Summary
Bir bileşik kitaplığın büyük ölçekli taraması ile foliar transpirasyon modülatörlerini tanımlamak için bir yöntem salıyoruz.
Abstract
Biyotik ve abiyotik streslere bitki adaptasyonu çeşitli faktörler tarafından yönetilir, aralarında su açığı veya patojenlere yanıt olarak stomatal diyafram düzenlenmesi önemli bir rol oynar. Bu nedenle stomatal hareketi düzenleyen küçük moleküllerin tanımlanması, bitkilerin çevrelerine uyum sağlamalarının fizyolojik temelini anlamalarına katkıda bulunabilir. Stomatal hareketin düzenleyicilerini tanımlamak için kullanılan büyük ölçekli tarama yaklaşımlarının potansiyel sınırlamaları vardır: bazıları abscisik asit (ABA) hormon sinyal yolu üzerinde yoğun olarak dayanır, bu nedenle ABA-bağımsız mekanizmalar hariç, diğerleri ise bitki büyümesi ve gelişimi gibi dolaylı, uzun vadeli fizyolojik etkilerin gözlemine dayanır. Burada sunulan tarama yöntemi, bitkilerin kimyasal bir kütüphane ile büyük ölçekli tedavi termal görüntüleme ile transpirasyon doğrudan bir nicelik selektib ile birleştiğinde sağlar. Yaprak yüzeyinin soğuması ile transpirasyon yoluyla suyun buharlaşması ndan, termal görüntüleme zaman içinde stomatal iletkenlik değişiklikleri araştırmak için non-invaziv bir yaklaşım sağlar. Bu protokolde Helianthus annuus fideleri hidroponik olarak yetiştirilir ve daha sonra kök besleme ile tedavi edilir, birincil kök kesilir ve test edilen kimyasal içine batırılır. Zaman içindeki kotoledoner sıcaklık değişikliklerinin istatistiksel analizini takip eden termal görüntüleme, stomatal diyafram açıklığını modüle eden biyoaktif moleküllerin tanımlanmasına olanak sağlar. Kavram kanıtı deneylerimiz, bir kimyasalın kesik kökten ayçiçeği fidesinin karyolasına 10 dakika içinde taşınabileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, bitkiler olumlu bir kontrol olarak ABA ile tedavi edildiğinde, yaprak yüzey sıcaklığında bir artış birkaç dakika içinde tespit edilebilir. Böylece yöntemimiz stomatal diyafram açıklığını düzenleyen yeni moleküllerin etkin ve hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar.
Introduction
Bitkilerde stres toleransı moleküler, hücresel, gelişimsel ve fizyolojik özellikleri ve mekanizmaları çeşitli etkilenmiştir polijenik bir özelliktir1. Dalgalı bir ortamda bitkiler sürekli yeterli su muhafaza ve patojen invazyonu önlerken karbon için fotosentetik talebi dengelemek için stomatal hareketlerini modüle etmek gerekir2; ancak, bu trade-off "kararlar" tarafından yapılan mekanizmalar kötü anlaşılmaktadır3. Biyoaktif moleküllerin bitkilere tanıtılması fizyolojilerini modüle edebilir ve yeni düzenleme mekanizmalarının araştırılmasına yardımcı olabilir.
Küçük moleküllerin büyük ölçekli tarama kısa bir süre içinde moleküllerin binlerce yüzlerce fizyolojik etkilerini test etmek için anti-kanser ilaç keşif ve farmakolojik tahliller kullanılan etkili birstratejidir 4,5. Bitki biyolojisinde, yüksek iş bölümü taraması örneğin sentetik molekül pyrabactin6'nın belirlenmesinde ve abscisik asit (ABA)7,8'inuzun zamandır aranan reseptörünün keşfinde etkinliğini göstermiştir. O zamandan beri, ABA reseptörlerinin agonistleri ve antagonistleri ve ABA indüklenebilir muhabir genlerin ekspresyonunu modüle edebilecek küçük moleküller tespit edilmiştir9,10,11,12,13,14,15. Stomatal diyafram ı modüle edilebilen küçük bileşikleri tanımlamak için mevcut olan yüksek iş gücü tarama yaklaşımlarının bazı sakıncaları vardır: (i) ABA sinyal yolu etrafında dönen protokoller yeni ABA-bağımsız mekanizmaların tanımlanmasını engelleyebilir ve (ii) biyoaktif küçük moleküllerin tanımlanmasında kullanılan in vivo stratejileri öncelikle tohum çimlenmesi veya tohumlama perling büyümesi üzerindeki fizyolojik etkilerine dayanır, bitki transpirasyonun düzenlenmesine değil.
Ayrıca, biyoaktif moleküller ile bitkilerin tedavisinde birçok yolu olmakla birlikte, bunların çoğu iyi stomatal hareketin büyük ölçekli bir çalışma için uygun değildir. Kısaca, üç en yaygın teknikleri püskürtme veya daldırma, kök sisteminin tedavisi ve kök sulama ile foliar uygulamasıdır. Yaprak yüzeyinde damlacıkların varlığı büyük ölçekli veri toplama ile engel olduğundan Foliar uygulaması stomatal diyafram ölçmek için en yaygın ve hızlı metodolojileri ile uyumlu değildir. Kök sulamanın başlıca sınırlamaları büyük numune hacmi gereksinimleri, bileşiklerin rizosferdeki elementler tarafından potansiyel olarak tutulması ve aktif kök alımına duyulan güvendir.
Burada, mutlaka ABA içermeyen bitki transpirasyon unu düzenleyen yeni bileşikler belirlemek için büyük ölçekli bir yöntem salıyoruz- veya bilinen kuraklık duyarlı mekanizmalar ve bitkilerin verimli ve güvenilir tedavi sağlar. Bu sistemde Helianthus annuus bitkileri, hidroponik olarak yetiştirilen fidelerin ana kökünü kesmeve kesme alanını numune çözeltisine daldırmaktan oluşan bir kök besleme yaklaşımı kullanılarak tedavi edilir. Tedavi edildikten sonra, bitkilerin transpirasyonu üzerinde her bileşiğin etkisi kızılötesi termal görüntüleme kamerası kullanılarak ölçülür. Yaprak yüzey sıcaklığının önemli bir belirleyicisi yapraktan buharlaşma oranı olduğundan, termal görüntüleme verileri stomatal iletkenlik ile doğrudan ilişkili olabilir. Kimyasal arıtma sonrasında foliar sıcaklığındaki göreceli değişim böylece bitki transpirasyon ölçmek için doğrudan bir araç sağlar.
H. annuus dünyanın en büyük beş yağlı tohum bitkileri biridir16 ve keşifler doğrudan bu bitki üzerinde yapılan teknolojinin gelecekteki transferleri kolaylaştırabilir. Buna ek olarak, H. annuus fideleri büyük ve düz cotyledons yanı sıra kalın bir birincil kök, bu protokolün geliştirilmesi için ideal olan var. Ancak, bu yöntem kolayca diğer bitkiler ve bileşiklerin çeşitli adapte edilebilir.
Bu protokol, stomatal kapanmayı tetikleyebilen molekülleri etkili bir şekilde tanımlamak veya stomatal açıklığı teşvik etmek için kullanılabilir, bu da stomatal iletkenliği ve bitki adaptasyonlarını düzenleyen sinyalleri anlamak için önemli sonuçlar doğurabilir. strese neden olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bitkilerin yetiştirimi
- Standart 10 inç x 20 in. (254 mm x 501 mm) deliksiz bitki tepsilerine 4 cm kalınlığında ince vermikülit tabakası ekleyin.
- Tohum tutucuları yerleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu) 2 cm arayla bitki tepsilerine.
- Tohum tutucuları vermikülitle doldurun.
- Her tohum tutucu aşağı sivri ucu ile bir ayçiçeği tohumu yerleştirin, böylece tohum yarısı maruz kalır aşağı iterek.
NOT: Ayçiçeği tohumu asimetriktir ve rakülin ortaya çıkacağı yerden sivri uç aşağıya doğru inmelidir. Tohum tutucular içinde kök ve sapın yeniden yönlendirmesi mümkün olmadığı için uygun tohum yerleşimi önemlidir. Tohumun yuvarlak ucu, tohum tutucunun üst kısmını geçmelidir. - Tohumlar yerleştirildikten sonra, ince vermikülit ek bir 2 cm kalınlığında tabaka ile kaplayın. Yukarıdan sisyaparak su. Yüzey bir saat sonra ıslak kalır. Bu durumda, kapakları ile tepsiler kapağı.
- Bir büyüme odası veya sera bitkileri büyümek. Önerilen koşullar 140 μmol foton·m-2·s-1 ışık yoğunluğu ve 22 °C'de 16 saat açık ve 20 °C'de 9 saat karanlık 5 gün boyunca fotoperatlardır.
NOT: Yüzey gözle görülür şekilde kurumadığı sürece sulama gerekli olmamalıdır.
2. Hidroponik sistemin kurulması
- Hidroponik olarak büyüyen bitkiler için uygun büyüklükte bir konteyner bulun. Konteynerin büyüklüğü büyüme odasında veya serada bulunan alana adapte edilmelidir. En az 15 cm derinlik önerilir.
- Kabı distile suyla doldurun ve üreticitarafından belirtildiği gibi genel hidroponik gübre ekleyin. Ortaya çıkan hidroponik çözelti hava ve su pompaları kullanılarak elde edilebilir ve sürekli hareket halinde olmalıdır.
- Hydroponics yüzen hazırlayın.
- 2 cm kalınlığında genişletilmiş polistiren köpükten bir levhayı (Bkz. Malzeme Tablosu)kabın boyutlarına kesin. Yaprak yosun büyümesini sınırlamak için kabın yüzeyinin çoğunu kapsayacak şekilde olmalıdır. Bir ahşap yakma aracı polistiren köpük kesmek için etkili ve bu protokol için yeterince çok yönlüdür.
DİkKAT: Polistiren köpüğün sıcak kesimi sırasında salınan duman veya buhar ciddi sağlık tehlikeleridir. Uygun solunum koruması kullanın. Kullanıcılar ayrıca köpük bir duman kaputunun altında keserek havalandırma gereksinimlerini karşılayabilir. - Bir odun yakma aleti kullanarak polistiren köpük levhadelik (çapı 1-2 cm) olun. İki deliğin merkezleri arasındaki mesafe deney ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Ancak en az 2,5 cm mesafe önerilir.
- 2 cm kalınlığında genişletilmiş polistiren köpükten bir levhayı (Bkz. Malzeme Tablosu)kabın boyutlarına kesin. Yaprak yosun büyümesini sınırlamak için kabın yüzeyinin çoğunu kapsayacak şekilde olmalıdır. Bir ahşap yakma aracı polistiren köpük kesmek için etkili ve bu protokol için yeterince çok yönlüdür.
3. Fidelerin hidroponik lere transferi ve bitki büyümesi
- Vermikülitten 5 günlük fideleri yavaşça çekin ve hemen 30 dakika boyunca su dolu bir kapta aktarın. Bu adım aşırı vermiküliti ortadan kaldırır ve kalan perikarps yumuşatır. Ortaya çıkan birincil kök görünür olmalıdır.
- Cotyledons gelecekteki genişleme optimize etmek için gerekirse elle pericarp duvarları çıkarın.
- Tohum tutucular içindeki fideleri polistiren köpük şamandırasına aktarın. 140 μmol foton·m-2·s-1ışık yoğunluğuna sahip bitkileri, %65'lik bağıl nem ve 22 °C'de 16 saat ışık ve 20 °C'de 9 saat karanlıkta 2 gün boyunca 16 saatlik bir fotoperest ile yetiştirin.
4. Tedavi öncesi hazırlık
NOT: Bu prosedür, 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) ve 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) içeren 100 mM MES-KOH (pH = 6.2) içeren 100 μM ABA ile, trilikat küçük bir bileşik kütüphaneden 20 kimyasal test etmek içindir 1% (v / v) dimetil sülfoksit (DMSO) pozitif ve negatif kontroller olarak.
- Tedaviye hazır yeterli bitki olduğundan emin olun. Tedaviye hazır bitkiler tam olarak ortaya çıkan cotyledons için yeterince olgun olmalıdır, ama yanal kök proliferasyonu minimal olduğu yeterince genç. Standart bir tarama yapmak için, 69 bu tür bitkiler gereklidir.
- -80 °C'lik dondurucudaki küçük bileşikleri içeren 96 kuyuluk plakayı çıkarın. Oda sıcaklığında çözülme.
- 1 M KOH ile 6,2 pH'a ayarlanmış 10 mM MES-KOH tamponunun 80 mL'sini hazırlayın.
- Etiket kapağıolmayan 2 mL mikrotüpler. Negatif kontrol tedavisi için en az altı tüp hazırlayın (10 mM MES-KOH (pH = 6.2) içeren 1% (v/v) DMSO). ABA tedavisi için üç tüp kullanın (10 mM MES-KOH pH'da 100 μM ABA = 6.2), pozitif kontrol). Triplicate 20 kimyasalların etkisini analiz etmek için kalan 60 tüpler kullanın.
- Her bir kimyasalın 10 μL'sini (DMSO'da 10 mM) uygun etiketlenmiş üç tüpün her birine aktarın. Pipet 10 μL 10 mM ABA DMSO'da üç tüp halinde, 10 μL DMSO ise altı kontrol tüpüne çözülmüştür.
DİkKAT: Doğası gereği bazı bileşikler ciddi sağlık etkilerine neden olabilir ve kullanıcılar uygun koruyucu önlemleri almalıdır. - 69 tüpün her birine 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) 990 μL ekleyin. MES tamponu, kimyasalı MES tamponuyla karıştırmak için yeterli güçle dağıtın, ancak kimyasallar ın ve MES tamponunun tüpten fışkırtacak kadar çok güç kullanmamaya dikkat edin. Alternatif olarak, düşük hızda girdap.
5. Termal görüntüleme kamerasını ayarlama
- Termal görüntüleme kamerasını bir fotokopi standına monte edin. Tüm kabloları dizüstü bilgisayara bağlayın.
NOT: Kayıt sıcaklık (20 °C ila 25 °C), nem (%50 ila %70) koşullarında yapılır. ve ışık kalitesi (110 ila 140 μmol foton·m-2·s-1)bitkilerin yetiştirimi için kullanılanlara benzer. - Kamerayı açın ve termal görüntüleme analiz yazılımını açın.
NOT: Sonraki kayıt talimatları kullanılan belirli bir yazılım için geçerlidir (bkz. Malzeme Tablosu). - Kayıt ayarlarını ayarlayın.
- Merkezi pencerenin üst kısmındaki kayıt kırmızıdüğmesinin üzerinden fare. Açılır menü görüntülenir. Anahtar simgesi Kayıt Ayarları'natıklayın.
- Uygun kayıt modunu ve seçeneklerini seçin. Kayıt periyodik seçeneği, dakikada bir kare yakalanan ve manuel durdurma kullanılabilir. Yazılımın videoyu kaydedeceği dosya hedefini not edin. Kayıt Ayarları penceresini kapatın.
6. Bitki hazırlama ve arıtma
- Kimyasalları içeren kapaksız tüpleri tüp raflarına yerleştirin. Alternatif olarak, bir polistiren köpük levha kesilebilir ve özel bir tüp raf yapmak için adım 2.3 açıklandığı gibi bir ahşap yakma aracı ile dürttü. Her deliğin çapı sıkıca tutmak için kapaksız tüplerin dış çapına çok yakın olmalıdır.
NOT: Kapaksız tüplerin nasıl yerleştirileceğine karar verirken dikkate alınması gereken kameranın görüş alanı sınırlayıcı bir faktördür. - Eşit pozisyon ayarı17hesaba raflarda pozitif ve negatif kontrol tüpleri yanı sıra deneysel tüpler dağıtmak.
- Hidroponik olarak yetiştirilen bitkilerin yanında aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: mikrodiseksiyon makası, su ile sığ bir tabak, hassas görev mendilleri, farklı kimyasallar içeren 69 kapaksız tüpler.
- Tedavi edilecek her bitki için aşağıdaki adımları tekrarlayın. Ayçiçeği filizi her zaman tohum tutucuda kalır.
- Dikkatle tohum tutucu kaldırın ve hızla su içeren sığ çanak içine kök daldırma.
- Kavitasyon önlemek için su altında birincil kök kesin. Kesme tohum tutucunun en bazal ucunun altında 0.8-1 cm olmalıdır.
- Yeni kesilmiş bitkiyi kimyasalları içeren tüplerden birine yerleştirin.
- Cotyledons üzerinde su damlası varsa, hafifçe hassas bir görev silme ile kuru dab.
NOT: Kinetik çalışmasındaki tutarsızlıkları önlemek için bu dört adım mümkün olduğunca çabuk (10 dk veya daha az) yapılmalıdır.
- Bitkileri termal görüntüleme kamerasının altına taşıyın ve tüm tesislerin kameranın görüş alanı içinde olduğundan emin olun. Kamera yüksekliği ve rafların konumunu gerektiği gibi ayarlayın.
7. Kayıt
- Ctrl + Alt + Atuşuna basarak kamerayı kotodonların yüzeyine odakla.
- Kırmızı düğmenin üzerinden fare ve Film Kaydet seçeneğini tıklatın. Kaydı onaylayan yeni bir pencere açılmalıdır.
- Kaydı 1-2 saat sonra durdurun.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
8. Veri toplama
- Dosyaya Git | Aç | Doğru için göz atın . SEQ dosya ve açın.
- Filmi oynamayı bırak.
- Ana pencerenin sol tarafında, ölçüm imleci Yatırım Getirisi (3x3 piksel) simgesi ekle'ye tıklayın. Yatırım Getirisi, İlgi Alanı anlamına gelir.
- Fare ilk bitkinin bir cotyledon merkezi üzerinde ve sol bir kez tıklayın. İmleç 1 artık yerinde. Prosedürü tekrarlayarak ilk tesisin ikinci cotyledon etiketleyin. Etiketlerin sırası belirtilmelidir.
- İşlemi tekrarlayın. Tüm bitkiler iki imleç ile etiketlenmelidir.
- ROIs'leri Edit simgesine tıklayın. Ana pencerede, sol tıklatın ve sol üst köşesinde tutun ve tüm ROI'ları seçmek için sağ alt köşeye kaydırın.
- İstatistik Görüntüleyici simgesinin üzerinde fare ve Zamansal Çizim'iseçin. Yeni bir pencere açılacak.
- Filmi yönet. Bir grafik verilerle doldurulur.
- Bu pencerede, yeni bir menü açmak için sağ üst köşedeki çift oku tıklatın.
- Kaydet simgesine tıklayın. Çizimde (.csv) X ve Y değerleriolarak kaydedin. Veriler dışa aktarıldıktan sonra yazılımı kapatın.
9. Veri analizi
- Veri analizi yazılımını (örneğin, Microsoft Excel) kullanarak .csv dosyasını açın. İlk üç sütunun (A'dan C'ye) kare sayısı, mutlak zaman ve göreli saat hakkında bilgi sağladığını unutmayın. Kalan sütunlar zaman içinde her Yatırım Getirisi'nin sıcaklığını verir.
- Kullanılacak istatistiksel aracın niteliğine karar verin; bu karar deneysel tasarım da dahil olmak üzere farklı faktörlere bağlıdır.
NOT: Örneğimizde, her örnek için nüfus ortalaması ve nüfus standardı sapması temel alınca standart bir puan veya z-skoru hesaplanır. Her örnek için bir p değeri z-skorundan hesaplanır. Bu yöntem, pozitif ve negatif kontrollerin onaylanmasının yanı sıra yeni bileşiklerin tanımlanmasının daha da test edilmesine olanak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kırmızı boya Eritrosin B (0.8 kDa) kullanılarak yapılan bir deney, kimyasalların 10 dakika içinde bir ayçiçeği fidesinin karyolalarına kesilmiş bir kök yoluyla gözle görülür bir şekilde emilme yeteneğini göstermektedir(Şekil 1).
Bitkiler ABA ile tedavi edildiğinde, birkaç dakika içinde ayçiçeği kotonlarında yaprak sıcaklığında bir artış tespit edilir. Yaprak sıcaklığındaki bu artış stomatal diyafram ve stomatal iletkenlikte bir azalma ile ilişkilidir. 10 μM ABA (p-değer = 0,02) ve 20 dk 5 μM ABA (p değeri = 0,003) ile tedaviden sonra 15 dk artış gözlenir (Şekil 2). Genel olarak, bu sonuçlar termal görüntüleme ile yaprak sıcaklığı ölçümleri stomatal diyafram ve iletkenlik ölçmek için iyi bir proxy olduğunu göstermektedir.
Şekil 3, NatProd Koleksiyonu'ndan pozitif (100 μM ABA) ve negatif kontrollerle 20 kimyasaldan oluşan bir alt küme kullanılarak konsept deneyinin bir kanıtıdır. Bu temsili deneyde, standart puan tabanlı istatistiksel tedavi, stomatal kapanmayı teşvik eden kimyasalların tanımlanmasına veya testin stomatal açıklığı teşvik eden kimyasalların belirli bir amaç için optimize edilmesi gerekirken, bu özel amaç için optimize edilmesine olanak sağlar. Verilen örnekte, standart puanların ısı haritası görselleştirilmesi kimyasalların #02 ve potansiyel adaylar olarak #16 hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar.
Şekil 4 iş akışının önemli adımlarını özetler.
Şekil 1: Kesilen kök besleme yaklaşımının etkinliği. (A) 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) içinde Eritrosin B ile 1 saat beslenen bir fide, kontrole (sol görüntü) göre gözle görülür şekilde kırmızıdır (sağ görüntü). Görüntüler doğal bitki pigmentleri kaldırmak için mutlak etanol bir gecede kuluçka ardından kesilmiş kök besleme sonra alınmıştır. Çubuk = 10 mm. (B) Zamanla kotoyledonlarda Eritrosin B birikimi. Eritrosin B, kesme kökü ayçiçeği fidelerinin boyaya aktarılmasından sonra kotolüdonlardan 8 dk (p-değer = 0.032) bitki özlerinde spektrofotometri ile saptanabilir. Hata çubukları SEM. * p değerini gösterir < 0,05 (n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yaprak sıcaklığı, stomatal diyafram ve iletkenlik arasındaki ilişkiler deneysel tasarımın hassasiyetini gösterir. (A) Termal görüntüleme ile 30 dakika görüntüledikten sonra 100 μM ABA ile (+ABA) ve tedavi edilmeyen (Kontrol) ayçiçeği fideleri arasındaki yaprak sıcaklığı farklılıklarını gösteren temsili görüntü. (B) Sol: 30 dk için 100 μM ABA ile tedavi edilen bitkiler kontrol tesislerine göre daha yüksek bir sıcaklık gösterir (* p-değerini gösterir < 0.01), n = 3). Sağ: aynı bitkilerden epidermal peeling stomatal diyafram ölçümleri stomatal diyafram bir azalma göstermektedir (genişlik / uzunluk) (* p-değeri gösterir < 0.01, n = 3, bitki başına stomata sayısı 』 162). (C) Yaprak gözenekölçeri ile ölçülen yaprak iletkenliği ve yaprak sıcaklığı ölçümleri ile birleştiğinde yaprak yüzey sıcaklığı ile stomatal iletkenlik arasında güçlü bir korelasyon (Pearson katsayısı = -0,89, n = 6) olduğunu göstermektedir. 30 dk boyunca 100 μM ABA ile tedavi edilen bitkiler, kontrol tesislerine göre sıcaklık artışı ve iletkenlik tesbit edilir (n = 6). (D) Doz-yanıt çalışması, 20 dk tedaviden sonra ABA konsantrasyonları 5 μM'ye kadar düşük olarak tedavi edilen bitkilerde yaprak sıcaklığının azaldığını göstermektedir (p-değeri = 0.0037, n = 3). Hata çubukları SEM. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 20 kimyasal bileşiğin taranması sonucunu temsil eder. (A) Üçlemelerde test edilen 20 bileşiğe bitki tepkilerini yansıtan Z-puanlarının ısı haritası. Koyu kırmızı ve koyu mavi stomatal kapatma ve açılış için sırasıyla %gt;99 güven düzeyini gösterir. Altı bitki DMSO (kontrol), üçü 100 μM ABA ile, diğer bitkiler ise 100 μM kimyasal ile trikifat ile tedavi edildi. Bileşik 16'ya (C#16) yanıt veren bitkiler, ABA ile işlenmiş bitkilerde görülene benzer bir stomatal kapanma gösterirler. Bileşik 02 (C#02) ile tedavi edilen üç bitkiden ikisi stomatal açıklıkta önemli bir artış göstermektedir. (B) Bileşikler 02 ve 16 bitkilerin tepki kinetiği. Kontrol tedavisine yanıt veren bitkiler için zaman içinde sıcaklıktaki ortalama değişimler (n = 6), 100 μM ABA (n = 3) veya her bileşiğin 100 μM 'si (n = 3) olarak gösterilir. Hata çubukları SEM. Sıcaklık değişiklikleri 10 dakika ABA tedavisinden sonra istatistiksel olarak anlamlıdır (p-değeri = 0.026, n = 3), C#16 ile 15 dk (p-değer = 0.030, n = 3) ve 71 dk C#02 (p değeri = 0.044, n = 3) kontrole göre. Tüm numuneler tarafından paylaşılan dalgalanmalar, büyüme odasındaki ortam sıcaklığının dinamik kontrolü nedeniyle arka plan gürültüsüdür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tarama iş akışının özeti. Görüntülerin önemli adımları temsil ettiğini ve birbirinden bağımsız olduğunu unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belirli bir günde test edilebilen bileşiklerin sayısı çoğunlukla (i) bitkileri büyütmek ve ekranı gerçekleştirmek için mevcut olan çevre kontrollü alana ve (ii) protokolün 6. İstatistiksel tedavi den sonra sonuçların yorumlanmasını pekiştirmek için üç deneysel kopya kullanılmasını öneriyoruz. Tipik bir günde, bir ila iki kişi örneğin [60 kimyasallar + 6 negatif (DMSO) kontrolleri + 3 pozitif (ABA) kontrolleri] sabah, öğle ve öğleden sonra] test ederek zorlanmadan triplicates 60 bileşikleri tarayabilirsiniz.
Bu yöntem, tam gelişmiş cotyledons ile sağlıklı fideler dayanır. Görüntüleme yukarıdan gerçekleştiğiiçin, ideal bir fide mümkün olduğunca çok bilgi toplamak için hipokotil ve kotodoner bıçak arasında 90 ° bir açı göstermelidir. Bu açı esas olarak ışık tarafından düzenlenir ve bu nedenle büyüyen koşullar ayarlayarak optimize edilmelidir. Sonuçlarımız, bir kimyasalın cotyledonlara ulaşmasının yaklaşık 10 dakika ve ABA gibi bir kimyasala yanıt vermenin birkaç dakika daha sürdüğünü göstermektedir. Bu gözlem, adım 6.4'ün protokoldeki en zamana duyarlı adım olduğunu gösteriyor. Bu nedenle, bitki yanıtları arasındaki tutarsızlıkları önlemek için 15 dk'dan daha kısa bir süre içinde tüm bitkileri belirli bir tinle tedavi etmek çok önemlidir. Foliar sıcaklık ölçümlerini pasif olarak etkileyen dış faktörler arasında, havalandırmanın çoğaltMalar arasında pozisyonla ilgili önyargılar veya önemli değişkenlikler ortaya çıkarma olasılığı yüksektir. Kullanıcılar, kayıt öncesi örnekleri rasgele dağıtarak havalandırma akışlarını kontrol ederek dikkatli olmalı ve pozisyonla ilgili önyargıları sınırlandırmalıdır. Diğer potansiyel faktörleri hesaba katmak için, bu koşullardaki herhangi bir değişiklik stomata kapatma ve/veya foliar sıcaklığını etkileyebileceğinden, bitkilerin büyümesi için kullanılanlara benzer sıcaklık, nem ve ışık koşullarında kayıt yapılmalıdır. Son olarak, stomatal kapama modüle edebilecek bir bileşik toksisitesi için değerlendirilmelidir. Bu bileşik stomatal kapatma tetikler eğer bu özellikle geçerlidir, bitki tarafından yaşanan yoğun stres dolaylı bir sonucu olarak bilinir.
Biyoaktif moleküllerin etkili bir dağıtım yöntemi ve bitki transpirasyonunu doğrudan ölçmek için bir yöntem sağlayarak, bu protokol, girişte belirtildiği gibi, mevcut tarama yaklaşımlarıyla ilişkili bazı sakıncaları ele alabiliyor. Protokolümüz ayçiçeği fidelerine özel değildir ve 90°'lik bir hipokotil ile çoğu dicot'a uygulanabilir. Arabidopsis cotyledons Termal görüntüleme etkili18,19 ve protokolümüz bu nedenle benzer küçük cotyledons ile fide adapte edilebilir. Buna ek olarak, klorofil floresan görüntüleme birlikte fotosentetik performansı ölçmek için kullanılabilir. Daha az zaman etkili olsa da, her bir kimyasala eklenen Eritrosin B'nin kotoyledonlarında transpirasyona dayalı birikim ölçümleri, termal görüntüleme kamerası yoksa transpirasyon oranlarını değerlendirmek için potansiyel olarak kullanılabilir. Toplamda, bu büyük ölçekli tarama yöntemi, bitki foliar yanıtını biyoaktif moleküllere etkin bir şekilde değerlendirir ve çeşitli uygulamalara kolayca uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Çalışma, Pomona College Start-up Funds ve Hirsch Research Inisiation Grants Fund (FJ'ye) ve Yıldız Yaz Araştırma Görevlisi Programı (KG) aracılığıyla Pomona College Moleküler Biyoloji Programı tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant's Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
