Summary
Wir bieten eine Methode zur Identifizierung von Modulatoren der Blatttranspiration durch großangelegtes Screening einer zusammengesetzten Bibliothek.
Abstract
Die Anpassung der Pflanzen an biotische und abiotische Belastungen wird durch eine Vielzahl von Faktoren bestimmt, unter denen die Regulierung der stomatalen Öffnung als Reaktion auf Wasserdefizit oder Krankheitserreger eine entscheidende Rolle spielt. Die Identifizierung kleiner Moleküle, die die stomasale Bewegung regulieren, kann daher dazu beitragen, die physiologische Nergrundlage zu verstehen, auf der sich Pflanzen an ihre Umgebung anpassen. Groß angelegte Screening-Ansätze, die zur Identifizierung von Regulatoren der stomatalen Bewegung verwendet wurden, haben potenzielle Einschränkungen: Einige verlassen sich stark auf den Signalweg des Abbscisinsäure(ABA)-Hormons, wodurch ABA-unabhängige Mechanismen ausgeschlossen werden, während andere auf die Beobachtung indirekter, langfristiger physiologischer Effekte wie Pflanzenwachstum und -entwicklung angewiesen sind. Das hier vorgestellte Screening-Verfahren ermöglicht die großflächige Behandlung von Anlagen mit einer Bibliothek von Chemikalien in Verbindung mit einer direkten Quantifizierung ihrer Transpiration durch Wärmebildgebung. Da die Verdunstung von Wasser durch Transpiration zu einer Blattoberflächenkühlung führt, bietet die Wärmebildgebung einen nicht-invasiven Ansatz, um Veränderungen der stomataalen Leitfähigkeit im Laufe der Zeit zu untersuchen. In diesem Protokoll werden Helianthus annuus Sämlinge hydroponisch angebaut und dann durch Wurzelfütterung behandelt, bei der die Primärwurzel geschnitten und in die zu prüfende Chemikalie getaucht wird. Die Wärmebildgebung mit anschließender statistischer Analyse von kotyledonären Temperaturänderungen im Laufe der Zeit ermöglicht die Identifizierung bioaktiver Moleküle, die die stomamale Öffnung modulieren. Unsere Proof-of-Concept-Experimente zeigen, dass eine Chemikalie innerhalb von 10 Minuten von der geschnittenen Wurzel zum Kotyledon des Sonnenblumensämlings getragen werden kann. Darüber hinaus kann bei der Behandlung von Pflanzen mit ABA als Positivkontrolle innerhalb von Minuten ein Anstieg der Blattoberflächentemperatur festgestellt werden. Unsere Methode ermöglicht somit die effiziente und schnelle Identifizierung neuartiger Moleküle, die die stomatole Öffnung regulieren.
Introduction
Die Stresstoleranz bei Pflanzen ist ein polygener Merkmal, das durch eine Vielzahl molekularer, zellulärer, entwicklungs- und physiologischer Merkmale und Mechanismen beeinflusst wird1. Pflanzen in einer schwankenden Umgebung müssen ihre stomatoalen Bewegungen kontinuierlich modulieren, um den photosynthetischen Kohlenstoffbedarf auszugleichen und gleichzeitig ausreichend Wasser zu erhalten und eine Invasion von Krankheitserregern zu verhindern2; die Mechanismen, mit denen diese "Entscheidungen" zwischen diesen Kompromissen getroffen werden, werden jedoch schlecht verstanden3. Die Einführung bioaktiver Moleküle in Pflanzen kann ihre Physiologie modulieren und bei der Untersuchung neuer Regulationsmechanismen helfen.
Das groß angelegte Screening kleiner Moleküle ist eine effektive Strategie, die bei der Entdeckung von Krebsmedikamenten und pharmakologischen Assays verwendet wird, um die physiologischen Wirkungen von Hunderten bis Tausenden von Molekülen in kurzer Zeit zu testen4,5. In der Pflanzenbiologie hat das Hochdurchsatz-Screening seine Wirksamkeit beispielsweise bei der Identifizierung des synthetischen Moleküls Pyrabactin6sowie bei der Entdeckung des lang ersehnten Rezeptors von Abscisinsäure (ABA)7,8gezeigt. Seitdem wurden Agonisten und Antagonisten von ABA-Rezeptoren und kleinen Molekülen identifiziert, die in der Lage sind, die Expression von ABA-induzierbaren Reportergenen zu modulieren9,10,11,12,13,14,15. Derzeit verfügbare Hochdurchsatz-Screening-Ansätze zur Identifizierung kleiner Verbindungen, die die stomatole Blendung modulieren können, haben einige Nachteile: (i) Protokolle, die sich um den ABA-Signalweg drehen, können die Identifizierung neuartiger ABA-unabhängiger Mechanismen verhindern, und (ii) In-vivo-Strategien zur Identifizierung bioaktiver kleiner Moleküle beruhen in erster Linie auf deren physiologischen Auswirkungen auf die Samenkeimung oder das Sämlingswachstum und nicht auf die Regulierung der Pflanzentranspiration.
Darüber hinaus gibt es viele Möglichkeiten, Pflanzen mit bioaktiven Molekülen zu behandeln, aber die meisten von ihnen sind nicht gut für eine groß angelegte Studie der stomatoalen Bewegung geeignet. Kurz gesagt, die drei häufigsten Techniken sind Blattanwendung durch Sprühen oder Tauchen, Behandlung des Wurzelsystems und Wurzelbewässerung. Die Blattanwendung ist nicht mit den gebräuchlichsten und schnellsten Methoden zur Messung der stomatalen Blende kompatibel, da das Vorhandensein von Tröpfchen an der Blattoberfläche die großangelegte Datenerfassung beeinträchtigt. Die Haupteinschränkungen der Wurzelbewässerung sind die großen Probenvolumenanforderungen, die potenzielle Retention der Verbindungen durch Elemente in der Rhizosphäre und die Abhängigkeit von aktiver Wurzelaufnahme.
Hier stellen wir eine groß angelegte Methode zur Identifizierung neuer Verbindungen vor, die die Pflanzentranspiration regulieren, die nicht unbedingt ABA- oder bekannte Trockenheitsreaktionsmechanismen beinhalten und eine effiziente und zuverlässige Behandlung von Anlagen ermöglichen. In diesem System werden Helianthus Annuus-Pflanzen mit einem Wurzelfütterungsansatz behandelt, der darin besteht, die Primärwurzel von hydroponisch angebauten Sämlingen zu schneiden und die schnittstelle in die Probenlösung zu tauchen. Nach der Behandlung wird die Wirkung jeder Verbindung auf die Transpiration von Pflanzen mit einer Infrarot-Wärmebildkamera gemessen. Da eine wesentliche Determinante der Blattoberflächentemperatur die Verdunstungsrate des Blattes ist, können Wärmebilddaten direkt mit der stomatalischen Leitfähigkeit korreliert werden. Die relative Veränderung der Blatttemperatur nach chemischer Behandlung bietet somit eine direkte Möglichkeit, die Pflanzentranspiration zu quantifizieren.
H. annuus ist eine der fünf größten Ölsaaten pflanzen in der Welt16 und Entdeckungen direkt auf dieser Pflanze gemacht kann zukünftige Transfer von Technologie zu erleichtern. Darüber hinaus haben H. annuus Sämlinge große und flache Kotyledonen, sowie eine dicke Primärwurzel, die ideal für die Entwicklung dieses Protokolls war. Diese Methode kann jedoch leicht an andere Pflanzen und eine Vielzahl von Verbindungen angepasst werden.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Moleküle effektiv zu identifizieren, die in der Lage sind, stomatale Verschluss zu lösen oder die stomasale Öffnung zu fördern, was erhebliche Auswirkungen auf das Verständnis der Signale hat, die die stomatole Leitfähigkeit und Die Anpassung der Anlage an die Umwelt regulieren. Betont.
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Protocol
1. Anbau der Pflanzen
- Fügen Sie eine 4 cm dicke Schicht feinen Vermiculit s. auf Standard 10 in. x 20 in (254 mm x 501 mm) Pflanzenschalen ohne Löcher.
- Legen Sie die Saatguthalter (siehe Materialtabelle)2 cm voneinander entfernt in die Pflanzenschalen.
- Säwerthalter mit Vermiculit füllen.
- Legen Sie einen Sonnenblumenkern mit seinem spitzen Ende nach unten in jeden Samenhalter, drücken Sie nach unten, so dass die Hälfte des Samens ausgesetzt bleibt.
HINWEIS: Ein Sonnenblumenkern ist asymmetrisch und das spitze Ende, von dem aus der Strahler entstehen wird, sollte nach unten zeigen. Eine richtige Saatgutplatzierung ist wichtig, da die Neuausrichtung von Wurzel und Stamm innerhalb der Samenhalter nicht möglich ist. Das abgerundete Ende des Samens sollte sich über die Oberseite des Saatguthalters erstrecken. - Sobald die Samen an Ort und Stelle sind, bedecken Sie sie mit einer zusätzlichen 2 cm dicken Schicht feinen Vermiculit. Wasser durch Vernebeln von oben. Die Oberfläche sollte nach einer Stunde nass bleiben. Wenn dies der Fall ist, bedecken Sie die Schalen mit Deckeln.
- Wachsen Sie Pflanzen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus. Empfohlene Bedingungen sind eine Lichtintensität von 140 'mol Photonen'm-2's-1 und eine Photoperiode von 16 h Licht bei 22 °C und 9 h dunkel bei 20 °C für 5 Tage.
HINWEIS: Eine Bewässerung sollte nicht erforderlich sein, es sei denn, die Oberfläche wird sichtbar trocken.
2. Einrichtung des hydroponischen Systems
- Finden Sie einen entsprechend großen Behälter, der für den hydroponischen Anbau von Pflanzen geeignet ist. Die Größe des Behälters sollte an den Platz in der Wachstumskammer oder im Gewächshaus angepasst werden. Es wird eine minimale Tiefe von 15 cm empfohlen.
- Füllen Sie den Behälter mit destilliertem Wasser und fügen Sie allgemeinen Hydroponikdünger, wie vom Hersteller angegeben. Die resultierende hydroponische Lösung sollte belüftet und in konstanter Bewegung erfolgen, was durch den Einsatz von Luft- und Wasserpumpen erreicht werden kann.
- Bereiten Sie die Hydroponik-Floater vor.
- Schneiden Sie ein Blatt aus 2 cm dickem expandiertem Polystyrolschaum (siehe Materialtabelle)auf die Abmessungen des Behälters. Das Blatt sollte den größten Teil der Oberfläche des Behälters abdecken, um das Algenwachstum zu begrenzen. Ein Holzverbrennungswerkzeug ist effektiv zum Schneiden von Polystyrolschaum und vielseitig genug für dieses Protokoll.
VORSICHT: Dämpfe oder Dämpfe, die beim Warmschneiden von Polystyrolschaum freigesetzt werden, sind ernste Gesundheitsgefahren. Verwenden Sie den richtigen Atemschutz. Benutzer können auch Die Belüftungsanforderungen erfüllen, indem sie den Schaum unter eine Dunstabzugshaube schneiden. - Machen Sie Löcher (1-2 cm Durchmesser) in der Polystyrol-Schaumplatte mit einem Holzverbrennungswerkzeug. Der Abstand zwischen den Zentren von zwei Löchern kann an die Bedürfnisse des Experiments angepasst werden. Es wird jedoch ein mindester Abstand von 2,5 cm empfohlen.
- Schneiden Sie ein Blatt aus 2 cm dickem expandiertem Polystyrolschaum (siehe Materialtabelle)auf die Abmessungen des Behälters. Das Blatt sollte den größten Teil der Oberfläche des Behälters abdecken, um das Algenwachstum zu begrenzen. Ein Holzverbrennungswerkzeug ist effektiv zum Schneiden von Polystyrolschaum und vielseitig genug für dieses Protokoll.
3. Übertragung von Sämlingen auf Hydroponik und Pflanzenwachstum
- 5 Tage alte Sämlinge vorsichtig aus dem Vermiculit ziehen und sofort in einen mit Wasser gefüllten Behälter für 30 min geben. Dieser Schritt wird überschüssige Vermiculit entfernen und die verbleibenden Perikarpfen erweichen. Die entstehende primäre Wurzel sollte sichtbar sein.
- Entfernen Sie bei Bedarf die Pericarpwände von Hand, um die zukünftige Ausdehnung der Kotyledonen zu optimieren.
- Die Sämlinge innerhalb der Samenhalter auf den Polystyrolschaumschwimmer geben. Wachsen Sie die Pflanzen mit einer Lichtintensität von 140 'mol Photonen'm-2's-1, eine relative Luftfeuchtigkeit von 65% und eine Photoperiode von 16 h Licht bei 22 °C und 9 h dunkel bei 20 °C für 2 Tage.
4. Vorbereitung vor der Behandlung
ANMERKUNG: Dieses Verfahren dient zur Prüfung von 20 Chemikalien aus einer kleinen Verbundbibliothek in Dreifachausführung, wobei 100 M ABA in 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) und 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) 1% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO) als positive bzw. negative Kontrollen enthalten.
- Stellen Sie sicher, dass genügend Pflanzen bereit für die Behandlung sind. Pflanzen, die zur Behandlung bereit sind, sollten reif genug sein, um vollständig entfaltete Kotyledonen zu haben, aber jung genug, dass die seitliche Wurzelproliferation minimal ist. Für ein Standard-Screening werden 69 solcher Anlagen benötigt.
- Entfernen Sie die 96-Well-Platte, die die kleinen Verbindungen enthält, aus dem Gefrierschrank -80 °C. Bei Raumtemperatur auftauen.
- Bereiten Sie 80 ml 10 mM MES-KOH Puffer auf einen pH-Wert von 6,2 mit 1 M KOH eingestellt.
- Etikettenkappenlose 2 ml Mikroröhren. Bereiten Sie mindestens sechs Röhrchen für die Negativkontrollbehandlung vor (10 mM MES-KOH (pH = 6,2) mit 1% (v/v) DMSO). Verwenden Sie drei Röhren für die ABA-Behandlung (100 M ABA in 10 mM MES-KOH pH = 6,2), Positivkontrolle). Verwenden Sie die restlichen 60 Rohre, um die Wirkung der 20 Chemikalien in DreifacherSäure zu analysieren.
- Übertragen Sie 10 l jeder Chemikalie (10 mM in DMSO) in jedes der drei entsprechend gekennzeichneten Rohre. Pipetten Sie 10 l von 10 mM ABA in DMSO in drei Röhren und 10 l DMSO in die sechs Steuerrohre gelöst.
VORSICHT: Von Natur aus können einige Verbindungen schwerwiegende gesundheitliche Auswirkungen haben und Benutzer müssen geeignete Schutzmaßnahmen ergreifen. - Fügen Sie jedem der 69 Röhren 990 l von 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) hinzu. Geben Sie den MES-Puffer mit genügend Kraft aus, um die Chemikalie mit dem MES-Puffer zu mischen, aber achten Sie sehr darauf, nicht so viel Kraft zu verwenden, dass die Chemikalien und der MES-Puffer aus dem Rohr spritzen. Alternativ kann man bei niedriger Geschwindigkeit wirbeln.
5. Richten Sie die Wärmebildkamera ein
- Montieren Sie die Wärmebildkamera auf einem Kopierständer. Schließen Sie alle Kabel an einen Laptop an.
HINWEIS: Die Aufzeichnung erfolgt unter Temperaturbedingungen (20 °C bis 25 °C), Luftfeuchtigkeit (50 % bis 70 %) und Lichtqualität (110 bis 140 mol Photonen-2s-1) ähnlich denen, die zum Anbau der Pflanzen verwendet wurden. - Schalten Sie die Kamera dann den Laptop ein und öffnen Sie die Wärmebildanalysesoftware.
HINWEIS: Die nachfolgenden Anweisungen für die Aufzeichnung gelten für eine bestimmte verwendete Software (siehe Tabelle der Materialien). - Passen Sie die Aufnahmeeinstellungen an.
- Bewegen Sie die Maus über die rote Aufnahmetaste oben im zentralen Fenster. Ein Dropdown-Menü wird angezeigt. Klicken Sie auf das Schraubenschlüsselsymbol Record Settings.
- Wählen Sie den entsprechenden Datensatzmodus und die entsprechenden Optionen aus. Die Option "Aufzeichnung" in regelmäßigen Abständen, wobei ein Frame pro Minute erfasst und ein manueller Stopp verwendet werden kann. Beachten Sie das Dateiziel, an dem die Software das Video speichert. Schließen Sie das Fenster Datensatzeinstellungen.
6. Pflanzenvorbereitung und -behandlung
- Legen Sie die kappenlosen Rohre, die die Chemikalien enthalten, in Rohrregale. Alternativ kann ein Polystyrolschaumblech mit einem Holzverbrennungswerkzeug geschnitten und gestochen werden, wie in Schritt 2.3 beschrieben, um ein individuelles Rohrgestell herzustellen. Der Durchmesser jedes Loches sollte sehr nahe am Außendurchmesser der kappenlosen Rohre liegen, um sie fest zu halten.
HINWEIS: Das Sichtfeld der Kamera ist ein begrenzender Faktor, der bei der Entscheidung, wie die kappenlosen Rohre an Ort und Stelle gehalten werden sollen, berücksichtigt werden sollte. - Gleichmäßig verteilen Sie die positiven und negativen Kontrollrohre sowie die Versuchsrohre in den Racks, um eine positionsbezogene Verzerrung zu berücksichtigen17.
- Bereiten Sie neben den hydroponisch angebauten Pflanzen folgende Materialien vor: Mikrodissektionsschere, eine flache Schale mit Wasser, zarte Aufgabentücher, die 69 kappenlosen Rohre, die die verschiedenen Chemikalien enthalten.
- Wiederholen Sie die folgenden Schritte für jede zu behandelnde Pflanze. Der Sonnenblumensprosse bleibt immer im Samenhalter.
- Heben Sie den Samenhalter vorsichtig an und tauchen Sie die Wurzel schnell in die flache Schale, die Wasser enthält.
- Schneiden Sie die primäre Wurzel unter Wasser, um Kavitation zu verhindern. Der Schnitt sollte 0,8-1 cm unter dem basalsten Ende des Samenhalters erfolgen.
- Die frisch geschnittene Pflanze in eine der Schläuche, die die Chemikalien enthält, einbauen.
- Wenn es irgendwelche Tropfen Wasser auf den Kotyledonen gibt, leicht tumdrehen sie trocken mit einem empfindlichen Aufgabenwischen.
HINWEIS: Diese vier Schritte müssen so schnell wie möglich (10 min oder weniger) durchgeführt werden, um Inkonsistenzen in der Kinetikstudie zu vermeiden.
- Bewegen Sie die Pflanzen unter der Wärmebildkamera und stellen Sie sicher, dass sich alle Pflanzen im Sichtfeld der Kamera befinden. Passen Sie die Kamerahöhe und die Racks bei Bedarf an.
7. Aufnahme
- Fokussieren Sie die Kamera auf die Oberfläche der Cotyledons, indem Sie Strg + Alt + Adrücken.
- Bewegen Sie die Maus über die rote Taste und klicken Sie auf die Option Film aufnehmen. Ein neues Fenster, das die Aufzeichnung bestätigt, sollte geöffnet werden.
- Beenden Sie die Aufnahme 1-2 Stunden später.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
8. Datenerhebung
- Gehen Sie zu Datei | Öffnen | Suchen Sie nach der richtigen . SEQ-Datei und öffnen Sie sie.
- Beenden Sie die Wiedergabe des Films.
- Klicken Sie auf der linken Seite des Hauptfensters auf Ein Symbol für den Messcursor ROI (3x3 Pixel) hinzufügen. ROI steht für Region of Interest.
- Bewegen Sie die Maus über die Mitte eines Cotyledon der ersten Pflanze und klicken Sie mit der linken Maustaste einmal. Der Cursor 1 ist nun an Ort und Stelle. Beschriften Sie das zweite Cotyledon der ersten Pflanze, indem Sie das Verfahren wiederholen. Die Reihenfolge der Etiketten ist zu beachten.
- Wiederholen Sie den Vorgang. Alle Pflanzen sollten mit zwei Cursorn beschriftet werden.
- Klicken Sie auf das Symbol ROIs bearbeiten. Klicken Sie im Hauptfenster mit der linken Maustaste auf die linke obere Ecke, und scrollen Sie in die untere rechte Ecke, um alle ROIs auszuwählen.
- Bewegen Sie die Maus über das Symbol Statistic Viewer, und wählen Sie Temporal Plot. Ein neues Fenster wird geöffnet.
- Führen Sie den Film aus. Ein Diagramm wird mit den Daten gefüllt.
- Klicken Sie in diesem Fenster auf den Doppelpfeil in der oberen rechten Ecke, um ein neues Menü zu öffnen.
- Klicken Sie auf das Save-Symbol. Speichern als X- und Y-Werte im Plot (.csv). Schließen Sie die Software, sobald Daten exportiert wurden.
9. Datenanalyse
- Öffnen Sie die .csv-Datei mit einer Datenanalysesoftware (z. B. Microsoft Excel). Beachten Sie, dass die drei ersten Spalten (A bis C) Informationen über die Framenummer, die absolute Zeit und die relative Zeit enthalten. Die verbleibenden Säulen geben die Temperatur jedes ROI im Laufe der Zeit an.
- Entscheidung über die Art des zu verwendenden statistischen Instruments; diese Entscheidung hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich des experimentellen Entwurfs.
HINWEIS: In unserem Beispiel wird für jede Stichprobe ein Standardwert oder Z-Score basierend auf dem Mittelwert der Grundgesamtheit und der Standardabweichung der Grundgesamtheit berechnet. Für jede Stichprobe wird dann ein p-Wert aus dem z-Score berechnet. Mit dieser Methode können die Positiven- und Negativkontrollen sowie die Identifizierung neuer Verbindungen weiter getestet werden.
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Representative Results
Ein Experiment mit dem roten Farbstoff Erythrosin B (0,8 kDa) zeigt die Fähigkeit von Chemikalien, durch eine geschnittene Wurzel innerhalb von 10 Minuten sichtbar durch eine geschnittene Wurzel in die Kotyledonen eines Sonnenblumensämlings aufgenommen zu werden (Abbildung 1).
Wenn Pflanzen mit ABA behandelt werden, wird innerhalb weniger Minuten ein Anstieg der Blatttemperatur in Sonnenblumen-Cotyledons festgestellt. Dieser Anstieg der Blatttemperatur ist mit einer Abnahme der stomataalen Öffnung und stomataalen Leitfähigkeit verbunden. Erhöhte Blatttemperatur wird 15 min nach der Behandlung mit 10 'M ABA (p-Wert = 0,02) und 20 min mit 5 'M ABA (p-Wert = 0.003) beobachtet (Abbildung 2). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Messungen der Blatttemperatur durch Wärmebildgebung ein guter Proxy für die Messung der stomataalen Blende und Leitfähigkeit sind.
Abbildung 3 zeigt ein Proof-of-Concept-Experiment mit einer Teilmenge von 20 Chemikalien aus der NatProd-Sammlung mit positiven (100 M ABA) und Negativkontrollen. In diesem repräsentativen Experiment ermöglicht eine Standard-Score-basierte statistische Behandlung die Identifizierung von Chemikalien, die den stomatalen Verschluss fördern, oder, während der Test für diesen speziellen Zweck optimiert werden sollte, Chemikalien, die die stomasale Öffnung fördern. Im gegebenen Beispiel ermöglicht eine Heatmap-Visualisierung der Standardwerte die schnelle Identifizierung von Chemikalien #02 und #16 als potenzielle Kandidaten.
Abbildung 4 fasst die wichtigen Schritte des Workflows zusammen.
Abbildung 1: Wirksamkeit des Ansatzes der Schnittwurzelfütterung. (A) Ein Sämling, der für 1 h mit Erythrosin B in 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) gefüttert wird, ist im Vergleich zum Steuerelement sichtbar rot (rechtes Bild). Die Bilder wurden nach der geschnittenen Wurzelfütterung aufgenommen, gefolgt von einer nächtlichen Inkubation in absolutem Ethanol, um die natürlichen Pflanzenpigmente zu entfernen. Bar = 10 mm. (B) Akkumulation von Erythrosin B in Kotyledonen im Laufe der Zeit. Erythrosin B kann durch Spektrophotometrie in Pflanzenextrakten aus Cotyledonen 8 min (p-Wert = 0,032) nach der Übertragung von schnittwurzeligen Sonnenblumensämlingen auf den Farbstoff nachgewiesen werden. Fehlerbalken geben SEM an. * gibt den p-Wert < 0,05 (n = 3) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beziehungen zwischen Blatttemperatur, stomataler Blende und Leitfähigkeit, um die Empfindlichkeit des experimentellen Designs zu zeigen. (A) Repräsentatives Bild, das Unterschiede in der Blatttemperatur zwischen 100 -M ABA-behandelten (+ABA) und nicht behandelten (Control) Sonnenblumensämlingen nach 30 min durch Wärmebildgebung visualisiert zeigt. (B) Links: Pflanzen, die 30 min lang mit 100 m ABA behandelt wurden, weisen eine erhöhte Temperatur im Vergleich zu Kontrollanlagen auf (* zeigt p-Wert < 0,01), n = 3). Rechts: Messungen der stomatalen Blende an epidermalen Schalen aus denselben Pflanzen zeigen eine Abnahme der stomatalen Blende (Breite/Länge) (* zeigt p-Wert < 0,01, n = 3, Anzahl der Stomata pro Pflanze bei 162). (C) Die mit einem Blattporometer gemessene Blattleitfähigkeit und die mit Blatttemperaturmessungen gekoppelten Messungen zeigen, dass eine starke Korrelation (Pearson-Koeffizient = -0,89, n = 6) zwischen Blattoberflächentemperatur und stomataler Leitfähigkeit besteht. Pflanzen, die 30 min lang mit 100 m ABA behandelt wurden, weisen eine erhöhte Temperatur und eine verringerte Leitfähigkeit im Vergleich zu Kontrollanlagen auf (n = 6). (D) Die Dosis-Wirkungs-Studie zeigt eine reduzierte Blatttemperatur in Pflanzen, die nach 20 min Behandlung mit ABA-Konzentrationen von bis zu 5 m behandelt wurden (p-Wert = 0,0037, n = 3). Fehlerbalken zeigen SEM an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse aus dem Screening von 20 chemischen Verbindungen. (A) Heatmap von Z-Scores, die die Reaktion der Anlage auf 20 in Triplicaten getestete Verbindungen widerspiegeln. Dunkelrot und Dunkelblau weisen auf ein Konfidenzniveau von >99 % für den stomatalen Verschluss bzw. das Öffnen hin. Sechs Pflanzen wurden mit DMSO (Kontrolle) behandelt, drei mit 100 M ABA und andere Pflanzen mit 100 M Chemikalie in Dreifacharbeit. Pflanzen, die auf Die Verbindung 16 (C-16) reagieren, weisen einen stomatalen Verschluss auf, der dem in ABA-behandelten Pflanzen ähnelt. Zwei von drei Pflanzen, die mit der Verbindung 02 (C-02) behandelt wurden, weisen eine signifikante Zunahme der stomatoalen Öffnung auf. (B) Kinetik der Reaktion von Pflanzen auf die Verbindungen 02 und 16. Für Pflanzen, die auf die Kontrollbehandlung reagieren (n = 6), 100 M ABA (n = 3) oder 100 M jeder Verbindung (n = 3), werden durchschnittliche Temperaturänderungen im Zeitverlauf angezeigt. Fehlerbalken weisen auf SEM hin. Temperaturänderungen sind nach 10 min ABA-Behandlung (p-Wert = 0,026, n = 3), 15 min Behandlung mit C-16 (p-Wert = 0,030, n = 3) und 71 min C-02 (p-Wert = 0,044, n = 3) im Vergleich zur Kontrolle konsistent statistisch signifikant. Schwankungen, die von allen Proben geteilt werden, sind Hintergrundgeräusche aufgrund der dynamischen Steuerung der Umgebungstemperatur in der Wachstumskammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zusammenfassung des Screening-Workflows. Beachten Sie, dass die Bilder wichtige Schritte darstellen und voneinander unabhängig sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Anzahl der Verbindungen, die an einem bestimmten Tag getestet werden können, hängt hauptsächlich von (i) dem umweltkontrollierten Raum ab, der für den Anbau der Pflanzen und die Durchführung des Bildschirms zur Verfügung steht, sowie von (ii) von der Anzahl der Personen, die an Schritt 6 des Protokolls beteiligt werden können. Wir empfehlen die Verwendung von drei experimentellen Replikaten, um die Interpretation der Ergebnisse nach der statistischen Behandlung zu konsolidieren. An einem typischen Tag können ein bis zwei Personen 60 Verbindungen in Triplicaten problemlos abschirmen, indem sie beispielsweise [60 Chemikalien + 6 negative (DMSO) Kontrollen + 3 positive (ABA) Kontrollen] morgens, mittags und nachmittags testen.
Diese Methode beruht auf gesunden Sämlingen mit voll entwickelten Kotyledonen. Da die Bildgebung von oben erfolgt, sollte ein idealer Sämling einen Winkel von 90° zwischen dem Hypocotyl und der Kotyledonalklinge aufweisen, um so viele Informationen wie möglich zu sammeln. Dieser Winkel wird hauptsächlich durch Licht reguliert und sollte daher durch die Einstellung der Wachstumsbedingungen optimiert werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es etwa 10 Minuten dauert, bis eine Chemikalie die Kotyledonen erreicht und noch ein paar Minuten auf eine Chemikalie wie ABA reagieren. Diese Beobachtung macht Schritt 6.4 zum zeitkritischen Schritt im Protokoll. Es ist daher wichtig, alle Pflanzen in einem bestimmten Test in weniger als 15 min zu behandeln, um Abweichungen zwischen den Pflanzenreaktionen zu vermeiden. Unter den externen Faktoren, die sich passiv auf Blatttemperaturmessungen auswirken, führt die Belüftung wahrscheinlich zu positionsbezogenen Verzerrungen oder signifikanten Variabilitäten zwischen Replikationen. Benutzer sollten Vorsicht walten lassen, indem sie Lüftungsströme steuern und positionsbezogene Verzerrungen begrenzen, indem sie die Proben vor der Aufzeichnung nach dem Zufallsprinzip verteilen. Um anderen potenziellen Faktoren Rechnung zu tragen, sollte die Aufzeichnung unter ähnlichen Temperatur-, Feuchtigkeits- und Lichtbedingungen wie beim Anbau der Pflanzen erfolgen, da änderungen dieser Bedingungen den Verschluss und/oder die Blatttemperatur beeinträchtigen können. Schließlich sollte eine Verbindung, die in der Lage ist, den stomatoalen Verschluss zu modulieren, auf ihre Toxizität untersucht werden. Dies gilt insbesondere dann, wenn die Verbindung einen stomatoalen Verschluss auslöst, da es sich um eine indirekte Folge von intensivem Stress der Pflanze handelt.
Durch die Bereitstellung einer wirksamen Bereitstellungsmethode für bioaktive Moleküle und einer Methode zur direkten Messung der Pflanzentranspiration wird dieses Protokoll auf einige der Nachteile im Zusammenhang mit aktuellen Screening-Ansätzen eingelassen, wie in der Einleitung erwähnt. Unser Protokoll ist nicht ausschließlich für Sonnenblumen-Sämlinge und kann auf die meisten Dicots mit einem Hypocotyl-Zukotyledon-Winkel von 90° angewendet werden. Thermische Bildgebung von Arabidopsis cotyledons ist wirksam18,19 und unser Protokoll könnte daher an Sämlinge mit ähnlich kleinen Kotyledonen angepasst werden. Darüber hinaus könnte chlorophyllfluoreszenzbildgebungsbildgebung verwendet werden, um die photosynthetische Leistung in Kombination zu messen. Während weniger zeiteffektiv, Messungen der Transpirations-gesteuerten Akkumulation in Kotyledonen von Erythrosin B zu jeder Chemikalie hinzugefügt werden könnte potenziell verwendet werden, um Transpirationsraten zu bewerten, wenn eine Wärmebildkamera nicht verfügbar ist. Insgesamt bewertet dieses groß angelegte Screening-Verfahren die pflanzliche Blattreaktion auf bioaktive Moleküle effizient und ist leicht an eine Vielzahl von Anwendungen anpassbar.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde durch pomona College Start-up Funds und Hirsch Research Initiation Grants Fund (to FJ) sowie das Pomona College Molecular Biology Program durch das Stellar Summer Research Assistant Program (to KG) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
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