Summary
نحن وصف منصة التي تستخدم مكتبه من المضادات الحيوية القولونية المقاومة للمضادات الحيوية للحصول علي dereplication من المضادات. يمكن استنتاج هويه المضادات الحيوية التي تنتجها البكتيريا أو الفطريات من خلال نمو e. كولاي التي تعبر عن جين المقاومة الخاصة بها. وهذه المنصة فعاله اقتصاديا وذات كفاءه زمنيه.
Abstract
واحده من التحديات الرئيسية في البحث عن المضادات الحيوية الجديدة من مقتطفات المنتجات الطبيعية هو أعاده اكتشاف المركبات المشتركة. للتصدي لهذا التحدي ، يتم تنفيذ dereplication ، وهي عمليه تحديد المركبات المعروفة ، علي عينات من الفائدة. وأساليب الفصل بين الطرق ، مثل الانفصال التحليلي الذي يعقبه قياس الطيف الكتلي ، تستغرق وقتا طويلا وتستهلك الموارد بكثافة. لتحسين عمليه dereplication ، قمنا بتطوير منصة مقاومه المضادات الحيوية (ARP). و ARP هي مكتبه من حوالي 100 الجينات مقاومه المضادات الحيوية التي تم استنساخها بشكل فردي في القولونية. هذه المجموعة سلاله لديها العديد من التطبيقات ، بما في ذلك وسيله فعاله من حيث التكلفة وطريقه سهل لdereplication المضادات الحيوية. وتنطوي هذه العملية علي تخمير الميكروبات المنتجة للمضادات الحيوية علي سطح اطباق بتري المستطيلة التي تحتوي علي وسط صلب ، مما يسمح بإفراز ونشر نواتج الأيض الثانوية من خلال الوسط. بعد فتره التخمير 6 أيام, يتم أزاله الكتلة الحيوية الميكروبية, ويضاف أجار رقيقه تراكب إلى طبق بيتري لخلق سطح أملس وتمكين نمو سلالات المؤشر e. كولاي . ثم يتم تثبيت مجموعتنا من سلالات ARP علي سطح طبق بيتري الذي يحتوي علي المضادات الحيوية. يتم احتضان اللوحة التالية بين عشيه وضحيها للسماح للنمو e. كولاي علي سطح التراكب. فقط السلالات التي تحتوي علي مقاومه للمضادات حيوية معينه (أو فئة) تنمو علي هذا السطح مما يتيح التعرف السريع علي المجمع المنتج. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح للتعرف علي منتجي المضادات الحيوية المعروفة وكوسيلة للتعرف علي تلك التي تنتج المركبات الجديدة.
Introduction
منذ اكتشاف البنسلين في 1928 ، أثبتت المنتجات الطبيعية المستمدة من الكائنات المجهرية البيئية انها مصدر غني للمركبات المضادة للميكروبات1. وتستمد حوالي 80 ٪ من المضادات الحيوية المنتجات الطبيعية من البكتيريا من جنس العقديات وغيرها من الاكاكتيميتيز ، في حين يتم إنتاج 20 ٪ المتبقية من الأنواع الفطرية1. بعض السقالات المضادات الحيوية الأكثر شيوعا المستخدمة في العيادة مثل β-اكتام, التتراسيكلين, rifamycins, و الامينوغليكوسيدس, كانت في الأصل معزولة عن الميكروبات2. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع البكتيريا المقاومة للادويه المتعددة ، أصبحت اللوحة الحالية من المضادات الحيوية اقل فعاليه في العلاج3،4. وتشمل هذه العوامل المسببة للامراض "ESKAPE" (اي ، فانكوميسين مقاومه المكورات المعوية والمكورات العنقوديةالذهبية المقاومة للاكتام ، klebsiella الرئوية، الزائفة الزنجاريه، والانتيفه باومانيي، و المعوية sp.) ، وهي مجموعه فرعيه من البكتيريا التي تعتبر مرتبطة باعلي المخاطر من قبل عدد من السلطات الصحية العامة الرئيسية مثل منظمه الصحة العالمية3،4،5. ظهور وانتشار العالمي لهذه الممرضات المدرة للادويه يؤدي إلى حاجه مستمرة للمضادات الحيوية رواية3,4,5. ومما يؤسف له ان العقدين الماضيين اثبتا ان اكتشاف المضادات الحيوية الجديدة من المصادر الميكروبية يزداد صعوبة6. وتشمل النهج الحالية لاكتشاف المخدرات الفحص عاليه الانتاجيه للمركبات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك المنتجات الطبيعية المكتبات استخراج ، مما يسمح للاف من مقتطفات ليتم اختبارها في وقت معين2. ومع ذلك ، وبمجرد الكشف عن النشاط المضاد للميكروبات ، فان الخطوة التالية هي تحليل محتويات مستخرج الخام لتحديد المكون النشط والقضاء علي تلك التي تحتوي علي مركبات معروفه أو زائده عن الحاجة7،8. هذه العملية ، التي يشار اليها باسم dereplication ، أمر حيوي لمنع و/أو خفض كبير في الوقت المستغرق في أعاده اكتشاف المضادات الحيوية المعروفة7،9. علي الرغم من ان خطوه ضرورية في اكتشاف المخدرات المنتج الطبيعي ، dereplication المعروف شاقه وكثيفه الموارد10.
من اي وقت مضي منذ beutler et al. أولا صاغ مصطلح "dereplication" ، بذلت جهود واسعه لوضع استراتيجيات مبتكره للتعرف السريع علي المضادات الحيوية المعروفة11،12. اليوم الاداات الأكثر شيوعا المستخدمة في dereplication تشمل النظم التحليلية الكروماتوغرافي مثل اللوني السائل عاليه الأداء ، والطيف الكتلي ، والنووية الرنين المغناطيسي القائم علي طرق الكشف11،13. ومن المؤسف ان كلا من هذه الأساليب يتطلب استخدام معدات تحليليه باهظه التكاليف وتفسيرات متطورة للبيانات.
في محاولة لتطوير طريقه dereplication التي يمكن تنفيذها بسرعة دون المعدات المتخصصة ، انشانا منصة مقاومه المضادات الحيوية (ARP)10. يمكن استخدام ARP لاكتشاف المواد المضادة للمضادات الحيوية ، وتنميط مركبات المضادات الحيوية الجديدة ضد أليات المقاومة المعروفة ، و dereplication من المضادات الحيوية المعروفة في مقتطفات مشتقه من البكتيريا المخاطية والميكروبات الأخرى. هنا ، ونحن نركز علي تطبيقه في dereplication المضادات الحيوية. يستخدم ARP مكتبه من سلالات القولونية ايزوسيكيا التي تعبر عن جينات المقاومة الفردية التي تكون فعاله ضد المضادات الحيوية الأكثر شيوعا أعاده اكتشاف14,15. عندما تزرع مكتبه e. القولونية في وجود كائن ثانوي المنتجة المستقلب, يمكن استنتاج هويه المجمع عن طريق نمو السلالات e. القولونية التي تعبر عن الجينات المقاومة المرتبطة بها10. عندما تم الإبلاغ عن ARP لأول مره ، كانت المكتبة تتكون من > 40 جينات تمنح مقاومه لفئات المضادات الحيوية 16. تم تصميم قالب dereplication الأصلي لتشمل مجموعه فرعيه من جينات المقاومة لكل فئة المضادات الحيوية لتوفير المعلومات المتعلقة بالمضادات الحيوية فئة فرعيه خلال عمليه dereplication. اليوم ، يتكون ARP من > 90 الجينات التي تمنح مقاومه لفئات المضادات الحيوية 18. باستخدام لدينا مجموعه واسعه من الجينات المقاومة ، وقد تم تطوير قالب dereplication الثانوية ويعرف باسم منصة مقاومه المضادات الحيوية الحد الأدنى (MARP). تم إنشاء هذا القالب للقضاء علي التكرار الجيني وببساطه توفير المعلومات المتعلقة بفئة المضادات الحيوية العامة التي ترتبط المستقلب dereplicated. بالاضافه إلى ذلك ، فان قالب MARP تمتلك كل من النوع البري وسلاله القصور الفائقة/efflux من e. كولاي BW25113 (e. كولاي BW25113 ΔbambΔtolc)، مقارنه بالتجسيد الأصلي لل ARP ، والتي فقط يستخدم سلاله فرط نفاذيه. هذا الجانب فريدة من نوعها يخلق الأنماط الظاهرية اضافيه اثناء dereplication ، مما يدل علي قدره المركبات لعبور الغشاء الخارجي للبكتيريا سلبيه الجرام. هنا ، ونحن وصف بروتوكول قويه ليتم اتباعها عند المراوغة مع اما ARP و/أو MARP ، تسليط الضوء علي الخطوات الأكثر اهميه لاتباعها ، ومناقشه مختلف النتائج الممكنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعداد المكتبة القولونية الأسهم الجلسرين (من أجار slants)
- خط السلالات ARP/MARP e. القولونية من مرق lysogeny (LB) أجار التعرجات علي اطباق بيتري التي تحتوي علي أجار LB وعلامة اختيار المناسبة (الجدول 1).
- اعداد الثقافات لكل من سلالات e. القولونية عن طريق تطعيم 3 مل من LB تحتوي علي علامة اختيار المناسبة مع مستعمره واحده. تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع التهوية (250 دوره في الدقيقة).
- الجمع بين 800 μL من الثقافة و 200 μL من الجلسرين 80 ٪ معقمه في كريوفيال 1.8 mL. مزيج من خلال عكس الأنابيب 3 − 4 مرات ، وتخزين في-80 درجه مئوية.
2. ARP/MARP المجمدة اعداد لوحه مكتبه الأوراق المالية
- خط السلالات ARP/MARP من الأسهم الجلسرين التي أعدت في القسم 1 علي مجموعه جديده من اطباق بيتري التي تحتوي علي أجار LB وعلامة اختيار المناسبة. تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- باستخدام تقنيه العقيم ، ماصه 500 μL من الموجبة المعدلة مرق مولر هينتون (MHB) من خزان معقم في كل بئر من العقيمة 96 صفيحه بئر عميقة.
- مع لوحات أعدت في الخطوة 2.1 ، استخدم عصا قضيب لتطعيم صفيحه البئر العميقة 96 وفقا لخريطة ARP/MARP (الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2). تاكد من أضافه علامة اختيار المناسبة لكل بئر. وضع غشاء الختم تنفس علي سطح لوحه البئر العميقة واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية (250 دوره في الدقيقة).
- تاكد من عدم وجود ابار ملوثه بالاشاره إلى خريطة ARP/MARP. كرر إذا كانت ملوثه. باستخدام pipettor متعدد القناات ، نقل 100 μL من كل بئر من لوحه البئر العميق إلى لوحه القاع العقيمة 96-بئر الجولة. كرر هذه الخطوة لإنشاء العديد من لوحات مكتبه الأسهم المجمدة.
ملاحظه: فمن الأفضل لاعداد ما لا يقل عن 5 لوحات مكتبه في وقت للحفاظ علي من تكرار الخطوات 2.1 − 2.4 في حاله التلوث لوحه مكتبه الأوراق المالية المجمدة. - الانتهاء من جعل ARP/MARP المجمدة لوحات مكتبه الأوراق المالية عن طريق التنضيد 100 μL من معقمه 50 ٪ الجلسرين في كل بئر ومزيج من الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا.
- تغطيه لوحات مع الأختام ألومنيوم المعقمة وضمان ان كل بئر مختومه بشكل فردي.
- عدد لوحات وتكريس واحد فقط المجمدة لوحه مكتبه الأوراق المالية لتطعيم قوالب جديده في وقت معين. الحفاظ علي الباقي كما النسخ الاحتياطي في حاله التلوث لوحه مكتبه الأوراق المالية المجمدة.
- وضع غطاء لوحه علي راس ختم ألومنيوم وتخزين في-80 درجه مئوية.
3. البذور الثقافة واعداد لوحه Dereplication
- باستخدام عصا قضيب ، تطعيم 3 مل من العقديات المضادات الحيوية المتوسطة (SAM) (أو المتوسطة المناسبة الأخرى للكائن الذي يجري اختباره) في أنبوب اختبار يحتوي علي حبه زجاجيه معقمه واحده (لتفتيت mycelium) مع سلاله المنتجة التي هي ان تكون [دربلاتيد]. بالنسبة للعقديات ، كشط الجراثيم برفق من سطح المستعمرة.
- باستخدام نفس عصا القضيب الخشبية ، والسيطرة علي العقم علي طبق بيتري التي تحتوي علي أجار بينيت.
- احتضان ثقافة البذور في 30 درجه مئوية مع التهوية لمده 6 أيام (250 دوره في الدقيقة) واحتضان لوحه التحكم في العقم في 30 درجه مئوية لمده 6 أيام.
ملاحظه: يرجى الرجوع إلى الجدول 2 للحصول علي وصفات إعلاميه ل SAM و بينيت. التعليمات المذكورة أعلاه هي مناسبه لمعظم الاكاكتيميتيز. تغيير وسائل الاعلام النمو حسب الضرورة لغيرها من البكتيريا والفطريات. - اعداد لوحات dereplication عن طريق شفط 23 مل من أجار بينيت الدافئة في ماصه المصلية والاستغناء 20 مل بالتساوي عبر سطح طبق بيتري مستطيله (جدول المواد) ، تاركا ما تبقي من المتوسطة في الماصة لمنع تشكيل فقاعه الهواء.
ملاحظه: تاكد من ان السطح المستخدمة لصب لوحات هو مستوي وتنفيذ هذه الخطوة قبل أجار قد يبرد كثيرا; سطح مستو أمر حتمي لتثبيت المكتبة في المراحل التالية. - قم بتدوير الصفيحة برفق حتى تغطي الوسط جميع مناطق الصفيحة ولا تزعجها حتى يتم ضبط أجارها تماما.
- اعداد صفائح غشاء النيتروسليلوز (جدول المواد) باستخدام غطاء طبق بيتري مستطيل كقالب تتبع بحيث تناسب الأوراق سطح لوحه dereplication. قطع الأوراق والاوتوكلاف لهم في الحقيبة المعقمة.
ملاحظه: يسمح هذا الغشاء للكائنات الحية للرياضية علي سطحه ، في حين قد تفرز نواتج الأيض الثانوية في الوسط أدناه. مره واحده نمت ، يتم أزاله الغشاء لتوفير سطح نظيف لdereplication. الأكثر ملاءمة ان ورقه غشاء لديه علي سطح أجار بينيت ، والأنظف نتيجة dereplication. - تحقق من لوحه التحكم في العقم للتاكد من عدم وجود ملوثات بعد 6 أيام من الحضانة. إذا كانت خاليه من التلوث ، وأزاله غطاء طبق بيتري مستطيله وماصه 200 μL من ثقافة البذور علي سطح أجار بينيت.
- نشر الثقافة بالتساوي عبر سطح اللوحة بأكملها باستخدام مسحه قطنية معقمه.
- وضع غشاء النيتروسليلوز أعدت في الخطوة 3.6 علي قمة الثقافة علي سطح طبق بيتري. تبدا من خلال محاذاة الحافة السفلية من الغشاء إلى الحافة السفلية من طبق بيتري ، وتطبيق ببطء الغشاء من الحافة السفلية إلى الحافة العليا من لوحه.
- استخدام مسحه قطنية معقمه لتخفيف اي فقاعات الهواء التي قد تكون شكلت بين واجهه أجار الغشاء ، وضمان ان الغشاء هو تدفق إلى أجار.
- وضع الغطاء مره أخرى علي صحن بيتري مستطيله ووضعه راسا علي عقب في كيس من البلاستيك مختومه. احتضان عند 30 درجه مئوية لمده 6 أيام.
4. dereplication لوحه MHB تراكب و ARP/MARP مكتبه اعداد اللوحة
- بعد 6 أيام ، وأزاله لوحه dereplication من الحاضنة 30 درجه مئوية. باستخدام ملاقط معقمه (الاوتوكلاف أو رش جيدا مع 70 ٪ الايثانول) ، وأزاله بعناية غشاء النيتروسليلوز من سطح أجار بينيت.
ملاحظه: هذه الخطوة سوف أزاله الجراثيم مسعور ونميت ميسليا علي سطح الغشاء لتوفير سطح نظيف لdereplication ، وتسهيل الخطوة 4.2. - كما هو موضح للخطوة 3.4 ، وضمان سطح العمل هو مستوي واستخدام ماصه المصلية ليستنشق 23 مل من الموجبة الدافئة أجار MHB المعدلة. إنشاء تراكب عن طريق الاستغناء عن 20 مل بالتساوي عبر سطح لوحه dereplication ، وترك ما تبقي من المتوسطة في ماصه لمنع تشكيل فقاعه الهواء.
- قم بتدوير الصفيحة برفق حتى تغطي الوسط جميع المناطق ولا تزعجها حتى يتم ضبط أجارها تماما. مره واحده تبريدها وعززت ، والعودة لوحه dereplication إلى كيس من البلاستيك مختومه وتخزينها علي الراس في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
ملاحظه: تسمح هذه الخطوة لنشر نواتج الأيض الثانوية من المتوسطة بينيت المخمرة في تراكب أجار MHB. إذا لم يتم اعداد غشاء النيتروسليلوز بشكل صحيح سيكون هناك نمو بوغ حول حواف لوحه ، والتي لديها خصائص مسعور ان صد أجار mhb. لا تصب التراكب فوق هذه الجراثيم لأنه يمكن ان يؤدي إلى تلوث التراكب. - في نفس اليوم الذي يتم سكب التراكب ، تطعيم قالب ARP/MARP الطازجة عن طريق التنضيد 100 μL من الموجبة المعدلة MHB في كل بئر من لوحه 96-حسنا.
ملاحظه: للحد من فرصه لنشر التلوث اثناء dereplication ، واستخدام واحده ARP/MARP لوحه مكتبه فقط لdereplication 2 − 3 لوحات الدراويش. ولذلك ، تطعيم ما يكفي من 96-بئر ARP/MARP لوحات استنادا إلى عدد من السلالات التي سيتم dereplicated. - تاخذ الأسهم المجمدة ARP/MARP لوحه مكتبه من 80 درجه مئوية الفريزر. أزاله ختم ألومنيوم قبل ان يبدا التكثيف لتشكيل علي السفلي ، التالي تقليل فرصه لتلويث الآبار المجاورة في لوحه المكتبة.
- باستخدام معقمه 96 أدوات تثبيت جيدا (أو اشكال أخرى من معدات التلقيح) ، دبوس بعناية من المجمدة الأسهم ARP/MARP لوحه المكتبة وتطعيم الطازجة MHB التي تحتوي علي لوحات 96-حسنا. للحد من التلوث اثناء dereplication ، واعداد العديد من لوحات المكتبة ARP أو MARP اللازمة لفقط dereplication 2 − 3 لوحات الدراويش لكل لوحه مكتبه. تعقيم أدوات تثبيت بين تطعيم كل لوحه.
- وضع ختم ألومنيوم معقمه جديده علي قالب المجمدة مره واحده كامله والعودة إلى-80 درجه مئوية الفريزر. ضع التطعيمات ال96ه بشكل جيد داخل كيس من البلاستيك المختوم وحضن في 37 درجه مئوية مع التهوية (250 دوره في الدقيقة) لمده 18 ساعة.
ملاحظه: يمكن اعداد لوحات مكتبه الأوراق المالية المجمدة الجديدة من هذه الخطوة بعد ضمان عدم وجود تلوث. أضافه الجلسرين إلى لوحه قبل تخزين في-80 درجه مئوية كما هو موضح في الخطوة 2.5.
5. الدراويش باستخدام ARP/MARP
- قم بازاله القالب ARP/MARP من الحاضنة وتاكد من عدم وجود ملوثات. دائما الدراويش باستخدام قالب التي يتم اعدادها طازجه وليس مباشره من المخزون المجمدة.
- أزاله لوحات dereplication من 4 درجه مئوية والسماح لتتوازن إلى درجه حرارة الغرفة. إذا كان هناك التكثيف ، وفتح الاغطيه والسماح لتجف في بيئة معقمه.
- باستخدام أدوات تثبيت معقمه (أو غيرها من معدات التلقيح) ، دبوس من لوحه مكتبه ARP/MARP علي سطح تراكب أجار MHB من لوحات dereplication. يجب الحرص علي عدم اختراق أجار. تعقيم أدوات التثبيت في ما بين تطعيم كل لوحه dereplication.
- بعد تثبيت القالب علي سطح لوحات dereplication ، والسماح للقالب القالب لتجف لمده 3 − 5 دقيقه. ضع لوحات التطعيم الملقحة راسا علي عقب في كيس من البلاستيك مختومه واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- تحليل نتائج dereplication في اليوم التالي عن طريق مقارنه النمو علي لوحه dereplication إلى الآبار التي تتوافق مع ARP/MARP الخريطة (الجدول 3 والجدول 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الحصول علي النتائج التالية عندما تم تجميع مجموعه من سلالات الفوائد المنتجة للمضادات الحيوية باستخدام ARP و/أو MARP.
ويرد في الشكل 1رسم تخطيطي لسير العمل الخاص بالdereplication ARP/marp ، وتظهر خرائط لوحه المكتبة في الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2. يوضح الشكل 2 نتيجة ايجابيه لاستخلاص النتائج حيث يتم تحديد المستخلص البيئي wac 8921 كمنتج الكلورامفينيكول. يظهر الشكل 3 نقصا في نمو ARP بالبالكامل ، مما يشير إلى وجود مضاد حيوي غير معروف أو مضاد حيوي اقل شيوعا لم يتم احتسابه في لوحه مكتبه ARP/marp. الشكل 4 يوضح نمط النمو الذي هو فريد من نوعه لل marp بسبب استخدامها لكل من wildtype e. القولونية BW25113 وفرط نفاذيه و افلوكس نقص متحولة e. القولونية BW25113 ΔbambΔtolc. وتشير هذه النتيجة إلى وجود مركب مع نشاط مضاد للميكروبات غير قادر علي تجاوز الغشاء الخارجي السليم. ويبين الشكل 5 نمط النمو القولونية التي تشير إلى التعقيم غير لائق من أدوات التثبيت والشكل 6 يظهر مثالا للتلوث ARP/marp لوحه مكتبه المخزون المجمدة. الشكل 7 يوضح ما يحدث إذا اخترقت تراكب أجار خلال dereplication. وأخيرا ، يظهر الشكل 8 التلوث المرتبط بتراكب mhb الذي يمكن ان يحدث اثناء عمليه المعالجة بالانحراف.
الشكل 1: رسم تخطيطي لعمليه الانحراف. يتم ستريمل السلالة المنتجة لتكون dereplicated علي طبق بيتري مستطيله كحديقة ويتم وضع غشاء النيتروسليلوز علي القمه. ثم يتم احتضان لوحه لمده 6 أيام حيث تنمو الكتلة الحيوية ذات الصلة المنتجة السلالة ينمو علي سطح الغشاء في حين ويفرز الأيض الثانوية المنتجة في وسائل الاعلام طبق بيتري. بعد فتره تخمير مدتها 6 أيام ، تتم أزاله الغشاء وأضافه تراكب MHB إلى سطح الوسائط المحتوية علي المضادات الحيوية لتوفير سطح أملس لتثبيته. ويتم بعد ذلك تثبيت المكتبة ARP/MARP e. كولاي ، التي يتم ترتيبها في شكل لوحه 96 بشكل جيد وفقا لخرائط ARP/marp ، علي سطح التراكب. بعد احتضان صينية بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية ، ونمو السلالات e. القولونية التعبير عن جينات مقاومه محدده يشير إلى هويه المجمع المنتجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الدرع المضاد للمضادات الحيوية المعروفة. تم dereplicated السلالة المنتجة WAC 8921 باستخدام قالب ARP. نمو e. القولونية BW25113 ΔBambΔTolc pGDP1:القط علي سطح تراكب أجار mhb يشير إلى ان wac 8921 هو منتج الكلورامفينيكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: Dereplication من مضاد حيوي غير معروف. تم dereplicated السلالة المنتجة WAC 9941 باستخدام قالب ARP. وكان ينظر إلى نقص النمو مكتبه e. القولونية علي سطح طبق بيتري مستطيله, مشيرا إلى ان اما wac 9441 ينتج مركب مضاد للميكروبات غير معروف أو مضاد حيوي نادر التي لا تحتسب في ARP. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحديد مركب مضاد للميكروبات لا يمكنه اجتياز غشاء خارجي سليم. تم dereplicated السلالة المنتجة WAC 4178 باستخدام قالب MARP. سلالات كولاي BW25113 قادره علي النمو علي سطح الوسائط الثانوية المحتوية علي المستقلب ، في حين ان جميع سلالات e. القولونية BW25113 ΔbambΔtolc لا يمكن ان تنمو. وهذا يوحي بان WAC 4178 ينتج مركب مضاد للميكروبات لا يمكن اجتياز الغشاء الخارجي السليم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التلوث بسبب أدوات التثبيت غير المعقمة. تم dereplicated السلالة المنتجة WAC 7094 باستخدام قالب ARP. وجود e. القولونية نمو المكتبة في المناطق التي لم يكن لديك سلاله e. القولونية المعينة تشير إلى ان أدوات التثبيت المستخدمة لتطعيم تراكب أجار Mhb من طبق بيتري مستطيله لم يتم تعقيمها بشكل صحيح. وهذا يؤدي إلى نقل سلالات e. كولاي غير معروفه عبر التراكب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التلوث الناجم عن قالب المخزون المجمد الملوث ARP/MARP. تم dereplicated السلالة المنتجة WAC 3683 باستخدام قالب ARP. ونميت ثلاث مستعمرات مختلفه e. القولونية علي سطح صحن بتري مستطيله: اثنين تتوافق مع e. كولاي BW25113 ΔbambΔtolc التعبير عن STAT ، انزيم مقاومه streptothricin ، والاخر يقابل e. كولاي BW25113 ΔbambΔTOLC التعبير عن فيم-2ss، وهو انزيم المقاومة β-لاكتام. نظرا لعدم وجود تكرار النموVIM2ss مستعمره bla, بالاضافه إلى عدم وجود مقاومه عبر المعروف ان يحدث بين هذه الفئات المضادات الحيوية اثنين, يمكن افتراض ان سلاله أخرى غير e. كولاي ΔbambΔ tolC pGDP1: blaVIM2ss ينمو في لوحه مكتبه المجمدة الخاصة بشكل جيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تراكب أجار MHB مثقوب. تم dereplicated السلالة المنتجة WAC 5106 باستخدام قالب ARP. تم العثور علي هذه السلالة ليكون منتج ستربتومايسين ، كما هو مبين من نمو e. كولاي BW25113 ΔBambΔtolc pGDP3:المكورات العنقودية (6)-Ia. ثقوب ثقب يمكن ان ينظر اليه علي سطح تراكب أجار MHB علي طول محيط لوحه. في حين ان هذا لا يؤثر علي نتائج dereplication ، فانه يمكن جعل البيانات من الصعب تفسير للوهلة الاولي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تلوث تراكب أجار MHB. وتنتج أجار MHB الملوثة نمط نمو غير منتظم علي سطح التراكب الذي يصبح مرئيا بعد احتضان اللوحة بين عشيه وضحيها عند 37 درجه مئوية. علي الرغم من ان النمو e. كولاي قد تكون لا تزال مرئية من خلال التلوث, وينصح لتكرار التجربة قبل استقراء البيانات من لوحه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| البلازميد | اختيار ماركر |
| pGDP1 | كاناميسين 50 ميكروغرام/مل |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | امبيسيلين 100 ميكروغرام/مل |
| pGDP4 | |
| اي | - |
الجدول 1: علامات الاختيار المستخدمة في سلسله البلازميد pgdp المحلي الإجمالي. خط السلالات ARP/MARP e. القولونية علي رطل أجار الاطباق بيتري التي تحتوي علي علامة اختيار المناسبة في التركيز الصحيح لكل plasmid.
| وسائل الاعلام | العنصر | المبلغ |
| سام | الجلوكوز | 15 ح |
| فول الصويا ببتون | 15 ح | |
| كلوريد | 5 ح | |
| مستخلص الخميرة | 1 ح | |
| CaCO3 | 1 ح | |
| الجلسرين | 2.5 مل | |
| ddH2O | إلى 1 لتر | |
| بينيت | نشا البطاطا | 10 ح |
| الأحماض الامينيه | 2 غ | |
| مستخلص الخميرة | 1.8 غ | |
| مزيج المعدنية czapek | 2 مل | |
| أجار (اختياري) | 15 ح | |
| ddH2O | إلى 1 لتر | |
| مزيج المعدنية czapek | بوكل | 10 ح |
| المساحة4-7 ح2س | 10 ح | |
| نانو3 | 12 ح | |
| 4-7 ح | 0.2 غ | |
| حمض الهيدروكلوريك المركز | 200 μL | |
| ddH2O | إلى 100 mL |
الجدول 2: وصفات لوسائل الاعلام سام وبينيت ، ومزيج المعدنية Czapek. ضبط SAM و بينيت لدرجه الحموضة 6.8 قبل التعقيم ، وتصفيه تعقيم مزيج المعدنية Czapek.
| فئة المضادات الحيوية | المضادات الحيويه | جين المقاومة | E. القولونية سلاله | حسنا الموقف |
| الامينوغليكوزيدات | الستربتومايسين | المكورات العنقودية (3 '')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 |
| 2-ديوكسيسترامين | rmtB | ΔbamBΔtolC BW25113 | F3 ، C10 | |
| ابرياميسين | apmA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5 ، F8 | |
| السبيكتينوميسين | المكورات العنقودية (9)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, مجموعه الثماني | |
| β-اكتام | البنسلين | NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 |
| السيفالوسبورين | ||||
| كاربابينام | ||||
| Lincosamides | Lincosamides | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 |
| الماكروليدات | الماكروليدات | ermC | ||
| نوع B ستريبتوكغراينز | نوع B ستريبتوكغراينز | ermC | ||
| النوع A ستريبتوكغرانز | النوع A ستريبتوكغرانز | فاتنات | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3 ، F10 |
| ستريبتوثريسين | ستريبتوثريسين | Stat | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3 ، المنتخبون |
| التتراسيكلين | التتراسيكلين | tet (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5 ، و. |
| كلومبيشينيكولس | كلومبيشينيكولس | القط | ΔbamBΔtolC BW25113 | هاء-4 ، دال-9 |
| فوسفومينز | فوسفومينز | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6 ، C7 |
| ريفاميسينس | ريفاميسينس | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| البوليميكسين | البوليميكسين | MCR-1 | البرية من نوع BW25113 | C6 ، F7 |
| [اشنوميينس] | [اشنوميينس] | uvrA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4 ، جيم-4 |
| سيموسيمينز | البوميسين | fhuB متحولة | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4 ، F9 |
| مسك الروم | فيميومايسين | vph | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5 ، جيم 8 |
| N/A | N/A | N/A | البرية من نوع BW25113 | C1 ، C12 ، F1 ، F12 ، E5 ، دال-1 |
| N/A | N/A | N/A | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1 ، A12 ، B1 ، B12 ، دال 6 ، الفئة السبع ، E6 ، E7 ، G1 ، G12 ، H1 ، H12 |
الجدول 3: جدول التعيين بشكل جيد لسلالات ARP الحد الأدنى. يشير هذا الجدول الذي جيدا من لوحه 96 جيدا ان كل من سلالات ARP الحد الأدنى يمكن العثور عليها في وفقا لخريطة لوحه مكتبه ARP الحد الأدنى. يسرد الطاولة أيضا اي صنف مضاد حيوي كل مورثه يمنح مقاومه إلى. يرجى ملاحظه ان بعض الجينات قد تمنح مقاومه لأكثر من مضاد حيوي واحد ضمن فئة المضادات الحيوية المعطية.
| فئة المضادات الحيوية | المضادات الحيويه | جين المقاومة | E. القولونية سلاله | حسنا الموقف |
| الامينوغليكوزيدات | الستربتومايسين | المكورات العنقودية (3 '')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B2 ، G11 |
| المكورات العنقودية (6)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | C6 ، F7 | ||
| السبيكتينوميسين | المكورات العنقودية (9)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A2, H11 | |
| الجنتاميسين | aac (3)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A3, H10 | |
| النمل (2 '')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | A5, اتش 5 | ||
| المكورات العنقودية (2 '')-معرف | ΔbamBΔtolC BW25113 | A4 ، H9 | ||
| ارما | ΔbamBΔtolC BW25113 | A6 ، H7 | ||
| aac (6 ')-المكورات العنقودية (2 '')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, مجموعه الثماني | ||
| كاناميسين | المكورات العنقودية (3 ')-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 | |
| المكورات العنقودية (3 ')-آيلا | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 | ||
| هايجرومايسين | المكورات العنقودية (4)-Ia | ΔbamBΔtolC BW25113 | B6 ، السبع | |
| β-اكتام | اموكسيسيلين | تيم-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6 ، C7 |
| السيفنازيديم | CTX-M-15 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5 ، جيم 8 | |
| Oxacillin | اوكسا-10 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G5 ، B8 | |
| OXA-48 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H5 ، A8 | ||
| الميروبينيم | العفريت-7ss | ΔbamBΔtolC BW25113 | G4 ، B9 | |
| فيلق حماية البترول-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H6 ، A7 | ||
| ايميبينيم | فيم-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4 ، جيم-4 | |
| Lincosamides | Lincosamides | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4 ، F9 |
| lnu (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5 ، F8 | ||
| الماكروليدات | الماكروليدات | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4 ، F9 |
| مفا | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3 ، F10 | ||
| mphB | ΔbamBΔtolC BW25113 | C2 ، F11 | ||
| نوع B ستريبتوكغراينز | نوع B ستريبتوكغراينز | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4 ، F9 |
| Vgb | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 | ||
| النوع A ستريبتوكغرانز | النوع A ستريبتوكغرانز | فاتنات | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5 ، و. |
| ستريبتوثريسين | ستريبتوثريسين | Stat | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3 ، المنتخبون |
| التتراسيكلين | التتراسيكلين | tet (M) | ΔbamBΔtolC BW25113 | E5 ، و دال- |
| كلومبيشينيكولس | كلومبيشينيكولس | القط | ΔbamBΔtolC BW25113 | هاء-4 ، دال-9 |
| فوسفومينز | فوسفومينز | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | H4, A9 |
| ريفاميسينس | ريفاميسينس | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| N/A | N/A | N/A | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1 ، A12 ، B1 ، B12 ، دال 6 ، الفئة السبع ، E6 ، E7 ، G1 ، G12 ، H1 ، H12 |
الجدول 4: جدول التسمية جيدا لسلالات ARP. يشير هذا الجدول الذي جيدا من لوحه 96 جيدا ان كل من سلالات ARP يمكن العثور عليها في وفقا لخريطة لوحه مكتبه ARP. يسرد الطاولة أيضا اي صنف مضاد حيوي كل مورثه يمنح مقاومه إلى. يرجى ملاحظه ان بعض الجينات قد تمنح مقاومه لأكثر من مضاد حيوي واحد ضمن فئة المضادات الحيوية المعطية.
الشكل التكميلي 1: خريطة لوحه المكتبة المستخدمة لقالب منصة مقاومه المضادات الحيوية الأصلي (ARP). تنظيم سلالات e. القولونية ذات الصلة في لوحه 96 بشكل جيد باستخدام هذا الشكل للتاكد من ان يتم تضمين كافة عناصر التحكم الضرورية والتكرارات. وقد تم تعديل هذا الرقم من كوكس وآخرون10. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: خريطة لوحه المكتبة المستخدمة لقالب منصة مقاومه المضادات الحيوية (MARP) الحد الأدنى. تنظيم سلالات e. القولونية ذات الصلة في لوحه 96 بشكل جيد باستخدام هذا الشكل للتاكد من ان يتم تضمين كافة عناصر التحكم الضرورية والتكرارات. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تطبيق البروتوكول الموصوف أعلاه علي كل من اكتشاف المركبات المضادة للميكروبات الجديدة والمواد المضادة التي يمكن استخدامها بالاقتران مع الحيوية الموجودة لإنقاذ نشاطها. منصة يستفيد من خصوصية عاليه الركيزة من أليات المقاومة والمضادات الحيوية الخاصة بهم ، إلى مركبات التخلص من النفط داخل مقتطفات المنتجات الطبيعية الخام. علي الرغم من ان الوقت اللازم للوحات dereplication ان تكون جاهزه طويلة (~ 2 أسابيع) ، عمليه dereplication نفسها كامله بعد فتره حضانة واحده بين عشيه وضحيها ، والتي هي سريعة بالمقارنة مع الوقت الذي يمكن ان يستغرقه لعزل وتميز مركب من مقتطفات الخام. بالاضافه إلى ذلك ، لا حاجه إلى معدات باهظه الثمن أو عاليه التخصص ، مما يجعل هذه المنصة متاحه وفعاله من حيث التكلفة.
ومن الفوائد الرئيسية الأخرى لهذه المنصة مرونتها. يمكن توسيع ARP لاحتواء جينات المقاومة التي تشمل المزيد من فئات المضادات الحيوية. ويتحقق ذلك من خلال رصد الأدبيات لظهور انزيمات المقاومة الجديدة واستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي الاساسيه لأضافه الجينات إلى مكتبه e. كولاي . وعلاوة علي ذلك ، فان قالب dereplication هو قابل للتخصيص علي أساس المستوي المطلوب من واسعه أو ضيقه نطاق الركيزة الخصوصية التي يريد الفرد لاستخدامها عند dereplication. اي مزيج من الجينات في مكتبه e. كولاي يمكن استخدامها لجعل لوحات مكتبه جديده مع القدرة علي الكشف عن المركبات مع لمحات مختلفه. علي سبيل المثال ، يمكن تطوير β-lactamase التعبير عن قالب القولونية للسماح لل dereplication محدده للغاية من β-اكتام والطبقات الفرعية المختلفة الخاصة بهم.
في حين تم تصميم هذه المنصة في البداية لبناء المركبات علي وسائل الاعلام الصلبة, كما كان يعمل في وسائل الاعلام السائلة. وهذا مفيد عند العمل مع المركبات التي تم تنقيتها بالفعل حيث يتوفر فقط كميه محدوده للاختبار ، أو عند العمل مع المركبات التي لا تنتشر بسهوله أو باستمرار في وسائل الاعلام الصلبة. وأخيرا ، في حين تم وصف هذا البروتوكول باستخدام البكتيريا القولونية BW25113 و BW25113 ΔBambΔtolc ، يمكن استخدام المنصة مع مكتبه الجينات المقاومة المعرب عنها في سلالات مختلفه من e. كولاي (dereplication قد تختلف الأنماط الظاهرية). في نهاية المطاف ، ومنصة المقاومة للمضادات الحيوية مرنه ، لديها العديد من التطبيقات ، ومفيد علي طرق dereplication الأخرى.
ولضمان الحصول علي نتائج قابله للتكرار وغير ملوثه ، من الاهميه بمكان اتباع تقنيات التعقيم والعقيم المناسبة. الفشل في القيام بذلك سوف يؤدي إلى تلوث أدوات التثبيت ، لوحه المكتبة ، أو لوحه dereplication نفسها. في حين توجد علامات للاختيار في المكتبة e. كولاي ، والتي يمكن ان تساعد علي منع التلوث الناجم عن البكتيريا في عداد المفقودين علامة ، فانه لا يمنع التلوث عبر من سلالات باستخدام نفس العلامة. للحد من خطر حدوث هذا من الضروري تعقيم أدوات تثبيت البكتيريا بعناية قبل تثبيتها من لوحه المكتبة. يجب ان يتم تثبيت كل لوحه مكتبه فقط من 3 − 4 مرات كحد اقصي قبل التخلص من القالب الجديد. وهذا يمنع انتشار التلوث عبر جميع لوحات dereplication إذا أصبحت لوحه مكتبه ملوثه اثناء عمليه التثبيت. بالاضافه إلى ذلك ، لا يتم استخدام المضادات الحيوية عند تطعيم لوحه dereplication التالي يجب توخي الحذر الشديد لمنع التلوث قبل ان يترك لتخمر لمده سته أيام. مصدر محتمل آخر للتلوث هو في تراكب أجار MHB من لوحه dereplication. إذا كانت الوسائط المتراكبه ملوثه ، فلن يظهر النمو الا بعد الاحتضان الليلي عند 37 درجه مئوية بعد التثبيت. التلوث تراكب يمكن ان تجعل من الصعب للغاية لتحليل نمو المكتبة e. القولونية علي سطح تراكب. للحد من فرص التلوث تراكب ، واعداد أجار MHB الطازجة قبل صب التراكب. فمن المستحسن انه حتى الفرد هو مريح مع هذه الطريقة ، وينبغي دائما لوحات dereplication تكون مستعدة في تكرار أو ثلاث نسخ من هذا القبيل في حاله تلوث لوحه واحده ، لا يزال يمكن استخراج البيانات من نامل لوحات غير ملوثه.
وأخيرا ، من المهم ان نلاحظ ان ARP/MARP لديه قيود. هذا البروتوكول ليست مناسبه لأزاله النسخ المتماثل من السلالات المنتجة التي تنتج أكثر من مجمع واحد النشطة بيولوجيا. وقد تم تصميم كل سلاله في المكتبة e. كولاي للتعبير عن جين المقاومة واحد. إذا كان يتم إنتاج اثنين من المضادات الحيوية من قبل الكائن الحي ، لن المقاومة الجينات تمنح مقاومه للمضادات الحيوية الثانية ، مما يؤدي إلى وفاه الخلية من كلا السلالتين. التالي ، يجب ان تؤخذ هذه الامكانيه في الاعتبار عند نتائج dereplication تشير إلى وجود مضاد حيوي رواية لأنه لا يمكن الكشف عن إنتاج المضادات الحيوية المتعددة بواسطة الحالية واحده بناء المكتبة القولونية . واحد النهج التي يمكن اتخاذها لمكافحه التحدي من سلالات التخليص التي تنتج أكثر من مضاد حيوي واحد ينطوي علي استخدام الاجراء أجار المكونات الموصوفة في ورقه ARP الاصليه من قبل كوكس وآخرون10. في هذه الطريقة ، يتم أزاله جزء من وسط الصلبة المخمرة من المنتجات المضادة للمضادات الحيوية التي تحتوي علي لوحه ووضعها علي حديقة من سلاله المؤشر ARP. يمكن ان يكون ضغط المؤشر اي من سلالات e. كولاي المقاومة في مكتبه ARP. وتستخدم بعد ذلك مناطق تثبيط للمقارنة بين النشاط الحيوي لسلاله المنتجة ضد سلالات ARP وسلاله من نوع البرية. سلالات ARP التي تشكل منطقه المثبطة من حجم انخفاض مقارنه مع سلاله البرية من نوع يمكن ان تقاوم المجمع الذي يتم إنتاجه. وقد أثبتت هذه الطريقة ان تكون فعاله في تحديد سلالات قادره علي إنتاج المضادات الحيوية متعددة10.
وباختصار ، للحصول علي أفضل النتائج عند العبث مع ARP/MARP فمن المستحسن ان يتم اعداد لوحات dereplicating في تكرار أو ثلاث نسخ. وتشمل الخطوات الهامه الأخرى في البروتوكول تعلق من لوحه مكتبه جديده (أبدا المجمدة) وأزاله أكبر قدر ممكن من الكتلة الحيوية من السلالة المنتجة خلال مرحله أزاله الغشاء. وإذا اتبعت جميع الخطوات اللازمة ، ينبغي ان يكون للمرء نتائج ناجحه لإنتاج سلاله من الاهتمام في غضون أسبوعين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ودعمت البحوث في مختبر رايت المتعلقة ARP/MARP من قبل صندوق البحوث في اونتاريو والمعاهد الكندية للمنح البحوث الصحية (FRN-148463). نود ان نعترف سومير تشو للمساعدة في توسيع وتنظيم مكتبه ARP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. Roessner, U., Dias, D. A. , Humana Press. Totowa, NJ. 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
