Summary
Vi tilbyr en metode for å identifisere modulatorer av foliar transpirasjon ved storskala screening av et sammensatt bibliotek.
Abstract
Plantetilpasning til biotiske og abiotiske påkjenninger styres av en rekke faktorer, blant annet regulering av stomatal blenderåpning som svar på vannunderskudd eller patogener spiller en avgjørende rolle. Identifisere små molekyler som regulerer stomatal bevegelse kan derfor bidra til å forstå det fysiologiske grunnlaget som planter tilpasser seg miljøet. Store screening tilnærminger som har blitt brukt til å identifisere regulatorer av stomatal bevegelse har potensielle begrensninger: noen stole tungt på abscisic acid (ABA) hormon signaling banen, derfor unntatt ABA-uavhengige mekanismer, mens andre stole på observasjon av indirekte, langsiktige fysiologiske effekter som plantevekst og utvikling. Screeningmetoden som presenteres her tillater storskala behandling av planter med et bibliotek av kjemikalier kombinert med en direkte kvantifisering av deres transpirasjon ved termisk avbildning. Siden fordampning av vann gjennom transpirasjon resulterer i bladoverflatekjøling, gir termisk avbildning en ikke-invasiv tilnærming til å undersøke endringer i stomatal konduktasjon over tid. I denne protokollen dyrkes Helianthus annuus frøplanter hydroponically og deretter behandlet ved rotfôring, der den primære roten kuttes og dyppes i kjemikaliet som testes. Termisk avbildning etterfulgt av statistisk analyse av kotyledonære temperaturendringer over tid gjør det mulig å identifisere bioaktive molekyler som modulerer stomatal blenderåpning. Våre konseptbeviseksperimenter viser at et kjemikalie kan bæres fra kuttroten til kosedonen til solsikkefrøingen innen 10 minutter. I tillegg, når planter behandles med ABA som en positiv kontroll, kan en økning i bladoverflatetemperaturen oppdages i løpet av minutter. Vår metode tillater dermed effektiv og rask identifisering av nye molekyler som regulerer stomatal blenderåpning.
Introduction
Stresstoleranse i planter er en polygen egenskap påvirket av en rekke molekylære, cellulære, utviklingsmessige og fysiologiske egenskaper og mekanismer1. Planter i et varierende miljø må kontinuerlig modulere sine stomatale bevegelser for å balansere den fotosyntetiske etterspørselen etter karbon samtidig som tilstrekkelig vann opprettholdes og forhindrer patogeninvasjon2; Men mekanismene som disse avveining "beslutninger" er gjort er dårlig forstått3. Innføring av bioaktive molekyler i planter kan modulere deres fysiologi og bidra til å undersøke nye reguleringsmekanismer.
Den store screeningen av små molekyler er en effektiv strategi som brukes i anti-kreft narkotika oppdagelse og farmakologiske analyser for å teste de fysiologiske effektene av hundrevis til tusenvis av molekyler i løpet av kort tid4,5. I plantebiologi har høy gjennomstrømning vist sin effektivitet for eksempel i identifisering av det syntetiske molekylet pyrabactin6, samt oppdagelsen av den ettertraktede reseptoren av abscisic acid (ABA)7,8. Siden da har agonister og antagonister av ABA-reseptorer, og små molekyler i stand til å modulere uttrykket av ABA-inducible reporter gener blitt identifisert9,10,11,12,13,14,15. Screeningtilnærminger med høy gjennomstrømning er tilgjengelig for å identifisere små forbindelser som kan modulere stomatal blenderåpning har noen ulemper: (i) protokoller som roterer rundt ABA-signalveien, kan forhindre identifisering av nye ABA-uavhengige mekanismer, og (ii) in vivo strategier som brukes for identifisering av bioaktive små molekyler stole primært på deres fysiologiske effekter på frø spiring eller frøplante vekst, og ikke på regulering av plantetranspirasjon per se.
I tillegg, mens det er mange måter å behandle planter med bioaktive molekyler, er de fleste av dem ikke godt egnet for en storstilt studie av stomatal bevegelse. Kort, de tre vanligste teknikkene er foliar søknad ved sprøyting eller dypping, behandling av rotsystemet, og rot vanning. Foliar-applikasjonen er ikke kompatibel med de vanligste og raskeste metodene for å måle stomatal blenderåpning siden tilstedeværelsen av dråper på bladoverflaten forstyrrer storskala datainnsamling. De store begrensningene for rotvanning er de store kravene til prøvevolum, den potensielle oppbevaringen av forbindelsene ved elementer i jordsfæren, og avhengigheten av aktivt rotopptak.
Her presenterer vi en storstilt metode for å identifisere nye forbindelser som regulerer plantetranspirasjon som ikke nødvendigvis involverer ABA- eller kjente tørkeresponsive mekanismer og gir effektiv og pålitelig behandling av planter. I dette systemet behandles Helianthus annuus planter ved hjelp av en rotfôringstilnærming som består av å kutte den primære roten av frøplanter dyrket hydroponically og dyppe kuttstedet inn i prøveløsningen. Når behandlet, effekten av hver forbindelse på transpirasjon av planter måles ved hjelp av en infrarød termisk bildekamera. Siden en viktig determinant for bladoverflatetemperatur er frekvensen av fordampning fra bladet, kan termiske bildedata være direkte korrelert til stomatal konduktasjon. Den relative endringen i foliar temperatur etter kjemisk behandling gir dermed et direkte middel til å kvantifisere anlegget transpirasjon.
H. annuus er en av de fem største oljefrøavlingene i verden16 og funn gjort direkte på dette anlegget kan lette fremtidige overføringer av teknologi. I tillegg har H. annuus frøplanter store og flate kotyledoner, samt en tykk primærrot, som var ideell for utviklingen av denne protokollen. Denne metoden kan imidlertid lett tilpasses andre planter og en rekke forbindelser.
Denne protokollen kan brukes til effektivt å identifisere molekyler som kan utløse stomatal lukking eller fremme stomatal åpning, som har store implikasjoner for å forstå signalene som regulerer stomatal konduktisering og plantetilpasning til miljømessige Understreker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrking av plantene
- Tilsett et 4 cm tykt lag med fin vermikulitt til standard 10 x 20 tommer (254 mm x 501 mm) plantebrett uten hull.
- Plasser frøholderne (se Materialtabell) 2 cm fra hverandre i plantebrettene.
- Fyll frøholdere med vermikulitt.
- Plasser et solsikkefrø med sin spisse ende ned i hver frøholder, og skyv ned slik at halvparten av frøet forblir utsatt.
MERK: Et solsikkefrø er asymmetrisk, og den spisse enden fra der radikelen vil dukke opp, bør peke nedover. Riktig frøplassering er viktig da reorientering av rot og stem ikke er mulig i frøholderne. Den avrundede enden av frøet skal strekke seg forbi toppen av frøholderen. - Når frøene er på plass, dekk dem med et ekstra 2 cm tykt lag med fin vermiculitt. Vann ved tåkeing ovenfra. Overflaten skal forbli våt etter en time. Hvis det er tilfelle, dekk skuffene med lokk.
- Dyrke planter i et vekstkammer eller et drivhus. Anbefalte forhold er en lysintensitet på 140 μmol fotoner·m-2·s-1 og en fotoperiode på 16 timer lys ved 22 °C og 9 t mørk ved 20 °C i 5 dager.
MERK: Vanning bør ikke være nødvendig med mindre overflaten blir synlig tørr.
2. Oppsett av hydroponisk system
- Finn en riktig størrelse beholder egnet for dyrking av planter hydroponically. Størrelsen på beholderen bør tilpasses plassen som er tilgjengelig i vekstkammeret eller drivhuset. En minimal dybde på 15 cm anbefales.
- Fyll beholderen med destillert vann og tilsett generell hydroponics gjødsel som indikert av produsenten. Den resulterende hydroponiskløsningen bør luftes og i konstant bevegelse, noe som kan oppnås ved hjelp av luft- og vannpumper.
- Forbered hydroponics flytere.
- Klipp et ark med 2 cm tykt ekspandert polystyrenskum (se Materialtabell)til dimensjonene på beholderen. Arket skal dekke det meste av overflaten av beholderen for å begrense veksten av alger. Et vedfyringsverktøy er effektivt for å kutte polystyrenskum og er allsidig nok for denne protokollen.
FORSIKTIG: Røyk eller damp som frigjøres under varm skjæring av polystyrenskum, er alvorlige helsefarer. Bruk riktig åndedrettsvern. Brukere kan også tilfredsstille ventilasjonskrav ved å kutte skummet under en røykhette. - Lag hull (1-2 cm i diameter) i polystyrenskumarket ved hjelp av et vedfyringsverktøy. Avstanden mellom sentrene på to hull kan justeres til behovene til eksperimentet. Det anbefales imidlertid en minimal avstand på 2,5 cm.
- Klipp et ark med 2 cm tykt ekspandert polystyrenskum (se Materialtabell)til dimensjonene på beholderen. Arket skal dekke det meste av overflaten av beholderen for å begrense veksten av alger. Et vedfyringsverktøy er effektivt for å kutte polystyrenskum og er allsidig nok for denne protokollen.
3. Overføring av frøplanter til hydroponics og plantevekst
- Trekk forsiktig ut 5-dagers gamle frøplanter fra vermiculitten og overfør umiddelbart til en beholder fylt med vann i 30 min. Dette trinnet vil fjerne overflødig vermiculite og myke de resterende pericarps. Den nye primære roten skal være synlig.
- Fjern perikarpveggene for hånd om nødvendig for å optimalisere den fremtidige utvidelsen av kotilonene.
- Overfør plantene i frøholderne til polystyrenskumflyteren. Vokse plantene med en lys intensitet på 140 μmol fotoner·m-2·s-1,en relativ fuktighet på 65% og en fotoperiode på 16 h lys ved 22 ° C og 9 t mørk ved 20 ° C i 2 dager.
4. Forberedelse før behandling
MERK: Denne prosedyren er for testing av 20 kjemikalier fra et lite sammensatt bibliotek i triplicate, med 100 μM ABA i 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) og 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) som inneholder henholdsvis 1 % (v/v) dimetylsulfoksid (DMSO) som henholdsvis positive og negative kontroller.
- Sørg for at det er nok planter klar til behandling. Planter klar for behandling bør være modne nok til å ha fullt utfoldet kotyledoner, men ung nok til at lateral rotspredning er minimal. For å gjøre en standard screening, er 69 slike planter nødvendig.
- Fjern 96-brønnplaten som inneholder de små forbindelsene fra -80 °C-fryseren. Tin ved romtemperatur.
- Forbered 80 ml MES-KOH-bufferen på 10 mM justert til en pH på 6,2 med 1 M KOH.
- Etikettcap-less 2 ml mikrorør. Forbered minst seks rør for behandling med negativ kontroll (10 mM MES-KOH (pH = 6,2) som inneholder 1 % (v/v) DMSO). Bruk tre rør til Behandling med ABA (100 μM ABA i 10 mM MES-KOH pH = 6,2), positiv kontroll). Bruk de resterende 60 rørene til å analysere effekten av de 20 kjemikaliene i triplicate.
- Overfør 10 μL av hvert kjemikalie (10 mM i DMSO) til hver av de tre passende merkede rørene. Rør 10 μL 10 mM ABA oppløst i DMSO i tre rør og 10 μL DMSO inn i de seks kontrollrørene.
FORSIKTIG: Av natur kan noen forbindelser forårsake alvorlige helseeffekter, og brukerne må ta nødvendige beskyttelsestiltak. - Tilsett 990 μL på 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) til hver av de 69 rørene. Dispenser MES-bufferen med nok kraft til å blande kjemikaliet med MES-bufferen, men vær veldig forsiktig så du ikke bruker så mye kraft at kjemikaliene og MES-bufferen spruter ut av røret. Alternativt, vortex ved lav hastighet.
5. Sett opp det termiske bildekameraet
- Monter det termiske bildekameraet på et kopieringsstativ. Koble alle kabler til en bærbar PC.
MERK: Opptaket gjøres under temperaturforhold (20 °C til 25 °C), fuktighet (50 % til 70 %) og lyskvalitet (110 til 140 μmol fotoner·m-2·s-1) lik de som brukes til å dyrke plantene. - Slå på kameraet og deretter den bærbare datamaskinen og åpne den termiske bildebehandlingsanalyseprogramvaren.
MERK: De påfølgende instruksjonene for opptak gjelder for en bestemt programvare som brukes (se Materialtabell). - Juster opptaksinnstillingene.
- Musen over den røde knappen øverst i det sentrale vinduet. En rullegardinmeny vises. Klikk på nøkkelikonet Postinnstillinger.
- Velg riktig postmodus og alternativer. Posten med jevne mellomrom alternativet, med en ramme fanget per minutt og en manuell stopp kan brukes. Legg merke til filmålet der programvaren lagrer videoen. Lukk vinduet Innstillinger for post.
6. Planteforberedelse og behandling
- Plasser de cap-less rør som inneholder kjemikalier i rørstativer. Alternativt kan et polystyrenskumark kuttes og stikkes med et vedfyringsverktøy som beskrevet i trinn 2.3 for å lage et tilpasset rørstativ. Diameteren på hvert hull skal være svært nær den ytre diameteren på de kanteløse rørene for å holde dem fast.
MERK: Kameraets synsfelt er en begrensende faktor som bør tas i betraktning når man bestemmer hvordan de cap-less rørene vil bli holdt på plass. - Fordele de positive og negative kontrollrørene jevnt og negativt i stativene for å ta høyde for posisjonsrelatert bias17.
- Forbered følgende materialer ved siden av plantene dyrket hydroponically: microdissection saks, en grunn tallerken med vann, delikate oppgaveservietter, de 69 cap-less rør som inneholder de forskjellige kjemikaliene.
- Gjenta følgende trinn for hver plante som skal behandles. Solsikkespiren vil alltid forbli i frøholderen.
- Løft forsiktig frøholderen og dypp roten raskt i den grunne parabolen som inneholder vann.
- Klipp den primære roten under vann for å forhindre kavitasjon. Kuttet skal forekomme 0,8-1 cm under den mest basalenden av frøholderen.
- Innfelt den nykuttede planten i et av rørene som inneholder kjemikaliene.
- Hvis det er noen dråper vann på kotyledonene, forsiktig dab dem tørr med en delikat oppgave tørk.
MERK: Disse fire trinnene må gjøres så raskt som mulig (10 min eller mindre) for å forhindre uoverensstemmelser i kinetikkstudien.
- Flytt plantene under det termiske bildekameraet og sørg for at alle planter er innenfor kameraets synsfelt. Juster kamerahøyde og stativer posisjon etter behov.
7. Opptak
- Fokuser kameraet til overflaten av kotilonene ved å trykke Ctrl + Alt + A.
- Mus over den røde knappen og klikk på alternativet Spill inn en film. Et nytt vindu som bekrefter at opptaket skal åpnes.
- Stopp opptaket 1-2 timer senere.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
8. Datainnsamling
- Gå til Fil | Åpne | Bla gjennom etter riktig . SEQ-filen og åpne den.
- Slutt å spille av filmen.
- Klikk på Legg til et ikon for målemarkør -TREKK (3x3 piksler). ROI står for Region of Interest.
- Mus over midten av en cotyledon av den første planten og venstre klikk en gang. Markøren 1 er nå på plass. Merk den andre kotilonen av den første planten ved å gjenta prosedyren. Rekkefølgen på etikettene bør noteres.
- Gjenta prosedyren. Alle planter bør merkes med to markører.
- Klikk på Rediger ROI-ikonet. I hovedvinduet, venstre klikk og hold øverst til venstre hjørne og bla til nederste høyre hjørne for å velge alle ROIer.
- Over statistikklisteikonet, og velg Temporal Plot. Et nytt vindu åpnes.
- Kjør filmen. En graf fylles med dataene.
- I dette vinduet klikker du på den doble pilen øverst til høyre for å åpne en ny meny.
- Klikk på Lagre-ikonet. Lagre som X- og Y-verdier i plottet (CSV). Lukk programvaren når dataene er eksportert.
9. Dataanalyse
- Åpne CSV-filen ved hjelp av en dataanalyseprogramvare (f.eks. Microsoft Excel). Vær oppmerksom på at de tre første kolonnene (A til C) gir informasjon om rammenummeret, den absolutte tiden og den relative tiden. De resterende kolonnene gir temperaturen på hver avkastning over tid.
- Bestem innholdet i det statistiske verktøyet som skal brukes; denne beslutningen avhenger av ulike faktorer, inkludert eksperimentell design.
MERK: I vårt eksempel beregnes en standardpoengsum, eller z-score, for hvert utvalg basert på populasjonsmiddelmiddel og populasjonsstandardavvik. For hvert eksempel beregnes en p-verdi deretter fra z-poengsummen. Denne metoden gjør det mulig å bekrefte de positive og negative kontrollene, samt identifisering av nye forbindelser som skal testes videre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksperiment ved hjelp av det røde farderet Erythrosine B (0,8 kDa) viser evnen til kjemikalier som skal synlig absorberes gjennom en kuttrot i kotyledonene til en solsikkefrø innen 10 minutter (figur 1).
Når planter behandles med ABA, oppdages en økning i bladtemperaturen i solsikkekotyledoner i løpet av minutter. Denne økningen i bladtemperaturen er forbundet med en reduksjon i stomatal blenderåpning og stomatal konduktans. Økt foliartemperatur observeres 15 min etter behandling med 10 μM ABA (p-verdi = 0,02) og 20 min med 5 μM ABA (p-verdi = 0,003) (figur 2). Samlet sett viser disse resultatene at målinger av bladtemperatur ved termisk bildebehandling er en god proxy for måling av stomatal blenderåpning og konduktans.
Figur 3 viser et konseptbevis eksperiment ved hjelp av en undergruppe på 20 kjemikalier fra NatProd Collection med positive (100 μM ABA) og negative kontroller. I dette representative eksperimentet tillater en standard-score-basert statistisk behandling identifisering av kjemikalier som fremmer stomatal lukking eller, mens analysen bør optimaliseres for det spesifikke formålet, kjemikalier som fremmer stomatal åpning. I det gitte eksemplet tillater en varmekartvisualisering av standardpoengsummene rask identifisering av kjemikalier #02 og #16 som potensielle kandidater.
Figur 4 oppsummerer de viktige trinnene i arbeidsflyten.
Figur 1: Effektiviteten av den kuttede rotfôringstilnærmingen. (A) En frøplante matet for 1 t med Erythrosine B i 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) er synlig rød (høyre bilde) i forhold til kontrollen (venstre bilde). Bildene ble tatt etter kutt rotfôring etterfulgt av en overnatting inkubasjon i absolutt etanol for å fjerne de naturlige plantepigmenter. Bar = 10 mm. (B) Akkumulering av Erythrosine B i kotyledoner over tid. Erythrosine B kan oppdages ved spektrofotometri i planteekstrakter fra kotyledoner 8 min (p-verdi = 0,032) etter overføring av cut-root solsikkefrøplanter til farsen. Feilfelt angir SEM. * angir p-verdi < 0,05 (n = 3). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Forholdet mellom bladtemperatur, stomatal blenderåpning og konduktans for å vise følsomheten til eksperimentell design. (A) Representativt bilde som viser forskjeller i bladtemperatur mellom 100 μM ABA-behandlet (+ABA) og ikke-behandlede (Kontroll) solsikkefrø etter 30 min visualisert ved termisk avbildning. (B) Venstre: planter behandlet med 100 μM ABA i 30 min viser økt temperatur sammenlignet med kontrollanlegg (* indikerer p-verdi < 0,01), n = 3). Høyre: Målinger av stomatal blenderåpning på epidermal skreller fra de samme plantene viser en reduksjon i stomatal blenderåpning (bredde/ lengde) (* indikerer p-verdi < 0,01, n = 3, antall stomata per plante ‰ 162). (C) Bladkonduksians målt med et bladporometer og kombinert med bladtemperaturmålinger viser at det er en sterk korrelasjon (Pearsons koeffisient = -0,89, n = 6) mellom bladoverflatetemperatur og stomatal ledning. Planter behandlet med 100 μM ABA i 30 min viser økt temperatur og redusert konduktans sammenlignet med kontrollanlegg (n = 6). (D) Doseresponsstudie viser redusert bladtemperatur i planter behandlet med ABA-konsentrasjoner så lave som 5 μM etter 20 min behandling (p-verdi = 0,0037, n = 3). Feilfelt indikerer SEM. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative resultater fra screening av 20 kjemiske forbindelser. (A) Varmekart over Z-score reflekterer plantesvar til 20 forbindelser testet i triplicates. Mørk rød og mørk blå indikerer konfidensnivå på henholdsvis >99 % for stomatal lukking og åpning. Seks planter ble behandlet med DMSO (kontroll), tre ble behandlet med 100 μM ABA, og andre planter ble behandlet med 100 μM kjemisk i triplicate. Planter som reagerer på sammensatte 16 (C # 16) viser en stomatal lukking som ligner på den som observeres i ABA-behandlede planter. To planter av tre behandlet med sammensatt ei forbindelse 02 (C#02) viser en betydelig økning i stomatal åpning. (B) Kinetikk av responsen av planter til forbindelser 02 og 16. Gjennomsnittlige temperaturendringer over tid er vist for planter som reagerer på kontrollbehandling (n = 6), 100 μM ABA (n = 3) eller 100 μM av hver forbindelse (n = 3). Feilfelt indikerer SEM. Temperaturendringer er konsekvent statistisk signifikante etter 10 min Behandling med ABA (p-verdi = 0,026, n = 3), 15 min behandling med C#16 (p-verdi = 0,030, n = 3) og 71 min C#02 (p-verdi = 0,044, n = 3) sammenlignet med kontroll. Svingninger som deles av alle prøvene er bakgrunnsstøy på grunn av den dynamiske kontrollen av omgivelsestemperaturen i vekstkammeret. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Sammendrag av screeningarbeidsflyten. Vær oppmerksom på at bildene representerer viktige trinn og er uavhengige av hverandre. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antall forbindelser som kan testes på en gitt dag avhenger for det meste av (i) den miljøkontrollerte plassen som er tilgjengelig for å dyrke plantene og å utføre skjermen, samt (ii) antall personer som kan være involvert i trinn 6 i protokollen. Vi anbefaler bruk av tre eksperimentelle replikaser for å konsolidere tolkningen av resultatene etter statistisk behandling. På en typisk dag kan en til to personer screene 60 forbindelser i triplicates uten problemer ved å teste for eksempel [60 kjemikalier + 6 negative (DMSO) kontroller + 3 positive (ABA) kontroller] om morgenen, midt på dagen og ettermiddagen.
Denne metoden er avhengig av sunne frøplanter med fullt utviklede kotyledoner. Etter hvert som avbildningen skjer ovenfra, bør en ideell frøplante vise en vinkel på 90° mellom hypokontylen og kotyledonbladet for å samle inn så mye informasjon som mulig. Denne vinkelen er hovedsakelig regulert av lys og bør derfor optimaliseres ved å justere vekstforholdene. Våre resultater viser at det tar rundt 10 min for et kjemikalie å nå kotyledonene og noen få minutter å svare på et kjemikalie som ABA. Denne observasjonen gjør trinn 6.4 det mest tidsfølsomme trinnet i protokollen. Det er derfor avgjørende å behandle alle plantene i en gitt analyse på mindre enn 15 min for å unngå avvik mellom plantesvarene. Blant de eksterne faktorene som passivt påvirker foliar temperaturmålinger, vil ventilasjon sannsynligvis innføre posisjonsrelaterte skjevheter eller signifikant variasjon blant replikater. Brukere bør utvise forsiktighet ved å kontrollere ventilasjonsstrømmer og begrense posisjonsrelaterte skjevheter ved å distribuere prøvene tilfeldig før opptak. For å ta høyde for andre potensielle faktorer, bør opptak gjøres under lignende temperatur, fuktighet og lysforhold til de som brukes til å dyrke plantene siden eventuelle endringer i disse forholdene kan påvirke stomata nedleggelse og / eller foliar temperatur. Til slutt bør en forbindelse som kan modulere stomatal lukking vurderes for toksisitet. Dette gjelder spesielt hvis forbindelsen utløser stomatal nedleggelse, som det er kjent for å være en indirekte konsekvens av intens stress opplevd av anlegget.
Ved å gi en effektiv leveringsmetode for bioaktive molekyler og en metode for å måle plantetranspirasjon direkte, tar denne protokollen for seg noen av ulempene forbundet med gjeldende screeningtilnærminger, som nevnt i introduksjonen. Vår protokoll er ikke eksklusiv for solsikkefrøplanter og kan brukes på de fleste dicots med en hypokontyl til kotyledonvinkel på 90°. Termisk avbildning av arabidopsis kotyledoner er effektiv18,19 og vår protokoll kan derfor tilpasses frøplanter med tilsvarende små kotyledoner. I tillegg kan klorofyllfluorescensavbildning brukes til å måle fotosyntetisk ytelse i kombinasjon. Mens mindre tidseffektive, målinger av transpirasjonsdrevet akkumulering i kotyledoner av Erythrosine B lagt til hvert kjemikalie kan potensielt brukes til å evaluere transpirasjonpriser hvis et termisk bildekamera ikke er tilgjengelig. I alt evaluerer denne store screeningmetoden effektivt plantefoliarrespons på bioaktive molekyler og er lett tilpasningsdyktig til en rekke bruksområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av Pomona College Start-up Funds and Hirsch Research Initiation Grants Fund (til FJ) samt Pomona College Molecular Biology Program gjennom Stellar Summer Research Assistant Program (til KG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant's Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
