Summary
理解生物分子-无机固相相互作用的第一步是揭示基本的物理化学常数,可以通过建立吸附等体来评估这些常数。液相的吸附受受动力学、表面容量、pH 和竞争吸附的限制,在设置吸附实验之前,应谨慎考虑这些。
Abstract
无机-有机相互作用的基础知识对于发现和开发适合生物技术和医学应用的新型生物界面至关重要。最近的研究表明,蛋白质通过有限的吸附位点与表面相互作用。氨基酸和肽等蛋白质片段可用于复杂生物大分子和无机表面之间的相互作用建模。在过去三十年中,开发了许多有效和敏感的方法来测量这些相互作用的物理化学基础:等温酸滴定热量测定(ITC)、表面质粒共振(SPR)、石英晶体微平衡(QCM)、总内部反射荧光(TIRF)和衰减总反射光谱(ATR)。
测量吸附方法最简单、最实惠的技术是耗竭方法,计算与溶液分散的吸附剂接触后,吸附液浓度(耗竭)的变化,并假定为吸附。基于耗竭数据的吸附等理会提供所有基本物理化学数据。但是,由于动力学限制和具有高特定表面积的吸附剂,来自解决方案的吸附需要较长的平衡时间,因此几乎不适用于宏观固定平面表面。此外,在研究吸附肽时,应考虑索尔的不稳定性、纳米颗粒聚集体、吸附晶体、纳米颗粒大小分布、溶液的pH级以及吸附竞争等因素。消耗数据是等构图,为几乎每一个可溶性沙球提供全面的物理化学数据,但仍然是最容易获得的方法,因为它不需要昂贵的设置。本文介绍了无机氧化物肽吸附实验研究的基本方案,涵盖了影响该工艺的所有临界点。
Introduction
在过去的50年里,无机表面和肽之间的相互作用因其在材料科学和医学中的重要性而备受关注。生物医学研究的重点是生物无机表面的相容性和稳定性,对再生医学、组织工程11、2、32,3和植入44、5、6、75,6,7有直接影响。当代,的生物反应装置,如传感器和执行器,基于在氧化物半导体表面8、9、10、11、12、139,10上固定的功能蛋白。,12,13811蛋白质生产的现代纯化方法往往依赖于下游纯化和分离中的生物分子相互作用特性。
在多种无机氧化物中,二氧化钛仍然是与生物相关基板15、16,16结合使用最多的。基于TiO2的生物界面领域的研究侧重于在不改变其生物和结构特性的情况下建立蛋白质和肽的强结合和特异性结合。最终,主要目标是高表面密度层的生物分子,具有高稳定性和更高的功能,将推动基于钛的生物技术和医疗应用的创造17。
钛及其合金已被广泛用作手术植入材料至少60年,因为厚度只有几纳米的表面TiO2层具有耐腐蚀性,在许多体内应用中表现出,19,高度的生物相容性。二氧化钛也被广泛认为是生物矿化中产生的无机基板,其中以蛋白质和肽伴有的成核和无机相生长可为材料提供具有前景的催化和光学特性21、22、23、24。21,22,23,24
鉴于无机材料与生物分子相互作用与蛋白质-TiO2相互作用之间的高相关性,已经有很多研究来解决TiO2上蛋白质吸附的操纵和控制问题。由于这些研究,这种相互作用的一些基本特性已经显现出来,如吸附动力学、表面覆盖和生物分子构象,为生物接口55、1313的进一步进步提供了实质性支持。
然而,蛋白质复杂性对完全确定和理解蛋白质与无机表面的分子水平相互作用增加了相当大的限制。假设生物分子通过有限的位点与无机表面相互作用,一些具有已知结构和氨基酸序列的蛋白质已减少到其成分-肽和氨基酸,分别研究。其中一些肽表现出显著的活性,使它们成为吸附研究的一个独特的课题,无需以前的蛋白质分离25,26,27,28,29,30。25,26,27,28,29,30
TiO2或其他无机表面的肽吸附定量表征可以通过物理方法完成,这些物理方法在过去几十年中专门针对生物分子进行了调整。这些方法包括等温滴节激素测定(ITC)、表面质粒共振(SPR)、石英晶体微平衡(QCM)、总内部反射荧光(TIRF)和衰减总反射光谱(ATR),所有这些都通过提供关键热力学数据(结合常量、吉布斯自由能、食体和熵31)来检测吸附强度。
生物分子对无机材料的吸附可以通过两种方式完成:1)ITC以及消耗方法使用分散在溶液中颗粒的固定宏观表面;2) SPR、QCM、TIRF 和 ATR 分别使用用无机材料修改的宏观表面,如镀金玻璃或金属芯片、石英晶体、硫化锌晶体和 PMMA 芯片。
等温滴热质(ITC)是一种无标签的物理方法,用于测量溶液或异质混合物滴定时产生或消耗的热量。敏感热敏细胞检测的热量效应小至100纳米焦耳,从而有可能测量纳米粒子表面的吸附热量。连续加滴滴期间,沙液的热性能,提供了相互作用的完整热力学轮廓,揭示在给定温度下的32、33、34、35、36下,揭示粘结、结合常数和熵。,33,34,35,36
表面质粒共振(SPR)光谱学是一种表面敏感光学技术,基于测量靠近研究表面的介质折射率。它是一种实时且无标签的方法,用于监控可逆吸附和吸附层厚度。绑定常量可以从关联和分离率计算。在不同温度下进行的吸附实验可能提供有关活化能的温度依赖性以及按顺序进行其他热力学参数37、38、3938,39的信息。37
石英晶体微平衡 (QCM) 方法测量压电晶体在吸附和脱盐过程中振荡频率的变化。结合常量可以从吸附率和脱离率常数的比率进行评估。QCM用于相对质量测量,因此不需要校准25,27,40。27,4025QCM 用于气体和液体的吸附。液体技术允许QCM用作分析工具,用于描述各种修饰表面的沉积41。
总内部反射荧光 (TIRF) 是一种基于测量吸附荧光荧光的敏感光学界面技术,具有内部反射的消逝波激发。该方法允许检测覆盖表面的荧光分子,其厚度在数十纳米左右,这就是为什么它用于研究各种表面的大分子吸附42,43。42,吸附和脱附时对荧光动力学进行原位监测,可提供吸附动力学,因此热力学数据42、43。42,
衰减总反射率(ATR)被罗迪克-兰齐洛塔用于建立基于1,600和1,525cm-1的莱辛光谱波段的莱辛吸附异从。这是首次使用原位红外方法44测定TiO2上肽的绑定常量。该技术有效地建立了多解合肽45和酸性氨基酸46的吸附等理。
与上述方法不同,吸附参数是原地测量的,在常规实验中,吸附生物分子的量是通过表面接触溶液后的浓度变化来测量的。由于在绝大多数吸附情况下,沙球的浓度衰减,这种方法被称为耗竭方法。浓度测量需要经过验证的分析测定,该测定可能基于沙球的内在分析特性,或基于标签47、48、49、5048,49,50或衍生51,52。,52 47
使用 QCM、SPR、TIRF 或 ATR 进行吸附实验需要用于吸附研究的芯片和传感器的特殊表面制备。由于氧化物表面不可避免的水化或沙球的化学化,制备的表面应使用一次,并在切换吸附剂时需要改变。一次只能使用 ITC、QCM、SPR、TIRF 或 ATR 运行一个样品,而在耗尽方法中,可以运行数十个样本,而数量仅受恒温器容量和吸附可用性的限制。这一点在处理大样本批次或生物活性分子库时尤其重要。重要的是,耗竭方法不需要昂贵的设备,而只需要恒温器。
然而,尽管耗竭方法具有明显的优点,但它需要复杂的程序特征,这些特征可能看起来很麻烦。本文介绍了如何使用耗竭方法对TiO2进行二肽吸附的综合物理化学研究,并解决研究人员在进行相关实验时可能面临的问题。
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Protocol
1. 制备二肽库存溶液和稀释
- 制备16 mM二肽溶液
- 将0.183克二肽(Ile-His)(参见材料表)放入无菌聚合物试管中,用双蒸馏水 (DDW) 稀释至 35 mL,并在室温 (RT) 下在剧烈搅拌下溶解。
注:如果二肽在搅拌时未溶解在DDW中,将二肽溶液放入超声波浴中并声波几分钟。 - 通过在无菌试管中溶解50 mLDDW中的干燥2(N-morpholino)ethanesulfonic酸,制备50mM溶液2-(N-morpholino)电硫酸(MES)缓冲液。NN通过在100 mL DDW中溶解200毫克氢氧化钠,制备50mM氢氧化钠溶液。
- 通过将预溶解二肽溶液的pH值调整到7.4,将50 mM MES或50 mM氢氧化钠添加到16 mM二肽溶液中,在RT处搅拌,用pH米监测pH值。调节 pH 后,将溶液倒入测量缸,冲洗试管,并将测量缸中填充 DDW 到 40 mL,使最终浓度达到 16 mM。
- 将0.183克二肽(Ile-His)(参见材料表)放入无菌聚合物试管中,用双蒸馏水 (DDW) 稀释至 35 mL,并在室温 (RT) 下在剧烈搅拌下溶解。
- 从 16 mM 库存溶液中制备二肽稀释液
- 通过使用DDW稀释16 mM二肽溶液,制备浓度在0.4至12.0mM之间的肽稀释液。例如,为了准备 8 mM 二肽溶液,将 7 mL DDW 添加到 16 mM 二肽溶液的 10 mL 中。稀释后,通过将 50 mM MES 或 50 mM NaOH 逐一降至二肽溶液(参见步骤 1.1.3),将 pH 值调整到 7.4。调节 pH 后,将溶液倒入测量缸,冲洗试管,然后用 DDW 填充高达 20 mL 的测量缸,使二肽浓度达到 8 mM。
注:浓度为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0、4.0、8.0和12.0m的16 mM二肽库存溶液的其他稀释液,均按照图1制备。步骤 1.1.3 中描述了每个二肽溶液 pH 到 7.4 的调整。
- 通过使用DDW稀释16 mM二肽溶液,制备浓度在0.4至12.0mM之间的肽稀释液。例如,为了准备 8 mM 二肽溶液,将 7 mL DDW 添加到 16 mM 二肽溶液的 10 mL 中。稀释后,通过将 50 mM MES 或 50 mM NaOH 逐一降至二肽溶液(参见步骤 1.1.3),将 pH 值调整到 7.4。调节 pH 后,将溶液倒入测量缸,冲洗试管,然后用 DDW 填充高达 20 mL 的测量缸,使二肽浓度达到 8 mM。
2. 泰坦索尔的准备
- 通过在 500 mL DDW 中溶解 1.066 g 的 MES,制备 MES 缓冲液的 10 mM 解决方案。用干氢氧化钠将pH值调整到7.4,用pH计监测pH值。
- 在砂浆中研磨200毫克纳米晶体TiO2至少5分钟(参见材料表)。
- 将40毫克的地面二氧化钛纳米颗粒称重到实验室烧瓶中。使用实验室支架将烧瓶放入声波浴(参见材料表)。
- 使用 TiO2将 20 mL 的 10 mM MES 缓冲液添加到烧瓶中,并在超声波浴(5 L、40 kHz、120 W)中声波20分钟。
3. 混合和热塑
- 将恒温器(参见材料表)设置为所需温度(即 0.00、10.00、20.00、30.00 或 40.00 °C)。
- 将 TiO2的声波索尔 1 mL 添加到标记的吸附小瓶中。将标记的吸附小瓶与相应的二肽稀释物放在由挤出聚苯乙烯泡沫制成的临时浮选装置中。将带有标记小瓶和相应二肽稀释物的浮选装置放入恒温器中至少 5 分钟。
- 将每个二肽稀释剂的 1 mL 添加到相应的标记吸附小瓶中,确保所有混合溶液具有相同的温度。将恒温器上采集的吸附样品系列保持在0.00、10.00、20.00、30.00或40.00°C,24小时达到吸附平衡。
注:在将所得分散体放入恒温器之前,要小心地摇动所有样品。 - 有时,在热处理过程中手动摇动 TiO2色散器,从而混合它们。
4. 热固样品的过滤
- 为了避免温度引起的再平衡,每次从恒温器中抽取一个样品进行过滤。
- 通过注射器针头,用注射器从每个玻璃小瓶中抽取二肽溶液样本。从注射器中取出针头,放入注射器过滤器(参见材料表),将二肽溶液过滤到玻璃瓶中。对其他样品重复过滤。
- 根据第 5 节分析滤液。
注:请勿使样品离心,因为它需要几分钟时间,并可能导致浓度平衡发生变化。
5. 衍生和HPLC分析
- 在醋酸酯中制造50 mL的三氟酸(TFA)溶液。在测量缸中加入 0.34 mL TFA,并在 RT 处使用醋酸酯将溶液的体积调整到 50 mL。
注意:在通风通风的烟罩下使用TFA,因为吸入三氟乙酸有害,造成严重的皮肤灼伤,即使在低浓度的53度对水生生物也有毒。 - 通过在分级气缸中放置299μL的苯基同心酸酯和347μL的三乙酰胺,并在RT用醋酸酯将溶液体积调整到50 mL,制备衍生溶液(即Edman试剂54)。
- 在高性能液相色谱分析 (HPLC) 之前,使用 Edman 的试剂在色谱小瓶中推导样品。将样品的400μL与埃德曼试剂的400μL混合。在60°C下加热样品15分钟。加热后,用 TFA 溶液的 225 μL 中和样品,并等待几分钟将样品冷却到 RT。
- 使用 HPLC 分析(参见材料表)确定吸附前后二肽溶液的浓度。将带有分析溶液的色谱小瓶放入 HPLC 自动采样器中,然后开始分析由软件设置的必要条件(参见材料表)。
注:移动相由0.1%的TFA在去离子水和纯乙酰三聚三甲组成,在286nm下从20-90%的醋酸酯梯度在13分钟。在三聚三联中分析每个样品。使用先前建立的校准曲线测量二肽溶液浓度(图2)。有关色谱规格,请参阅什切洛科夫等人55。
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Representative Results
在0~40°C的生物相容条件下,研究了纳米晶体二氧化钛二肽的吸附。二氧化钛表面的实验二肽吸附(A,mmol/g)被评价为
其中C0和C e分别为毫摩尔的二肽起始和平衡浓度;V是升中二肽溶液的体积;m是吸附剂的重量(以克计)。
使用亨利模型处理了二肽吸附的测量数据。此等值体模型假定吸附在相对较低的浓度下,在吸附表面上彼此分离的沙球分子,适合描述实验数据(图3)。但是请注意,此模型只能应用于可逆吸附的情况下,这也应予以确认。多次冲洗的材料的红外光谱适合此目的。TiO2上获得的平衡肽量与溶液根据线性方程相关:
其中KH是亨利的吸附常数。
平衡结合常数KH是从二肽吸附依赖性(A)对二肽平衡浓度(Ce)的斜率中获得的。每个温度 T 的标准吉布斯自由能量(μG,kJ/mol) 通过 Van't Hoff 方程确定:
其中R是J/mol+K中的理想气体K常数,T是开尔文吸附过程的温度。
在每种温度下确定的二肽吉布斯自由能(图4)揭示了同轴的线性回归截取(如图4)。回归变量,过程的熵(#S), 派生自基本方程:
表1中给出了易位定量(KH)、标准吉布斯能量(μG)、ehalpy(μH)和熵(μS)的计算值 。
图1:稀释16 mM二肽库存溶液。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2:不同二肽浓度的校准曲线。二肽浓度在0.4-16.0mM之间。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3:亨利模型为每个温度计算的二肽吸附等值。在 (A) 0 °C (B) 10°C( C ) 20 °C (D) 30 °C 和 (E) 40 °C 处的二肽吸附等理。计算的相关系数 (R2) 属于所有获得的 Henry 模型等同词的 0.96±0.99 范围。误差条表示三联测每个样品浓度的 95% 置信区间。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4:二肽吸附的标准吉布斯自由能对温度的依赖。误差条表示吉布斯自由能量的95%置信区间,作为基于亨利模型的间接测量。请点击此处查看此图形的较大版本。
T, K | KH | ΜG0, kJ/摩尔 | ΜH0, kJ/mol | *S0,kJ/mol K |
273.15 | 0.32 × 0.01 | 2.6 × 0.0 | - 41 × 9 | - 0.16 ± 0.03 |
283.15 | 0.25 × 0.01 | 3.2 × 0.1 | ||
293.15 | 0.17 × 0.06 | 4.3 × 0.9 | ||
303.15 | 0.050 × 0.002 | 7.6 × 0.1 | ||
313.15 | 0.037 × 0.002 | 8.3 × 0.1 |
表1:二肽吸附的热力学参数。
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Discussion
由于动力学限制和具有高特定表面积的吸附剂,从等值结构解决方案中吸附需要较长的平衡时间。此外,在吸附氨基酸时,应考虑sol、纳米粒子聚集体、结晶性、纳米颗粒大小分布、溶液的pH含量以及吸附竞争。然而,使用耗竭方法进行吸附等体结构仍然是最可用的方法,因为它不需要昂贵的设置,但它为字面上每个可溶性沙球提供了详尽的物理化学数据。
当晶体材料用作吸附剂时,必须区分吸附模式(即溶液分散颗粒或固定表面)。人们应该期望在宏观平面和颗粒上晶体面的分布有显著差异。通过吸附纳米粒子上的肽来确定的热力学参数可能与肽吸附的热力学参数对应宏观平面。
在无机表面上吸附肽的平均量极低。在室温下,此值约为每平方米28微克数百微克。这种少量吸附需要精确的测量方法和具有良好表面的固体。因此,具有大特定表面(数百平方米)的小颗粒物质应用于吸附实验43、56、57、58、59、60。43,56,57,58,59,60
肽和蛋白质一样不稳定,在狭窄的条件下保持其功能。在生物相容温度为0°C-40°C(273.15 K-313.15 K)的生物相容温度下,对二氧化纳米晶体钛进行了吸附实验,这与正常、功能正常、活生物体相似。在较高或更低的温度下吸附无关紧要,不应考虑进行实验。
多功能生物活性化合物也表现出对介质pH的高易感性,因为它影响表面电荷,因此,带电功能组61、62、6362,63之间的库仑相互作用61。由于水合表面64的活性质子交换,氧化物材料的吸附电荷也依赖于pH。为了建立pH稳定条件,需要吸附平衡使用缓冲液。在这项研究中,MES缓冲器用于其非协调特性65,因此与氧化金属表面的肽不竞争吸附,不像磷酸盐缓冲液66。
最近对氨基酸吸附的试验表明,纳米粒子上的主要结合位点是表面缺陷55。表面缺陷分布是纳米晶体基板最可控的特征之一,因此应使用同一批次的吸附剂,以保持吸附研究的一致性。
QCM、质子共振和ITC是真正的具有微妙灵敏度的方法,结合光谱方法,在与表面相互作用时,可以揭示吸附物的结构特性。然而,它们没有克服动力学限制,仍然需要相当长的时间来实现吸附平衡。此外,一次只能处理一个样品,这使得批次样品分析具有挑战性。另一方面,提出的耗竭方法简单,仅限于恒温器容量,使处理大量样品成为可能。
热固样品一旦从恒温器中取出,应立即进行过滤,以避免温度引起的重新平衡。虽然新温度下的均衡可能需要几个小时,但应尽量减少将吸附样品保持在不同温度。不建议对中相分离的样品进行离心,因为它最多需要几分钟,并可能导致浓度平衡的变化。滤清器材料的选择取决于沙球的性质,应减少可能的滤芯结合,以实现最大的回收。在选择特定筛选器时,最好遵循供应商的说明和建议。
此外,还应记住,应使用质谱、光谱或紫外可见光谱学,使用经过验证的定量方法监测吸附研究中的浓度变化。如果吸附物具有光谱活性,则分析非常简单,否则需要额外的吸附物标签或推导。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了俄罗斯基础研究基金会(第15-03-07834-a号赠款)的财政支助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | TCI Chemicals | 4432-31-9 | MES, >98% |
Acetonitrile | Panreac AppliChem | HPLC grade | |
Chromatography vials | glass | ||
Dipeptide Ile-His | Bachem | 4000894 | |
Double-distilled water | DDW was obtained on spot | ||
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" | J.P. Selecta | 3000865 | 5 L, 40 kHz, 120 Watts |
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector | Shimadzu, LC-20 Prominence | HPLC | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich (Merck) | 67-63-0 | 99.70% |
LabSolutions Lite | Shimadzu | 223-60410 | Software for high-performance liquid chromatography system |
Nanocrystalline TiO2 | Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details. | ||
Phenyl isothiocyanate | Acros Organics | 103-72-0 | PITC, 98% |
Reversed-phase Zorbax column | ZORBAX LC | 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm | |
Syringe filter | Vladfilter | 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate | |
Test sterile polymeric tube | polypropylene | ||
Thermostat TC-502 | Brookfield | Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich (Merck) | 121-44-8 | TEA; 99% |
Trifluoroacetic acid | Panreac AppliChem | 163317 | TFA, 99% |
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