Summary
אנו מספקים שיטה לזיהוי מודולים של דיות שקרנים על ידי הקרנת בקנה מידה גדול של ספריה מורכבת.
Abstract
עיבוד הצמח ללחצים ביוטיים ובין מדגיש הוא נשלט על ידי מגוון של גורמים, ביניהם התקנה של מיפתח הצמצם בתגובה לגירעון מים או פתוגנים ממלא תפקיד מכריע. זיהוי מולקולות קטנות המווסתים את התנועה לרפואת שיניים יכולה לתרום להבנת הבסיס הפיזיולוגי שממנו מסתגלים הצמחים לסביבתם. בקנה מידה גדול גישות הקרנה ששימשו לזיהוי הרגולטורים של התנועה יש מגבלות פוטנציאליות: כמה להסתמך בכבדות על חומצה אבציסית (ABA) הורמון איתות מסלול, ולכן להוציא מנגנונים עצמאיים aba, בעוד אחרים להסתמך על התבוננות של השפעות בלתי עקיפות, לטווח ארוך כגון צמיחה ופיתוח הצמח. שיטת ההקרנה המוצגת כאן מאפשרת טיפול בקנה מידה גדול של צמחים עם ספרייה של כימיקלים בשילוב עם קוונפיקציה ישירה של דיות שלהם על ידי הדמיה תרמית. מאז התאיידות של מים באמצעות תוצאות דיות הקירור משטח עלה, הדמיה תרמית מספק גישה לא פולשנית כדי לחקור שינויים העברת מוליכות לאורך זמן. בפרוטוקול זה, הליוציץ שתילים השנתי הם גדלו הידרופונטית ולאחר מכן מטופלים על ידי האכלה השורש, שבו השורש העיקרי הוא נחתך וטבול לתוך הכימיקל נבדק. הדמיה תרמית ואחריו ניתוח סטטיסטי של שינויי טמפרטורה cotyledonary במשך הזמן מאפשר זיהוי של מולקולות אקטיביים מודולים הצמצם שיניים. ניסויים הוכחת המושג שלנו להפגין כי כימית יכול להתבצע משורש לגזור את cotyledon של שתיל חמניות בתוך 10 דקות. בנוסף, כאשר הצמחים מטופלים עם ABA כפקד חיובי, עלייה בטמפרטורת פני העלה ניתן לזהות בתוך דקות. השיטה שלנו ובכך מאפשרת זיהוי יעיל ומהיר של מולקולות הרומן ויסות הצמצם.
Introduction
עמידות ללחץ בצמחים היא תכונה פוליגנית המושפעת ממגוון תכונות מולקולריות, סלולריות, התפתחותיות ופיזיולוגיות ומנגנונים1. הצמחים בסביבה התנודות צריך ברציפות לווסת את התנועות שלהם לאיזון הביקוש פוטוסינתטי עבור פחמן תוך שמירה על מספיק מים ומניעת פלישה הפתוגן2; עם זאת, המנגנונים שבהם החלטות אלה מתקבלות באופן מובן למדי3. היכרות אקטיביים מולקולות לצמחים יכול לווסת את הפיזיולוגיה שלהם ולעזור בחיטוט מנגנונים חדשים של רגולציה.
ההקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות היא אסטרטגיה יעילה המשמשת לגילוי תרופות נגד סרטן ו הפרמקולוגית לבדוק את ההשפעות הפיזיולוגיות של מאות אלפי מולקולות בתקופה קצרה של זמן4,5. ב ביולוגיה של הצמח, הקרנת תפוקה גבוהה הראתה את יעילותו למשל בזיהוי של המולקולה הסינתטית pyrabactin6, כמו גם גילוי של הקולטן המבוקש של חומצה אבציסית (ABA)7,8. מאז, האגוניסטים והאנטוניסטים של קולטני אבא, מולקולות קטנות מסוגל לווסת את הביטוי של גנים העיתונאי aba-inducible זוהו9,10,11,12,13,14,15. תפוקה גבוהה ההקרנה גישות זמין כעת כדי לזהות תרכובות קטנות שיכולות לווסת את הצמצם שיניים יש כמה חסרונות: (i) הפרוטוקולים הסובבים סביב מסלול האיתות של ה-aba עשוי למנוע זיהוי של הספר הרומן מנגנונים עצמאיים, ו (ii) באסטרטגיות vivo המשמש לזיהוי מולקולות קטנות אקטיביים להסתמך בעיקר על ההשפעות הפיזיולוגיות שלהם על נביטה הזרע או שתיל צמיחה, ולא על התקנה של דיות הצמח כשלעצמה.
בנוסף, בעוד ישנן דרכים רבות לטיפול בצמחים עם מולקולות אקטיביים, רובם לא מתאימים למחקר בקנה מידה גדול של התנועה. בקצרה, שלוש הטכניקות הנפוצות ביותר הן היישום שקרן בריסוס או טבילה, טיפול במערכת השורש והשקיה בשורש. יישום שקרן אינו תואם למתודולוגיות הנפוצות והמהירות ביותר כדי למדוד את הצמצם מכיוון שנוכחותם של טיפות על פני העלה מפריעה לאיסוף נתונים בקנה מידה גדול. המגבלות המרכזיות של השקיה בשורש הן הדרישות נפח גדול המדגם, החזקת פוטנציאל של תרכובות על ידי אלמנטים בתוך הריון, ואת ההסתמכות על ספיגת השורש הפעיל.
כאן, אנו מציגים שיטה בקנה מידה גדול כדי לזהות תרכובות חדשות ויסות דיות הצמח שאינו מערב בהכרח את ABA-או מנגנוני תגובה בצורת מוכר ומאפשר טיפול יעיל ואמין של צמחים. במערכת זו, הליוציץ הצמחים השנתי מטופלים באמצעות גישה האכלה השורש המורכב של חיתוך השורש העיקרי של שתילים הידרופונטי ולטבול את האתר לחתוך לפתרון לדוגמה. לאחר טיפול, ההשפעה של כל תרכובת על דיות של צמחים נמדד באמצעות מצלמת אינפרא אדום תרמית הדמיה. כיוון שדטרמיננטה גדולה של טמפרטורת פני העלה היא שיעור האידוי מעלה, נתוני הדמיה תרמית יכולים להיות מתואמים במישרין לאופן מוליכות. השינוי היחסי בטמפרטורה שקרנית לאחר טיפול כימי ובכך מספק אמצעים ישירים לכמת את דיות הצמח.
H. שנתיות הוא אחד מחמשת גידולי הנפט הגדולים בעולם16 ותגליות שנעשו ישירות על צמח זה עשוי להקל על העברות עתידיות של הטכנולוגיה. בנוסף, שתילי ה-H. השנתי כוללים cotyledons גדולים ושטוחים, כמו גם שורש ראשי עבה, שהיה אידיאלי לפיתוח פרוטוקול זה. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לצמחים אחרים ומגוון של תרכובות.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות ביעילות מולקולות מסוגל להפעיל את הסגר שיניים או לקדם את הפתיחה, אשר יש השלכות מרכזיות על הבנת האותות המסדירים את היכולת לווסת את מוליכות ועיבוד הצמח לסביבה דגיש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול הצמחים
- הוסף שכבה בעובי 4 ס מ של ורמיקוליט דק לתקן 10 ב. x 20 ב. (254 mm x 501 מ"מ) מגשי צמחים ללא חורים.
- מניחים את מחזיקי הזרעים (ראו טבלת חומרים) 2 ס מ זה מזה במגשים הצמחיים.
- ממלאים מחזיקי זרעים בורמיקוליט.
- מניחים זרע חמניות עם הקצה המחודד שלו למטה בכל מחזיק זרע, דוחף למטה כל כך מחצית הזרע נשאר חשוף.
הערה: זרעי חמניות הוא א-סימטרי והקצה המחודד מהמקום שבו הרדילה יופיעו מצביעים כלפי מטה. מיקום הזרעים הנכון חשוב כמו הכיוון החוזר של השורש גזע אינם אפשריים בתוך מחזיקי הזרעים. הקצה העגול של הזרע צריך להאריך את החלק העליון של מחזיק הזרע. - לאחר הזרעים נמצאים במקום, לכסות אותם עם תוספת 2 ס"מ שכבה עבה של ורמיקוליט קנס. . מים על ידי מיסטינג מלמעלה המשטח אמור להישאר רטוב אחרי שעה. אם זה המקרה, כסו את המגשים במכסים.
- לגדל צמחים בחדר הצמיחה או חממה. התנאים המומלצים הם עוצמת אור של 140 μtהפוטונים · m-2· s-1 ו photoperiod של 16 h אור ב 22 ° צ' ו 9 h כהה ב 20 ° c עבור 5 ימים.
הערה: השקיה לא צריך להיות נחוץ, אלא אם כן המשטח הופך יבש בעליל.
2. הגדרת מערכת הידרופוני
- מצא מכולה בגודל כראוי מתאים הידרופונטי צמחים גדל. יש להתאים את גודל המיכל לשטח הזמין בחדר הגידול או בחממה. מומלץ לעומק של 15 ס מ.
- למלא את המיכל עם מים מזוקקים ולהוסיף דשן כללי הידרופוניקה כפי שמצוין על ידי היצרן. הפתרון ידרופוני כתוצאה מכך צריך להיות מוגזים ובתנועה מתמדת, אשר ניתן להשיג באמצעות משאבות אוויר ומים.
- . הכן את ההידרופוניקה
- חותכים סדין מוקצף מורחב בעובי 2 ס מ (ראו טבלת חומרים) לממדי המכולה. על הסדין לכסות את מרבית המשטח של המיכל כדי להגביל את צמיחת האצות. כלי שריפת עץ יעיל לחיתוך פוליסטירן מוקצף והוא תכליתי מספיק עבור פרוטוקול זה.
התראה: אדים או אדים שפורסמו במהלך חיתוך חם של קלקר הם מפגעים בריאותיים חמורים. השתמש באמצעי הגנה נאותים. משתמשים יכולים גם לספק את דרישות האוורור על ידי חיתוך קצף תחת מכסה המנוע. - הפוך חורים (1-2 ס מ בקוטר) ב פוליסטירן מוקצף באמצעות כלי שריפת עץ. ניתן לכוונן את המרחק בין המרכזים של שני חורים לצורכי הניסוי. עם זאת, מומלץ מרחק מינימלי של 2.5 ס מ.
- חותכים סדין מוקצף מורחב בעובי 2 ס מ (ראו טבלת חומרים) לממדי המכולה. על הסדין לכסות את מרבית המשטח של המיכל כדי להגביל את צמיחת האצות. כלי שריפת עץ יעיל לחיתוך פוליסטירן מוקצף והוא תכליתי מספיק עבור פרוטוקול זה.
3. העברת שתילים להידרופוניקה וצמיחת צמחים
- בעדינות לשלוף שתילים בן 5 ימים מורמיקוליט ולהעביר מיד למיכל מלא מים עבור 30 דקות. צעד זה יסיר עודפי ורמיקוליט וירכך את קרום הלב הנותרים. השורש הראשי המתעוררים צריך להיות גלוי.
- הסירו את קירות הקרום בידיים במידת הצורך על מנת למטב את התרחבות העתיד של הקוטיונים.
- העבירו את השתילים בתוך מחזיקי הזרעים לקלקר מוקצף. לגדל את הצמחים עם עוצמת אור של 140 μta הפוטונים · m-2· s-1, לחות יחסית של 65% ו photoperiod של 16 h אור ב 22 ° צ' ו 9 h כהה ב 20 ° c עבור 2 ימים.
4. הכנה לפני טיפול
הערה: הליך זה מיועד לבדיקת 20 כימיקלים מספריה מורכבת קטנה בטרילקאט, עם 100 μM ABA ב -10 מ"מ MES-KOH (pH = 6.2) ו-10 מ"מ MES-KOH (pH = 6.2) המכיל 1% (v/v) diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כפקדים חיוביים ושליליים, בהתאמה.
- ודא כי יש מספיק צמחים מוכנים לטיפול. צמחים מוכנים לטיפול צריך להיות בוגרת מספיק כדי להיות במלואו cotyledons, אבל צעיר מספיק כי התפשטות השורש הרוחבי הוא מינימלי. כדי לבצע הקרנה סטנדרטית, 69 צמחים כאלה נחוצים.
- הסר את הצלחת 96-באר המכילה את התרכובות הקטנות מ-80 ° c מקפיא. . להפשיר בטמפרטורת החדר
- להכין 80 mL של 10 mM MES-קו מאגר מותאם ל-pH של 6.2 עם אחד M KOH.
- תווית כובע פחות 2 מ"ל מיקרוצינוריות. הכינו לפחות שש שפופרות לטיפול בשליטה שלילית (10 מ"מ MES-KOH (pH = 6.2) המכיל 1% (v/v) DMSO). השתמש שלוש שפופרות לטיפול ב-ABA (100 μM ABA ב 10 מ"מ MES-KOH pH = 6.2), בקרה חיובית). השתמש הנותרים 60 צינורות כדי לנתח את ההשפעה של 20 כימיקלים ב טרילקאט.
- העברה 10 μL של כל כימיקל (10 מ"מ ב DMSO) לתוך כל אחד משלושת הצינורות המסומנים כראוי. Pipet 10 μL של 10 מ"מ ABA מומס DMSO לתוך שלוש שפופרות ו 10 μL של DMSO לתוך שישה שפופרות שליטה.
התראה: לפי הטבע, תרכובות מסוימות עלולות לגרום להשפעות בריאותיות חמורות ומשתמשים חייבים לנקוט באמצעי הגנה מתאימים. - הוסף 990 μL של 10 מ"מ MES-KOH (pH = 6.2) לכל אחד מצינורות 69. לחלק את מאגר ה-MES עם מספיק כוח כדי לערבב את הכימיקל עם מאגר ה-MES, אבל להיזהר מאוד לא להשתמש כל כך הרבה כוח כי כימיקלים ומאגר MES להתיז מתוך הצינור. לחילופין, מערבולת במהירות נמוכה.
5. הגדר את מצלמת ההדמיה התרמית
- טעינת מצלמת ההדמיה התרמית במעמד העתקה. חבר את כל הכבלים למחשב נישא.
הערה: ההקלטה נעשית בתנאים של טמפרטורה (20 ° צלזיוס עד 25 ° c), לחות (50% עד 70%) ואיכות האור (110 עד 140 μa הפוטונים · m-2· s-1) דומה לאלה המשמשים לגדל את הצמחים. - הפעל את המצלמה ואז את המחשב הנייד ופתח את תוכנת ניתוח הדמיה תרמית.
הערה: ההוראות הבאות להקלטה חלות על תוכנה ספציפית שבשימוש (ראה טבלת חומרים). - כוונן את הגדרות ההקלטה.
- עכבר מעל לחצן הקלט האדום בחלק העליון של החלון המרכזי. יופיע תפריט נפתח. לחץ על סמל מפתח הברגים הגדרות רשומה.
- בחר את מצב הרשומה והאפשרויות המתאימות. אפשרות הרשומה באופן תקופתי, עם מסגרת אחת שנלכדה לדקה וניתן להשתמש בעצירה ידנית. שים לב ליעד הקובץ שבו התוכנה תשמור את הווידאו. סגור את החלון ' הגדרות רשומה '.
6. הכנה וטיפול בצמחים
- מניחים את הצינורות נטולי הכיפה המכילים את הכימיקלים בארונות הצינורות. לחילופין, יריעות פוליסטירן מוקצף ניתן לגזור והוא התקרש עם כלי שריפת עץ כמתואר בשלב 2.3 לעשות מתלה צינור מותאם אישית. קוטרו של כל חור צריך להיות קרוב מאוד לקוטר החיצוני של צינורות הקפילס על מנת להחזיק אותם בחוזקה.
הערה: שדה התצוגה של המצלמה הוא גורם מגביל שיש לקחת בחשבון בעת החלטה על האופן שבו הצינורות פחות מכסה יתקיים במקום. - מפיץ באופן שווה את שפופרות הבקרה החיוביות והשליליות, כמו גם את הצינורות הניסיוניים בארונות התקשורת לחשבון עבור הטיה הקשורה למיקום17.
- הכינו את החומרים הבאים לצד הצמחים שגדלו באופן הידרופונטי: מספריים לחיתוך, מנה רדודה עם מים, מגבוני משימות עדינים, הצינורות ה69 המכילים את כבלי הכימיקלים השונים.
- חזור על השלבים הבאים עבור כל אחד מהצומח שיטופל. נבט החמניה יישאר תמיד במחזיק הזרעים.
- הרם בזהירות את מחזיק הזרעים וטבול במהירות את השורש לתוך המנה הרדודה המכילה מים.
- חותכים את השורש הראשי מתחת למים כדי למנוע הקשרות. החתך אמור להתרחש 0.8-1 ס מ מתחת לקצה הבזלי ביותר של מחזיק הזרע.
- שיבוץ הצמח לחתוך טרי לתוך אחד הצינורות המכילים את הכימיקלים.
- אם יש טיפות של מים על הפחם, בעדינות לייבש אותם עם מחיקה עדין משימה.
הערה: יש לבצע את ארבעת השלבים האלה במהירות האפשרית (10 דקות או פחות) כדי למנוע חוסר עקביות במחקר הקינטיקה.
- להעביר את הצמחים תחת מצלמת הדמיה תרמית ולהבטיח כי כל הצמחים נמצאים בתוך שדה התצוגה של המצלמה. כוונן את גובה המצלמה ואת מיקום המדפים לפי הצורך.
7. הקלטה
- מקד את המצלמה לפני השטח של מספרי החשבונות על-ידי הקשה על Ctrl + Alt + A.
- עכבר מעל הכפתור האדום ולחץ על הקלטת אפשרות סרט . חלון חדש המאשר את ההקלטה צריך להיפתח.
- הפסק את ההקלטה 1-2 שעות לאחר מכן.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
8. איסוף נתונים
- עבור לקובץ | פתח | חפש את הנכון. קובץ SEQ ופתיחתו.
- . תפסיק לשחק את הסרט
- בצד שמאל של החלון הראשי, לחץ על הוסף מדידה הסמן ROI (3x3 פיקסלים) סמל. ROI מייצג את אזור הריבית.
- עכבר מעל המרכז של cotyledon של הצמח הראשון ולחץ שמאלה פעם אחת. הסמן 1 נמצא כעת במקומו. סמן את החותם השני של הצמח הראשון על-ידי חזרה על ההליך. יש לציין את סדר התוויות.
- חזור על ההליך. יש לתייג את כל הצמחים באמצעות שני סמנים.
- לחץ על הסמל ' ערוך ROIs '. בחלון הראשי, עזב לחץ והחזק בפינה השמאלית העליונה וגלול לפינה הימנית התחתונה כדי לבחור את כל ROIs.
- עכבר מעל סמל המציג הסטטיסטי ובחר מגרש זמני. חלון חדש ייפתח.
- . תריץ את הסרט גרף ימלא את הנתונים.
- בחלון זה, לחץ על החץ הכפול בפינה הימנית העליונה כדי לפתוח תפריט חדש.
- לחץ על סמל שמור . שמור כערכי X ו-Y בהתוויה (. csv). סגור את התוכנה לאחר ייצוא הנתונים.
9. ניתוח נתונים
- פתח את קובץ ה-. csv באמצעות תוכנת ניתוח נתונים (לדוגמה, Microsoft Excel). שים לב ששלושת העמודות הראשונות (A עד C) מספקות מידע אודות מספר המסגרת, הזמן המוחלט והזמן היחסי. העמודות הנותרות נותנות את הטמפרטורה של כל ROI לאורך זמן.
- להחליט על אופי הכלי הסטטיסטי לשימוש; החלטה זו תלויה בגורמים שונים, לרבות התכנון הניסיוני.
הערה: בדוגמה שלנו, ציון רגיל או תוצאת z, מחושב עבור כל דוגמה המבוססת על ממוצע אוכלוסיה וסטיית תקן של אוכלוסיה. עבור כל דוגמה, ערך p מחושב לאחר מכן מתוצאת ה-z. שיטה זו מאפשרת אישור של הפקדים חיוביים ושליליים, כמו גם זיהוי תרכובות חדשות להיבדק יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניסוי באמצעות הצבע האדום אריתרופוסין B (0.8 kda) מדגים את היכולת של כימיקלים להיות נספג בעליל דרך שורש לחתוך לתוך פסיגי של שתיל חמניות בתוך 10 דקות (איור 1).
כאשר הצמחים מטופלים עם ABA, עלייה בטמפרטורת העלה מזוהה פסיגי חמניות בתוך דקות. הגידול בטמפרטורת העלה משויך לירידה בהפחתת הצמצם ומוליכות הפעולה. טמפרטורה מוגברת שקרן הוא נצפתה 15 דקות לאחר הטיפול עם 10 μM ABA (p-value = 0.02) ו 20 דקות עם 5 μM ABA (p-ערך = 0.003) (איור 2). באופן כללי, תוצאות אלה מראות כי מדידות של טמפרטורת עלה על ידי הדמיה תרמית היא פרוקסי טוב למדידת מפתח הצמצם ומוליכות.
איור 3 מראה הוכחת ניסוי המושג באמצעות תת-קבוצה של 20 כימיקלים מאוסף NatProd למד עם חיובי (100 ΜM ABA) ופקדים שליליים. בניסוי מייצג זה, טיפול סטטיסטי מבוסס-ניקוד מאפשר זיהוי כימיקלים המקדם את הסגר או, בעוד שהצריכה להיות ממוטבת למטרה ספציפית זו, כימיקלים לקידום הפתיחה. בדוגמה הנתונה, הדמיית מפת חום של הציונים הסטנדרטיים מאפשרת זיהוי מהיר של כימיקלים #02 ו#16 כמועמדים פוטנציאליים.
איור 4 מסכם את השלבים החשובים של זרימת העבודה.
איור 1: האפקטיביות של הגישה השורש לחתוך הגשת. (א) שתיל הניזון 1 h עם אריתרופוסין B ב 10 מ"מ MES-KOH (pH = 6.2) הוא בעליל אדום (התמונההימנית) לעומת השליטה (התמונה השמאלית). התמונות צולמו לאחר האכלה השורש לחתוך ואחריו הדגירה לילה באתנול מוחלט כדי להסיר את פיגמנטים הצמח הטבעי. בר = 10 מ"מ. (ב) הצטברות של אריתרופוסינוס B בקוטיוונים לאורך זמן. אריתרופוסין B ניתן להבחין על-ידי ספקטרופוטומטר ב תמציות צמחים מ פסיגי 8 דקות (p-value = 0.032) לאחר העברת שתלי שורש בחתך חמניות לצבוע. קווי שגיאה מציינים את SEM. * מציין ערך p < 0.05 (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: היחסים בין טמפרטורת העלה, שיניים מפתח ומוליכות כדי להפגין רגישות של התכנון הניסיוני. (א) דמות מייצגתהמציגה הבדלים בטמפרטורת העלה בין 100 ΜM aba מטופלים (+ aba) ו-לא מטופלים (בקרה) שתילי חמניות לאחר 30 דקות דמיינו על ידי דימות תרמי. (ב) משמאל: צמחים שטופלו עם 100 ΜM ABA עבור 30 דקות להראות טמפרטורה מוגברת לעומת הצמחים בקרה (* מציין p-ערך < 0.01), n = 3). הזכות: מדידות של מיפתח הצמצם על קליפות עוריות מן הצמחים אותם להראות ירידה בפתח הצמצם (רוחב/אורך) (* מציין p-value < 0.01, n = 3, מספר סטואטה לכל צמח ≈ 162). (ג) מוליכות העלה מוערכת עם פורמטר עלה וביחד עם מדידות טמפרטורת העלה מראים כי יש קורלציה חזקה (מקדם של פירסון =-0.89, n = 6) בין הטמפרטורה משטח העלה לבין מוליכות הכוח. צמחים שטופלו עם 100 μM ABA עבור 30 דקות להראות טמפרטורה מוגברת וירידה מוליכות בהשוואה לצמחי בקרה (n = 6). (ד) מינון-תגובה מראה טמפרטורה מופחתת עלה בצמחים שטופלו עם ריכוזי ABA נמוך כמו 5 μm לאחר 20 דקות של טיפול (p-value = 0.0037, n = 3). קווי שגיאה מציינים את SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הנציגה נובעת מהקרנה של 20 תרכובות כימיות. (א) החום מפת Z-ציונים משקפים תגובות הצמח 20 תרכובות נבדק בטריליטים. אדום כהה וכחול כהה מצביעים על רמת הביטחון של > 99% עבור הסגר ופתיחה, בהתאמה. שישה צמחים טופלו עם DMSO (שליטה), שלושה טופלו עם 100 μM ABA, וצמחים אחרים טופלו עם 100 μM של כימיקלים ב טרילקאט. צמחים מגיבים למתחם 16 (C16) להראות הסגר מיניים דומה לזה שנצפה בצמחים מטופלים ABA. שני צמחים מתוך שלושה מטופלים עם מתחם 2 (C02) להראות עלייה משמעותית הפתיחה. (ב) קינטיקה של תגובת צמחים לתרכובות 02 ו -16. שינויים ממוצעים בטמפרטורה לאורך זמן מוצגים עבור צמחים להגיב לטיפול בקרת (n = 6), 100 μM ABA (n = 3) או 100 μM של כל תרכובת (n = 3). קווי שגיאה מציינים את SEM. שינויים בטמפרטורה הם משמעותיים בעקביות לאחר 10 דקות של טיפול ב-ABA (p-value = 0.026, n = 3), 15 דקות של טיפול עם C16 (p-value = 0.030, n = 3) ו 71 דקות של C02 (p-value = 0.044, n = 3) לעומת שליטה. תנודות משותף על ידי כל הדגימות הוא רעש רקע בשל השליטה הדינמית של טמפרטורת הסביבה בחדר הגידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סיכום זרימת העבודה של ההקרנה. שים לב שהתמונות מייצגות שלבים חשובים ואינן תלויות זו בזו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר תרכובות שניתן לבחון ביום נתון תלוי בעיקר ב (i) מרחב הסביבה מבוקרת זמין לגדל את הצמחים לבצע את המסך, כמו גם (ii) מספר אנשים שיכולים להיות מעורבים בשלב 6 של הפרוטוקול. אנו ממליצים להשתמש בשלושה משכפל ניסיוני כדי לגבש את הפרשנות של התוצאות לאחר טיפול סטטיסטי. ביום אופייני, אחד לשני אנשים יכולים למסך 60 תרכובות בטריפליטים ללא קושי על ידי בדיקה לדוגמה [60 כימיקלים + 6 שלילי (DMSO) שולטת + 3 חיובי (ABA) שולטת] בבוקר, צהריים ואחר הצהריים.
שיטה זו נשענת על שתילים בריאים עם cotyledons מפותחים לחלוטין. כמו הדמיה מתרחשת מלמעלה, שתיל אידיאלי צריך להראות זווית של 90 ° בין ההיפוקטיל לבין להב cotyledonary כדי לאסוף מידע רב ככל האפשר. זווית זו מוסדר בעיקר על ידי אור, ולכן צריך להיות ממוטב על ידי התאמת התנאים גדל. התוצאות שלנו מראות כי זה לוקח בערך 10 דקות כדי כימיקל להגיע פסיגי ועוד כמה דקות להגיב כימית כגון ABA. התבוננות זו הופכת את שלב 6.4 לשלב הרגיש ביותר בפרוטוקול. לכן חשוב להתייחס לכל הצמחים בתוך פחות מ -15 דקות כדי למנוע אי-התאמות בין התגובות במפעל. בין הגורמים החיצוניים שמשפיעים באופן פסיבי על מדידות טמפרטורה שקרנית, אוורור עשוי להציג ביוסים הקשורים לעמדה או שינויים משמעותיים בין המשכפלת. המשתמשים צריכים לנקוט זהירות על-ידי שליטה בזרימות אוורור והגבלת בדיקות הקשורות למיקום על ידי הפצת הדגימות באופן אקראי לפני ההקלטה. כדי להתחשב בגורמים פוטנציאליים אחרים, יש לבצע הקלטה תחת טמפרטורה דומה, לחות ותנאי תאורה לאלה המשמשים לגידול הצמחים מאחר ששינויים כלשהם בתנאים אלה עשויים להשפיע על סגירת שיניים ו/או טמפרטורה שקרנית. לבסוף, תרכובת מסוגלת לווסת את סגירת הסגירה צריך להיות מוערך על הרעילות שלה. זה מחזיק נכון במיוחד אם המתחם מפעיל את הסגר, כפי שהוא ידוע כתוצאה עקיפה של לחץ אינטנסיבי מנוסה על ידי הצמח.
על ידי מתן שיטת מסירה יעילה של אקטיביים מולקולות ושיטה למדוד ישירות דיות הצמח, פרוטוקול זה מתייחס כמה חסרונות הקשורים גישות ההקרנה הנוכחית, כפי שהוזכר במבוא. הפרוטוקול שלנו הוא לא בלעדי שתילי חמניות ניתן להחיל על רוב dicots עם היפוקטיל כדי cotyledon זווית של 90 °. הדמיה תרמית של arabidopsis פסיגי הוא יעיל18,19 והפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם לשתילים עם פסיגי קטנים באופן דומה. בנוסף, הדמיה כלורופיל פלואורסצנטית יכול לשמש כדי למדוד ביצועים פוטוסינתטיים בשילוב. בעוד פחות זמן, מדידות של הצטברות דיות מונחה ב פסיגי של אריתרופוסין B הוסיף לכל כימיקל יכול לשמש כדי להעריך את התעריפים דיות אם מצלמת הדמיה תרמית אינה זמינה. בסך הכל, זו שיטת ההקרנה בקנה מידה גדול מעריך ביעילות את התגובה צמח שקרן מולקולות אקטיביים והוא בקלות להתאמה מגוון של יישומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
העבודה נתמכת על ידי פומונה College הסטארט-up קרנות מלגות הירש מימון הקרן (FJ), כמו גם את תוכנית הביולוגיה מולקולרית של מכללת פומונה באמצעות תוכנית עוזר מחקר הקיץ של כוכבי (ק ג).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant's Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
