Summary
Her beskriver vi en enkel og billig metode, der gør det muligt at kvantificere klæbende tumorceller til lymfeknude (LN) kryosektioner. LN-klæbende tumorceller er let identificeret ved lys mikroskopi og bekræftet af en fluorescens-baseret metode, hvilket giver en vedhæftning indeks, der afslører tumor celle-bindende affinitet til LN parenkym.
Abstract
Tumor-dræning lymfeknuder (LNs) er ikke blot filtre af tumor-produceret affald. De er en af de mest almindelige regionale steder for midlertidig ophold af formidlede tumorceller hos patienter med forskellige typer af kræft. Påvisning af disse LN-bosiddende tumorceller er en vigtig biomarkør forbundet med dårlig prognose og adjuverende terapi beslutninger. Nylige musemodeller har vist, at LN-bosiddende tumorceller kunne være en væsentlig kilde til maligne celler til fjerne metastaser. Evnen til at kvantificere vedhæftning af tumorceller til LN parenkym er en kritisk måler i eksperimentel forskning, der fokuserer på identifikation af gener eller signalering veje er relevante for lymfe/metastatisk formidling. Fordi LNs er komplekse 3D strukturer med en række optrædener og kompositioner i væv sektioner afhængigt af planet af sektion, deres matricer er vanskelige at kopiere eksperimentelt in vitro i en fuldt kontrolleret måde. Her beskriver vi en enkel og billig metode, der gør det muligt at kvantificere klæbende tumorceller til LN kryosektioner. Ved hjælp af serielle sektioner af samme LN, vi tilpasse den klassiske metode udviklet af Brodt til at bruge ikke-radioaktive etiketter og direkte tælle antallet af tilslutning tumorceller pr LN overfladeareal. LN-klæbende tumorceller er let identificeret ved lys mikroskopi og bekræftet ved en fluorescens-baseret metode, der giver en vedhæftning indeks, der afslører celle-bindende affinitet til LN parenkym, som er tyder på tegn på molekylære ændringer i affinitet binding af integrins til deres korrelerer LN-ligands.
Introduction
Kræft metastase er den vigtigste årsag til behandling fiasko og den dominerende livstruende aspekt af kræft. Som postuleret 130 år siden, den metastatiske spredning resultater, når en elite af formidlede tumorceller (DTCs, den "frø") erhverve specifikke biologiske evner, der giver dem mulighed for at unddrage sig primære steder og etablere ondartede vækst på fjerne steder (den "jord")1. For nylig er der opstået flere nye begreber vedrørende "frø og jord" relationer opstået, såsom induktion af præmetastatiske nicher (konceptualiseret som en "frugtbar jord" er nødvendig for "frø" til at trives), selvsåning af primære tumorer ved DTCs, "frø" hvilegrad på sekundære organer og den parallelle progression model metastase2.
For de fleste faste maligniteter kan DTCs opholde sig og påvises i mange mesenkymale organer, såsom knoglemarv og lymfeknuder (LN'er) hos patienter med eller uden tegn på klinisk metastase. Fordi tumor-dræning LNs er den første placering af den regionale spredning af DTCs, LN status er en vigtig prognose og er ofte forbundet med adjuverende terapi beslutninger3. For nogle tumortyper, korrelationen mellem LN status og værreresultater er stærk, herunder hoved og hals4,5,bryst6,prostata7,lunge8,gastrisk9,kolorektal10,11 og kræft i skjoldbruskkirtlen12.
LNs er små ægformede organer i lymfesystemet, der er dækket med retikulære celler og omgivet af lymfekar. Disse organer er absolut nødvendige for immunsystemets funktion13. LNs fungerer som attractant platforme for immun cirkulerende celler, hvilket bringer lymfocytter og antigen-præsentere celler sammen14. Men, LNs også tiltrække cirkulerende tumorceller. Gennem årtier, LNs blev afbilledet som passive transportveje for metastatisktumorceller. Men, nylige undersøgelser har vist, at tumorceller også kan være styret mod LNs af kemotaktiske (chemokiner) og / eller haptotaktiske (ekstracellulære matrix elementer) signaler udskilles af lymfeenendotel15. Som eksempler, overekspression af CCR7 receptor i tumorceller letter vejledning af metastatiskmelanom celler mod tumor-dræning LNs16. Desuden giver ekstracellulære LN proteiner et klæbende stillads til rekruttering og overlevelse af cirkulerende tumorceller17. Faktisk giver tumordrænende LN'er frugtbar jord til såning af DTC'er, som kan opretholdes i proliferateller hvilende tilstande af specifikke LN mikromiljømæssige signaler18. Den endelige skæbne for disse LN-bosiddende DTCs er kontroversiel; nogle værker tyder på, at disse celler er passive indikatorer for metastatisk progression19, mens andre foreslår, at de er mere sandsynligt grundlæggere af resistens (ved selvsåning primære steder) og / eller fungere som cellulære reservoirer for metastaser (spredning "frø" for tertiær kræft vækst)20,21. For nylig, ved hjælp af prækliniske modeller, Det er blevet påvist, at en brøkdel af disse LN-bosiddende DTCs aktivt invaderet blodkar, trådte ind i blodcirkulationen og koloniseret lungerne21.
I betragtning af at tilstedeværelsen af kræftceller i LNs er en markør for kræft aggressivitet og invasiv, i denne undersøgelse, vi optimeret en klassisk metode udviklet af Brodt22 til kvantitativt måle tumor celle vedhæfte til LNs in vitro. Brugen af en fluorescens-baseret analyse tillod os at udvikle en billig, hurtig, følsom og miljøvenlig (ikke-radioaktiv) protokol til påvisning af klæbende ændringer mellem tumorceller og LN kryosektioner. Ved hjælp af MCF-7 brystkræftceller udtrykke forskellige niveauer af NDRG4 genekspression og rotte LN frosne sektioner til at eksemplificere metoden, vi viste, at denne protokol tillod en god sammenhæng mellem tumorcelle vedhæftning til LNs in vitro og LN metastase observeret i brystkræftpatienter24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LNs blev genvundet fra friske kroppe af raske voksne Wistar rotter ofret af livmoderhalskræft dislokation. Vi fulgte NIH's retningslinjer for smerte og angst hos laboratoriedyr, og alle procedurer blev godkendt af den etiske komité og dyreforskning ved Forsknings- og Uddannelsesinstituttet på Sírio-Libanês hospital (CEUA P 2016-04).
BEMÆRK: Alle ferske frosne væv betragtes som biofarlige og bør håndteres ved hjælp af passende biosikkerhedsforanstaltninger.
1. Lymfadenektomi og kryosektion
- Anbring friske kroppe af voksne Wistar rotter (180-220 g) liggende i rygmangel på et rent dissektionsbræt ved stuetemperatur.
BEMÆRK: LNs skal indsamles op til 30 min post dødshjælp. - Spray rottekroppen med 70% isopropylalkohol og brug steriliserede instrumenter til LN-høst.
- Løft mavehuden ved hjælp af pincet og åbne et hulrum med et mediale snit uden at beskadige det underliggende væv, udsætter abdominal indvolde. Træk tarmen og bryst- og mave-LN'erne ud bliver synlige (figur 1).
- Forsigtigt punktafgifter LNs fra hver rotte med brug af stump spids saks for at undgå at skade den overlegne mesenteriske arterie liggende bag.
BEMÆRK: Afhængigt af placeringen af den resected lymfeknude, er det nødvendigt at rense andre væv, der holdes til det, såsom mesenteriske væv. - Høst LN'er i 15 ml koniske rør indeholdende 5 ml sterile fosfatbufferede saltvand (PBS).
- Kasseres rottekroppene korrekt.
- Fjern friske LN'er fra PBS, rul og tør noden på et tørt filterpapir. Placer det i en lille petriskål og tilsæt indlejring opløsning til frosne væv prøver (OKT) i 2 min.
- Overfør og orientere LN med ansigtet nedad i en ønsket position i bunden af en cryomold, med lige nok O.C.T til at dække det. Undgå bobler i nærheden af vævet. Sektionsoverfladen er bunden af kryomolden.
- Snap-freeze straks kryoparret i en Styrofoam køler med tøris. Når der stadig er en lille del af ufrosne O.C.T. (~ 20-35 s), overføre prøven til aluminiumsfolie og læg den i en køler med tøris og samtidig fortsætte med at fryse andre prøver. I slutningen opbevares alle prøver ved -80 °C indtil skæring.
- Del LN med en kryokratjustering styktykkelse til 5-8 μm. Overfør krysektioner på mikroskopdias.
BEMÆRK: Før sektionerne fjernes de frosne prøver fra -80 °C-fryseren, og de kan jævniseres til temperaturen i kryomikrotomekammeret ved -22 °C i ca. 30 min. LN-holdige lysbilleder kan opbevares ved -80 °C i op til en måned.
2. Cellulære mærkning med fluorescerende farvestoffer
BEMÆRK: Fluorescerende farvestoffer er meget udbredt i cellebiologi. Vi foretrækker at bruge den lange kæde dialkylcarbocyanines mærkning (DiI(C18),excitation 549 nm, Emission 565 nm), fordi de er lyse, stabile og kan føjes direkte til kulturmedier, påvirker ikke celle levedygtighed eller celle klæbende egenskaber25,26.
- Dissociatceller, der vokser under ideelle forhold (dvs. i fuldstændigt medium) og gensuspenderes i serumfrit medium med en tæthed på 106 celler/ml.
- Der tilsættes 1 ml cellesuspension (106 celler) til et konist rør og etiket på 115 ml med Dil(C18) (2 μg/ml) i 10 min ved 37 °C.
BEMÆRK: Efter 5 min, forsigtigt ophidse rørene for at undgå celle sedimentering og underfarvning af sedimenterede celler. Større tætheder kræver længere inkubationstider for ensartet farvning. En optimal inkubationstid for cellefarvning varierer med cellelinje. Det kan kvantificeres bedre ved hjælp af den konventionelle FL2 flow cytometri detektionskanal (Figur 2A). - Centrifugede de mærkede affjedringsrør ved 300 x g i 4 min.
- Fjern supernatantet og vask to gange i 10 ml serumfrit medium. Gendan cellerne som røde pellets. Ophæng cellerne op igen ved 106 celler/ml i serumfrit medium med 0,1% kvægserumalbumin (BSA).
3. Precoating Retter med Poly-L-lysin opløsning eller BSA som en Seeding Control (Valgfrit)
BEMÆRK: Vi brugte cellekulturretter precoated med PLL som positive lastning-kontrol overflader for at sikre, at forskellige eksperimentelle grupper af tumorceller blev seedet på samme antal, samt BSA-belagte overflader som negative kontroller.
- Under sterile forhold tilsættes 300 μL PLL (0,1 % w/v i H2O) eller BSA (fortyndet ved 2,5 % w/v i H2O) direkte til 24-brøndspladen og inkubere natten over ved 4 °C.
- Fjern opløsningen ved aspiration, skyl forsigtigt overfladen med steril PBS og lufttørrepladen ved stuetemperatur i vævskulturhætten før cellesåning.
BEMÆRK: De endelige mængder PLL eller BSA skal justeres i henhold til området med forskellige brøndplader.
4. Seedning Fluorescerende-mærket tumorceller på LN Cryosektioner eller PLL/BSA-belagtWells
BEMÆRK: Som eksperimentelle kontroller brugte vi (1) cellekulturretter, der var forbelagte med PLL eller BSA og (2) på hinanden følgende afsnit af samme LN pr. eksperiment (se denne detalje i figur 2D), hvor sidstnævnte vil minimere regionale variationer i ekstracellulær matrix (ECM) sammensætning af hver LN-sektion, hvilket igen kan diktere cellevedhæftningshastigheden. For følgende tumor celle vedhæfte assay, skal du vælge høj kvalitet og sekventiel LN kryosektioner.
- Vask forsigtigt kryosektionerne to gange med PBS og rehydrere med PBS i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Bloker uspecifik vedhæftning til kryosektioner med 2,5% BSA i 30 min ved 37 °C. Brug immunhistokemi vaskekamre og lamina vugger for at sikre, at hele O.C.T blev fjernet under vasker og inkubationer.
- Hæld vandet fra den overskydende BSA på et tørt køkkenrulle, tør omridset af LN sektioner med en vatpind og omkranser sektionerne ved hjælp af en PAP pen.
- For tumorcellevedhæftningsanalysen tilsættes 100 μL celleaffjedring (fra trin 2.4) til hver omringet LN-sektion eller godt i de 24-brønds PLL-belagte plader, og læg den i et befugtet kammerstativ i 1-2 timer ved 37 °C i den konventionelle cellekulturkuvøse.
BEMÆRK: Det endelige volumen af celleaffjedring skal justeres i henhold til området med forskellige omringede LN'er. - Vask forsigtigt ikke-klæbende celler fire gange med PBS. Fastgør de resterende klæbende fluorescerende celler med 3,7% formaldehyd i PBS i 15 min ved stuetemperatur.
5. Manuel kvantificering af klæbeindekset
BEMÆRK: Klæbeindekset (dvs. tumorceller/LN mm2) blev opnået ved hjælp af en 10X-målsætning og manuelt tælle antallet af tumorceller, let identificeret ved lysmikroskopi og bekræftet af en fluorescensmikroskopi (Figur 2D), pr. lymfeknudeområder på flere uafhængige områder (opnået ved hjælp af National Institute of Health's ImageJ/FIJI-software).
- Brug et fluorescerende mikroskop med en 10x målsætning til at tage separate TIFF-billeder i to kanaler, der svarer til de lyse og rødfluorescerende felter (Figur 2D). Navngiv og gem disse billeder systematisk.
- Start ImageJ/FIJI, åbn billederne, og indstil vægten. Det er nødvendigt at anvende en kalibreringsskala (f.eks. en mikrometrisk lineal 1 mm) (figur 2C).
- Åbn billedet af mikrometrisk lineal (eller et fasemikrometer), vælg værktøjet Lige streg, og tegn en lige linje, der definerer en kendt afstand.
- Vælg Angiv skaleringi menuen Analysér . Afstanden i pixel udfyldes baseret på længden (i pixel) på den streg, der trækkes i trin 5.3. Den kendte afstand vil blive fyldt med den reelle afstand (i dette tilfælde i millimeter) og længdens enhed i feltet Længdeenhed (i dette tilfælde i millimeter).
- Klik på Global (denne kalibrering gælder for alle billeder, der åbnes i denne ImageJ/FIJI-session), og tryk på OK.
- Lymfeknudeområde kvantificering: Vælg wandværktøjet, og åbn veksveksvã¦rksindstillingerne ved dobbeltklikke. Indstil tilstand til 8-tilsluttet. Klik på billedet og indstil tolerancen, indtil du vælger alle lymfeknuder på billedet, og tryk på OK. Hvis du vil måle området, skal du åbne Analysér | Mål (CTRL + M). Området udtrykkes i de enheder, der er angivet tidligere.
- Tumorcellekvantificering: Åbn de lysmikroskopi/fluorescensbilleder i FIJI-software. Vælg plugins | Analyser | Celletæller | Celletæller. Klik på billedet for at blive kvantificeret, og tryk på Indinitialer knappen i celletællervinduet. Vælg tællertype (1-8), og klik på cellerne på billedet. Hvis du vil initialisere det næste billede, skal du trykke på knappen Nulstil i celletællervinduet, åbne det nye billede og gentage alle trin.
BEMÆRK: LN vedhæftningindeks udtrykkes som antallet af klæbende tumorceller pr. LN-dækket område (celler/mm2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi illustrerer analysen ved at evaluere LN-klæbepotentialet i røde fluorescerende MCF-7 brystkræftceller, der udtrykker forskellige niveauer af NDRG4-genet (benævnt NDRG4-positive og NDRG4-negative celler), en negativ modulator af beta1-integrinklyngedannelse på celleoverfladen24, ved at undersøge brøkdele af rotte LN-klæbende tumorceller. Eksempler på de rå billeder af denne protokol vises i figur 2. Som det fremgår af figur 2B,afrundes fasfologien af klæbende celler i formet, og de er heterogent spredt over hele LN. LN-klæbeindekset er 2 gange højere i NDRG4-negative MCF-7-celler (877 ± 124 celler/mm2 af LN) sammenlignet med i tilsvarende NDRG4-positive MCF-7-celler (412 ± 76 celler/mm2 af LN, p = 0,03) (figur 2D).
Figur 1: Trinvis procedure for isolering af rottemesenteriske LN'er. (A) Ventral midterhudssnit: aflivet rotter blev anbragt i dorsale oplagsopgående stilling, og der blev foretaget et 30-50 mm midtersnit i huden, der ligger over midtermaven, og som eksponerede mavevisceraen (lever, tyndtarmen, cecum og blære). (B) Tyndtarmen blev forsigtigt trukket ud af bughulen udsætter rotte mesenteric LNs indlejret i visceral fedtvæv. (C)Grov anatomi af dissekeret mave-tarmkanalen efter fjernelse. (D) Dissekeret mesenteriske lymfeknuder fra det forbindende fedtvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater af tumorcellevedhæftning til rotte lymfeknude sektioner. A) Illustrativ flowcytometrianalyse, der viser intensiteten af DiI(C18)mærkning (øvre kvadrant) sammenlignet med ikke-mærkede celler (lavere kvadrant). (B) Lys (venstre) og fluorescerende (højre) mikroskopi billeder af rødmærkede MCF-7 celler klæber til LN sektioner efter vask trin. (C) Efter vedhæftningsanalyse kvantificeres ved hjælp af ved hjælp af en kalibreringsskala for at anslå lymfeknudeområdet og fluorescerende mikroskopi til direkte celletælling. (D) NDRG4 knockdown i MCF-7 brysttumorceller øger lymfeknude vedhæftning. Repræsentative billeder af røde fluorescerende MCF-7 celler (NDRG4-positive eller NDRG4-negative DiIC18-mærkede celler) 30 min efter såning på 5 μm rotte lymfeknude sektioner. LN-klæbeindekset udtrykkes som antallet af klæbende tumorceller pr. LN-overdækket område (celler/mm2). Skalabjælke = 200 μm. *p < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lymfesystem formidling af kræftceller kræver en række komplekse celle-drevne begivenheder. De indleder med celle løsrivelse fra primær tumor og remodeling af den ekstracellulære matrix (ECM) arkitektur, og understøttes af vedvarende kemotaxis og aktiv migration gennem afferent lymfatics på vej til sentinel LNs. Hvis kræftceller klæber og overleve i LNs, kan de nemt sprede sig til andre sekundære organer. Her beskriver vi en nem metode til hurtig og billig funktionel analyse af specifikke klæbende interaktioner mellem tumorceller og frosne LN'er.
Strukturelt, LNs er diskretsvamp-lignende masser af tætte og omfattende netværk af ECM fibre, ofte benævnt "retikulære fibre", der fungerer som veje til cellemigration og som kanaler for hurtig levering af opløselige faktorer (antigener og / eller chemokiner) inden for LN parenkym27. De bevarede retikulære fibre af de frosne LNs af analysen støtte haptotaktiske signaler og give stilladser til tumor celle vedhæftning in vitro. Disse fibre består primært af strukturelle proteiner, såsom kollagener I og III, og af sekundære ECM elementer, såsom fibronectin, tenascin, laminin, vitronectin og heparansulfat proteoglycans28,29. Efter celle vedhæftning, de fleste af disse LN-afledte ECM faktorer giver molekylære signaler, der bestemmer celle overlevelse (proliferative eller hvilende stater) eller celledød (anoikis) gennem integrin-medieret signaler.
Her demonstrerer vi analysen ved hjælp af xenogeneic rotte LNs og en menneskelig brysttumor cellelinje. Alternativt kan der anvendes andre kilder til LN'er. Sammensætningen af rotte, mus eller menneskelige LN'er omfatter de samme strukturelle og funktionelle proteiner, der er en del af indfødte pattedyr ECM, alle bevarer lignende binding ssteder, der er nødvendige for celle vedhæftning23. Det er vigtigt, at det eneste kritiske trin er at bruge på hinanden følgende udsnit af det samme LN pr. eksperiment for at minimere regionale variationer i ECM-sammensætningen af hver LN-sektion, hvilket igen kunne diktere cellevedhæftningshastigheden.
En ulempe ved analysen er, at det ikke opsummerer de første trin i lymfeformidling, kun afspejler den klæbende styrke tumorceller til LNs. For eksempel, såning mindre aggressive bryst tumorceller på LN sektioner, ligesom MCF-7 (Figur 2) eller T47D tumor cellelinjer24,føre til en stærk vedhæftning til LN sektioner in vitro, på samme niveauer end observeret for den høje aggressive MDA-MB-231 tumorceller (data ikke vist). Men, Det er velkendt, at ortotop MCF-7 xenograft tumorer ikke kan nå sentinel LNs, mens MDA-MB-231 tumorer spontant metastasere for dem30. Det er klart, den største flaskehals for MCF-7 celler LN-metastase dannelse forekomme i trin, før de når og overholde LNs, ligesom den manglende evne til MCF-7 celler effektivt flygte fra de primære tumorer. Så styrken af analysen beskrevet her er ikke etablere direkte sammenhænge med LN-metastatisk potentiale, men er en simpel metode til at kvantificere de klæbende egenskaber af en tumorcelle i en mere realistisk ECM in vitro. Ved hjælp af frosne væv repræsenterer kryoafsnittene lN'ernes naturlige kompleksitet med hensyn til struktur og sammensætning, hvilket ville være umuligt at genskabe ved hjælp af syntetiske teknikker, især dem, der anvender rensede ECM-proteiner.
Yderligere begrænsninger af metoden er (1) det gør det ikke muligt at vurdere det kemotaktiske potentiale af faktorer udskilles af LN'er, og at (2) den ikke informerer om, hvorvidt den cellespecifikke vedhæftning til LN-afsnit er et resultat af præferencebinding til ECM-proteiner, celler eller andre strukturer, der findes i LN-afsnit. Vi mente imidlertid, at denne tilgang kunne være relevant og skal overvejes seriøst for bestemte anvendelser, men lå uden for dette særlige manuskripts anvendelsesområde. For eksempel, i en nylig undersøgelse, identificerede vi N-Myc downstream-reguleret gen 4 (NDGR4) som en mekanistisk biomarkør af LN metastase i brysttumorer24. Mekanistisk, tumorceller mangler NDRG4 udtryk øge vedhæftning til kryosektioner af LNs ved at favorisere samling af β1-integrinreceptorer på forkant med brysttumorceller. Desuden ved hjælp af yderligere kontroller, ligesom retter belagt med rensede ECM proteiner, vi afdækket, at differentiale vedhæftning til LN sektioner er et resultat af selektiv tilknytning til vitronectin24.
Endelig er det værd at bemærke, at denne metode ikke er begrænset til LNs sektioner og kunne sættes op til at vurdere celle vedhæftning til forskellige levende organer, som kryosektioner af milt eller lunger. Metastatiske celler udviser organotropisme og målinger af klæbende styrke i frosne dele af forskellige organer in vitro, kunne være et nyttigt middel til at forudsige organspecifik kræftformidling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Rosana De Lima Pagano og Ana Carolina Pinheiro Campos for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra: FAPESP - São Paulo Research Foundation (2016/07463-4) og Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).
