Summary
Qui, descriviamo un metodo semplice ed economico che permette la quantificazione delle cellule tumorali adesive alle criosezioni dei linfonodi (LN). Le cellule tumorali aderenti a LN sono facilmente identificabili dalla microscopia leggera e confermate da un metodo basato sulla fluorescenza, dando un indice di adesione che rivela l'affinità di legame delle cellule tumorali al parenchyma LN.
Abstract
I linfonodi che drenano di tumore (LN) non sono solo filtri di rifiuti prodotti da tumore. Sono uno dei siti regionali più comuni di residenza provvisoria di cellule tumorali diffuse in pazienti con diversi tipi di cancro. La rilevazione di queste cellule tumorali che risiedano da LN è un importante biomarcatore associato a prognosi infaminante e decisioni di terapia adiuvante. Recenti modelli murini hanno indicato che le cellule tumorali che risiedivano l'LN potrebbero essere una fonte sostanziale di cellule maligne per metastasi distanti. La capacità di quantificare l'adiposisia delle cellule tumorali al parenchyma LN è un indicatore critico nella ricerca sperimentale che si concentra sull'identificazione dei geni o sui percorsi di segnalazione rilevanti per la diffusione linfatica/metastatica. Poiché le LN sono strutture 3D complesse con una varietà di aspetti e composizioni in sezioni di tessuto a seconda del piano di sezione, le loro matrici sono difficili da replicare sperimentalmente in vitro in modo completamente controllato. Qui, descriviamo un metodo semplice ed economico che permette la quantificazione delle cellule tumorali adesive alle criosezioni LN. Utilizzando sezioni seriali dello stesso LN, adattiamo il metodo classico sviluppato da Brodt per utilizzare etichette non radioattive e contiamo direttamente il numero di cellule tumorali aderenti per superficie LN. Le cellule tumorali aderenti a LN sono facilmente identificabili mediante microscopia leggera e confermate da un metodo basato sulla fluorescenza, fornendo un indice di adesione che rivela l'affinità di legame cellulare con il parenchyma LN, che è una prova suggestiva di alterazioni molecolari nel legame di affinità delle integrine alle loro legature LN correlate.
Introduction
La metastasi del cancro è la ragione principale per il fallimento del trattamento e l'aspetto dominante pericoloso per la vita del cancro. Come postulato 130 anni fa, la diffusione metastatica si traduce quando un'élite di cellule tumorali diffuse (DTC, i "semi") acquisisce specifiche abilità biologiche che permettono loro di eludere i siti primari e stabilire una crescita maligna in siti lontani (il "suolo")1. Recentemente, sono emersi diversi nuovi concetti riguardanti le relazioni "seme e suolo", come l'induzione di nicchie premetastatiche (concettualizzate come un "terreno fertile" necessario per i "semi" per prosperare), l'auto-semina dei tumori primari da parte della DC, la dormancy "seme" agli organi secondari e il modello di progressione parallela della metastasi2 .
Per la maggior parte delle neoplasie solide, le DTC possono risiedere ed essere rilevate in molti organi mesenchyli, come il midollo osseo e i linfonodi (LN) in pazienti con o senza evidenza di metastasi cliniche. Poiché le LN che drenano i tumori sono la prima posizione della diffusione regionale dei DTC, lo stato di LN è un importante indicatore prognostico ed è spesso associato alle decisioni terapeutiche adiuvanti3. Per alcuni tipi di tumore, la correlazione tra lo stato di LN e gli esiti peggiori è forte, tra cui testa e collo4,5, seno6, prostata7, polmone8, gastrico9, colonctal10,11 e tumori tiroidei12.
Le LN sono piccoli organi ovoidi del sistema linfatico, che sono coperti con cellule reticolari e racchiusi con vasi linfatici. Questi organi sono assolutamente necessari per il funzionamento del sistema immunitario13. Le LN fungono da piattaforme attrattiva per le cellule circolanti immunitarie, portando insieme i linfociti e le cellule che presentano antigeni14. Tuttavia, le LN attraggono anche le cellule tumorali circolanti. Nel corso dei decenni, le LN sono state raffigurate come vie passive di trasporto per le cellule tumorali metastatiche. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che le cellule tumorali possono anche essere guidate verso Le LN da chemiotattiche (chemiochine) e/o aptotattiche (elementi di matrice extracellulari) spunti secreti dall'endotelio linfatico15. Ad esempio, la sovraespressione del recettore CCR7 nelle cellule tumorali facilita la guida delle cellule del melanoma metastatico verso i LN16che drenano il tumore . Inoltre, le proteine LN extracellulari forniscono uno scaffold adesivo per il reclutamento e la sopravvivenza delle cellule tumorali circolanti17. Infatti, le LN che drenano i tumori forniscono terreno fertile per la semina di DTC, che può essere mantenuta in stati proliferanti o dombetari da specifici segnali microambientali LN18. Il destino finale di questi DTC residenti da LN è controverso; alcune opere suggeriscono che queste cellule sono indicatori passivi di progressione metastatica19, mentre altri propongono che sono più probabili fondatori di resistenza (da siti primari auto-semina) e/o agiscono come serbatoi cellulari per metastasi (diffondendo "semi" per la crescita del cancro terziario)20,21. Recentemente, utilizzando modelli preclinici, è stato dimostrato che una frazione di questi DTC residenti da LN ha invaso attivamente i vasi sanguigni, è entrata nella circolazione sanguigna e ha colonizzato i polmoni21.
Considerando che la presenza di cellule tumorali nelle LN è un indicatore per l'aggressività e l'invasività del cancro, in questo studio, abbiamo ottimizzato un metodo classico sviluppato da Brodt22 per misurare quantitativamente l'adesione delle cellule tumorali alle LN in vitro. L'uso di un saggio basato sulla fluorescenza ci ha permesso di sviluppare un protocollo a basso costo, rapido, sensibile e rispettoso dell'ambiente (non radioattivo) per il rilevamento di alterazioni adesive tra cellule tumorali e criosezioni LN. Utilizzando le cellule MCF-7 di cancro al seno che esprimono diversi livelli di espressione genica NDRG4 e sezioni congelate di LN di ratto per esemplificare il metodo, abbiamo dimostrato che questo protocollo ha permesso una buona correlazione tra l'adesione delle cellule tumorali alle LN in vitro e la metastasi LN osservata nei pazienti affetti da cancro al seno24.
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Protocol
Le LN sono state recuperate da carcasse fresche di ratti Wistar adulti sani sacrificati dalla lussazione cervicale. Abbiamo seguito le linee guida NIH per il dolore e il soccorso negli animali da laboratorio e tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico e ricerca animale dell'Istituto di Ricerca e Educazione dell'ospedale di SanRio-Libanàs (CEUA P 2016-04).
NOTA: Tutti i tessuti freschi congelati sono considerati biopericolosi e devono essere trattati con precauzioni di biosicurezza appropriate.
1. Linfodenectomia e criosezione
- Posizionare carcasse fresche di ratti Wistar adulti (180-220 g) che si trovano in recumbency dorsale su una tavola di dissezione pulita a temperatura ambiente.
NOTA: Le LN devono essere raccolte fino a 30 min dopo l'eutanasia. - Spruzzare la carcassa di ratto con 70% di alcool isopropile e utilizzare strumenti sterilizzati per la raccolta di LN.
- Sollevare la pelle addominale con l'aiuto di pinzette e aprire una cavità con un'incisione mediale senza danneggiare il tessuto sottostante, esponendo le viscere addominali. Estrarre l'intestino e le LN toraciche e addominali diventano visibili (Figura 1).
- Accise con attenzione i LN di ogni ratto con l'uso di forbici contundenti per evitare di ferire l'arteria mesenterica superiore che si trova dietro.
NOTA: A seconda della posizione del linfonodo resezionato, è necessario pulire altri tessuti aderenti ad esso, come il tessuto mesenterico. - Raccogliere LN in tubi conici da 15 mL contenenti 5 mL di salina tamponata da fosfato sterile (PBS).
- Scartare correttamente le carcasse di ratto.
- Rimuovere le LN fresche dal PBS, arrotolare e asciugare il nodo su una carta da filtro secco. Mettetelo in una piccola parabola Petri e aggiungete una soluzione di incorporamento per campioni di tessuto congelati (O.C.T.) per 2 min.
- Trasferire e orientare l'LN a faccia in giù nella posizione desiderata nella base di un criomuffone, con appena sufficiente O.C.T per coprirlo. Evitare le bolle vicino al tessuto. La superficie di sezionamento è il fondo del criomuff.
- Immediatamente schioccare il criostampo in un refrigeratore di polistirolo con ghiaccio secco. Quando c'è ancora una piccola parte di O.C.T. non congelati (20-35 s), trasferire il campione in un foglio di alluminio e metterlo in un refrigeratore con ghiaccio secco pur continuando a congelare altri campioni. Alla fine, conservare tutti i campioni a -80 gradi centigradi fino alla sezionamento.
- Sezionare l'LN con un criostato che regola lo spessore della sezione a 5-8 m. Trasferire le clerie sui vetrini del microscopio.
NOTA: Prima della semazione, togliere i campioni congelati dal congelatore a -80 gradi centigradi e lasciarli eclavitare alla temperatura nella camera dei microtomi criostat a -22 gradi centigradi per circa 30 min.
2. Etichettatura cellulare con coloranti fluorescenti
NOTA: I coloranti fluorescenti sono ampiamente utilizzati nella biologia cellulare. Preferiamo utilizzare l'etichettatura delle dialkylcarbocyanine a catena lunga (DiI(C18), eccitazione 549 nm, Emissione 565 nm) perché luminose, stabili e possono essere aggiunte direttamente ai supporti di coltura, non influisce sulla vitalità cellulare o sulle proprietà adesive delle cellule25,26.
- Dissociare le cellule che crescono in condizioni ideali (cioè, in mezzo completo) e risospendere in mezzo senza siero ad una densità di 106 cellule / mL.
- Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare (106 celle) a un tubo conico a15 mL ed etichettare con Dil (C18) (2 g/mL) per 10 min a 37 .
NOTA: Dopo 5 min, agitare delicatamente i tubi per evitare la sedimentazione cellulare e la sottostagliamento delle cellule sedimentate. Densità maggiori richiedono tempi di incubazione più lunghi per una colorazione uniforme. Un tempo di incubazione ottimale per la colorazione cellulare varia a seconda della linea cellulare. Può essere quantificato meglio utilizzando il canale convenzionale di rilevamento della citometria di flusso FL2 (Figura 2A). - Centrifugare i tubi di sospensione etichettati a 300 x g per 4 min.
- Rimuovere il supernatante e lavare due volte in 10 mL di mezzo senza sieri. Recuperare le cellule come pellet rossi. Risospendere le cellule a 106 cellule / mL in mezzo senza siero con 0.1% bovine serum albumin (BSA).
3. Precoating piatti con Poly-L-lysine Solution o BSA come seeding Control (opzionale)
NOTA: Abbiamo usato piatti di coltura cellulare prerivestiti con PLL come superfici positive di controllo del carico per garantire che diversi gruppi sperimentali di cellule tumorali fossero seminati allo stesso numero, così come superfici rivestite di BSA come controlli negativi.
- In condizioni sterili, per preparare pozzi rivestiti di PLL o BSA, aggiungere 300 L di PLL (0,1% w/v in H2O) o BSA (diluito al 2,5% w/v in H2O) direttamente alla piastra di 24 pozze e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere la soluzione per aspirazione, sciacquare delicatamente la superficie con PBS sterile e asciugare ad aria la piastra a temperatura ambiente nel cofano di coltura dei tessuti prima della semina cellulare.
NOTA: I volumi finali di PLL o BSA devono essere regolati in base all'area di diverse piastre di pozzo.
4. Seeding Fluorescente-etichettato cellule tumorali su LN Cryosections o Pozze PLL/BSA rivestito
NOTA: Come controlli sperimentali, abbiamo usato (1) piatti di coltura cellulare prerivestiti con PLL o BSA e (2) sezioni consecutive dello stesso LN per esperimento (vedi questo dettaglio in Figura 2D),dove quest'ultimo ridurrà al minimo le variazioni regionali nella composizione della matrice extracellulare (ECM) di ogni sezione LN, che a sua volta può dettare il tasso di adesione della cellula. Per il seguente saggio di adesione delle cellule tumorali, selezionare criosezioni LN di alta qualità e sequenziali.
- Lavare delicatamente le criosezioni con PBS e reidratarsi con PBS per 15 min a temperatura ambiente.
- Bloccare l'adesione non specifica alle criosezioni con 2,5% BSA per 30 min a 37 gradi centigradi. Utilizzare camere di lavaggio immunohistochimiche e culle di lamina per garantire che l'intera O.C.T sia stata rimossa durante lavaggi e incubazioni.
- Scolare la BSA in eccesso su un tovagliolo di carta asciutto, asciugare il contorno delle sezioni LN con un tampone di cotone e circondare le sezioni utilizzando una penna PAP.
- Per il saggio di adesione delle cellule tumorali, aggiungere 100 gradi di sospensione cellulare (dal punto 2.4) ad ogni sezione LN circondata o bene nelle piastre rivestite di PLL a 24 pozze, e posizionarlo in un rack da camera umida per 1-2 h a 37 gradi centigradi nell'incubatrice di coltura cellulare convenzionale.
NOTA: Il volume finale della sospensione cellulare deve essere regolato in base all'area di diversi LN circondati. - Lavare delicatamente le cellule non aderenti quattro volte con PBS. Fissare le restanti cellule fluorescenti aderenti con 3,7% formaldeide in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.
5. Quantificazione manuale dell'indice adesivo
NOTA: L'indice adesivo (cioè le cellule tumorali/LN mm2) è stato raggiunto utilizzando un obiettivo 10X e contando manualmente il numero di cellule tumorali, facilmente identificabili mediante microscopia leggera e confermate da una microscopia a fluorescenza (Figura 2D), aree per linfonodo di diversi campi indipendenti (ottenute utilizzando il software ImageJ/FIJI dell'Istituto Nazionale di Salute).
- Utilizzare un microscopio fluorescente con un obiettivo 10x per scattare immagini TIFF separate in due canali corrispondenti ai campi luminosi e fluorescenti rossi (Figura 2D). Assegna un nome e salva sistematicamente queste immagini.
- Avviare ImageJ/FIJI, aprire le immagini e impostare la scala. È necessario utilizzare una scala di calibrazione (ad esempio, un righello micrometrico 1 mm) (Figura 2C).
- Aprire la foto del righello micrometrico (o un micrometro di fase), selezionare lo strumento Linea retta e disegnare una linea retta che definisce una distanza nota.
- Nel menu Analizza, selezionare Imposta scala. La Distanza in pixel verrà riempita in base alla lunghezza (in pixel) della linea disegnata nel passaggio 5.3. La distanza nota verrà riempita con la distanza reale (in questo caso, in millimetri) e l'unità di lunghezza nel campo Unità di lunghezza (in questo caso, in millimetri).
- Fare clic su Globale (questa calibrazione si applica a tutte le immagini aperte in questa sessione ImageJ/FIJI) e premere OK.
- Quantificazione dell'area del nodo linfonodo: selezionare lo strumento Bacchetta e, facendo doppio clic, aprire le impostazioni dello strumento Bacchetta. Impostare la modalità su 8 connessi. Fare clic nella foto e impostare la tolleranza fino a selezionare tutti i linfonodi nella foto e premere OK. Per misurare l'area, aprire Analizzare Misura (CTRL e M). L'area è espressa nelle unità impostate in precedenza.
- Quantificazione delle cellule tumorali: aprire le immagini di microscopia/fluorescenza della luce nel software FIJI. Selezionare Plugins Proprietà Analyze . Contatore di celle Contatore di celle. Fare clic sulla foto da quantificare e premere il pulsante Inizializza nella finestra del contatore della cella. Selezionare il tipo di contatore (1-8) e fare clic sulle celle nella foto. Per inizializzare la foto successiva, premi il pulsante Reset nella finestra del contatore della cella, apri la nuova foto e ripeti tutti i passaggi.
NOTA: l'indice di adesione LN è espresso come il numero di cellule tumorali aderenti per area coperta da LN (cellule/mm2).
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Representative Results
Illustriamo la valutazione del potenziale adesivo LN delle cellule di carcinoma mammario MCF-7 fluorescenti rosse che esprimono diversi livelli del gene NDRG4 (indicato come cellule NDRG4-positive e NDRG4-negative), un modulatore negativo del clustering beta1-integrin sulla superficie cellulare24,esaminando le frazioni delle cellule tumorali aderenti al ratto LN. Esempi di immagini non elaborate di questo protocollo sono illustrati nella Figura 2. Come osservato nella Figura 2B, la morfologia delle cellule aderenti è arrotondata in forma e sono eterogeneamente disperse in tutto il LN. L'indice adesivo LN è di 2 volte più alto nelle celle NDRG4-negative MCF-7 (877 x 124 celle/mm2 di LN) rispetto a quello delle corrispondenti celle MCF-7 ndRG4-positive (412 x 76 celle/mm2 di LN, p - 0,03) (Figura 2D).
Figura 1: procedura stepwise per l'isolamento delle LAn mesenteche del ratto. (A) Incisione cutanea della linea mediana ventrale: i ratti eutanasia sono stati posti in posizione di recumbency dorsale e un'incisione mediana di 30-50 mm è stata fatta nella pelle sovrastante l'addome medio, esponendo le viscere addominali (fegato, intestino tenue, cecum e vescica). (B) L'intestino tenue è stato delicatamente estratto dalla cavità addominale esponendo ratto mesenterico LN incorporati nel tessuto adiposo viscerale. (C) Anatomia lorda del tratto gastrointestinale sezionato dopo la rimozione. (D) I linfonodi mesentoici dissected dal tessuto adiposo di collegamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi dell'adesione delle cellule tumorali alle sezioni del linfonodo del ratto. (A) Analisi della citometria del flusso illustrativo che mostra l'intensità dell'etichettatura DiI(C18)(quadrante superiore) rispetto alle celle non etichettate (quadrante inferiore). (B) Immagini di microscopia leggera (sinistra) e fluorescente (destra) di cellule MCF-7 con etichetta rossa aderenti alle sezioni LN dopo la fase di lavaggio. (C) Dopo il test dell'adesione, le cellule attaccate sui copricoperture vengono quantificate manualmente utilizzando una scala di calibrazione per stimare l'area del linfonodo e la microscopia fluorescente al conteggio diretto delle cellule. (D) Il knockdown NDRG4 nelle cellule tumorali al seno MCF-7 aumenta l'adesione del linfonodo. Immagini rappresentative di cellule MCF-7 fluorescenti rosse (cellule etichettate DiIC18 positive o NDRG4-negative) 30 min dopo la semina su 5 sezioni di linfonodi di ratto. L'indice adesivo LN è espresso come il numero di cellule tumorali aderenti per area coperta da LN (cellule/mm2). Barra della scala: 200 m. < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La diffusione del sistema linfatico delle cellule tumorali richiede una varietà di eventi complessi basati sulle cellule. Iniziano con il distacco cellulare dal tumore primario e il rimodellamento dell'architettura a matrice extracellulare (ECM), e sono supportati da chemiotassi persistenti e migrazione attiva attraverso la linfatica afferente in rotta verso le LN sentinella. Se le cellule tumorali aderiscono e sopravvivono in LN, possono facilmente diffondersi ad altri organi secondari. Qui descriviamo un metodo semplice per un'analisi funzionale rapida e a basso costo di specifiche interazioni adesive tra cellule tumorali e LN congelate.
Strutturalmente, le LN sono masse discrete simili a spugne di reti dense ed estese di fibre ECM, spesso chiamate "fibre reticolari", che fungono da percorsi per la migrazione cellulare e come condotti per la consegna rapida di fattori solubili (antigeni e/o chemiochine) all'interno del parenchyma LN27. Le fibre reticolari conservate delle LN congelate del saggio supportano i segnali aptotattici e forniscono scaffold per l'adesione delle cellule tumorali in vitro. Queste fibre sono costituite principalmente da proteine strutturali, come collageni I e III, e da elementi ECM secondari, come fibronectina, tenascina, laminina, vitronectina ed eparan solfato proteoglicani28,29. Dopo l'adesione cellulare, la maggior parte di questi fattori ECM derivati da LN forniscono segnali molecolari che determinano la sopravvivenza delle cellule (stati di mortalità o dormancy) o la morte cellulare (anoikis) attraverso segnali mediati dall'integrina.
Qui, dimostriamo l'analisi usando LN di ratti xenogeneici e una linea cellulare del tumore al seno umano. In alternativa, è possibile utilizzare altre origini di LN. La composizione di lAn torati, topi o umani include le stesse proteine strutturali e funzionali che fanno parte dei mammiferi nativi ECM, tutti preservando siti di legame simili che sono necessari per l'adesione cellulare23. È importante sottolineare che l'unico passaggio critico consiste nell'utilizzare sezioni consecutive dello stesso LN per esperimento per ridurre al minimo le variazioni regionali nella composizione ECM di ogni sezione LN, che a sua volta potrebbe dettare il tasso di adesione cellulare.
Uno svantaggio del test è che non ricapitola i primi passi della diffusione linfatica, riflettendo solo la forza adesiva delle cellule tumorali alle LN. Ad esempio, la semina di cellule tumorali al seno meno aggressive sulle sezioni LN, come l'MCF-7 (Figura 2) o le linee cellulari tumorali T47D24, portano ad una forte adesione alle sezioni LN in vitro, a livelli simili a quelli osservati per le cellule tumorali ad alta aggressività MDA-MB-231 (dati non mostrati). Tuttavia, è ben noto che i tumori ortotopici MCF-7 xenotrapianto non possono raggiungere le LN sentinella, mentre i tumori MDA-MB-231 metastazzano spontaneamente a loro30. Chiaramente, il collo di bottiglia principale per le cellule MCF-7 la formazione di LN-metastasi si verifica nei passi prima che raggiungano e aderiscano alle LN, come l'incapacità delle cellule MCF-7 di sfuggire in modo efficiente dai tumori primari. Quindi, la forza dell'analisi qui descritta non è stabilire correlazioni dirette con il potenziale metastatico LN, ma è un metodo semplice per quantificare le proprietà adesive di una cellula tumorale in un ECM più realistico in vitro. Utilizzando tessuti congelati, le criosezioni rappresentano la naturale complessità delle LN in termini di struttura e composizione, che sarebbe impossibile ricreare utilizzando tecniche sintetiche, in particolare quelle che utilizzano proteine ECM purificate.
Ulteriori limitazioni del metodo sono (1) non consente la valutazione del potenziale chemiotattico dei fattori secreti dalle LN e che (2) non informa se l'adesione specifica della cellula alle sezioni LN sia il risultato di un legame preferenziale alle proteine ECM, alle cellule o a qualsiasi altra struttura presente nelle sezioni LN. Tuttavia, abbiamo ritenuto che questo approccio potesse essere rilevante e debba essere preso seriamente in considerazione per particolari applicazioni, ma esulava dall'ambito di questo particolare manoscritto. Ad esempio, in uno studio recente, abbiamo identificato il gene n-Myc regolato a valle 4 (NDGR4) come biomarcatore meccanicistico della metastasi LN nei tumori mammari24. Meccanicamente, le cellule tumorali prive di espressione NDRG4 aumentano l'adesione alle criosezioni delle LN favorendo l'assemblaggio di recettori di z1-integrin al bordo principale delle cellule tumorali del seno. Inoltre, utilizzando controlli aggiuntivi, come piatti rivestiti con proteine ECM purificate, abbiamo scoperto che l'adesione differenziale alle sezioni LN è il risultato di un'associazione selettiva con la vitronectina24.
Infine, vale la pena notare che questo metodo non è limitato alle sezioni LN e potrebbe essere impostato per valutare l'adesione cellulare a diversi organi viventi, come criosezioni di milza o polmoni. Le cellule metastatiche mostrano organotropismo e misurazioni della forza adesiva in sezioni congelate di diversi organi in vitro, potrebbero essere un utile mezzo per prevedere la diffusione del cancro specifico dell'organo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Dr. Rosana De Lima Pagano e Ana Carolina Pinheiro Campos per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di: FAPESP - San Paolo Research Foundation (2016/07463-4) e Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
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