung^10,11eingestellt werden.

5. Anästhesie-Vorbereitung — 1% MS-222 Bestandslösung

ACHTUNG: Anästhesie-Präparation umfasst die Verwendung von pulverisiertem MS-222, einem karzinogenen. Daher müssen die Schritte 5.2 und 5.3 in einer chemischen Kapuze mit Handschuhen durchgeführt werden.

1. Fügen Sie 100 ml Wasser in ein Rohr, das mehr als 100 ml enthalten kann.
2. Legen Sie in eine chemische Kapuze eine Einweg-Gewichtungsplatte auf eine Waage. Fügen Sie 1 g MS-222 Pulver mit einem Spachtel, dann fügen Sie das Pulver in die Röhre.
3. Schütteln Sie die Röhre gut.
   HINWEIS: In flüssiger Form kann MS-222 außerhalb der chemischen Kapuze mit Handschuhen verwendet werden, erfordert aber keine Maske.
4. Legen Sie eine Einweg-Gewichtungsplatte auf eine Waage. Fügen Sie 2 g Natriumbicarbonat mit einem Spachtel hinzu, dann fügen Sie das Pulver in die Röhre. Schütteln Sie die Röhre gut.

6. Vorbereitung des Fischschädels

HINWEIS: In diesem Stadium ist der Fisch bereit für eine Implantatoperation. Stellen Sie vor der Operation sicher, dass alle Komponenten und Vorräte durch die entsprechenden Verfahren sterilisiert wurden. Für diesen Schritt wird ein U-förmiger Fischhalter aus Dem Wasser benötigt. In diesem Protokoll wird ein Aluminiumhalter verwendet, der einen 15 cm langen Goldfisch von Kopf zu Schwanz passt. Dieses System hält die Fische aus dem Wasser, während die Kiemen mit sauerstoffhaltigem Wasser durchdringen. Einzelheiten siehe Vinepinsky et al.⁸.

1. Legen Sie den Fisch in ein 0,02% MS-222 Wasserbad für 20 min, bis der Fisch schläft.
2. Mit sterilen Handschuhen den Fisch aus dem Wasser nehmen und in den Halter legen.
   HINWEIS: Das sauerstoffhaltige Wasser, das die Fische durchdringt, enthält MS-222 mit einer Konzentration von 0,02%, so dass der Fisch während der Operation beästhesiert bleibt.
3. Mit einem sterilen Spachtel, lidocaine 5% Paste auf der Haut über dem vorgesehenen Ort für die Operation für 10 min, dann entfernen Sie die Lidocain.
   HINWEIS: Konsultieren Sie einen geeigneten Hirnatlas, um die spezifische Hirnregion anzusprechen.
4. Entfernen Sie mit einem sterilen 15-Blatt-Skalpell die Haut über dem Schädel im Implantatbereich.
5. Mit einem Zahnbohrer mit 0,7 mm Bohrern, bohren Sie 4 Löcher in den Schädel. Legen Sie eine 1 mm Schraube (3 mm lang) in jedes Loch ein und tragen Sie Cyanoacrylatkleber direkt vor dem Einsetzen der Schraube auf die Löcher auf.
6. Mit einem Zahnbrand, tragen Sie Zahnzement auf die Schrauben und an der Peripherie des exponierten Schädels.
7. Mit dem Zahnbohrer, machen Sie ein Loch von 5 mm durchmesser im Schädel über dem GehirnBereich von Interesse. Entfernen Sie das Fettgewebe zwischen Schädel und Gehirn und setzen Sie das Ziel der Hirnregion mit einer feinen Pinzette und Weichteilpapier aus. Achten Sie darauf, die großen Blutgefäße unter dem Schädel nicht zu beschädigen.
   HINWEIS: Am Ende dieser Phase ist der Fisch bereit, die Sonde zu implantieren. Hier werden nur die wichtigsten Schritte zu diesem Protokoll beschrieben. Mehrere postoperative Verfahren (z.B. detaillierte Dokumentation der Gesundheit des Tieres und Sterilisation der Operationswerkzeuge und des Bereichs) werden nicht vorgestellt oder diskutiert, da sie für alle Operationen mit Fischen oder Kleintieren gelten.

7. Implantation der Sonde

HINWEIS: Um den letzten Schritt im Protokoll abzuschließen, wird ein Manipulator benötigt, der das Implantat an Ort und Stelle halten kann, während es in das Gehirn eingeführt wird.

1. Verwenden Sie den Manipulator, um die Logger-Box-Abdeckung mit den Tetrodes nach unten in Richtung des Fischhirns zu halten.
2. Biegen Sie die Referenzelektrode so, dass, wenn die Tetrodes in das Gehirn abgesenkt werden, die Referenz außerhalb des Gehirns bleibt.
3. Schneiden Sie das Gelände so, dass sie in den Schädel passen. Optional verbinden Sie einen Erdungsdraht mit einer der Schädelschrauben.
4. Senken Sie das Implantat so, dass die Elektroden in das Gehirn eingeführt werden, während sich der untere Teil des Mikroantriebsgehäuses in der Nähe des Schädels befindet.
5. Beginnen Sie mit der Befestigung des Implantats am Schädel, indem Sie eine kleine Menge Zahnzement zwischen dem Gehäuse und der nächsten Schädelschraube auftragen.
6. Nachdem der erste Teil des Zahnzements ausgehärtet ist, tragen Sie Zahnzement auf und schließen Sie das Loch über dem Schädel und dem gesamten freiliegenden Schädel.
   HINWEIS: In der Regel sind mehrere Runden von Zahnzement-Anwendungen erforderlich, um den gesamten exponierten Schädel zu bedecken.
7. Installieren Sie den Logger und die Batterie in der Box und versiegeln Sie die Box mit allen Schrauben.
8. Wenden Sie Antibiotika und lokale Schmerzmittel entsprechend der Art der Fische an, die für die Experimente verwendet werden.
9. Spülen Sie die Kiemen der Fische mit frischem Wasser, bis der Fisch aufzuwachen beginnt. Entfernen Sie den Fisch aus dem Halter und legen Sie ihn wieder in seinen heimischen Tank.
   HINWEIS: Der Fisch wird innerhalb von 60 min nach der Operation vollständig geborgen.
10. Stellen Sie sicher, dass der Fisch mit dem Implantat frei schwimmen kann (Abbildung 3, Ergänzendes Video 1). Passen Sie bei Bedarf die Größe des extrudierten Polystyrolschaums über der Loggerbox so an, dass der Fisch leicht balancieren kann.

Representative Results

Während einer Aufnahmesitzung schwamm der Goldfisch frei in einem quadratischen Wassertank, während die neuronale Aktivität in seinem Telencephalon aufgezeichnet wurde. Das Ziel dieser Experimente war es zu untersuchen, wie die neuronale Aktivität einzelner Zellen das Verhalten des Fisches bestimmt. Um dies zu tun, musste die Spiking-Aktivität in den aufgezeichneten Daten identifiziert werden. Die Gehirnaktivität wurde bei 31.250 Hz digitalisiert und mit 300 Hz durch den Datenlogger gefiltert. Dann wurde offline ein Bandpassfilter (300 bis 5.000 Hz) auf die Signale angewendet, und die vorsortierten Rohdaten wurden in die Kanäle der einzelnen Tetroden und den Referenzkanal getrennt (Abbildung 4A). Als Nächstes wurden gängige Spike-Sortieralgorithmen¹² verwendet, um die Einzelzellaktivität zu charakterisieren. Zunächst wurde jeder Kanal manuell nach dem minimalen Spitzenamplitudenschwellenwert gefiltert (bezogen auf den Rauschpegel jedes Kanals). Da sich die Spitzen der Tetrodes nicht an der gleichen Stelle befinden und sich die Referenzelektrode außerhalb des Gehirns befand, wurden auch Spitzen gefiltert, die in mehr als einer Tetrooder oder im Referenzkanal auftauchten. Die gefilterten Daten wurden dann manuell gruppiert und nach Form, Länge, Inter-Spike-Intervall (die Zeit zwischen nachfolgenden Aktionspotentialen muss der feuerfesten Periode der Neuronen) und der Hauptkomponentenanalyse (PCA) entsprechen. Beispiele für Einzelzellenclusterbildung im Vergleich zu Mehrkomponenten- und Rauschclustern sind in Abbildung 4dargestellt.

Abbildung 1: Implantatmontage. (A) Microdrive, hergestellt aus einem Stiftkopf, Messingplatten und einer Schraube. (B) Microdrive Gehäuse, hergestellt aus einer einzigen Messingplatte durch Falten. (C) Microdrive-Montage mit dem Microdrive (A) und dem Gehäuse (B). (D) Das Tetrode-Array wurde mit EIB-16, zwei Tetroden, einer Referenzelektrode und Gründen hergestellt, die mit einem Steckverbinder verbunden sind (siehe Tabelle der Materialien). (E) und (F) Die Mikroantriebsimplantat-Baugruppe ist mit der wasserdichten Logger-Box-Abdeckung verbunden. Der Tetrode-Montagestecker befindet sich im Inneren der Box und die Tetrodes werden an den Microdrive geklebt. (G) Die Logger-Box-Basis, auf der sich der Logger und die Batterie befinden. Der O-Ring um die Basis wird zum Abdichten verwendet. (H) Einreihige männliche Stift-Header Streifen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Microdrive GehäuseFalttechnik. (A) Beginnen Sie mit einer 1 mm breiten Messingplatte und machen Sie vier Schlitze. (B) Falten Sie den mittleren Teil der Seite nach innen. (C) Falten Sie den oberen Teil nach hinten und den unteren Teil nach innen. (D) Bohren Sie drei 3 mm Löcher in die Oberseite. (E) Einen 1 mm Halbkreis auf der Unterseite gravieren. (F) Bohren Sie ein 1 mm Loch in der Mitte der Oberseite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Aufnahme von einem frei verhaltenden Goldfisch. (A) Die Tetroden werden in das Fischhirn implantiert und die Baugruppe ist mit dem Schädel des Fisches verbunden. (B) Die Box ist mit dem Logger innen versiegelt. (C-E) Ein Fisch, der nach der Operation frei mit der Montage schwimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse. (A) Aufnahme 0,5 s lang von einem frei schwimmenden Fisch 24 h nach der Operation. Das Signal wird mit einem Bandpassfilter (300 x 10.000 Hz) gefiltert. Es gibt kein hohes Amplitudenrauschen in der Referenzelektrode, was auf einen Mangel an Bewegungsartefakten hinweist. Im zweiten Tetroden (grüne Kanäle) gibt es keine Aktionspotentiale. Die ersten Elektrodendaten werden in den braunen Kanälen angezeigt. Blaue und rote Sterne zeigen Spitzen aus blauen und roten Sternhaufen an, die in den Panels B bzw. C dargestellt sind. (B) Spike-Formen von zwei verschiedenen Clustern von einzelnen Neuronen, aufgezeichnet aus Tetrode 1. (C) Projektion auf die ersten drei Hauptkomponenten der Daten aus der ersten Tetrode aller Spitzenkandidaten, die den Schwellenwert überschritten haben. Blaue und rote Sternhaufen entsprechen blauen und roten Spike-Formen aus Panel B. Graue Punkte stellen neuronale Rauschen oder Multiunit-Aktivität dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Video 1: Schwimmmuster: Beispiel Goldfisch einen Tag vor der Implantationsoperation (links) und einen Tag danach (rechts). Das Video zeigt ähnliche Schwimmmuster, was darauf hinweist, dass der Fisch nicht durch eine Operation behindert wird. Die Videogeschwindigkeit beträgt x1,8. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).

Ergänzende Abbildung 1: Diagramm der Hauptkammer des Loggerkastens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 2: Diagramm der Loggerbox-Abdeckung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 3: Diagramm der Kammerabdeckung der EIB-16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 4: Diagramm der Messingplatte, die für den Microdrive verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Gehäusediagramm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Discussion

In diesem Protokoll werden die Schritte beschrieben, die bei der Implantation eines Tetrode-Arrays in das Telencephalon frei schwimmender Goldfische erforderlich sind. Diese Technik implementiert einen neuronalen Logger, der die signale aus bis zu 16 Kanälen zusammen mit einem Mikroantrieb verstärkt und aufzeichnet, der die Tetrode-Position im Gehirn anpassen kann. Der Microdrive ermöglicht es, die Position im Gehirn anzupassen, um die Aufnahme zu optimieren.

Dieses Protokoll kann leicht für die Aufnahme aus anderen Hirnregionen (siehe Vinepinsky et al.⁸ für die Aufnahme aus dem optischen Tectum mit einer ähnlichen Technik) oder einem anderen Wassertier 15 cm lang oder größer (ungefähr gleich einem Goldfisch Kopf zu Schwanz, 100 Gramm Gewicht) geändert werden. Darüber hinaus kann das Protokoll so geändert werden, dass es mit jedem Datenlogger arbeitet, solange es mit einer Frequenz kommuniziert, die Inwasser eindringen kann. Der hier verwendete Logger kommuniziert über eine Funkfrequenz von 900 MHz und kann durch ca. 20 cm Wasser kommunizieren. Eine Radiofrequenz von 2,4 GHz kann auch durch 15 cm Frischwasser eindringen. Niedrigere Frequenzen und andere Alternativen könnten noch bessere Ergebnisse geben^13,14,15. Das hier vorgestellte Protokoll verwendete ein Zwei-Tetrode-Array mit acht Aufnahmekanälen. Darüber hinaus kann das Protokoll geändert werden, um andere Sondengeometrien wie ein Drahtarray¹⁶ oder Silikonsonden⁹zu integrieren.

Die Verwendung eines Datenloggers über ein vollständiges Telemetrie-Aufzeichnungssystem oder ein gebundenes System bietet mehrere Vorteile. Erstens fügt die drahtlose Kommunikation der Aufzeichnung Geräusche hinzu. Daher wird die vollständige Übertragung der Daten die Signalqualität reduzieren. Darüber hinaus stellt die Protokollierung der Daten sicher, dass keine Daten verloren gehen, wenn die Kommunikation fehlschlägt. Darüber hinaus ermöglichen drahtlose Systeme den Fischen, frei zu schwimmen, im Gegensatz zu gefesselten Tieren. Schließlich wurde dieses Protokoll entwickelt, um Aktionspotenziale aufzuzeichnen, kann aber auch verwendet werden, um lokale Feldpotenziale aufzuzeichnen, indem der analoge Hochpassfilter des Loggers auf 1 Hz statt 300 Hz gesetzt wird. Ein Nachteil des Loggers ist die Notwendigkeit, die Daten physisch herunterzuladen und die Batterie zu ersetzen, wenn sie herunterläuft.

Das im Protokoll vorgeschlagene Mikrolaufwerk erhöht die Wahrscheinlichkeit der Aufzeichnung der Einzelzellaktivität erheblich. Ohne das Microdrive-Gerät werden die implantierten Tetrodes während der gesamten Getesteten etwa in derselben Aufnahmestelle im Gehirn platziert. Dies begrenzt physisch die Wahrscheinlichkeit, mehrere einzelne Neuronen von demselben Fisch aufzunehmen, und reduziert daher den Aufnahmeertrag pro Fisch. Die Tatsache, dass die spezifische Aufnahmestelle im Gehirn bis nach der Operation unbekannt bleibt, verstärkt die Notwendigkeit eines beweglichen Geräts, das es ermöglicht, die Elektroden im Gehirn auch nach der Fixierung zu bewegen.

Ein wichtiges Merkmal dieses Protokolls, das aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen wurde, ist die Bestimmung der Elektrodenimpedanz. Die Elektrodenimpedanz kann durch die Auswahl des Drahtdurchmessers (d. h. ein höherer Durchmesser führt zu einer niedrigeren Impedanz), der Drahtzusammensetzung (z.B. Wolfram oder Nichrom) und der Elektrodenbeschichtung (z. B. Platinschwarz für Wolfram und Gold für Nichrom) eingestellt werden, was Drähte mit niedrigeren Durchmessern und niedrigerer Impedanz ergibt. Da all diese Parameter für den Erfolg neuronaler Aufnahmen entscheidend sind, wird der Leser dringend ermutigt, die umfangreiche Literatur zu diesem Thema zu konsultieren, einschließlich Harris et al.¹⁷.

Beachten Sie die Bedeutung der Referenzelektrode bei der Erkennung möglicher externer Rauschquellen im System. Die Referenzelektrode ist eine relativ niedrige Impedanzelektrode, die in den Schädel eingeführt wird, sich aber außerhalb des Gehirns befindet. Da es nicht mit Hirngewebe in Berührung kommt, zeichnet es die Signatur des Signals auf, die aus thermischem Rauschen, Bewegungsartefakten und externem Rauschen besteht. Die wichtigsten Geräuschquellen in diesem System sind Bewegungsartefakte und Kommunikationsgeräusche, die vom Logger gesteuert und getimt werden können. Diese Geräusche können leicht durch die Signatur erkannt werden, die sie dem Signal der Referenzelektrode auferlegen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm round drill bits			Compatible with the drill.
15 blade Scalpel	Sigma-Aldrich
16 channel PCB board	Neurlynx	EIB-16
1x3M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
1x3M phillips round head screws			Stainless steel. Any type.
27 cm x 19 cm x 1 mm brass plate			See Figure 2
2x6M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
3140 RTV coating	Dow Crowning	2767996
75 µm Silver wire	A-M Systems
Brass machine screws #00-90		947-1006
Brass plates 7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm			A 3D drawing is provided. See supplementary 1
Coated Tungsten wire 25µm	California Fine Wire Company	5000160	Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000)
Coated Tungsten wire 50 µm	A-M Systems	795500	Can be replaced with any other wire with low impedance
Cyanoacrilic glue
Dental Burnisher	ComDent UK		Any small sterille stainless-still tool will do.
Dental cement - GCFujiPLUS	GC	431011	Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other.
Dental drill or nail polish drill			Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement.
Drill bit #65		947-65
Fast curing epoxy			Any 5 min curing epoxy can be used here.
Logger box with O-ring sealing			A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger.
Motorized turning device			Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means.
Mouselog-16 Neural logger	Deuteron Technologies Ltd		There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98%
Nano-Z plating	White Matter LLC		The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics.
PCB pins	Neurlynx	Neuralynx EIB Pins
Polymide tubing 250 µm	A-M Systems	822000
Rechargable battery			3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time.
Silicone tubing 0.64 mm	A-M Systems	806100
Stainless steel 1.5 mm	A-M Systems	846000
Sudium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S9625
Tap #00-90		947-1301
Vaseline			Any type of soft petroleum skin protectant can be used here.