Summary
ציטומהיר הוא כלי חזותי המשמש לניתוח פלט מתוך קיבוץ באשכולות. ציטומהיר ניתן להשתמש כדי להשוות שתי שיטות באשכולות: Flowsom ו ציטושינור. ציטומהיר יכול ליצור במהירות סקירה כמותית ואיכותית של הנתונים cy, לנסות המוני ולהדגיש את ההבדלים העיקריים בין אלגוריתמים שונים באשכולות.
Abstract
המורכבות של הנתונים שנוצרו על-ידי cy, try המונית המחייב כלים חדשים להמחיש במהירות תוצאות אנליטיות. שיטות התקבצות כמו ציטושלנור או flowsom משמשות להדמיה וזיהוי של אשכולות תאים. עבור ניתוח במורד הזרם, חבילת R שפותחה לאחרונה, ציטומהיר, יכול ליצור הדמיה מהירה של תוצאות משיטות התקבצות. ציטומהר לוקח בחשבון את האפיון פנוטילי של אשכולות תאים, מחשב את שפע אשכול התא, ולאחר מכן כימות השוואת קבוצות. פרוטוקול זה מסביר את היישומים של ציטומהיר כדי להשתמש cy, לנסות המוני נתונים מבוסס על אפנון של מערכת החיסון בסביבת מיקרו הגידול (כלומר, הרוצח הטבעי [NK] התגובה התא) על אתגר הגידול ואחריו חיסוני (PD-L1 המצור). הפגנה של השימושיות של ציטומהיר עם Flowsom ו ציטובין מוצג. ציטומיהיר במהירות יוצר ייצוגים חזותיים של קבוצות הקשורות לקבוצה של אשכולות התא החיסונית עם הרכב המערכת החיסונית. הבדלים מוצגים בניתוח האשכולות, אך הפרדה בין קבוצות גלויה עם שתי שיטות האשכול. ציטוהיר ויזואלי מראה את דפוסי הנגרמת על ידי הטיפול PD-L1 הכוללים שפע גבוה יותר של קבוצות מערכות מופעלות של תא NK, המבטא עוצמה גבוהה יותר של סמני הפעלה (כלומר, CD54 או CD11c).
Introduction
Cy, המוני הסיילנסה (cy, לנסות לפי זמן הטיסה, או Cyתוף) מאפשר זיהוי של מגוון רחב של בסמנים תאיים או מסחטות במיליוני תאים בודדים. האופי הרב מימדי של הנתונים cyPhenograph try ההמוני מחייבת כלי ניתוח מסוימים, כגון טכניקות באשכולות תא כמו עלה1, flowmaps2, flowmaps3, 4, מערבולת5, ו מפות הגרדום6. בנוסף, פותחו טכניקות מבוססות מימדית שונות (כלומר, ניתוח המרכיב העיקרי [PCA]7, t-הפצת שכנה סטוכסטי שכנים [t-sne]8, היררכי הטמעה סטוכסטי שכנים [hsne]9, הקירוב סעפת אחיד והקרנה [umap]10, ו דיפוזיה מפות11) כדי לשפר את המהירות, פרשנות ויזואליזציה של מימדי high-
ניתוח במורד הזרם של זרימה גבוהה ונתונים cy, המוניים לעתים קרובות חסרים תהליכים אוטומטיים כדי לבצע בדיקות סטטיסטיות על תדר אשכולות וקישורים עם תוצאות קליניות. בעבר, פיתחנו זרימת עבודה מבוססת R המכונה ציטוfast12, אשר מאפשר ניתוח ויזואלי כמותי למטה של טכניקות התקבצות על ידי ציטומאגור או flowsom.
הפרוטוקול המתואר כאן מבהיר את השימוש בציטוצום ב R ומראה כיצד ליצור מפות חום כמותיים ואיכותניות. יתרה מזאת, היא מקלה על קביעת הקשרים בין הפנוטיפים החיסונית ותוצאות קליניות. בנוסף, דוח זה מתאר את הניתוח של ערכת נתונים מוגדרת של cy, המסה באמצעות שתי הליכי באשכולות שונים: Flowsom וציטוספיטור. באמצעות ציטומהיר עם שתי שיטות האשכול, זה בהתאמה מראה כי הפעלת פנוטיפ של תאים NK מושפע PD-L1 הסגר המחסום החיסון.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת ניסויים בעלי חיים של LUMC והוצאו להורג על פי ההנחיות לניסויים בבעלי חיים של LUMC בהתאם להנחיות של ועדות הולנדית ואירופית.
הערה: עבור הגדרת ניסיוני, C57BL/6 עכברים היו תת-עורי חוסנו על האגף הימני עם גידול המעי הגס מורלין MC38 בריכוז של 0.3 x 106 תאים/200 μl של פוספט מאגור מלוחים (PBS). לאחר 10 ימים, כאשר הגידולים היו מוחשי, העכברים טופלו עם L1 המשטרה לחסימת נוגדנים (שיבוט MIH-5, 200 μg/עכבר, הזרקת פנים-הצפק) או היו ללעוג. גידולים היו resected 3 ימים לאחר מכן לאחר PD-L1 הזרקת, מעובד לשעבר vivo, וניתח על ידי cytof המוני cytof try באמצעות 38 סמנים13.
1. ציוד ותוכנה לניתוח נתונים
הערה: השתמש במחשב (Windows 7 או יותר) ומעבד I5 ב-2.4 ג'יגה-הרץ או שווה ערך, זיכרון מותקן RAM 6 gb, ו-10 gb של שטח פנוי בכונן הקשיח. החבילה R ציטוfast משתמש בפונקציות קיימות: בעיקר flowcore, פאטמפהו- ggplot. שורות הפקודה שיבוצעו ב-R נכללות בפרוטוקול. ניתן למצוא את המשאב עבור הוראות R ב- https://education.rstudio.com/.
- כדי להתקין את החבילה ציטוfast , הפעל את R (גירסה "3.6") והתקן את bioconductor נצח גירסה 3.9 על-ידי הזנת הקוד הבא:
אם (! בשקט = TRUE)
התקנת חבילות ("BiocManager")
BiocManager:: התקנה ("ציטומהיר") - ודא שהחבילה נטענת בסביבה הרצויה על-ידי הפעלת הפעולות הבאות:
ספריה (ציטומהר)
2. יצירת אשכולות
הערה: כדי להציג את שתי שיטות התקבצות באשכולות ו flowsom עם ציטומהר, התאים NK (CD161+) בסביבת הגידול מיקרו 3 ימים לאחר טיפול PD-L1 מנותח.
- קיבוץ באשכולות המבוצע על-ידיCytosplore
- לאחר הורדה והתקנה של ציטותיםore, מתארח ב < www. . אנימבין. ארגון >, להעלות את קבצי. fcs (קבצים משלימים 1.1 – 1.8 [קבצי קלט ציטופיפוט]) על ידי לחיצה על קובץ | פתח קובץ FCS (s) בציטובטור. הוסף תג דוגמה ייחודי כערוץ על-ידי לחיצה על הוסף תג דוגמה ייחודי כערוץ כאשר תתבקש ובחר קופקטור עבור המרה arcsinh היפרבולי (ברירת המחדל היא 5).
- בחר באפשרות ' הפעל את H-SNE', הפעל רמת hsne של 3 והמתן ליצירת המפה.
הערה: שלב זה עשוי לדרוש זמן מה, בהתאם למספר התאים שנותחו ולרמת HSNE שנבחרו. - ברמת HSNE הראשונה, בדוק את התאים החיוביים עבור CD161. בחר את התאים CD161+ ולחץ לחיצה ימנית לתוך הבחירה. בשלב השני, חזור על ההליך כדי להגיע לרמה השלישית עם CD161+ אירועים בלבד.
- לאחר יצירת מפת ה-tSNE האחרונה, שמור את האשכולות שהוגדרו על-ידי ציטושפיץ באמצעות לחיצה ימנית על מפת tsne ובחר באפשרות ' שמור אשכולות'. בחר את הספריה של קבצי הפלט כפי שהתבקש על-ידי ציטופיאגור ושים לב למיקום זה, מאחר שספריה זו תהיה בשימוש כדי לטעון את קבצי ה-. fcs לתוך R.
הערה: ניתן לשנות את מספר קבוצות המשנה באופן ידני על-ידי שינוי ערך ה-סיגמא. ערך סיגמא נקבע כברירת מחדל ב-30; עם זאת, המספר הממשי של קבוצות משנה תלוי בקלט. כאן, מזהה ציטוהאגור 10 ערכות משנה שונות, כאשר כל קובץ מייצג קבוצת משנה אחת. - השתמש בשם פשוט (תווים בלבד) בעת שינוי שם של קבצי הפלט, אשר יגרום לזיהוי ולטיפול נוסף בקלות. שמור את קבצי הפלט על-ידי בחירה באפשרות שמור.
הערה: לאחר שמירה, תיקיה נוצרת על-ידי הקובץ. fcs , כאשר כל אחד מהקבצים מתאים לאשכולות המזוהים ב- ציטופיאגור. השלב הבא יהיה לטעון את הקבצים לתוך R בעזרתו של ציטומהר. כאן, קבצי הפלט שנוצר מסופקים קבצים משלימים 2.1 – 2.10 (קבצי פלט ציטופלוט). - טען את קבצי הפלט שנוצרו על-ידי התכונה ' ציטומה ' ב-R באמצעות הפונקציה המיועדת: Readציטוsplorcs.
מ< הוראות-"C:\\\users\\cps\tuplls\\thps"
cfData <-Readציטוspcs (dir = dirFCS, colNames מות = "תיאור") - נקה את הנתונים על-ידי הסרת פרמטרים מסוימים כגון "זמן" ו-"רקע". בדוק את מיקום העמודה הקשורה לפרמטרים המיותרים שלה והסר אותה מהמטריצה.
שמות colnames cfData@expr)
cfData@expr <-cfData@expr [,-c (3, 4, 6, 8:10, 46:49, 51:54)]
הערה: ניתן לראות את העמודות הלא נחוצות על-ידי קריאת שמות העמודות של המטריצה שנוצרה. על-ידי הפעלת colnames מות (cfData@expr) פעם נוספת, ודא שרק הפרמטרים הרצויים מתקבלים. - סדר מחדש את הסמנים כך שסמני שושלת היוחסין יוצגו תחילה, ואחריהם סמנים פונקציונליים.
cfData@expr < cfData@expr [, c (1, 2, 3, 35, 36, 31, 9, 10, 17, 8, 7, 15, 18, שמונה, 37, 20,
29, 40, 5, 30, 33, 11, 34, 14, 19,
32, 28, 6, 7, 4, 12, 13, 17, 16, 15,
21, 22, 24, 25, 26, 27, 38, 39]
הערה: Step 2.1.8 הוא אופציונלי. - קשר את ה-meta קובץ נתונים לנתונים שנוצרו מציטומנור על-ידי העלאת קובץ ה-metafile של הגיליון האלקטרוני המכיל מידע קליני (משלים File 3).
ספריה (readxl)
מטא <-read_excel ("C:\\\users\\cps\ee\\\t.s\cp\n sample_id. xlsx")
cfData@samples <-data. frame (meta)
הערה: ביצוע האשכולות שבוצע על ידי ציטוהאגור כעת הסתיים. אפשרות לקיבוץ באשכולות חלופית לציטובין היא flowsom והיא מתוארת בסעיף 2.2. לאחר ביצוע אחד משני שלבי האשכול, המשך בשלב ההדמיה (סעיף 3).
- קיבוץ באשכולות המבוצע על-ידיFlowSOM
- התקן תחילה את Flowsom ב-R על-ידי הפעלת הפקודה הבאה:
אם (! בשקט = TRUE)
התקנת חבילות ("BiocManager")
ביורוקנג:: התקנה ("FlowSOM")
ספריה (FlowSOM) - התקן את חבילת flowCore בשיטה דומה וטען אותה בסביבה על-ידי הפעלת הפעולות הבאות:
אם (! בשקט = TRUE)
התקנת חבילות ("BiocManager")
BiocManager:: התקנה ("flowCore")
ספריה (FlowSOM) - טען את הנתונים הגולמיים שסופקו בקבצים משלימים 4.1 – 4.8 (קלט flowsom של fcs), שהיו מגודרת בעבר באירועים CD161 +, ב-R באמצעות הפונקציה קריאה. flowsom.
fcs_raw <-קריאה. flowSet (נתיב = "C:\\:\users\\share\cps\tul\\:mers", תבנית = ". fcs", טרנספורמציה = FALSE, truncate_max_range = FALSE, seed = 123) - בחר את הסמנים הביולוגיים הרלוונטיים (הסר "רקע" או "זמן") על-ידי בחירת העמודות המתאימות ושינוי הנתונים באופן arcsinh5 כפי שמוצג בקוד שלהלן (כאן, הסרת עמודות 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51, שאינם מתאימים החלת קופקטור של 5 כפי שהוחל קודם לכן באמצעות הציטובטור, על ידי בחירת קופקטור = 5 בפונקציה שלהלן.
fcs_raw <-fsApply (fcs_raw, פונקציה (x, קופקטור = 5) {
colnames מות (x) <-fcs_raw [[1]] @parameters @data $ desc
expr <-exprs (x)
expr <-asinh (expr [,-c, 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 15, 7, 8, 35, 36, 37, 38, 51)]/קופקטור
exprs (x) <-expr
return (x)}) - אשכול את הנתונים באמצעות הפונקציה Flowsom . כדי להשוות את Flowsom ואת הציטופלוט, בחר לקבץ את הנתונים בעשר קבוצות מידע כפלט שהושאר בעבר על-ידי ציטוהאגור.
fsom <-FlowSOM (fcs_raw, טרנספורפונקציה = FALSE, קנה מידה = FALSE,
שינוי גודל. מרכז = false, קנה מידה. scale = FALSE, שקט = FALSE, כגון = c (1:37),
nClus = 10, maxMeta = 10, חשיבות = NULL, seed = 123)
הערה: ניתן לשנות זאת באופן ידני על-ידי המשתמש. - הקצה כל תא לקבוצת המשנה המזוהה ולמזהה המדגם שלו.
subset_id < כפקטור (fsom $ FlowSOM $ מפה $ מיפוי [, 1])
רמות (subset_id) <-fsom $ מוקשרת
ראש (subset_id) - טען את קובץ המטא-נתונים ב-R (זמין בקובץ משלים 5) המכיל את הקצאת הקבוצה וקשר אותו לקבצי ה-. fcs.
סמלאיד <-read_excel ("C:\\:\usernams\\ct\\\t.s\le\n sample_id. xlsx")
סמלמד <-na. השמט (סמליאיד)
סמלאיד $ סמליאיד <-כפקטור (סמליאיד $ סמליאיד)
סמלאיד $ קבוצה <-as. פקטור (קבוצת סמבלאיד $)
סמליאיד $ CSPLR_ST < בתור פקטור (סמליאיד $ CSPLR_ST)
סאמלאיד <-כנתונים. מסגרת (סמליאיד)
שמות (סמליאיד) [3] <-"סאמליאיד"
סמלאיד <-lapply (fsom $ FlowSOM $ מטא-נתונים, פונקציה (x) {נציג (x [1], כל = אורך (x [1]: x [2]))}
מ<-NULL (סמלאיד, שמות)
סמלאיד < בתור פקטור (ללא רשימה (סמליאיד))
סמלאיד <-נתונים. מסגרת (סמליאיד)
רמות (סמלאיד) <-הדבקה ("מזהה", 1: dim (סמליאיד) [1], ספט = "_")
df <-נתונים. מסגרת (subset_id, סמליאיד, fsom $ FlowSOM $ נתונים [, c (1:37)])
שינוי שם של <-data. frame (colpar = fcs_raw [[1]] @parameters @data $ desc)
שמות colnames (df) <-c ("ברדק", "סמלאיד", שינוי שם של $ colnames [c (1:37)])
df $ מזהה ברדק <-as. פקטור (df $ ברדק מזהה)
df $ סמלאיד < כפקטור (df $ סמבלאיד) - צור cfList המבוסס על הנתונים שהתקבלו מ- Flowsom על-ידי הפעלת הסקריפט הבא:
cfData <-Cfdata (דגימות = סמבלאיד,
expr = df) - סדר מחדש את הסמנים כך שיופיעו באופן דומה לפלט מניתוח ה- ציטומרמור .
cfData@expr < cfData@expr [, c (1, 2, 34, 36, 37, 10, 23, 24, 31, 22,
38, 15, 8, 3, 27, 9, 11, 28, 35, 26,
14, 33, 17, 20, 21, 18, 25, 29, 13,
30, 12, 16, 32, 4, 5, 6, 7, 19, 39]
הערה: הקיבוץ באשכולות על-ידי flowsom הסתיים כעת. לאחר מכן, בצע הדמיה של פלט הקיבוץ באשכולות.
- התקן תחילה את Flowsom ב-R על-ידי הפעלת הפקודה הבאה:
3. הדמיה: ניתוח לאחר עיבוד באשכולות
הערה: שלב זה הוא שיטה המשותפת לשתי שיטות האשכול. לכן, ניתן לבצע אותה לאחר קיבוץ באשכולות באמצעות Flowsom או ציטובין.
- לפני יצירת מפות החום, צור את טבלת הספירה לדוגמה באמצעות הפונקציה cellCounts כפי שמוצג בקוד שלהלן. מאחר שאשכולות מסוימים מכילים פחות תאים מאחרים, שנה את קנה המידה של הנתונים בכל אשכול על-ידי ציון "קנה מידה = TRUE" בתוך ה-cellCounts של הפונקציה, כך שניתן יהיה לראות בקלות את הפיזור בין הדגימות.
cfData <-cellCounts (cfData, תדירות = TRUE, קנה מידה = TRUE)
הערה: כעת ניתן לדמיין את הנתונים. - . תדמיין עם מפת חום
הערה: אחת הפונקציות העיקריות של חבילה זו היא ציטוחום מפות, אשר משמש כדי להמחיש את הפנוטיפ של האשכולות שנוצרו, כמו גם את הטרוגניות שלהם ביחס דגימות.
מפות ציטוחום (cfData, קבוצה = "קבוצה", מקרא = TRUE) - ויזואליזציה עם מגרשים
הערה: ניתן לייצג נתונים באופן כמותי על-ידי קריאה לפונקציה cytoBoxplots. הפלט של פונקציה זו מייצג את הפרופורציה של כל מדגם עבור כל אשכול.- צור את ספירת התא כפי שנעשה בשלב 3.1, אך אל תשנה את גודל הנתונים כדי לקבל את התדירות של כל אשכול.
cfData <-cellCounts (cfData, תדירות = TRUE, קנה מידה = FALSE)
ציטובוקמגרשים (cfData, קבוצה = "קבוצה")
- צור את ספירת התא כפי שנעשה בשלב 3.1, אך אל תשנה את גודל הנתונים כדי לקבל את התדירות של כל אשכול.
- ויזואליזציה עם היסטוגרמה של אות בעוצמה חציון
הערה: הנתונים יכולים גם להיות מדמיינו על ידי ייצוג היסטוגרמה העוצמה חציון האות.- המחש את עוצמת הביטוי של שלושה סמנים: CD45, CD11c וCD54.
- בדוק את שמות הסמנים הרצויים על-ידי קריאה לשורה הבאה. שים לב לשמות הסמן וכלול אותו בפונקציה msiPlot.
שמות (cfData@expr)
הערה: כאן, התמקד ב-CD45, CD11C וCD54. בדוק את האיות המדויק של הסמנים והתאם במידת הצורך:
msiPlot (cfData, סמנים = c ("89Y_CD45", "167Er_CD11c", "164Dy_CD54"), byGroup = ' קבוצה ')
Representative Results
ציטומהיר של זרימת העבודה (איור 1) נועד לספק סקירה כמותית ואיכותית של הנתונים המקובצים במקור על-ידי תוכנת ניתוח (כלומר, Flowsom או ציטומאגור). ציטומהיר מפעיל מספר יציאות אפשריות, כולל מפת החום של כל האשכולות המזוהים בניתוח ומבוססים על ביטוי סמן (איור 2 ואיור 3). הגודגרמה בחלק העליון מייצגת את הדמיון ההיררכי בין האשכולות שזוהו. החלונית העליונה מציגה מפת חום נוספת המציגה את הכמות היחסית של ערכות ממשנה תואמות בכל דוגמה. הגיגרם מימין מציג את הדמיון בין הדגימות ומתבסס על קיבוץ באשכולות הירארכי שבוצע על מרחקים אוקלידית בין דגימות. מפות החום המשולב מוצגות עבור Flowsom ואחריו ציטומהיר באיור 2 ו ציטושלור ואחריו ציטומהיר באיור 3. ציטוהיר יכול לשמש גם כדי להציג את הנתונים לכמת ולהציג את התוצאות במגרשים (באמצעות הפונקציה ציטובוקמגרשים), כפי שמוצג באיור 4 ואיור 5.
אשכולות דומים נמצאו בין שתי השיטות השונות (למשל, אשכול 8 מ ציטומאגור מתאים לאשכול 10 מ- flowsom), וביטוי משותף של כמה סמנים מעכבות כמו PD-1 ו-3 עדיין להיות גלויים בשתי השיטות). שתי שיטות התקבצות מותר לאפליה בין PD-L1 vs. . עכברים שטופלו ב-PBS לעומת זאת, ניתן להדגיש חלק מההבדלים בין שתי השיטות. Flowsom מזהה 2 אשכולות (MHC-ii+), ואילו ציטומאגור מציג רק אשכול אחד (mhc-ii+ dim). הדבר נובע מהאסטרטגיה הראשונית שבה תאי NK היו מגודרת באופן ידני על CD161+ תאים, ולאחר מכן עיבוד נוסף על ידי flowsom. עם זאת, ציטוספור באופן אוטומטי מגודרת תאים מתוך CD45+ אוכלוסיה ברמה hsne הראשון, אשר היו אז מקובצים ברמה הירארכית גבוהה יותר. כך, ציטומאגור הגדיר את ערכות המשנה של התא NK בדיוק יותר מאשר כיצד לעבור באופן ידני על CD161. אף על פי כן, התקבצות הירארכית של הדגימות נשמרה, כפי שמוצג בגודגרמה מימין, ומציינים כי הפרדה בין שתי הקבוצות (PD-L1 ו-PBS) לא הייתה תלויה בשיטת הקיבוץ הנבחרת.
ניתן להגדיר באופן ידני את מספר האשכולות בשתי השיטות. ציטומהיר מאפשר למשתמש להעריך את הטרוגניות של הנתונים שלהם ויכול לספק תובנה כיצד לבחור את מספר האשכולות שאליהם יש לחלק את הנתונים. תכונות אחרות כלולות בחבילה הציטומטר , כגון הפונקציה msiplot (שלב 3.4.2), המציגה את מגרש האות החציוני (MSI) של כל סמן לכל קבוצה (איור 6 ואיור 7). פונקציה זו מאפשרת זיהוי של שינויים כלליים, כגון עליות בביטוי של CD54 או CD11c בתאי NK של הקבוצה המטופלת L1-PD. ניתן לשלב תכונות אופציונליות בחבילת ציטוfast , כגון הצגת נתונים בתרשימי עמודות ושיטות אחרות של ייצוג נתונים. האחרון דורש תוספת של כלים ggplot, אשר ניתן להפיק על ידי R.
איור 1: זרימת העבודה של חבילת ציטומהיר . הנתונים נוצרו על ידי cy, לנסות המונית מן הגידול 3 ימים לאחר הטיפול עם חיסוני או שמאל מטופל. שתי טכניקות שונות לקיבוץ באשכולות הושוו: ציטוגאגור ו- flowsom. ציטוהיר שימש להמחיש הבדלים בין שתי הטכניקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מבט כולל על אשכול ושפע אשכול לכל קבוצה כפי שנותחו על-ידי ציטומטר בעקבות ציטומה. החום מפה של כל אשכולות התא NK (CD161+ תאים המוגדרים באופן אוטומטי על ידי ציטוזאגור), אשר זוהו 3 ימים לאחר חיסוני (PD-L1). הנתונים המוצגים מבוססים על התקבצות באשכולות של ציטומאגור ובמאגר מקבוצות הטיפול התייחסו לטיפול באמצעות PD-L1. רמות של סמן הביטוי ArcSinh5 השתנה מוצגות בסולם הקשת. בחלונית התחתונה, השפע היחסי של כל דוגמה מיוצג בקנה מידה ירוק-סגול. הגודגרמה מימין מייצגת את הדמיון בין הדגימות המבוססות על תדרי תת-קבוצה. קנה המידה של התדר מייצג את הפיזור של הממוצע. תדר נמוך או גבוה מיוצג על-ידי צבע ירוק או סגול, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מבט כולל על אשכול ושפע של אשכולות לכל קבוצה כפי שנותחו על-ידי הארגון לאחר flowsom. החום מפה של כל האשכולות התא NK (מגודרת מראש על CD161+ אירועים), אשר זוהו 3 ימים לאחר חיסוני (PD-L1). הנתונים המוצגים מבוססים על התקבצות של Flowsom וממאגר מקבוצות הטיפול שטופלו על-ידי PD ו-L1. רמות של סמן הביטוי ArcSinh5 השתנה מוצגות בסולם הקשת. בחלונית התחתונה, השפע היחסי של כל דוגמה מיוצג בקנה מידה ירוק-סגול. הגודגרמה מימין מייצגת את הדמיון בין הדגימות המבוססות על תדרי תת-קבוצה. קנה המידה של התדר מייצג את הפיזור של הממוצע. תדר נמוך או גבוה מיוצג על-ידי צבע ירוק או סגול, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מהיר ייצוג עם מגרשים של האשכולות שהוגדרו על ידי ציטוזאגור. התדירות של כל אשכול מיוצגת בתוך מזימת, המופרדת בשתי הקבוצות (PBS ו-PD-L1). נקודה אחת בודדת תואמת לעכבר אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מהיר ייצוג עם מגרשים של האשכולות שהוגדרו על ידי flowsom. התדירות של כל אשכול מיוצגת בתוך מזימת, המופרדת בשתי הקבוצות (PBS ו-PD-L1). נקודה אחת בודדת תואמת לעכבר אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הפצת מגרשים בעלי עוצמת אות מתאי NK באופן אוטומטי מגודרת על ידי ציטוהאגור. התפלגות עוצמות האות מוצגות בהיסטוגרמה עבור שלושה סמנים ספציפיים: CD45, CD11c ו-CD54. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הפצת מגרשים בעלי עוצמת אות מתאי NK באופן אוטומטי מגודרת על ידי flowsom. התפלגות עוצמות האות מוצגות בהיסטוגרמה עבור שלושה סמנים ספציפיים: CD45, CD11c וCD54, הפרדה על-ידי קבוצות PBS ו-PD-L1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קבצים משלימים 1.1 – 1.8. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
קבצים משלימים 2.1 – 2.10. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
קובץ משלים 3. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
קבצים משלימים 4.1 – 4.8. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
קובץ משלים 5. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Discussion
ציטומהיר הוא כלי חישוביות מהירה המספקת חקר מהיר וגלובלי של נתונים ציטומטוניים על ידי הדגשת וכימות מערכות מידע סלולריות ספציפיות לטיפול. הפרוטוקול תיאר מטרתו להמשיך ולנתח את האשכולות עם ציטוספינור או flowsom. כלי ניתוח אחרים באשכולות מתאימים לציטומהיר, אך הדבר דורש את השימוש בציטומהיר כדי להקצות כל תא לקבוצת משנה. ציטוfast, עם זאת, אינו שיטת קיבוץ באשכולות, ולכן דורש הליכי קיבוץ באשכולות לפני השימוש.
הניתוח שבוצע כאן הראה כי מסוימים CD161+ מערכות המשנה של תא בסביבת מיקרו הגידול היו רגישות למצור PD-L1. זה נצפה על ידי שינויים הפנוטיפים שלהם ושפע, אשר נצפו באמצעות שני ציטוסם ו flowsom כמו שיטות באשכולות. שתי השיטות להבדיל את האשכול העיקרי של התא NK (CD11b+ NKG2A+) עם תדרים שונים במקצת (15%-20% עבור הציטומאגור, 30% – 40% עבור flowsom). ההבדלים בשפע וקירוב זה לא השפיעו על התבנית הגלובלית, משום ששתי הגיגרמות מוצגות בלוחות הנכונות של הדמות 2 ובאיור 3 הראו תוצאות דומות. באמצעות ציטומהיר, כך ניתן (בלתי תלוי בשיטת התקבצות שנבחרה) לL1-PD-מטופלים ועכברים שטופלו על בסיס ניתוחים של האשכול של תא NK ושפע.
בהתאם לפרמטרים שנרשמו, יש צורך בשינויים בפרוטוקול. באופן ספציפי, יש להסיר פרמטרים מסוימים כגון זמן ורקע בעת ביצוע ניתוח האשכולות. בנוסף, חשוב שכל תא יוקצה לקבוצת משנה. הפונקציה cfData פשוט תוסיף את ספירת התא הגולמי לכל אשכול לכל מדגם לתוך Cfdata. משלב זה ניתן לבנות את מפת הציטוחום כמוסבר בסעיף 3.
ציטומהר כבר נעשה שימוש בהצלחה ככלי הדמיה וכימות להשוואת שיטות שונות באשכולות13. חבילת R זו תואמת גם לתכונות מתקדמות, כגון המבחן הגלובלי14, אשר יכול לבדוק שיוכים בין קבוצות של אשכולות באמצעות משתנים קליניים. בעתיד, ניתן לשלב את הכלי הגלובלי והאלגוריתמים האחרים באמצעות ציטומהיר לצורך הדמיה וכימות מעמיקה יותר.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מכירים במימון הנציבות האירופית לפרס H2020 MSCA לפי הצעה מספר 675743 (Iהיספאני). אנו מודים לטיטג'ה ואן דר סלואן ואיריס פארנק על בחינת הפרוטוקול.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Dell | NA | NA |
References
- Anchang, B., et al. Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE. Nature Protocols. 11 (7), 1264-1279 (2016).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16 (3), 323-337 (2015).
- Van Gassen, S., et al. FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry A. 87 (7), 636-645 (2015).
- Levine, J. H., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., et al. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Hotelling, H. Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology. 24 (6), 417-441 (1933).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. , (2008).
- Pezzotti, N., Hollt, T., Lelieveldt, B., Eisemann, E., Vilanova, A. Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding. Computer Graphics Forum. 35 (3), 21-30 (2016).
- Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38 (2018).
- Haghverdi, L., Buettner, F., Theis, F. J. Diffusion maps for high-dimensional single-cell analysis of differentiation data. Bioinformatics. 31 (18), 2989-2998 (2015).
- Beyrend, G., Stam, K., Höllt, T., Ossendorp, F., Arens, R. Cytofast: A workflow for visual and quantitative analysis of flow and mass cytometry data to discover immune signatures and correlations. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 435-442 (2018).
- Beyrend, G., et al. PD-L1 blockade engages tumor-infiltrating lymphocytes to co-express targetable activating and inhibitory receptors. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 217 (2019).
- Goeman, J. J., van de Geer, S. A., de Kort, F., van Houwelingen, H. C. A global test for groups of genes: testing association with a clinical outcome. Bioinformatics. 20 (1), 93-99 (2004).
