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Chemistry

Étude de l’adsorption à court peptide sur la solution dispersées nanoparticules inorganiques en utilisant la méthode d’épuisement

Published: April 11, 2020 doi: 10.3791/60526
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Nanotechnology Education and Research Center, South Ural State University, 2Laboratory of Computational Modelling of Drugs, South Ural State University

Summary

La première étape dans la compréhension de l’interaction de phase solide biomolécule-inorganique est de révéler des constantes physicochimiques fondamentales qui peuvent être évaluées en établissant des isothermes d’adsorption. L’adsorption de la phase liquide est limitée par la cinétique, la capacité de surface, le pH et l’adsorption concurrentielle, qui doivent tous être prudemment considérés avant de définir une expérience d’adsorption.

Abstract

Les principes fondamentaux des interactions inorganiques et biologiques sont d’une importance cruciale dans la découverte et le développement de nouvelles biointerfaces qui peuvent être utilisées en biotechnologie et en médecine. Des études récentes indiquent que les protéines interagissent avec les surfaces par l’intermédiaire de sites d’adsorption limités. Des fragments de protéines tels que les acides aminés et les peptides peuvent être utilisés pour la modélisation d’interaction entre les macromolécules biologiques complexes et les surfaces inorganiques. Au cours des trois dernières décennies, de nombreuses méthodes valides et sensibles ont été développées pour mesurer les principes fondamentaux de la chimie physique de ces interactions : calorimétrie de titration isothermale (ITC), résonance plasmone de surface (SPR), microbalance de cristal de quartz (QCM), fluorescence totale de réflexion interne (TIRF) et spectroscopie totale atténuée de réflectance (ATR).

La technique la plus simple et la plus abordable pour la mesure de l’adsorption est la méthode d’épuisement, où le changement de concentration de sorbate (épuisement) après le contact avec le sorbent dispersé par la solution est calculé et supposé être adsorbed. Les isothermes d’adsorption basés sur les données d’épuisement fournissent toutes les données physicochimiques de base. Cependant, l’adsorption des solutions nécessite des temps d’équilibre plus longs en raison de restrictions cinétiques et de sorbents avec une surface spécifique élevée, ce qui le rend presque inapplicable aux surfaces fixes macroscopiques de plan. En outre, des facteurs tels que l’instabilité du sols, les agrégats de nanoparticules, la cristallinité sorbente, la distribution de la taille des nanoparticules, le pH de la solution et la concurrence pour l’adsorption, devraient être pris en considération lors de l’étude des peptides adsorbing. La construction d’isotherm de données d’épuisement fournit des données complètes de chimie physique pour littéralement chaque sorbate soluble mais reste la méthodologie la plus accessible, car elle ne nécessite pas de configurations coûteuses. Cet article décrit un protocole de base pour l’étude expérimentale de l’adsorption peptide sur l’oxyde inorganique et couvre tous les points critiques qui affectent le processus.

Introduction

Au cours des 50 dernières années, l’interaction entre les surfaces inorganiques et les peptides a attiré beaucoup d’attention en raison de sa grande importance dans la science des matériaux et la médecine. La recherche biomédicale est axée sur la compatibilité et la stabilité des surfaces bioinorganiques, qui ont des implications directes pour la médecine régénérative, l’ingénierie tissulaire1,2,3, et l’implantation4,5,6,7. Les dispositifs bioresponsifs contemporains, tels que les capteurs et les actionneurs, sont basés sur des protéines fonctionnelles immobilisées sur les surfaces semi-supraconductrices d’oxyde8,9,10,11,12,13. Les pratiques modernes de purification de la production de protéines reposent souvent sur des propriétés d’interaction de biomolécule dans la purification et la séparation en aval14.

Parmi les oxydes inorganiques multiples, le dioxyde de titane reste le plus utilisé en combinaison avec des substrats biologiquement pertinents15,16. La recherche dans le domaine des biointerfaces basées sur TiO2s’est concentrée sur l’établissement d’une liaison forte et spécifique des protéines et des peptides sans changer leurs propriétés biologiques et structurelles. En fin de compte, l’objectif principal est une couche de haute densité de surface de biomolécules avec une grande stabilité et une fonctionnalité accrue qui fera progresser la création d’applications biotechnologiques et médicales basées sur le titane17.

Le titane et ses alliages ont été largement utilisés comme un matériau d’implant chirurgical pendant au moins six décennies parce qu’une couche TiO2 de surface avec une épaisseur de quelques nanomètres est résistante à la corrosion et présente un niveau élevé de biocompatibilité dans de nombreuses applications in vivo18,19,20. Le dioxyde de titane est également largement considéré comme un substrat inorganique produit dans la biominéralisation, où la nucléation et la croissance en phase inorganique accompagnées de protéines et de peptides peuvent fournir des matériaux avec des propriétés catalytiques et optiques prometteuses21,22,23,24.

Compte tenu de la grande pertinence de l’interaction entre les matériaux inorganiques et les biomolécules en général et les interactions protéines-TiO2 en particulier, il ya eu beaucoup de recherches pour aborder la manipulation et le contrôle de l’adsorption des protéines sur TiO2. En raison de ces études, certaines propriétés fondamentales de cette interaction ont été révélées, telles que la cinétique adsorption, la couverture de surface, et la conformation de biomolécule, donnant un soutien substantiel pour d’autres progrès dans les biointerfaces5,13.

Cependant, la complexité des protéines ajoute des restrictions considérables sur la détermination et la compréhension complètes de l’interaction moléculaire d’une protéine avec les surfaces inorganiques. En supposant que les biomolécules interagissent avec les surfaces inorganiques à travers des sites limités, certaines protéines avec des structures connues et des séquences d’acides aminés ont été réduites à leurs composants -peptides et acides aminés- qui sont étudiés séparément. Certains de ces peptides ont démontré une activité significative, ce qui en fait un sujet unique d’études adsorption sans avoir besoin de séparation de protéinesprécédentes 25,26,27,28,29,30.

La caractérisation quantitative de l’adsorption peptide sur TiO2 ou d’autres surfaces inorganiques peut être accomplie au moyen de méthodes physiques qui ont été adaptées spécifiquement pour les biomolécules au cours des dernières décennies. Ces méthodes comprennent la calorimétrie de titration isothermale (ITC), la résonance plasmone de surface (SPR), le microbalance cristalline de quartz (QCM), la fluorescence interne totale de réflexion (TIRF), et la spectroscopie totale de réflectance atténuée (ATR), qui permettent la détection de la force d’adsorption en fournissant des données thermodynamiques clés : La constante de liaison, Gibbs énergie libre, enthalpy, et entropy31.

L’adsorption des biomolécules au matériau inorganique peut être accomplie de deux façons : 1) ITC ainsi que la méthode d’épuisement emploient des particules dispersées dans une solution liant aux surfaces macroscopiques fixes ; 2) SPR, QCM, TIRF et ATR utilisent des surfaces macroscopiques modifiées avec du matériau inorganique, comme des copeaux de verre ou de métal enduits d’or, des cristaux de quartz, des cristaux de sulfure de zinc et des puces PMMA, respectivement.

La calorimétrie de titration isothermale (ITC) est une méthode physique sans étiquette qui mesure la chaleur produite ou consommée lors de la titration de solutions ou de mélanges hétérogénées. Les cellules calorimétriques sensibles détectent des effets de chaleur aussi petits que 100 nanojoules, ce qui rend possible la mesure de la chaleur de l’adsorption sur les surfaces nanoparticules. Comportement thermique du sorbate lors de l’addition continue- titration, fournit un profil thermodynamique complet de l’interaction révélant enthalpie, contraignant constant, et l’entropie à une température donnée32,33,34,35,36.

La spectroscopie de résonance de plasmon de surface (SPR) est une technique optique sensible à la surface basée sur la mesure de l’index réfractiv du support à proximité de la surface étudiée. Il s’agit d’une méthode en temps réel et sans étiquette pour surveiller l’adsorption réversible et l’épaisseur de la couche adsorbed. La constante contraignante peut être calculée à partir de l’association et des taux de dissociation. Les expériences d’adsorption réalisées à des températures différentes peuvent fournir des informations sur la dépendance à la température de l’énergie d’activation et séquentiellement d’autres paramètres thermodynamiques37,38,39.

La méthode de microbalance cristal (QCM) de quartz mesure le changement dans la fréquence oscillante des cristaux piézoélectriques pendant les processus d’adsorption et de desorption. La constante de liaison peut être évaluée à partir du rapport des constantes de taux d’adsorption et de desorption. QCM est utilisé pour les mesures de masse relatives et, par conséquent, n’a pas besoin d’étalonnage25,27,40. QCM est utilisé pour l’adsorption à partir de gaz et de liquide. La technique liquide permet à QCM d’être utilisé comme outil d’analyse pour décrire les dépôts sur les surfaces différentes modifiées41.

La fluorescence interne totale de réflexion (TIRF) est une technique interfaciale optique sensible basée sur la mesure de la fluorescence des fluorophores adsorbés excités avec des ondes évanescentes réfléchies en interne. La méthode permet la détection de molécules fluorescentes recouvrant la surface d’épaisseurs de l’ordre de dizaines de nanomètres, c’est pourquoi il est utilisé dans l’étude de l’adsorption macromoléculaire sur diverses surfaces42,43. La surveillance in situ de la dynamique de fluorescence sur l’adsorption et la desorption fournissent la cinétique adsorption et donc les données thermodynamiques42,43.

Roddick-Lanzilotta a utilisé la réflectance totale atténuée (ATR) pour établir des isothermes d’adsorption lysine basés sur les bandes spectrales lysines à 1 600 et 1 525 cm-1. C’est la première fois que la constante de liaison pour un peptide sur TiO2 a été déterminée à l’aide d’une méthode infrarouge in situ44. Cette technique a été efficace dans l’établissement d’isothermes adsorption pour les peptides polylysine45 et acides aminés acides46.

Contrairement aux méthodes susmentionnées, où le paramètre d’adsorption est mesuré in situ, dans une expérience conventionnelle, la quantité de biomolécules adsorbed est mesurée par le changement de concentration après que la surface a contacté la solution. Parce que la concentration d’un sorbate se désintègre dans une grande majorité des cas d’adsorption, cette méthode est appelée méthode d’épuisement. Les mesures de concentration nécessitent un essai analytique validé, qui peut être basé sur une propriété analytique intrinsèque du sorbate ou basé sur l’étiquetage47,48,49,50 ou la dérivatisation51,52 de celui-ci.

Les expériences d’adsorption utilisant QCM, SPR, TIRF ou ATR nécessitent une préparation spéciale de surface des puces et des capteurs utilisés pour les études d’adsorption. Les surfaces préparées doivent être utilisées une fois et nécessitent un changement lors de la commutation de l’adsorbate, en raison de l’hydratation inévitable de la surface d’oxyde ou de la chemisorption possible d’un sorbate. Un seul échantillon à la fois peut être exécuté à l’aide d’ITC, QCM, SPR, TIRF ou ATR, alors que dans la méthode d’épuisement on peut exécuter des dizaines d’échantillons, pour lesquels la quantité n’est limitée que par la capacité du thermostat et la disponibilité sorbente. Ceci est particulièrement important lors du traitement de grands lots d’échantillons ou de bibliothèques de molécules bioactives. Fait important, la méthode d’épuisement ne nécessite pas d’équipement coûteux, mais uniquement un thermostat.

Cependant, malgré ses avantages évidents, la méthode d’épuisement exige des caractéristiques procédurales complexes qui peuvent sembler lourdes. Cet article présente comment effectuer une étude physicochimique complète de l’adsorption dipeptide sur TiO2 en utilisant la méthode d’épuisement et aborde les questions que les chercheurs peuvent faire face lors de l’exécution d’expériences pertinentes.

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Protocol

1. Préparation de solutions de stock dipeptide et dilions

  1. Préparation d’une solution de dipeptide de 16 mM
    1. Placer 0,183 g d’un dipeptide (Ile-His) (voir Tableau des matériaux)dans un tube à essai polymère stérile, diluer à 35 ml avec de l’eau à double distillation (DDW), et dissoudre à température ambiante (RT) sous une agitation vigoureuse.
      REMARQUE : Si le dipeptide ne se dissout pas dans DDW en remuant, placez la solution de dipeptide dans un bain à ultrasons et sonicate pendant quelques minutes.
    2. Préparer une solution de 50 mM de tampon d’acide éthanesulfonique (MES) de 2 m()endissolvant 0,533 g d’acide éthanesulfonique sec de 2m(n)dans50 ml de DDW dans le tube à essai stérile. Préparer une solution d’hydroxyde de sodium de 50 mM en dissolvant 200 mg d’hydroxyde de sodium dans 100 ml de DDW.
    3. Ajuster le pH de la solution de dipeptide prédissolée à 7,4 en ajoutant soigneusement (titration microliter) 50 mM MES, ou 50 mm d’hydroxyde de sodium à la solution de dipeptide de 16 mM, en remuant à RT et en surveillant le pH avec un compteur de pH. Après ajustement du pH, versez la solution dans un cylindre de mesure, rincez le tube à essai et remplissez le cylindre de mesure avec DDW à 40 mL pour faire une concentration finale de 16 mM.
  2. Préparation des dilutions de dipeptide à partir d’une solution de stock de 16 mM
    1. Préparer les dilutions peptide avec des concentrations comprises entre 0,4 et 12,0 mM en diluer la solution de dipeptide de 16 mM avec DDW. Par exemple, afin de préparer une solution de dipeptide de 8 mM, ajoutez 7 ml de DDW à 10 ml de la solution de dipeptide de 16 mM. Après dilution, ajustez le pH à 7,4 en ajoutant 50 mM MES ou 50 mM NaOH goutte par goutte à la solution dipeptide (voir étape 1.1.3). Après ajustement du pH, versez la solution dans un cylindre de mesure, rincez le tube à essai et remplissez le cylindre de mesure jusqu’à 20 ml avec DDW pour faire la concentration de dipeptide 8 mM.
      REMARQUE : D’autres dilutions de 16 mM de solution de stock de dipeptide avec des concentrations de 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0, 3,0, 4,0, 8,0 et 12,0 mM, sont préparées conformément à la figure 1. L’ajustement de chaque solution de dipeptide pH à 7.4 est décrit dans l’étape 1.1.3.

2. Préparation de titania sol

  1. Préparer une solution de 10 mM de tampon MES en dissolvant 1,066 g de MES dans 500 mL de DDW. Ajuster le pH à 7,4 avec de l’hydroxyde de sodium sec en remuant et en surveillant le pH avec le compteur de pH.
  2. Broyer 200 mg de nanocrystalline TiO2 dans un mortier pendant au moins 5 min (voir Tableau des matériaux).
  3. Peser 40 mg des nanoparticules de dioxyde de titane moulu dans un flacon de laboratoire. Placez le flacon dans le bain de sonication (voir Tableau des matériaux)à l’aide du support de laboratoire.
  4. Ajouter 20 ml de tampon MES de 10 mM dans le flacon avec TiO2 et sonicate dans un bain à ultrasons (5 L, 40 kHz, 120 W) pendant 20 min.

3. Mélange et thermostating

  1. Réglez le thermostat (voir tableau des matériaux)aux températures souhaitées (c.-à-d., 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 ou 40,00 oC).
  2. Ajoutez 1 ml de sol sonore de TiO2 aux flacons d’adsorption marqués. Placez les flacons d’adsorption marqués contre la dilution correspondante du dipeptide dans un dispositif de flottaison de fortune en mousse de polystyrène extrudée. Placez le dispositif de flottaison avec les flacons marqués et les dilutions correspondantes de dipeptide dans le thermostat pendant au moins 5 min.
  3. Ajoutez 1 ml de chaque dilution dipeptide à la fiole d’adsorption marquée correspondante, en veillant à ce que toutes les solutions de mélange aient la même température. Maintenez la série d’échantillons d’adsorption obtenus sur le thermostat à 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 ou 40,00 oC pendant 24 h pour atteindre l’équilibre adsorption.
    REMARQUE : Secouez prudemment tous les échantillons de dispersions obtenues avant de les mettre dans le thermostat.
  4. Mélangez occasionnellement les dispersions TiO2 en les secouant manuellement pendant le thermostatage.

4. Filtration des échantillons thermostatés

  1. Afin d’éviter la rééquilibration induite par la température, retirez un échantillon à la fois du thermostat pour filtration.
  2. Prenez un échantillon de la solution dipeptide de chaque flacon de verre avec une seringue, à travers une aiguille de seringue. Retirer l’aiguille de la seringue et mettre le filtre à seringue (voir tableau des matériaux)pour filtrer la solution de dipeptide dans la fiole de verre. Répétez la filtration avec les autres échantillons.
  3. Analyser le filtrate conformément à l’article 5.
    REMARQUE : Ne pas centrifuger les échantillons, car cela prend quelques minutes et peut provoquer un changement dans l’équilibre de concentration.

5. Dérivatisation et analyse HPLC

  1. Faire une solution de 50 ml d’acide trifluoroacetic (TFA) en acétyronique. Ajouter 0,34 mL de TFA dans le cylindre de mesure et ajuster le volume de la solution à 50 ml avec acétonitrile à RT.
    CAUTION : Travailler avec TFA sous une hotte de fumée avec ventilation d’échappement, parce que l’acide trifluoroacetic est nocif une fois inhalé, cause des brûlures graves de peau, et est toxique pour les organismes aquatiques même à de faibles concentrations53.
  2. Préparer la solution de dérivatisation (c.-à-d. Edman réactif54) en plaçant 299 L d’isothiocyanate de phényl et 347 l de triethylamine dans un cylindre gradué et en ajustant le volume de la solution à 50 ml avec acetonitrile à RT.
  3. Avant l’analyse de la chromatographie liquide haute performance (HPLC), dérivaisez les échantillons avec le réactif d’Edman dans les flacons de chromatographie. Mélanger 400 l’échantillon avec 400 l de réactif d’Edman. Chauffer l’échantillon à 60 oC pendant 15 min. Après le chauffage, neutralisez l’échantillon avec 225 L de la solution TFA et attendez quelques minutes pour refroidir l’échantillon à RT.
  4. Utilisez l’analyse HPLC (voir Tableau des matériaux) pour déterminer la concentration de la solution dipeptide avant et après l’adsorption. Placez les flacons de chromatographie avec les solutions analysées dans l’autosampler HPLC et commencez à analyser les échantillons avec les conditions nécessaires, qui sont définies par le logiciel (voir Tableau des matériaux).
    REMARQUE : La phase mobile se compose de 0,1 % de TFA dans l’eau déionisée et l’acétonitrile pur, avec des gradients d’acécononitrile de 20-90% à 286 nm pendant 13 min. Analyser chaque échantillon en triplicate. Mesurer la concentration de la solution dipeptide à l’aide de la courbe d’étalonnage précédemment établie(figure 2). Pour les spécifications de chromatographie voir Shchelokov et al.55.

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Representative Results

L’adsorption d’un dipeptide sur le dioxyde de titane nanocrystalline a été étudiée dans les conditions biocompatibles dans une plage de température de 0 à 40 oC. L’adsorption expérimentale de dipeptide (A, mmol/g) à la surface d’un dioxyde de titane a été évaluée

Lorsque C0 et Ce sont les concentrations de démarrage et d’équilibre du dipeptide en millimoles, respectivement; V est le volume d’une solution dipeptide en litres; et m est le poids du sorbent en grammes.

Les mesures de l’adsorption dipeptide étaient des données traitées à l’aide du modèle Henry. Ce modèle isotherm suppose l’adsorption à des concentrations relativement faibles avec les molécules de sorbate isolées les unes des autres sur une surface sorbente et convient à la description des données expérimentales(figure 3). Notez, cependant, que ce modèle ne peut être appliqué que dans le cas de l’adsorption réversible, qui doit être confirmée ainsi. La spectroscopie IR du matériau rincé plusieurs fois est adaptée à cette fin. Les montants de peptide d’équilibre obtenus sur le TiO2 et la solution sont liées conformément à l’équation linéaire :

où KH est la constante d’adsorption d’Henry.

L’équilibre contraignant constant KH a été obtenu à partir de la pente de la dépendance de l’adsorption dipeptide (A) sur la concentration d’équilibre dipeptide (Ce). L’énergie libre Gibbs standard(G, kJ/mol) pour chaque température T a été déterminée par l’équation Van’t Hoff :

où R est la constante de gaz idéale dans J/molK, et T est la température du processus d’adsorption dans Kelvin.

Dipeptide Gibbs énergies libres déterminées à chaque température (figure 4) a révélé enthalpy (H) comme une interception de la régression linéaire avec l’axe. La variable de régression, l’entropie du processus,a été dérivée de l’équation fondamentale :

Les valeurs calculées de la constante de liaison d’équilibre (KH), l’énergie Standard Gibbs (G), enthalpy(H ), et l’entropie ( ' ' ' ' ' ' '' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Table 1

Figure 1
Figure 1 : Dilution de la solution de stock de dipeptide de 16 mM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Courbe d’étalonnage à différentes concentrations de dipeptide. Les concentrations de dipeptide se sont élevées entre 0,4 et 16,0 mM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Les isorptions d’adsorption dipeptide calculées par le modèle Henry pour chaque température. Dipeptide adsorption isotherms à (A) 0 'C (B) 10'C( C ) 20 'C (D) 30 'C, et (E) 40 'C, respectivement. Les coefficients de corrélation calculés (R2) sont tombés dans une fourchette de 0,96 à 0,99 pour tous les isothermes du modèle Henry obtenus. Les barres d’erreur représentent l’intervalle de confiance de 95 % pour chaque concentration d’échantillon mesurée en triplicate. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Dépendance de l’énergie standard Gibbs libre de l’adsorption dipeptide sur la température. Les barres d’erreur représentent l’intervalle de confiance de 95 % pour l’énergie libre Gibbs comme mesure indirecte basée sur Henry Model. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

T, K KH G0, kJ/mol H0, kJ/mol S0, kJ/mol K
273.15 0,32 à 0,01 2,6 à 0,0 - 41 à 9 - 0,16 à 0,03
283.15 0,25 à 0,01 3,2 à 0,1
293.15 0,17 à 0,06 4,3 à 0,9
303.15 0.050 à 0.002 7,6 à 0,1
313.15 0.037 à 0.002 8,3 à 0,1

Tableau 1 : Paramètres thermodynamiques de l’adsorption dipeptide.

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Discussion

L’adsorption des solutions pour la construction d’isotherm nécessite un temps plus long pour l’équilibre dû aux restrictions cinétiques et aux sorbents avec une surface spécifique élevée. En outre, l’instabilité du sols, les agrégats de nanoparticules, la cristallinité, la distribution de la taille des nanoparticules, le pH de la solution et la concurrence pour l’adsorption devraient être envisagées lors de l’adsorbing des acides aminés. Cependant, la construction d’isotherm adsorption utilisant la méthode d’épuisement reste la méthodologie la plus disponible, parce qu’elle ne nécessite pas de configurations coûteuses, et pourtant elle fournit des données exhaustives de chimie physique pour littéralement chaque sorbate soluble.

Il faut faire une distinction entre les modes d’adsorption (c’est-à-dire les particules dispersées de solution ou sur une surface fixe) lorsqu’un matériau cristallin est utilisé comme sorbent. Il faut s’attendre à une différence substantielle dans la distribution des visages cristallins sur les surfaces macroscopiquement plates et sur les particules. Les paramètres thermodynamiques résultant déterminés à partir de l’adsorption des peptides sur les nanoparticules peuvent ne pas correspondre aux paramètres thermodynamiques de l’adsorption peptide aux surfaces macroscopiquement plates.

La quantité moyenne de peptides adsorbed sur les surfaces inorganiques est extrêmement faible. À température ambiante, cette valeur est d’environ plusieurs centaines de microgrammes par mètre carré28. Cette petite quantité d’adsorbate nécessite des méthodes de mesure précises et des solides avec des surfaces bien développées. Par conséquent, les petites substances de particules avec une grande surface spécifique (des centaines de mètres carrés) devraient être employées pour des expériences d’adsorption43,56,57,58,59,60.

Les peptides sont, comme les protéines, instables, et conservent leur fonctionnalité à une gamme étroite de conditions. Des expériences d’adsorption ont été réalisées sur du dioxyde de titane nanocrystalline à des températures biocompatibles de 0 c à 40 oC (273,15 K-313,15 K), qui sont semblables à celles d’un organisme vivant normal et fonctionnel. L’adsorption à des températures plus élevées ou plus basses n’est pas pertinente et ne devrait pas être considérée pour l’expérience.

Les composés biologiquement actifs multifonctionnels présentent également une forte sensibilité au pH des médias, car il affecte la charge de surface et donc les interactions Coulomb entre les groupes fonctionnels chargés61,62,63. La charge sorbente des matériaux d’oxyde est également pH-dépendante en raison de l’échange actif de proton à la surface hydratée64. Afin d’établir des conditions stables pH pour l’utilisation d’équilibre adsorption d’un tampon est nécessaire. Dans cette étude, tampon MES est utilisé pour sa propriété non coordonnée65, de sorte qu’il ne serait pas en concurrence avec le peptide pour l’adsorption sur la surface de l’oxyde de métal, contrairement aux tampons de phosphate66.

Ce test récent d’adsorption d’acide aminé montre que le principal site de liaison sur le nanoparticule est le défaut de surface55. La distribution de défauts sur la surface est l’une des caractéristiques les moins contrôlables des substrats de nanocristalline, d’où l’on devrait utiliser le sorbent du même lot afin de maintenir la cohérence dans les études d’adsorption.

QCM, résonance plasmon, et ITC sont des méthodes authentiques avec une sensibilité subtile que dans une combinaison de méthodes spectroscopiques révèlent des particularités structurelles de l’adsorbate pendant l’interaction avec la surface. Cependant, ils ne surmontent pas les restrictions cinétiques et nécessitent encore beaucoup de temps pour atteindre l’équilibre adsorption. De plus, un seul échantillon à la fois peut être traité, ce qui rend l’analyse des échantillons de lots difficile. D’autre part, la méthode d’épuisement présentée est simple et seulement limitée à la capacité de thermostat, ce qui rend le traitement d’un grand nombre d’échantillons possible.

Les échantillons thermostatés doivent être filtrés dès qu’ils sont retirés du thermostat afin d’éviter l’équilibre induit par la température. Bien que l’équilibre à une nouvelle température peut prendre jusqu’à quelques heures, garder les échantillons d’adsorption à une température différente devrait être réduit au minimum. La centrifugation des échantillons pour la séparation supernatante n’est pas non plus recommandée, car elle prend jusqu’à quelques minutes et peut provoquer un changement dans l’équilibre de concentration. Le choix du matériau de filtre dépend de la nature sorbate et devrait réduire la liaison filtre possible pour la récupération maximale. Il est préférable de suivre les instructions et les recommandations des fournisseurs lors du choix de filtres spécifiques.

En outre, il faut garder à l’esprit que le changement de concentration dans les études d’adsorption devrait être surveillé à l’aide de la méthode de quantification validée à l’aide de la spectrométrie de masse, la radio-spectroscopie, ou spectroscopie UV-visible. L’analyse est facile si l’adsorbate est spectroscopiquement actif, sinon un étiquetage ou une dérivatisation supplémentaire de l’adsorbate est nécessaire.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation russe pour la recherche fondamentale (Subvention no 15-03-07834-a).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid TCI Chemicals 4432-31-9 MES, >98%
Acetonitrile Panreac AppliChem HPLC grade
Chromatography vials glass
Dipeptide Ile-His Bachem 4000894
Double-distilled water DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" J.P. Selecta 3000865 5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector Shimadzu, LC-20 Prominence HPLC
Isopropanol Sigma-Aldrich (Merck) 67-63-0 99.70%
LabSolutions Lite Shimadzu 223-60410 Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2 Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate Acros Organics 103-72-0 PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column ZORBAX LC 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter Vladfilter 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube polypropylene
Thermostat TC-502 Brookfield Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine Sigma-Aldrich (Merck) 121-44-8 TEA; 99%
Trifluoroacetic acid Panreac AppliChem 163317 TFA, 99%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Chimie Numéro 158 dioxyde de titane anatase nanoparticules peptide adsorption modèle adsorption
Étude de l’adsorption à court peptide sur la solution dispersées nanoparticules inorganiques en utilisant la méthode d’épuisement
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Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).

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