Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Studie van korte peptide adsorptie op oplossing verspreidanannnanodeeltjes met behulp van uitputting methode

doi: 10.3791/60526 Published: April 11, 2020

Summary

De eerste stap in het begrijpen van biomolecule-anorganische vaste fase interactie is het onthullen van fundamentele fysisch-chemische constanten die kunnen worden geëvalueerd door het vaststellen van adsorptie isothermen. Adsorptie uit de vloeibare fase wordt beperkt door kinetiek, oppervlaktecapaciteit, pH en concurrerende adsorptie, die allemaal voorzichtig moeten worden overwogen voordat u een adsorptie-experiment instelt.

Abstract

Fundamenten van anorganische-organische interacties zijn van cruciaal belang bij de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe bio-interfaces die gebruik kunnen maken in biotechnologie en geneeskunde. Recente studies geven aan dat eiwitten interageren met oppervlakken via beperkte adsorptiesites. Eiwitfragmenten zoals aminozuren en peptiden kunnen worden gebruikt voor interactiemodellering tussen complexe biologische macromoleculen en anorganische oppervlakken. In de afgelopen drie decennia zijn veel geldige en gevoelige methoden ontwikkeld om de fysische chemische fundamenten van die interacties te meten: isothermale titratiecalorimetrie (ITC), oppervlakteplasmonresonantie (SPR), kwartskristalmicrobalans (QCM), totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) en verzwakte totale reflectantiespectroscopie (ATR).

De eenvoudigste en meest betaalbare techniek voor het meten van adsorptie is de uitputtingsmethode, waarbij de verandering in sorbaatconcentratie (uitputting) na contact met oplossingsverspreide sorbent wordt berekend en verondersteld te zijn geadsorbeerd. Adsorptieisotherms op basis van uitputtingsgegevens bieden alle basisfysisch-chemische gegevens. Echter, adsorptie van oplossingen vereist langere evenwichtstijden als gevolg van kinetische beperkingen en sorbents met een hoog specifiek oppervlak, waardoor het bijna niet van toepassing op macroscopische vaste vlak oppervlakken. Bovendien moeten factoren zoals de instabiliteit van solen, nanodeeltjesaggregaten, sorbent kristalliniteit, nanodeeltjesgrootteverdeling, pH van de oplossing en concurrentie voor adsorptie, worden overwogen tijdens het bestuderen van adsorbing peptiden. Uitputting stoomisotherm constructie biedt uitgebreide fysieke chemie gegevens voor letterlijk elke oplosbare sorbaat nog blijft de meest toegankelijke methodologie, omdat het geen dure opstellingen vereisen. Dit artikel beschrijft een basisprotocol voor de experimentele studie van peptide adsorptie op anorganisch oxide en behandelt alle kritieke punten die het proces beïnvloeden.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In de afgelopen 50 jaar heeft de interactie tussen anorganische oppervlakken en peptiden veel aandacht getrokken vanwege het hoge belang ervan in de materiaalkunde en de geneeskunde. Biomedisch onderzoek is gericht op de compatibiliteit en stabiliteit van bioanorganische oppervlakken, die directe implicaties hebben voor4regeneratieve geneeskunde, weefseltechniek21,,2,3en implantatie 4,5,6,7. Hedendaagse bioresponsieve apparaten, zoals sensoren en actuatoren, zijn gebaseerd op functionele eiwitten geïmmobiliseerd op oxide semigeleidende oppervlakken8,9,10,11,12,13. Moderne zuiveringspraktijken voor eiwitproductie zijn vaak afhankelijk van biomolecuulinteractie-eigenschappen in downstream zuivering en scheiding14.

Van de meervoudige anorganische oxiden blijft titaniumdioxide het meest gebruikt in combinatie met biologisch relevante substraten15,16. Onderzoek op het gebied2van TiO 2-gebaseerde bio-interfaces heeft zich geconcentreerd op het vaststellen van een sterke en specifieke binding van eiwitten en peptiden zonder hun biologische en structurele eigenschappen te veranderen. Uiteindelijk is het belangrijkste doel een hoge oppervlaktedichtheidlaag van biomoleculen met een hoge stabiliteit en verhoogde functionaliteit die de creatie van biotechnologische en medische toepassingen op basis van titanium zal bevorderen17.

Titanium en zijn legeringen zijn op grote schaal gebruikt als een chirurgisch implantaat materiaal voor ten minste zes decennia, omdat een oppervlak TiO2 laag met een dikte van een paar nanometer is corrosiebestendig en vertoont een hoog niveau van biocompatibiliteit in veel in vivo toepassingen18,19,20. Titaniumdioxide wordt ook algemeen beschouwd als een anorganisch substraat geproduceerd in biomineralisatie, waar nucleatie en anorganische fase groei vergezeld van eiwitten en peptiden materialen kunnen voorzien van veelbelovende katalytische en optische eigenschappen21,22,23,24.

Gezien de grote relevantie van de interactie tussen anorganische materialen en biomoleculen in het algemeen en eiwit-TiO2 interacties in het bijzonder, is er veel onderzoek gedaan naar de manipulatie en controle van de adsorptie van eiwitten op TiO2. Als gevolg van deze studies zijn enkele fundamentele eigenschappen van deze interactie onthuld, zoals adsorptiekkinetiek, oppervlaktedekking en biomolecuulbevleesvorming, wat aanzienlijke steun geeft voor verdere vooruitgang in bio-interfaces5,13.

Echter, eiwit complexiteit voegt aanzienlijke beperkingen op volledige bepaling en begrip van moleculaire niveau van een eiwit interactie met anorganische oppervlakken. Ervan uitgaande dat de biomoleculen interageren met de anorganische oppervlakken via beperkte plaatsen, sommige eiwitten met bekende structuren en aminozuur sequenties zijn teruggebracht tot hun componenten-peptiden en aminozuren-die afzonderlijk worden bestudeerd. Sommige van deze peptiden hebben aangetoond significante activiteit, waardoor ze een uniek onderwerp van adsorptie studies zonder de noodzaak van eerdere eiwitscheiding25,26,27,28,29,30.

Kwantitatieve karakterisering van peptide adsorptie op TiO2 of andere anorganische oppervlakken kan worden bereikt door middel van fysische methoden die speciaal zijn aangepast voor biomoleculen voor de afgelopen decennia. Deze methoden omvatten isothermale titratie calorimetrie (ITC), oppervlakteplasmon resonantie (SPR), kwarts kristal microbalans (QCM), totale interne reflectie fluorescentie (TIRF), en verzwakte totale reflectantie spectroscopie (ATR), die allemaal zorgen voor de detectie van de adsorptie sterkte door het verstrekken van belangrijke thermodynamische gegevens: De bindende constante, Gibbs vrije energie, enthalpy, en entropy31.

De adsorptie van biomoleculen op het anorganische materiaal kan op twee manieren worden bereikt: 1) ITC en de uitputtingsmethode gebruiken deeltjes die zijn verspreid in een oplossing die bindend is voor vaste macroscopische oppervlakken; 2) SPR, QCM, TIRF en ATR maken gebruik van macroscopische oppervlakken die zijn gewijzigd met anorganisch materiaal, zoals goudgecoate glas- of metaalchips, kwartskristallen, zinksulfidekristallen en PMMA-chips.

Isothermale titratie calorimetrie (ITC) is een labelvrije fysische methode die de warmte meet die wordt geproduceerd of verbruikt bij titratie van oplossingen of heterogene mengsels. Gevoelige calorimetrische cellen detecteren warmte-effecten zo klein als 100 nanojoules, waardoor de meting van adsorptiewarmte op nanodeeltjes oppervlakken mogelijk is. Thermisch gedrag van de sorbaat tijdens continue toevoeging- titratie, biedt een volledig thermodynamisch profiel van de interactie onthullen de enthalpy, bindende constante, en entropie bij een bepaalde temperatuur32,33,34,35,36.

Oppervlakteplasmon resonantie (SPR) spectroscopie is een oppervlaktegevoelige optische techniek gebaseerd op de meting van de brekingsindex van de media in de nabijheid van het bestudeerde oppervlak. Het is een real-time en label-vrije methode voor het toezicht op omkeerbare adsorptie en adsorbed laag dikte. De bindingsconstante kan worden berekend op basis van de associatie- en dissociatiepercentages. Adsorptie-experimenten die bij verschillende temperaturen worden uitgevoerd , kunnen informatie verschaffen over de temperatuurafhankelijkheid van de activeringsenergie en achtereenvolgens andere thermodynamische parameters37,38,39.

De kwartskristalmicrobalans (QCM) meet de verandering in de oscillerende frequentie van piëzo-elektrische kristallen tijdens de adsorptie- en desorptieprocessen. De bindingsconstante kan worden geëvalueerd aan de hand van de verhouding van de adsorptie- en desorptieconstanteconstanten. QCM wordt gebruikt voor relatieve massametingen en behoeft daarom geen kalibratie25,27,40. QCM wordt gebruikt voor adsorptie van zowel gas als vloeistof. De vloeibare techniek maakt het mogelijk QCM te gebruiken als een analyse-instrument om afzetting op verschillende gewijzigde oppervlakken te beschrijven41.

Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) is een gevoelige optische interfaciale techniek gebaseerd op de meting van de fluorescentie van adsordenfluorofaat met intern gereflecteerde evanescente golven. De methode maakt het mogelijk om fluorescerende moleculen die het oppervlak bedekken met diktes in de orde van tientallen nanometers, dat is waarom het wordt gebruikt in de studie van macromoleculaire adsorptie op verschillende oppervlakken42,43. In situ monitoring van de fluorescentiedynamiek bij adsorptie en desorptie zorgen voor de adsorptiek en dus thermodynamische gegevens42,43.

Verzwakte totale reflectantie (ATR) werd gebruikt door Roddick-Lanzilotta om lysine adsorptie isothermen op basis van de lysine spectrale banden op 1.600 en 1.525 cm-1vast te stellen . Dit is de eerste keer dat de bindingconstante voor een peptide op TiO2 werd bepaald met behulp van een in situ infraroodmethode44. Deze techniek was effectief bij het vaststellen van adsorptieisothermen voor polylysine peptiden45 en zure aminozuren46.

In tegenstelling tot de bovengenoemde methoden, waarbij de adsorptieparameter ter plaatse wordt gemeten, wordt in een conventioneel experiment de hoeveelheid van de geadsorbeerde biomoleculen gemeten door de concentratieverandering nadat het oppervlak contact had opgenomen met de oplossing. Omdat de concentratie van een sorbaat vervalt in een overgrote meerderheid van adsorptiegevallen, wordt deze methode aangeduid als de uitputtingsmethode. Concentratiemetingen vereisen een gevalideerde analytische test, die kan worden gebaseerd op een intrinsieke analytische eigenschap van de sorbaat of op basis van de etikettering47,48,49,,50 of derivatization51,52 daarvan.

Adsorptie-experimenten met QCM, SPR, TIRF of ATR vereisen een speciale oppervlaktevoorbereiding van de chips en sensoren die worden gebruikt voor adsorptiestudies. Voorbereide oppervlakken moeten eenmaal worden gebruikt en moeten worden gewijzigd bij het schakelen van de adsorbaat, als gevolg van de onvermijdelijke hydratatie van het oxideoppervlak of mogelijke chemisorptie van een sorbaat. Slechts één monster tegelijk kan worden uitgevoerd met ITC, QCM, SPR, TIRF of ATR, terwijl men in de uitputtingsmethode tientallen monsters kan uitvoeren, waarvoor de hoeveelheid alleen wordt beperkt door de thermostaatcapaciteit en de beschikbaarheid van sorbent. Dit is vooral belangrijk bij het verwerken van grote steekproefbatches of bibliotheken van bioactieve moleculen. Belangrijk is dat de uitputtingsmethode geen dure apparatuur vereist, maar alleen een thermostaat.

Ondanks de duidelijke voordelen vereist de uitputtingsmethode echter complexe procedurele kenmerken die omslachtig kunnen lijken. Dit artikel presenteert hoe een uitgebreide fysisch-chemische studie van dipeptide adsorptie op TiO2 uit te voeren met behulp van de uitputtingmethode en adressen kwesties die onderzoekers kunnen worden geconfronteerd bij het uitvoeren van relevante experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Bereiding van dipeptide stockoplossingen en verdunningen

  1. Bereiding van 16 mM dipeptide oplossing
    1. Plaats 0,183 g van een dipeptide (Ile-His) (zie Tabel van materialen) in een steriele polymeerreageerbuis, verdun tot 35 mL met dubbel gedestilleerd water (DDW) en los op bij kamertemperatuur (RT) onder krachtig roeren.
      OPMERKING: Als het dipeptide niet oplost in DDW tijdens het roeren, plaats de dipeptide oplossing in een ultrasoon bad en sonicaat voor een paar minuten.
    2. Bereid een 50 mM-oplossingNvan 2-( N-morpholino)ethaansulfoniczuur (MES) buffer voor door 0,533 g droge 2-( N-morpholino)ethaansulfoonzuur in 50 mL DDW in de steriele reageerbuis op te lossen.N Bereid een natriumhydroxideoplossing van 50 mM voor door 200 mg natriumhydroxide op te lossen in 100 mL DDW.
    3. Pas de pH van de vooraf opgeloste dipeptideoplossing aan op 7,4 door de pH zorgvuldig toe te voegen (microlitertitratie) 50 mM MES, of 50 mM natriumhydroxide aan de 16 mM dipeptide oplossing, roerend bij RT en het monitoren van de pH met een pH-meter. Na het aanpassen van de pH giet u de oplossing in een meetcilinder, spoelt u de reageerbuis af en vult u de meetcilinder met DDW tot 40 mL om een eindconcentratie van 16 mM te maken.
  2. Bereiding van dipeptide verdunningen van 16 mM voorraadoplossing
    1. Bereid peptideverdunningen voor met concentraties tussen 0,4 en 12,0 mM door de 16 mM dipeptideoplossing met DDW te verdunnen. Bijvoorbeeld, om een 8 mM dipeptide oplossing voor te bereiden, voeg 7 mL DDW toe aan 10 mL van de 16 mM dipeptide oplossing. Pas na verdunning de pH aan op 7,4 door 50 mM MES of 50 mM NaOH druppel voor druppel toe te voegen aan de dipeptide-oplossing (zie stap 1.1.3). Na het aanpassen van de pH giet u de oplossing in een meetcilinder, spoelt u de reageerbuis af en vult u de meetcilinder tot 20 mL met DDW om de dipeptideconcentratie 8 mM te maken.
      OPMERKING: Andere verdunningen van 16 mM dipeptide stock oplossing met concentraties van 0,4, 0,8, 1.2, 1.6, 2.0, 3.0, 4.0, 8.0, en 12.0 mM, worden bereid overeenkomstig figuur 1. De aanpassing van elke dipeptide oplossing pH tot 7.4 wordt beschreven in stap 1.1.3.

2. Voorbereiding van titania sol

  1. Bereid een 10 mM oplossing van MES buffer voor door 1.066 g MES op te lossen in 500 mL ddw. Stel de pH aan op 7,4 met droge natriumhydroxide bij het roeren en bewaken van de pH met de pH-meter.
  2. Maal 200 mg nanokristallijnTiO2 in een mortel gedurende ten minste 5 min (zie Materiaaltafel).
  3. Weeg 40 mg van de grond titaniumdioxide nanodeeltjes in een laboratoriumkolf. Doe de kolf in het sonicatiebad (zie Materiaaltafel)met behulp van de laboratoriumstandaard.
  4. Voeg 20 mL van 10 mM MES buffer in de kolf met TiO2 en sonicaer in een ultrasoon bad (5 L, 40 kHz, 120 W) gedurende 20 min.

3. Mengen en thermostaten

  1. Stel de thermostaat (zie Materiaaltafel)in op de gewenste temperaturen (d.w.z. 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 of 40,00 °C).
  2. Voeg 1 mL van de gesoniceerde sol van TiO2 toe aan de gemarkeerde adsorptieflesjes. Plaats de gemarkeerde adsorptieflacons tegen overeenkomstige dipeptideverdunning in een geïmproviseerd drijfmiddel van geëxtrudeerd polystyreenschuim. Plaats de flotatieinrichting met de gemarkeerde flacons en bijbehorende dipeptideverdunningsverwijdingen gedurende ten minste 5 min in de thermostaat.
  3. Voeg 1 mL van elke dipeptide verdunning toe aan de overeenkomstige gemarkeerde adsorptieflacon, zodat alle mengoplossingen dezelfde temperatuur hebben. Bewaar de serie verkregen adsorptiemonsters op de thermostaat op 0,00, 10.00, 20.00, 30,00 of 40,00 °C gedurende 24 uur om het adsorptieevenwicht te bereiken.
    LET OP: Schud voorzichtig alle monsters van verkregen dispersies voordat u ze in de thermostaat plaatst.
  4. Meng af en toe de TiO2 dispersies door ze handmatig te schudden tijdens het thermostaten.

4. Filtratie van de gethermostateerde monsters

  1. Om temperatuur-geïnduceerde reequilibratie te voorkomen, neemt u één monster tegelijk van de thermostaat voor filtratie.
  2. Neem een monster van de dipeptide oplossing van elke glazen flacon met een spuit, door middel van een spuitnaald. Haal de naald uit de spuit en zet het spuitfilter (zie Tabel van materialen)om de dipeptideoplossing in de glazen flacon te filteren. Herhaal de filtratie met de andere monsters.
  3. Analyseer het filtraat in overeenstemming met sectie 5.
    LET OP: Centrifugeer de monsters niet, omdat het enkele minuten duurt en een verandering in het concentratieevenwicht kan veroorzaken.

5. Derivatization en HPLC-analyse

  1. Maak een 50 mL oplossing van trifluorazijnzuur (TFA) in acetonitril. Voeg 0,34 mL TFA toe aan de meetcilinder en pas het volume van de oplossing aan op 50 mL met acetonitril bij RT.
    LET OP: Werk met TFA onder een rookkap met uitlaatventilatie, omdat trifluorazijnzuur schadelijk is bij inademing, ernstige brandwonden veroorzaakt en zelfs bij lage concentraties giftig is voor waterorganismen53.
  2. Bereid de derivatisatieoplossing (d.w.z. Edman reagens54)voor door 299 μL fenylisothiocyanaat en 347 μL triethylamine in een gegradueerde cilinder te plaatsen en het volume van de oplossing aan te passen op 50 mL met acetonitril bij RT.
  3. Voorafgaand aan de high-performance liquid chromatografie (HPLC) analyse, derivatize de monsters met Edman's reagens in de chromatografie flesjes. Meng 400 μL van het monster met 400 μL reagens van Edman. Verwarm het monster op 60 °C gedurende 15 min. Neutraliseer het monster na het verwarmen met 225 μL van de TFA-oplossing en wacht een paar minuten om het monster tot RT af te koelen.
  4. Gebruik HPLC-analyse (zie Tabel van materialen)om de concentratie van de dipeptide-oplossing voor en na adsorptie te bepalen. Plaats de chromatografieflesjes met de geanalyseerde oplossingen in de HPLC-autosampler en begin met het analyseren van de monsters met de nodige voorwaarden, die door de software worden ingesteld (zie Tabel van materialen).
    OPMERKING: De mobiele fase bestaat uit 0,1% TFA in gedeïoniseerd water en zuiver acetonitril, met acetonitrilgradiënten van 20-90% bij 286 nm voor 13 min. Analyseer elk monster in drievoud. Meet de dipeptide oplossingsconcentratie met behulp van de eerder vastgestelde kalibratiecurve(figuur 2). Voor chromatografiespecificaties zie Shchelokov et al.55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Adsorptie van een dipeptide op nanokristallijn titaniumdioxide werd bestudeerd in de biocompatibele omstandigheden in een temperatuurbereik van 0−40 °C. Experimentele dipeptide adsorptie (A, mmol/g) op het oppervlak van een titaniumdioxide werd geëvalueerd als

Wanneer C0 en Ce respectievelijk de begin- en evenwichtsconcentraties van de dipeptide in millimol zijn; V is het volume van een dipeptide oplossing in liters; en m is het gewicht van de sorbent in grammen.

De metingen van de dipeptide adsorptie werden verwerkt met behulp van het Henry-model. Dit isothermmodel gaat uit van adsorptie bij relatief lage concentraties met de sorbaatmoleculen die van elkaar zijn geïsoleerd op een sorbentoppervlak en is geschikt voor het beschrijven van de experimentele gegevens (figuur 3). Houd er echter rekening mee dat dit model alleen kan worden toegepast in het geval van omkeerbare adsorptie, die ook moet worden bevestigd. IR-spectroscopie van het meerdere malen gespoelde materiaal is hiervoor geschikt. De verkregen evenwichtpeptidebedragen op de TiO2 en de oplossing zijn gerelateerd in overeenstemming met de lineaire vergelijking:

waar KH is Henry's adsorptie constante.

De evenwichtsbindende constante KH werd verkregen uit de helling van de afhankelijkheid van dipeptide adsorptie (A) op de dipeptide evenwichtsconcentratie (Ce). De standaard Gibbs vrije energie (ΔG, kJ/mol) voor elke temperatuur T werd bepaald door middel van de Van't Hoff vergelijking:

waar R de ideale gasconstante is in J/mol*K,en T is de temperatuur van het adsorptieproces in Kelvin.

Dipeptide Gibbs vrije energieën bepaald bij elke temperatuur (Figuur 4) onthuld enthalpie (ΔH) als een interceptie van de lineaire regressie met de as. De regressievariabele, de entropie van het proces (ΔS), is afgeleid van de fundamentele vergelijking:

De berekende waarden van de evenwichtsbindende constante (KH), standaard Gibbs energie (ΔG), enthalpy (ΔH), en entropie (ΔS) voor Ile-His worden gepresenteerd in tabel 1.

Figure 1
Figuur 1: Verdunning van de 16 mM dipeptide voorraadoplossing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Kalibratiecurve bij verschillende dipeptideconcentratie. De dipeptide concentraties lagen tussen 0,4-16,0 mM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: De dipeptide adsorptieisotherms berekend door het Henry-model voor elke temperatuur. Dipeptide adsorptieisotherm bija) 0 °C (B) 10 °C (C) 20 °C (D) 30 °C, respectievelijk (E) 40 °C. De berekende correlatiecoëfficiënten (R2)vielen in een bereik van 0,96−0,99 voor alle verkregen Henry-modelisothermen. Foutbalken vertegenwoordigen het betrouwbaarheidsinterval van 95% voor elke monsterconcentratie gemeten in drievoud. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Afhankelijkheid van de standaard Gibbs vrije energie van de dipeptide adsorptie op temperatuur. Foutbalken vertegenwoordigen het betrouwbaarheidsinterval van 95% voor Gibbs vrije energie als indirecte meting op basis van Henry Model. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

T, K KH ΔG0, kJ/mol ΔH0, kJ/mol ΔS0, kJ/mol K
273.15 0,32 ± 0,01 2,6 ± 0,0 - 41 ± 9 - 0,16 ± 0,03
283.15 0,25 ± 0,01 3,2 ± 0,1
293.15 0,17 ± 0,06 4,3 ± 0,9
303.15 0,050 ± 0,002 7,6 ± 0,1
313.15 0,037 ± 0,002 8,3 ± 0,1

Tabel 1: Thermodynamische parameters van dipeptide adsorptie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Adsorptie van oplossingen voor isotherm constructie vereist een langere tijd voor evenwicht als gevolg van kinetische beperkingen en sorbents met een hoge specifieke oppervlakte. Bovendien moet rekening worden gehouden met instabiliteit van solen, nanodeeltjesaggregaten, kristalliniteit, nanodeeltjesgrootteverdeling, pH van de oplossing en concurrentie voor adsorptie tijdens het adsorberen van aminozuren. Echter, adsorptie isotherm constructie met behulp van de uitputting methode blijft de meest beschikbare methode, omdat het geen dure opstellingen vereist, en toch biedt uitputtende fysieke chemie gegevens voor letterlijk elke oplosbare sorbaat.

Er moet een onderscheid worden gemaakt tussen adsorptiemodi (d.w.z. oplossingsverspreide deeltjes of op een vast oppervlak) wanneer een kristallijn materiaal als sorbent wordt gebruikt. Men zou een wezenlijk verschil in de distributie van kristallijne gezichten op macroscopically vlakke oppervlakten en op deeltjes moeten verwachten. Resulterende thermodynamische parameters die worden bepaald door adsorptie van peptiden op nanodeeltjes, komen mogelijk niet overeen met de thermodynamische parameters van peptideadsorptie met macroscopisch vlakke oppervlakken.

De gemiddelde hoeveelheid peptiden die op de anorganische oppervlakken worden geadsorbeerd is extreem laag. Bij kamertemperatuur, deze waarde is ongeveer enkele honderden microgram per vierkante meter28. Deze kleine hoeveelheid adsorbaat vereist nauwkeurige meetmethoden en vaste stoffen met goed ontwikkelde oppervlakken. Daarom moeten kleine deeltjesstoffen met een groot specifiek oppervlak (honderden vierkante meters) worden gebruikt voor adsorptie-experimenten43,56,57,58,59,60.

Peptiden zijn, net als eiwitten, instabiel, en behouden hun functionaliteit in een smal scala van voorwaarden. Adsorptie-experimenten werden uitgevoerd op nanokristallijn titaniumdioxide bij biocompatibele temperaturen van 0 °C-40 °C (273,15 K-313.15 K), die vergelijkbaar zijn met die van een normaal, functionerend, levend organisme. Adsorptie bij hogere of lagere temperaturen is niet relevant en mag niet in aanmerking worden genomen voor het experiment.

Multifunctionele biologisch actieve verbindingen vertonen ook een hoge gevoeligheid voor pH van de media, omdat het de oppervlaktelading beïnvloedt en daarom Coulomb interacties tussen geladen functionele groepen61,62,63. De sorbent lading van oxide materialen is ook pH-afhankelijk als gevolg van actieve protonuitwisseling op het gehydrateerde oppervlak64. Om pH stabiele voorwaarden voor adsorptie evenwicht gebruik van een buffer vast te stellen is vereist. In deze studie wordt de MES-buffer gebruikt voor zijn niet-coördinerende eigenschap65, zodat het niet zou concurreren met het peptide voor adsorptie op het metaaloxideoppervlak, in tegenstelling tot fosfaatbuffers66.

Deze recente test van aminozuur adsorptie toont aan dat de belangrijkste bindende site op het nanodeeltje is het oppervlak defect55. Defectverdeling op het oppervlak is een van de minst controleerbare kenmerken van de nanokristallijne substraten, vandaar dat men sorbent van dezelfde partij moet gebruiken om consistentie in adsorptiestudies te behouden.

QCM, plasmon resonantie, en ITC zijn echte methoden met subtiele gevoeligheid die in een combinatie van spectroscopische methoden structurele eigenaardigheden van de adsorbaat onthullen tijdens het samenspel met het oppervlak. Ze overwinnen echter geen kinetische beperkingen en hebben nog steeds veel tijd nodig om adsorptie-evenwicht te bereiken. Bovendien kan slechts één monster per keer worden verwerkt, wat batchmonsteranalyse uitdagend maakt. Aan de andere kant is de gepresenteerde uitputtingsmethode eenvoudig en beperkt tot de thermostaatcapaciteit, waardoor de verwerking van een groot aantal monsters mogelijk is.

De thermostaten moeten worden gefilterd zodra ze van de thermostaat worden verwijderd om temperatuurveroorzaakte reequilibratie te voorkomen. Hoewel de evenwicht bij een nieuwe temperatuur tot een paar uur kan duren, moet het houden van de adsorptiemonsters op een andere temperatuur worden geminimaliseerd. Centrifugatie van de monsters voor supernatant scheiding wordt ook niet aanbevolen, omdat het tot een paar minuten duurt en een verandering in het concentratieevenwicht kan veroorzaken. De keuze van het filtermateriaal is afhankelijk van de sorbaataard en moet de mogelijke filterbinding voor maximale terugwinning verminderen. Het is het beste om instructies en aanbevelingen van leveranciers te volgen bij het kiezen van specifieke filters.

Bovendien moet men in gedachten houden dat concentratieverandering in de adsorptiestudies moet worden gecontroleerd met behulp van gevalideerde kwantificeringsmethode met behulp van massaspectrometrie, radiospectroscopie of UV-zichtbare spectroscopie. De analyse is eenvoudig als de adsorbaat spectroscopisch actief is, anders is aanvullende etikettering of derivatisatie van de adsorbaat vereist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd financieel ondersteund door de Russische Stichting voor Fundamenteel Onderzoek (Grant No. 15-03-07834-a).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid TCI Chemicals 4432-31-9 MES, >98%
Acetonitrile Panreac AppliChem HPLC grade
Chromatography vials glass
Dipeptide Ile-His Bachem 4000894
Double-distilled water DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" J.P. Selecta 3000865 5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector Shimadzu, LC-20 Prominence HPLC
Isopropanol Sigma-Aldrich (Merck) 67-63-0 99.70%
LabSolutions Lite Shimadzu 223-60410 Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2 Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate Acros Organics 103-72-0 PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column ZORBAX LC 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter Vladfilter 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube polypropylene
Thermostat TC-502 Brookfield Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine Sigma-Aldrich (Merck) 121-44-8 TEA; 99%
Trifluoroacetic acid Panreac AppliChem 163317 TFA, 99%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garcia, A. J. Interfaces to Control Cell-Biomaterial Adhesive Interactions. Polymers for Regenerative Medicine. 203, Chapter 71 171-190 (2006).
  2. Mahmood, T. A., et al. Modulation of chondrocyte phenotype for tissue engineering by designing the biologic-polymer carrier interface. Biomacromolecules. 7, (11), 3012-3018 (2006).
  3. Gandavarapu, N. R., Mariner, P. D., Schwartz, M. P., Anseth, K. S. Extracellular matrix protein adsorption to phosphate-functionalized gels from serum promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 9, (1), 4525-4534 (2013).
  4. Horbett, T. Biological Activity of Adsorbed Proteins. Surfactant Science Series. 110, 393-413 (2010).
  5. Ratner, B. D., Hoffman, A. S., Schoen, F. J., Lemons, J. E. Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine. Elsevier Academic Press/Academic Press. San Diego. (2004).
  6. Jahangir, A. R., et al. Fluorinated surface-modifying macromolecules: Modulating adhesive protein and platelet interactions on a polyether-urethane. Journal of Biomedical Materials Research. 60, (1), 135-147 (2002).
  7. Shen, M., et al. PEO-like plasma polymerized tetraglyme surface interactions with leukocytes and proteins: In vitro and in vivo studies. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 13, (4), 367-390 (2002).
  8. Wisniewski, N., Moussy, F., Reichert, W. M. Characterization of implantable biosensor membrane biofouling. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry. 366, (6-7), 611-621 (2000).
  9. Geelhood, S. J., et al. Passivating Protein Coatings for Implantable Glucose Sensors: Evaluation of Protein Retention. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81, 251-260 (2007).
  10. Knowles, J. R. Enzyme catalysis: not different, just better. Nature. 350, (6314), 121-124 (1991).
  11. Blankschien, M. D., et al. Light-triggered biocatalysis using thermophilic enzyme - Gold nanoparticle complexes. ACS Nano. 7, (1), 654-663 (2013).
  12. Wu, H., et al. Catechol modification and covalent immobilization of catalase on titania submicrospheres. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 92, 44-50 (2013).
  13. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Current Opinion in Structural Biology. 14, (1), 110-115 (2004).
  14. Hlady, V., Buijs, J. Protein adsorption on solid surfaces. Current Opinion in Biotechnology. 7, (1), 72-77 (1996).
  15. Kulkarni, M., et al. Titanium nanostructures for biomedical applications. Nanotechnology. 26, (6), 062002 (2015).
  16. Yin, F. Z., Wu, L., Gui Yang, H., Su, H. Y. Recent progress in biomedical applications of titanium dioxide. Physical Chemistry Chemical Physics. 15, (14), 4844-4858 (2013).
  17. Rezania, A., Johnson, R., Lefkow, A. R., Healy, K. E. Bioactivation of metal oxide surfaces. 1. Surface characterization and cell response. Langmuir. 15, (20), 6931-6939 (1999).
  18. Schenk, R. The Corrosion Properties of Titanium and Titanium Alloys. Titanium in Medicine. Brunette, D. M., et al. Springer-Verlag. Berlin, Germany. 145-170 (2001).
  19. Bozzini, B., et al. An electrochemical impedance investigation of the behaviour of anodically oxidised titanium in human plasma and cognate fluids, relevant to dental applications. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, (11), 3443-3453 (2008).
  20. Popa, M. V., et al. Long-term assessment of the implant titanium material - Artificial saliva interface. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, (1), 1-9 (2008).
  21. Kim, J. K., et al. Lysozyme-mediated biomineralization of titanium-tungsten oxide hybrid nanoparticles with high photocatalytic activity. Chemical Communications. 50, 12392-12395 (2014).
  22. Suriyaraj, S. P., Selvakumar, R. Room temperature biosynthesis of crystalline TiO2 nanoparticles using Bacillus licheniformis and studies on the effect of calcination on phase structure and optical properties. RSC Advances. 4, 39619-39624 (2014).
  23. Inoue, I., et al. Thermo-stable carbon nanotube-TiO2 nanocompsite as electron highways in dye-sensitized solar cell produced by bio-nano-process. Nanotechnology. 26, (28), 285601 (2015).
  24. Gardères, J., et al. Self-assembly and photocatalytic activity of branched silicatein/silintaphin filaments decorated with silicatein-synthesized TiO2 nanoparticles. Bioprocess and Biosystems Engineering. 39, (9), 1477-1486 (2016).
  25. Chen, H., Su, X., Neoh, K. G., Choe, W. S. QCM-D analysis of binding mechanism of phage particles displaying a constrained heptapeptide with specific affinity to SiO2 and TiO2. Analytical Chemistry. 78, (14), 4872-4879 (2006).
  26. Iucci, G., et al. Peptides adsorption on TiO2 and Au: Molecular organization investigated by NEXAFS, XPS and IR. Surface Science. 601, (18), 3843-3849 (2007).
  27. Gronewold, T. M. A., Baumgartner, A., Weckmann, A., Knekties, J., Egler, C. Selection process generating peptide aptamers and analysis of their binding to the TiO2 surface of a surface acoustic wave sensor. Acta Biomaterialia. 5, (2), 794-800 (2009).
  28. Gitelman, A., Rapaport, H. Bifunctional designed peptides induce mineralization and binding to TiO2. Langmuir. 30, (16), 4716-4724 (2014).
  29. Tada, S., Timucin, E., Kitajima, T., Sezerman, O. U., Ito, Y. Direct in vitro selection of titanium-binding epidermal growth factor. Biomaterials. 35, (11), 3497-3503 (2014).
  30. Micksch, T., Liebelt, N., Scharnweber, D., Schwenzer, B. Investigation of the peptide adsorption on ZrO2, TiZr, and TiO2 surfaces as a method for surface modification. ACS Applied Materials and Interfaces. 6, (10), 7408-7416 (2014).
  31. Limo, M. J., Perry, C. C., Thyparambil, A. A., Wei, Y., Latour, R. A. Experimental Characterization of Peptide-Surface Interactions. Bio-Inspired Nanotechnology: From Surface Analysis to Applications. 37-94 (2013).
  32. Draczkowski, P., Matosiuk, D., Jozwiak, K. Isothermal titration calorimetry in membrane protein research. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 87, 313-325 (2014).
  33. Omanovic-Miklicanin, E., Manfield, I., Wilkins, T. Application of isothermal titration calorimetry in evaluation of protein-nanoparticle interactions. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 127, 605-613 (2017).
  34. Jing, X., et al. Interaction of peptidomimetics with bilayer membranes: Biophysical characterization and cellular uptake. Langmuir. 28, (11), 5167-5175 (2012).
  35. Mizuguchi, C., et al. Effect of phosphatidylserine and cholesterol on membrane-mediated fibril formation by the N-terminal amyloidogenic fragment of apolipoprotein A-I. Scientific Reports. 8, (1), 5497 (2018).
  36. Bisker, G., et al. Insulin Detection Using a Corona Phase Molecular Recognition Site on Single-Walled Carbon Nanotubes. ACS Sensors. 3, (2), 367-377 (2018).
  37. Singh, N., Husson, S. M. Adsorption thermodynamics of short-chain peptides on charged and uncharged nanothin polymer films. Langmuir. 22, (20), 8443-8451 (2006).
  38. Seker, U. O. S., et al. Thermodynamics of engineered gold binding peptides: Establishing the structure-activity relationships. Biomacromolecules. 15, (7), 2369-2377 (2014).
  39. Beutner, R., Michael, J., Schwenzer, B., Scharnweber, D. Biological nano-functionalization of titanium-based biomaterial surfaces: A flexible toolbox. Journal of the Royal Society Interface. 7, (Suppl 1), S93-S105 (2010).
  40. Sultan, A. M., et al. Aqueous Peptide-TiO2 Interfaces: Isoenergetic Binding via Either Entropically or Enthalpically Driven Mechanisms. ACS Applied Materials and Interfaces. 8, (28), 18620-18630 (2016).
  41. Teichroeb, J. H., Forrest, J. A., Jones, L. W., Chan, J., Dalton, K. Quartz crystal microbalance study of protein adsorption kinetics on poly(2-hydroxyethyl methacrylate). Journal of Colloid and Interface Science. 325, (1), 157-164 (2008).
  42. Lok, B. K., Cheng, Y. L., Robertson, C. R. Protein adsorption on crosslinked polydimethylsiloxane using total internal reflection fluorescence. Journal of Colloid And Interface Science. 91, (1), 104-116 (1983).
  43. Nakanishi, K., Sakiyama, T., Imamura, K. On the Adsorption of Proteins on Solid Surfaces, a Common but Very Complicated Phenomenon. Journal of Bioscience and Bioengineering. 91, (3), 233-244 (2001).
  44. Roddick-Lanzilotta, A. D., Connor, P. A., McQuillan, A. J. An In Situ Infrared Spectroscopic Study of the Adsorption of Lysine to TiO2 from an Aqueous Solution. Langmuir. 14, 6479-6484 (1998).
  45. Roddick-Lanzilotta, A. D., McQuillan, A. J. An in situ infrared spectroscopic investigation of lysine peptide and polylysine adsorption to TiO2 from aqueous solutions. Journal of Colloid and Interface Science. 217, (1), 194-202 (1999).
  46. Roddick-Lanzilotta, A., McQuillan, A. An in situ infrared spectroscopic study of glutamic acid and of aspartic acid adsorbed on TiO2: implications for the biocompatibility of titanium. Journal of Colloid and Interface Science. 227, (1), 48-54 (2000).
  47. Chan, B. M. C., Brash, J. L. Adsorption of fibrinogen on glass: reversibility aspects. Journal of Colloid And Interface Science. 82, (1), 217-225 (1981).
  48. van Enckevort, H. J., Dass, D. V., Langdon, A. G. The adsorption of bovine serum albumin at the stainless-steel/aqueous solution interface. Journal of Colloid And Interface Science. 98, (1), 138-143 (1984).
  49. Arnebrant, T., Nylander, T. Sequential and competitive adsorption of β-lactoglobulin and κ-casein on metal surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 111, (2), 529-533 (1986).
  50. Van Dulm, P., Norde, W. The adsorption of human plasma albumin on solid surfaces, with special attention to the kinetic aspects. Journal of Colloid And Interface Science. 91, (1), 248-255 (1983).
  51. Gonçalves, T. Fluorescent labeling of biomolecules with organic probes. Chemical Reviews. 109, (1), 190-212 (2009).
  52. Roth, K. D. W., Huang, Z. H., Sadagopan, N., Watson, J. T. Charge derivatization of peptides for analysis by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 17, (4), 255-274 (1998).
  53. AppliChem, P. Safety Data Sheet According to Regulation (EU) 830/2015 3317 Trifluoroacetic Acid. http://pub.panreac.com/msds/ing/3317.htm 112 (2018).
  54. Heinrikson, R. L., Meredith, S. C. Amino acid analysis by reverse-phase high-performance liquid chromatography: Precolumn derivatization with phenylisothiocyanate. Analytical Biochemistry. 136, (1), 65-74 (1984).
  55. Shchelokov, A., et al. Adsorption of Native Amino Acids on Nanocrystalline TiO2: Physical Chemistry, QSPR, and Theoretical Modeling. Langmuir. 35, (2), 538-550 (2019).
  56. Fair, B. D., Jamieson, A. M. Studies of Protein Adsorption on Polystyrene Latex Surfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 77, (2), 525-534 (1980).
  57. Kim, J. C., Lund, D. B. Adsorption behavior of p-lactoglobulin onto stainless steel surfaces. Journal of Food Processing and Preservation. 21, (607), 303-317 (1997).
  58. Kondo, A., Oku, S., Murakami, F., Higashitani, K. Conformational changes in protein molecules upon adsorption on ultrafine particles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 1, 197-201 (1993).
  59. Itoh, H., Nagai, T., Saeki, T., Sakiyama, T., Nakanishi, K. Adsorption of Protein onto Stainless Steel Particle Surface and its Desorption Behavior. Developments in Food Engineering. 811-813 (1994).
  60. Itoh, H., Nagata, A., Toyomasu, T., Sakiyama, T., Nagai, T. Adsorption of β-Lactoglobulin onto the Surface of Stainless Steel Particles. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 59, (9), 1648-1651 (1995).
  61. Mudunkotuwa, I. A., Grassian, V. H. Histidine adsorption on TiO2 nanoparticles: An integrated spectroscopic, thermodynamic, and molecular-based approach toward understanding nano-bio interactions. Langmuir. 30, 8751-8760 (2014).
  62. Pászti, Z., Guczi, L. Amino acid adsorption on hydrophilic TiO2: A sum frequency generation vibrational spectroscopy study. Vibrational Spectroscopy. 50, (1), 48-56 (2009).
  63. Costa, D., Savio, L., Pradier, C. M. Adsorption of Amino Acids and Peptides on Metal and Oxide Surfaces in Water Environment: A Synthetic and Prospective Review. Journal of Physical Chemistry B. 120, (29), 7039-7052 (2016).
  64. Kosmulski, M. The significance of the difference in the point of zero charge between rutile and anatase. Advances in Colloid and Interface Science. 99, (3), 255-264 (2002).
  65. Kandegedara, A., Rorabacher, D. B. Noncomplexing tertiary amines as "better" buffers covering the range of pH 3-11. Temperature dependence of their acid dissociation constants. Analytical Chemistry. 71, (15), 3140-3144 (1999).
  66. Susumu, O., Teruaki, A., Koichi, T. The Adsorption of Basic a-Amino Acids in an Aqeous Solution by Titanium(IV) Oxide. Bulletin of the Chemical Society of Japan. 54, 1595-1599 (1981).
Studie van korte peptide adsorptie op oplossing verspreidanannnanodeeltjes met behulp van uitputting methode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).More

Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter