Summary
Le moment de l'exposition aux ligands peut avoir une incidence sur leurs conséquences sur le développement. Ici, nous montrons comment la libération d'image d'une protéine morphogène osseuse Drosophila (BMP) appelée Dpp à partir de cellules du disque d'aile.
Abstract
La superfamille transformante du facteur de croissance-bêta (TGF-MD) est essentielle pour le modelage embryonnaire précoce et le développement des structures adultes dans les organismes multicellulaires. La superfamille de TGF-MD comprend le TGF-MD, la protéine morphogénétique osseuse (BMP), les activines, les facteurs de croissance et de différenciation et les nodals. On sait depuis longtemps que la quantité de ligand exposée aux cellules est importante pour ses effets. On pensait que les gradients de concentration à longue portée ont établi un motif embryonnaire. Cependant, récemment, il est devenu clair que le moment de l'exposition à ces ligands est également important pour leurs conséquences transcriptionnelles en aval. Un ligand superfamilial TGF-MD ne peut pas avoir de conséquence sur le développement tant qu'il n'est pas libéré de la cellule dans laquelle il a été produit. Jusqu'à récemment, il était difficile de déterminer quand ces ligands ont été libérés des cellules. Ici, nous montrons comment mesurer la libération d'un BMP Drosophila appelé Decapentaplegic (Dpp) à partir des cellules du primordium de l'aile ou du disque d'aile. Cette méthode pourrait être modifiée pour d'autres systèmes ou ligands de signalisation.
Introduction
Les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) sont essentielles pour l'embryogenèse précoce et le modelage des structures adultes. Les BMP sont produits et sécrétés pour affecter la transcription des gènes cibles nécessaires à la croissance et à la différenciation cellulaire dans les cellules qui répondent. Decapentaplegic (Dpp) est un homolog Drosophila de BMP4 qui est important pour le développement de structures embryonnaires et adultes comme l'aile1,2,3,4. Plusieurs groupes se sont concentrés sur le rôle de Dpp dans le modelage des ailes de mouche adultes parce que 1) les ailes sont composées de deux feuilles d'épithélie transparentes avec un modèle de vénérisation cohérent qui peut être facilement évalué; 2) les disques d'aile sont également raisonnablement plats, peuvent être cultivés en dehors de la larve, et sont simples à imager et quantifier les différences dans le modèle ; et 3) le développement du modèle d'aile est sensible à Dpp de telle sorte que de petites perturbations dans la voie auront un impact sur le modèle de vénation des ailes.
Dpp est produit dans des cellules situées dans la limite antérieure/postérieure du disque d'aile5,6,7,8. Dpp se lie à un complexe de type 1 et de type 2 récepteurs de sérine/thréonine kinase9,10. Sur la liaison Dpp, le récepteur de type 2 phosphoryle le récepteur de type 1 qui phosphorylate ensuite Mothers against Dpp (Mad), un homolog Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recrute un co-Smad supplémentaire (Médée), qui lui permet d'entrer dans le noyau où il régule les gènes cibles, conduisant à des effets en aval tels que la prolifération ou la différenciation4,11.
Récemment, le Laboratoire Bates a montré que la libération incorrecte de Dpp dans le disque d'aile peut conduire à une diminution de la phosphorylation mad, la réduction de l'expression des gènes cibles, et les défauts de modelage des ailes12,13. Plusieurs canaux ioniques ont un impact sur le développement de l'aile Drosophila et des structures associées14,15. Ces canaux ioniques pourraient également être impliqués dans la version Dpp. Pour déterminer le mécanisme de la libération du morphogène, il est important qu'il existe une méthode pour visualiser les événements de libération.
Les Drs Aurelio Teleman et Stephen Cohen ont créé une protéine de fusion Dpp-GFP qui est capable de sauver la perte de Dpp, ce qui signifie qu'elle est biologiquement active et est libérée d'une manière biologiquement pertinente16. Ici, nous décrivons comment nous visualisons les événements de sortie Dpp à l'aide de ce Dpp-GFP. Cette protéine de fusion est particulièrement utile parce que le GFP est sensible au pH de telle sorte que lorsqu'il est dans les vésicules acides, la fluorescence est éteinte17. Par conséquent, lorsqu'une protéine étiquetée avec le GFP est libérée d'une vésicule dans l'environnement extracellulaire plus neutre, l'intensité de fluorescence de GFP augmente17. Nous avons profité de la sensibilité de pH de GFP pour déterminer si Dpp-GFP réside dans les vésicules acides. Nous avons photographié des disques d'aile exprimant Dpp-GFP avant et après l'ajout de chlorure d'ammonium, qui neutralise les vésicules des compartiments intracellulaires18. Nous avons constaté une augmentation significative de la fluorescence de la poncte après l'ajout de chlorure d'ammonium, suggérant que le Dpp-GFP intracellulaire soit éteint avant l'ajout de chlorure d'ammonium18. Nous concluons que le Dpp-GFP intracellulaire réside dans les compartiments membranaires acides, tels que les vésicules, et est non éteint à l'ajout de chlorure d'ammonium pour neutraliser le pH des compartiments intracellulaires18. Cela fait de l'imagerie en direct de Dpp-GFP une technique utile pour visualiser la dynamique de Dpp dans le disque d'aile Drosophila comme il est libéré des compartiments acides dans l'environnement extracellulaire.
Ici, nous décrivons la méthode que nous utilisons pour visualiser les événements de sortie Dpp à l'aide de Dpp-GFP. Dpp-GFP peut être exprimé dans son modèle natif dans les disques d'aile Drosophila en utilisant le système UAS-GAL419. C'est la méthode qui a été utilisée pour déterminer que les canaux Irk impact Dpp communiqué18. Nous avons validé la méthode par des z-stacks en direct.imagerie. Nous ne voyons pas Dpp-GFP puncta se déplacer dans le plan de mise au point dans les séries chronologiques si nous avons acquis dans un plan de mise au point. Nous ne voyons pas non plus le mouvement de Dpp-GFP puncta si nous avons imaginé dans un z-stack. Nous concluons que la puncta dpp-GFP vue utilisant cette méthode sont des événements de libération plutôt que le mouvement des vésicules intracellulaires. Cette méthode d'imagerie en direct de Dpp-GFP pourrait potentiellement être utilisée pour tester d'autres modificateurs putatifs de la libération de Dpp pour leur impact sur la dynamique Dpp ou pourrait être modifiée pour examiner la dynamique d'autres ligands
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Protocol
1. Collecte d'œufs pour générer des larves pour la dissection
- Cross 30-40 femelle vierge Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu vole à 10-15 mâles Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
REMARQUE: Les deux génotypes contenant Dpp-GAL4 et UAS-Dpp-GFP peuvent être utilisés tant que les équilibristes ont des marqueurs larvaires permettant la sélection de la progéniture appropriée pendant l'étape larvaire. - Pour recueillir les œufs, retourner les mouches croisées dans une fiole fraîche de nourriture et leur permettre de pondre pendant 3 à 4 h avant de les retirer de la fiole. Pour encourager la ponte, une petite quantité de pâte de levure faite de levure granulée mélangée à une petite quantité d'eau peut être ajoutée au sommet de la nourriture avant que les mouches ne soient introduites dans le flacon. Le même ensemble de mouches croisées peut être conservé et utilisé jusqu'à 7 jours de collecte d'œufs.
REMARQUE: Toute recette standard d'aliments de semoule de maïs Drosophila devrait être acceptable. Utilisé ici est la recette alimentaire décrite par Hazegh et Reis20. - Maintenez les flacons de collecte d'œufs à 25 oC pendant environ 144 h jusqu'à ce que les larves en soient au troisième stade instar (errance).
- Pour sélectionner les larves appropriées pour la dissection (celles qui expriment à la fois Dpp-GAL4 et UAS-Dpp-GFP) choisissez d'abord les larves qui ne sont pas tb. Ces larves seront de longueur normale plutôt que courtes et grasses.
- Parmi les larves non-Tb, il y aura des larves exprimant CyO-GFP et des larves exprimant Dpp-GFP. Pour sélectionner les larves exprimant le Dpp-GFP, visionnez-les sous un stéréomicroscope à fluorescence. Bien que d'après Dpp-GFP et CyO-GFP exprimant la lurve aura une certaine fluorescence GFP, les larves exprimant Dpp-GFP peuvent être distinguées en ce que le GFP est limité aux disques d'aile et la fluorescence est beaucoup moins brillante que les larves exprimant CyO-GFP. Sélectionnez ces larves moins brillantes pour la dissection.
2. Préparation d'une solution pour l'imagerie larvaire et la dissection
- Pour l'imagerie en direct des disques d'aile, préparer des supports HL3 modifiés21 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,5 mM CaCl2 dyhydrate, 4 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 mM trehalose dyhydrated, 115 mM sucrose, 5 mM HEPES). Ce support permet de garder le disque d'aile en vie pour l'imagerie21.
- Ajuster le pH à 7,1 à l'aide de HEPES et filtrer à l'aide d'un filtre de 0,22 m. Utilisez ce support pour les dissections du disque d'aile et comme support de montage pour l'imagerie en direct.
3. Préparation de diapositives pour le montage du disque d'aile
- Placez deux morceaux de ruban adhésif double face incolore dans le sens de la largeur sur une lame de microscope, laissant un espace d'environ 5 mm entre eux. Les morceaux de ruban adhésif doivent être assez longs pour que les extrémités de la bande se trouvent à ras bord avec les bords de la lame du microscope.
- Utilisez un bord plat (comme l'extrémité de la poignée d'une paire de forceps disséquants) pour appuyer fermement sur le ruban adhésif sur la diapositive afin qu'aucun support ne puisse s'infiltrer en dessous.
- Placer 25 l l de supports HL3 modifiés entre les deux morceaux de ruban adhésif. Le disque d'aile sera monté dans cette goutte de support entre les morceaux de ruban adhésif de sorte que la bande empêche le coverslip d'écraser le disque (Figure 1A).
4. Disséquer et monter des disques d'aile pour l'imagerie
- Disséquer les larves dans le hL3 modifié préparé26.
- Déchirer délicatement les larves en deux à l'aide de deux paires de forceps et jeter la moitié postérieure de la larve.
- Saisissez le milieu de la moitié antérieure de la larve avec une paire de forceps et utilisez une autre paire de forceps fermés pour pousser les crochets de la bouche dans la larve jusqu'à ce que la larve soit complètement inversée.
- Les disques d'aile peuvent être plus facilement trouvés en recherchant les courbures pointues dans les deux branches primaires plus foncées colorées des trachées qui courent en bas des deux côtés des larves. Les disques d'aile se trouvent directement sous ces courbures dans les trachées dans une larve inversée.
- Retirez délicatement les disques d'aile et transférez-les dans les 25 degrés HL3 sur la lame de microscope préparée. Il est important de s'assurer qu'aucun morceau de trachée n'est laissé attaché aux disques d'aile disséqués car cela peut faire flotter les disques, ce qui rend l'imagerie difficile.
- Disposer le disque d'aile de sorte que le côté périipodial de la poche d'aile soit orienté vers le haut loin de la glissière du microscope avec le disque couché à plat (voir Figure 1A,B).
- Couvrir le disque d'aile et le ruban adhésif d'un bordereau et sceller la couverture à l'aide de vernis à ongles. Une fois que le vernis est sec, passez immédiatement aux étapes d'imagerie ci-dessous.
5. Sortie d'imagerie Dpp
- Imagedu le disque monté d'aile utilisant un microscope à balayage de laser confocal avec un objectif d'huile 40x et laser 488 nm. Le Dpp-GFP devrait apparaître comme une bande de fluorescence GFP au centre du disque d'aile avec une petite poncte de Dpp-GFP étant libéré de cette bande centrale de cellules.
- Recueillir des images à une vitesse de 2 Hz pendant 2 min pour visualiser la libération Depp. Pour de meilleurs résultats, réglez le laser à un réglage juste assez fort pour obtenir une image claire des cellules Dpp-libération pour éviter le blanchiment excessive pendant la collecte d'images. Les images peuvent être collectées sous forme de série chronologique qui peut ensuite être exportée sous forme de fichiers AVI (pas de compression, 3 images/s) pour obtenir des fichiers vidéo de la version Dpp.
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Representative Results
La figure 2 montre les résultats représentatifs de ce protocole en imagerie en direct. Lorsque le protocole est réussi, Dpp-GFP peut être considéré comme une bande au centre du disque d'aile avec des noyaux visibles comme des cercles non fluorescents dans la région Dpp-GFP (Figure 2). La libération de Dpp-GFP est visible sous forme de puncte fluorescente qui apparaissent et disparaissent. Nous avons observé la fluorescence de Dpp-GFP apparaissant et disparaissant dans les corps cellulaires et loin des corps cellulaires. La signalisation de Dpp dépend des structures filopodia-like basées sur l'actine appelées cytonemes qui s'étendent loin du corps cellulaire22,23. Par conséquent, il est probable que Dpp-GFP puncta qui sont visualisés loin des corps cellulaires Dpp-production dans ces vidéos présentées sont susceptibles dans les cytonemes ou à cytoneme "synapses"15. Ces ponctuas sont plus apparents près de la limite D/V, ce qui peut être considéré comme l'écart dans la bande Dpp-GFP.
La figure 3 montre un résultat sous-optimal. Dans la méthode décrite ici, les disques d'aile sont montés de sorte que le côté périipodial fait face loin de la glissière du microscope de sorte que le disque est représenté du côté périipodiaque (comme le montre la figure 1B). Si le disque d'aile est représenté du revers, c'est-à-dire du côté périipodiaque vers la lame du microscope, la fluorescence Dpp-GFP apparaîtra hors de mise au point et la résolution sera mauvaise, ce qui se traduira par le résultat sous-optimal montré à la figure 3. L'étape 4.6 est donc essentielle pour s'assurer que le disque d'aile est couché à plat dans la bonne orientation avant l'imagerie pour éviter ce résultat.
La figure 4 montre une série chronologique d'images d'un Dpp-gt;GFP (dpp-GAL4; UAS-GFP) troisième disque d'aile larvaire instar. Lorsque GFP n'est pas fusionné à Dpp, nous n'observons pas l'apparition de puncta en dehors des corps cellulaires. Ce contrôle est important pour la conclusion que Dpp-GFP se comporte différemment de GFP seul.
La figure 5 montre une série chronologique d'images d'un pilote dpp-GAL4 seul troisième disque d'aile larvaire instar. Les images ont été prises avec les mêmes paramètres d'acquisition de microscope que tous les autres échantillons. Ces images montrent que la ponctua fluorescente n'apparaît pas lorsque Dpp-GFP n'est pas exprimé.
Figure 1 : Illustration de la configuration de montage de disque d'aile. Pour imager la version Dpp-GFP, les disques d'aile disséqués doivent être montés comme indiqué. (A) Deux morceaux de ruban adhésif recto-verso sont placés dans le sens de la largeur sur la glissière du microscope avec le disque d'aile monté dans des supports HL3 modifiés entre la bande. (B) Vue latérale d'un disque d'aile correctement monté. Le disque est orienté de sorte que le côté périipodial de la poche d'aile fait face vers le haut vers le couvercle. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Vidéo représentative de la sortie de Dpp-GFP dans le disque d'aile. Dpp-GFP a été exprimé dans le disque d'aile en utilisant le système UAS-GAL4. On voit ici une vidéo représentative des résultats d'imagerie en direct de la version Dpp-GFP. Les noyaux cellulaires peuvent être considérés comme des lacunes circulaires dans la fluorescence. Secretd Dpp-GFP peut être considéré comme une ponctua lumineuse. En raison du contraste, ces puncta lumineuses sont plus faciles à observer en dehors de la région qui comprend les corps cellulaires producteurs de Dpp. Une telle zone est indiquée par un rectangle qui disparaît après les premières images. Les directions ventrales et postérieures du disque d'aile sont indiquées par les flèches. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Figure 3 : Résultat sous-optimal de l'imagerie par libération d'Un Dpp-GFP. Exemple d'un résultat sous-optimal qui se produit si le disque d'aile est orienté côté périipodial face vers le bas. En raison de l'orientation incorrecte de la poche de disque d'aile Dpp-GFP n'est pas au point, les noyaux clairs ne peuvent pas être vus, et la résolution reste pauvre n'importe comment les paramètres du microscope sont ajustés. Les directions ventrales et postérieures du disque d'aile sont indiquées par les flèches. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Figure 4 : Vidéo représentative de l'expression gFP dans les cellules productrices de Dpp du disque d'aile. L'expression gFP apparaît brillamment dans les corps cellulaires et n'apparaît pas comme une poncte brillante libérée dans la périphérie. Les directions ventrales et postérieures du disque d'aile sont indiquées par les flèches. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Figure 5 : Vidéo représentative des disques d'aile dpp-Gal4 troisième instar sans l'expression de Dpp-GFP ou GFP. Si Gal4 ne peut pas conduire l'expression de GFP ou Dpp-GFP en raison de l'absence de UAS-GFP ou UAS-Dpp-GFP, aucune fluorescence n'est observée. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Les BMP tels que Dpp font leur impact significatif quand ils lient un complexe de récepteurs liés de membrane pour causer une cascade de signalisation intracellulaire dans les cellules voisines ou apparemment lointaines. Le laboratoire du Dr Thomas Kornberg a montré que les cellules qui produisent les cellules de contact de signal Dpp qui reçoivent le signal en utilisant des structures minces à base d'actine filapodia appelées cytonemes15,24,25. Ces données suggèrent que la communication de cellules-cellules développementales dans ce contexte puisse être semblable à une synapse neuronale26. Dans la communication synaptique, la dynamique de la libération de neurotransmetteur sont cruciales à son effet sur la cellule postsynaptique. De même, la dynamique de la libération de Dpp est également importante pour ses conséquences en aval12. Par conséquent, il est important d'être en mesure de mesurer la dynamique de la libération de Dpp dans différents milieux génétiques et conditions pour comprendre quels facteurs influent sur la libération de Dpp.
Ici, nous avons présenté la méthode optimisée pour l'image Dpp communiqué. Nous avons également essayé d'utiliser des puits pour la culture du disque d'aile pour l'imagerie. Trop profond d'un puits peut entraîner des difficultés à se concentrer sur les événements de libération Dpp. En outre, le disque d'aile peut se déplacer pendant l'imagerie en direct, ce qui complique l'analyse. Le ruban adhésif double côté permet suffisamment d'espace entre le glissement et la glissière du couvercle pour éviter l'écrasement du disque d'aile, tout en permettant une mise au point appropriée. Nous avons constaté que le tournage du microscope sur une demi-heure avant l'imagerie pour permettre au microscope de se réchauffer empêche la dérive de l'image sur la durée de la vidéo. Le placement du disque d'aile avec le côté périipodial de la poche d'aile faisant face vers le haut est très important pour la libération de Dpp d'imagerie. Nous avons constaté que l'orientation opposée ne nous permet pas d'imager les événements de sortie Dpp.
Cette méthode pourrait être utilisée pour rechercher des modificateurs génétiques de la libération de Dpp. Nous avons observé que l'inhibition d'un canal ionique affecte Dpp communiqué12. D'autres canaux ioniques pourraient également affecter la dynamique de sortie de Dpp. Nous pourrions également tester comment les conditions environnementales telles que les tératogènes affectent la libération de Dpp. Modificateurs de libération Dpp peut révéler le mécanisme moléculaire qui contrôle la sécrétion de ligand. La dynamique de rejet peut être importante pour les conséquences en aval de plusieurs ligands de signalisation développementale différents. Alors que nous avons seulement décrit comment nous image Dpp libération, d'autres ligands tels que Hedgehog ont été observés dans la signalisation parmediaue cytoneme et pourrait être réglementée par un mécanisme similaire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier la Dre Sarala Pradhan d'avoir travaillé sur une version antérieure de ce protocole. Nous tenons à remercier NSF-IOS 1354282 pour le financement pendant que nous éduquions ce protocole. Nous tenons à remercier NIH-NIDCR RO1DE025311 pour le financement de notre laboratoire actuellement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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