Summary
Nous décrivons une plate-forme qui utilise une bibliothèque d'Escherichia coli résistant aux antibiotiques isogéniques pour la déplication des antibiotiques. L'identité d'un antibiotique produit par des bactéries ou des champignons peut être déduite par la croissance de E. coli exprimant son gène de résistance respectif. Cette plate-forme est économiquement efficace et efficace en temps.
Abstract
L'un des principaux défis dans la recherche de nouveaux antibiotiques à partir d'extraits de produits naturels est la redécouverte de composés communs. Pour relever ce défi, la déplication, qui consiste à identifier les composés connus, est effectuée sur des échantillons d'intérêt. Les méthodes de déplication telles que la séparation analytique suivie de la spectrométrie de masse prennent beaucoup de temps et consomment beaucoup de ressources. Pour améliorer le processus de déplication, nous avons développé la plate-forme de résistance aux antibiotiques (ARP). L'ARP est une bibliothèque d'environ 100 gènes de résistance aux antibiotiques qui ont été individuellement clonés en Escherichia coli. Cette collection de souches a de nombreuses applications, y compris une méthode rentable et facile pour la déplication des antibiotiques. Le processus implique la fermentation de microbes produisant des antibiotiques à la surface des plats rectangulaires Petri contenant milieu solide, permettant ainsi la sécrétion et la diffusion de métabolites secondaires à travers le milieu. Après une période de fermentation de 6 jours, la biomasse microbienne est enlevée, et une mince agar-overlay est ajoutée au plat Petri pour créer une surface lisse et permettre la croissance des souches de l'indicateur E. coli. Notre collection de souches ARP est ensuite épinglée sur la surface du plat Petri contenant des antibiotiques. La plaque est ensuite incubée pendant la nuit pour permettre la croissance d'E. coli à la surface de la perceuse. Seules les souches contenant une résistance à un antibiotique spécifique (ou classe) se développent sur cette surface permettant l'identification rapide du composé produit. Cette méthode a été utilisée avec succès pour l'identification des producteurs d'antibiotiques connus et comme un moyen d'identifier ceux qui produisent de nouveaux composés.
Introduction
Depuis la découverte de la pénicilline en 1928, les produits naturels dérivés de micro-organismes environnementaux se sont avérés être une riche source de composés antimicrobiens1. Environ 80% des antibiotiques de produits naturels sont dérivés de bactéries du genre Streptomyces et d'autres actinomycéres, tandis que les 20% restants sont produits par des espèces fongiques1. Certains des échafaudages antibiotiques les plus courants utilisés dans la clinique, tels que les lactams, les tétracyclines, les rifamycines et les aminoglycosides, ont été isolés à l'origine à partir de microbes2. Cependant, en raison de l'augmentation des bactéries multirésistantes (MDR), notre panel actuel d'antibiotiques est devenu moins efficace dans le traitement3,4. Il s'agit notamment des agents pathogènes "ESKAPE" (c.-à-d., entérocoques résistants à la vancomycine et Staphylococcus aureusrésistant au lactam , Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, et Enterobacter sp.), qui sont un sous-ensemble de bactéries considérées comme associées au risque le plus élevé par un certain nombre de grandes autorités de santé publique telles que l'Organisation mondiale de la Santé3,4,5. L'émergence et la propagation mondiale de ces agents pathogènes MDR entraîne un besoin constant d'antibiotiques nouveaux3,4,5. Malheureusement, les deux dernières décennies ont démontré que la découverte de nouveaux antibiotiques provenant de sources microbiennes est de plus en plus difficile6. Les approches actuelles de la découverte de médicaments comprennent le dépistage à haut débit des composés bioactifs, y compris les bibliothèques d'extraits de produits naturels, permettant de tester des milliers d'extraits à un moment donné2. Cependant, une fois que l'activité antimicrobienne est détectée, l'étape suivante consiste à analyser le contenu de l'extrait brut afin d'identifier la composante active et d'éliminer ceux qui contiennent des composés connus ou redondants7,8. Ce processus, appelé déplication, est essentiel pour prévenir et/ou réduire considérablement le temps consacré à la redécouverte d'antibiotiques connus7,9. Bien qu'une étape nécessaire dans la découverte de médicaments de produits naturels, la déplication est notoirement laborieuse et gourmande en ressources10.
Depuis que Beutler et coll. ont inventé le terme « déplication », des efforts considérables ont été déployés pour élaborer des stratégies novatrices pour l'identification rapide des antibiotiques connus11,12. Aujourd'hui, les outils les plus communs utilisés pour la déplication incluent les systèmes chromatographiques analytiques tels que la chromatographie liquide de haute performance, la spectrométrie de masse, et les méthodes de détection par résonance magnétique nucléaire11,13. Malheureusement, chacune de ces méthodes nécessite l'utilisation d'équipements d'analyse coûteux et d'une interprétation sophistiquée des données.
Dans une tentative de développer une méthode de déplication qui peut être rapidement effectuée sans équipement spécialisé, nous avons établi la plate-forme de résistance aux antibiotiques (ARP)10. L'ARP peut être utilisé pour la découverte d'adjuvants antibiotiques, le profilage de nouveaux composés antibiotiques contre les mécanismes de résistance connus, et la déplication d'antibiotiques connus dans des extraits dérivés d'actinobactéries et d'autres microbes. Ici, nous nous concentrons sur son application dans la déplication d'antibiotiques. L'ARP utilise une bibliothèque de souches isogènes Escherichia coli exprimant des gènes de résistance individuels qui sont efficaces contre les antibiotiques les plus couramment redécouverts14,15. Lorsque la bibliothèque E. coli est cultivée en présence d'un organisme secondaire producteur de métabolites, l'identité du composé peut être déduite par la croissance des souches d'E. coli qui expriment son gène de résistance associé10. Lorsque l'ARP a été signalé pour la première fois, la bibliothèque se composait de gènes de 40 livres conférant une résistance à 16 classes d'antibiotiques. Le modèle original de déplication a été conçu pour englober un sous-ensemble de gènes de résistance par classe d'antibiotiques pour fournir des informations concernant la sous-classe d'antibiotiques pendant le processus de déplication. Aujourd'hui, l'ARP est composé de gènes qui confèrent une résistance à 18 classes d'antibiotiques. À l'aide de notre vaste collection de gènes de résistance, un modèle de déplication secondaire a été développé et est connu sous le nom de plate-forme minimale de résistance aux antibiotiques (MARP). Ce modèle a été créé pour éliminer la redondance génétique et pour simplement fournir des informations concernant la classe générale d'antibiotiques qu'un métabolite déreproduit est lié à. En outre, le modèle MARP possède à la fois wildtype et une souche hyperperméable / efflux déficiente de E. coli BW25113 (E. coli BW25113 -bamB-tolC), par rapport à l'incarnation originale de l'ARP, qui ne utilise la souche hyperperméable. Cet aspect unique crée des phénotypes supplémentaires pendant la déplication, indiquant une capacité de composés à traverser la membrane externe des bactéries Gram-négatives. Ici, nous décrivons un protocole robuste à suivre lors de la déplication avec l'ARP et/ou le MARP, mettons en évidence les étapes les plus critiques à suivre, et discutons des divers résultats possibles.
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Protocol
1. Préparation des stocks de glycérol de la bibliothèque E. coli (de Agar Slants)
- Ststreak the ARP/MARP E. coli strains from lysogeny broth (LB) agar slants onto Petri dishes containing LB agar and the appropriate selectable marker (Tableau 1).
- Préparer les cultures pour chacune des souches d'E. coli en inoculant 3 mL de LB contenant le marqueur sélectionnable approprié avec une seule colonie. Cultivez pendant la nuit à 37 oC avec l'aération (250 tr/min).
- Combiner 800 l de culture et 200 l de glycérol stérile à 80 % dans un cryovial de 1,8 ml. Mélanger en inversant les tubes 3 à 4 fois et les conserver à -80 oC.
2. Préparation des plaques de la bibliothèque de stock congelées ARP/MARP
- Étrier les souches ARP/MARP des stocks de glycérol préparées en section 1 sur un nouvel ensemble de plats Petri contenant de l'agar LB et le marqueur sélectionnable approprié. Cultivez toute la nuit à 37 oC.
- À l'aide d'une technique aseptique, la pipette 500 'L de bouillon Mueller Hinton ajusté de cation (MHB) à partir d'un réservoir stérile dans chaque puits d'une plaque stérile de puits profond de 96.
- Une fois les plaques préparées à l'étape 2.1, utilisez un bâton d'applicateur pour inoculer la plaque de puits profond 96 conformément à la carte ARP/MARP ( Figure supplémentaire1 et Figure supplémentaire 2). Assurez-vous que le marqueur sélectionnable approprié est ajouté à chaque puits. Placer une membrane d'étanchéité respirante sur la surface de la plaque du puits profond et incuber toute la nuit à 37 oC (250 tr/min).
- Assurez-vous qu'il n'y a pas de puits contaminés en se référant à la carte ARP/MARP. Répéter l'opération si elle est contaminée. À l'aide d'un pipettor multicanal, transférer 100 L de chaque puits de la plaque de puits profond à une plaque de fond stérile de 96 puits. Répétez cette étape pour créer plusieurs plaques de bibliothèque de stock congelées.
REMARQUE: Il est préférable de préparer au moins 5 plaques de bibliothèque à la fois pour éviter de répéter les étapes 2.1-2.4 en cas de contamination des plaques de bibliothèque congelées. - Terminer la fabrication des plaques de bibliothèque de bouillon congelées ARP/MARP en piétrant 100 l de glycérol stérile à 50 % dans chaque puits et mélangez en faisant doucement du haut et vers le bas.
- Couvrir les plaques de joints d'aluminium stériles et s'assurer que chaque puits est scellé individuellement.
- Numérotez les plaques et consacrez une seule plaque de bibliothèque de stock congelée pour l'inoculation de nouveaux modèles à un moment donné. Conservez le reste sous forme de back-ups en cas de contamination des plaques de bibliothèque congelées.
- Placer le couvercle de la plaque sur le dessus du joint d'aluminium et le conserver à -80 oC.
3. Préparation de la culture des semences et des plaques de déplication
- À l'aide d'un bâton d'applicateur, inoculer 3 ml de milieu antibiotique Streptomyces (SAM) (ou tout autre milieu approprié pour l'organisme testé) dans un tube à essai contenant une perle de verre stérile (pour briser le mycélium) avec la souche productrice qui doit être déreplicated. Pour les streptomyces, gratter délicatement les spores de la surface d'une colonie.
- À l'aide du même bâton d'applicateur en bois, stries un contrôle de stérilité sur un plat Petri contenant l'agar de Bennett.
- Incuber la culture des graines à 30 oC avec l'aération pendant 6 jours (250 tr/min) et incuber la plaque de contrôle de la stérilité à 30 oC pendant 6 jours.
REMARQUE: Consultez le tableau 2 pour les recettes médiatiques de SAM et Bennett. Les instructions ci-dessus conviennent à la plupart des actinomycètes. Modifier les supports de croissance au besoin pour d'autres bactéries et champignons. - Préparer les plaques de déplication en aspirant 23 ml d'agar chaud de Bennett dans une pipette sérologique et distribuer 20 mL uniformément sur la surface d'un plat de Petri rectangulaire (Table of Materials), laissant le reste du milieu dans la pipette pour prévenir formation de bulles d'air.
REMARQUE: Assurez-vous que la surface utilisée pour verser les plaques est de niveau et effectuer cette étape avant que l'agar a refroidi trop; une surface plane est impérative pour l'épinglage de bibliothèque dans les prochaines étapes. - Faire pivoter doucement la plaque jusqu'à ce que le milieu couvre toutes les zones de la plaque et ne pas la déranger jusqu'à ce que l'agar a complètement mis.
- Préparer les feuilles de membrane de nitrocellulose(tableau des matériaux)en utilisant un couvercle rectangulaire de boîte de Petri comme modèle de traçage de sorte que les feuilles adaptent la surface de la plaque de déplication. Couper les feuilles et les autoclaver dans une poche stérile.
REMARQUE: Cette membrane permet aux organismes de sporuler à sa surface, tandis que les métabolites secondaires peuvent être excrétés dans le milieu ci-dessous. Une fois cultivée, la membrane est enlevée pour fournir une surface propre pour la déplication. Plus le papier membranaire se rapproche de la surface de l'agar de Bennett, plus le résultat de la déplication est propre. - Vérifiez la plaque de contrôle de la stérilité pour vous assurer qu'aucun contaminant n'est présent après 6 jours d'incubation. S'il n'est pas contaminé, retirez le couvercle du plat rectangulaire Petri et de la pipette 200 ll de culture de graines sur la surface de l'agar du Bennett.
- Répartir uniformément la culture sur la surface de toute la plaque à l'aide d'un coton-tige stérile.
- Placer la membrane de nitrocellulose préparée à l'étape 3.6 au-dessus de la culture sur la surface du plat Petri. Commencez par aligner le bord inférieur de la membrane sur le bord inférieur du plat Petri, et appliquez lentement la membrane du bord inférieur au bord supérieur de la plaque.
- Utilisez un coton-tige stérile pour lisser les bulles d'air qui pourraient s'être formées entre l'interface membrane-agar, en veillant à ce que la membrane soit rincée à l'agar.
- Remettez le couvercle sur le plat rectangulaire Petri et placez-le à l'envers dans un sac en plastique scellé. Incuber à 30 oC pendant 6 jours.
4. Déplication Plaque MHB Overlay et ARP/MARP Library Plate Preparation
- Après 6 jours, retirer la plaque de déplication de l'incubateur de 30 oC. À l'aide d'une pince stérile (autoclaved ou pulvérisé à fond avec 70 % d'éthanol), retirer soigneusement la membrane de nitrocellulose de la surface de l'agar de Bennett.
REMARQUE: Cette étape permettra d'éliminer les spores hydrophobes et les mycéliums cultivés à la surface de la membrane pour fournir une surface propre pour la déplication, facilitant l'étape 4.2. - Comme décrit pour l'étape 3.4, assurez-vous que la surface de travail est de niveau et utilisez une pipette sérologique pour aspirer 23 ml d'agar MHB ajusté à la cation chaude. Créez une pari en distribuant 20 ml uniformément sur la surface de la plaque de déplication, laissant le reste du milieu dans la pipette pour empêcher la formation de bulles d'air.
- Faire pivoter doucement la plaque jusqu'à ce que le milieu couvre toutes les zones et ne pas la déranger jusqu'à ce que l'agar ait complètement été complètement réglé. Une fois refroidi et solidifié, retournez la plaque de déplication dans le sac en plastique scellé et rangez-la à l'envers à 4 oC pendant la nuit.
REMARQUE: Cette étape permet la diffusion de métabolites secondaires à partir du milieu fermenté de Bennett dans la couverture d'agar mHB. Si la membrane de nitrocellulose n'a pas été préparée correctement il y aura la croissance de spores autour des bords de la plaque, qui ont des propriétés hydrophobes qui repoussent l'agar de MHB. Ne versez pas la parisursur ces spores, car elle peut entraîner une contamination de la pari. - Le jour même où la perceuse est versée, inoculer un nouveau modèle ARP/MARP en pipetting 100 'L de Cation ajusté MHB dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.
REMARQUE: Pour réduire le risque de propagation de la contamination pendant la déplication, utilisez une seule plaque de bibliothèque ARP/MARP pour ne dérépliquer que les plaques de déplication de 2 à 3. Par conséquent, inoculer suffisamment de plaques ARP/MARP de 96 puits en fonction du nombre de souches qui seront déproduites. - Sortez le bouillon congelé aRP/MARP de la plaque de bibliothèque de -80 oC. Retirez le joint d'aluminium avant que la condensation commence à se former sur le dessous, diminuant ainsi les risques de contamination des puits voisins dans la plaque de bibliothèque.
- À l'aide d'outils d'épinglage stériles de 96 puits (ou d'autres formes d'équipement d'inoculation), épinglez soigneusement la plaque de bibliothèque ARP/MARP et inoculez les plaques fraîches contenant du MHB contenant 96 puits. Pour minimiser la contamination pendant la déplication, préparez autant de plaques de bibliothèque ARP ou MARP nécessaires pour ne dérépliquer que les plaques de déplication de 2 à 3 plaques par plaque de bibliothèque. Stériliser les outils d'épinglage entre l'inoculation de chaque plaque.
- Placez un nouveau joint d'aluminium stérile sur le modèle congelé une fois terminé et retournez-le au congélateur de -80 oC. Placer les plaques inoculées de 96 puits à l'intérieur d'un sac en plastique scellé et couver à 37 oC avec aération (250 tr/min) pendant 18 h.
REMARQUE: De nouvelles plaques de bibliothèque congelées peuvent être préparées à partir de cette étape après s'être assurées qu'aucune contamination n'est présente. Ajouter le glycérol dans la plaque avant de le ranger à -80 oC, tel que décrit à l'étape 2.5.
5. Déplication à l'aide de l'ARP/MARP
- Retirez le modèle ARP/MARP de l'incubateur et assurez-vous qu'aucun contaminant n'est présent. Toujours déplicer à l'aide d'un modèle fraîchement préparé et non directement à partir du bouillon congelé.
- Retirer les plaques de déplication de 4 oC et laisser l'équilibre à la température ambiante. En cas de condensation, ouvrez les couvercles et laissez sécher dans un environnement stérile.
- À l'aide d'outils d'épinglage stériles (ou d'autres équipements d'inoculation), épinglez de la plaque de bibliothèque ARP/MARP sur la surface de la reitière d'agar MHB des plaques de déplication. Veillez à ne pas percer l'agar. Stériliser les outils d'épinglage entre l'inoculation de chaque plaque de déplication.
- Après avoir épinglé le modèle sur la surface des plaques de déplication, laissez sécher l'inoculum du modèle pendant 3 à 5 min. Placez les plaques de déplication inoculées à l'envers dans un sac en plastique scellé et incubez toute la nuit à 37 oC.
- Analyser les résultats de la déplication le lendemain en comparant la croissance de la plaque de déplication aux puits qui correspondent à la carte ARP/MARP(tableau 3 et tableau 4).
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Representative Results
Les résultats suivants ont été obtenus lorsqu'une collection de souches d'intérêt productrices d'antibiotiques a été déproduite à l'aide de l'ARP et/ou du MARP.
Un diagramme du flux de travail de déplication ARP/MARP est représenté dans la figure 1, et les cartes des plaques de bibliothèque sont affichées dans la figure 1 et la figure supplémentaire 2. La figure 2 démontre un résultat positif de déplication dans lequel l'extrait environnemental WAC 8921 est identifié comme un producteur de chloramphenicol. La figure 3 montre un manque de croissance de l'ARP entièrement, ce qui indique la présence d'un antibiotique inconnu ou d'un antibiotique moins couramment trouvé qui n'est pas pris en compte dans la plaque de bibliothèque ARP/MARP. La figure 4 montre un modèle de croissance unique au MARP en raison de son utilisation du type sauvage E. coli BW25113 et d'un mutant hyperperméable et déficient en efflux E. coli BW25113 -bamBtolC. Ce résultat suggère la présence d'un composé avec l'activité antimicrobienne qui est incapable de dépasser une membrane externe intacte. La figure 5 montre un modèle de croissance de la bactérie E. coli qui suggère la stérilisation inadéquate des outils d'épinglage et la figure 6 montre un exemple de contamination des plaques de bibliothèque congelées ARP/MARP. La figure 7 montre ce qui se passe si la perceuse est percée lors de la déplication. Enfin, la figure 8 montre que la contamination liée à la jAtM est présente pendant le processus de déplication.
Figure 1 : Schéma du processus de déplication. La souche productrice à dérépliquer est strié sur un plat rectangulaire Petri comme une pelouse et une membrane de nitrocellulose est placé sur le dessus. La plaque est ensuite incubée pendant 6 jours, dans laquelle la biomasse liée à la production-souche pousse à la surface de la membrane tandis que les métabolites secondaires produits sont sécrétés dans le support plat Petri. Après une période de fermentation de 6 jours, la membrane est enlevée et une superpose de MHB est ajoutée à la surface du support antibiotique-contenant pour fournir une surface lisse pour l'épinglage. La bibliothèque ARP/MARP E. coli, qui est disposée en format de 96 puits selon les cartes ARP/MARP, est ensuite épinglée sur la surface de la perle. Après avoir incubé le plateau pendant la nuit à 37 oC, la croissance des souches d'E. coli exprimant des gènes de résistance spécifiques indique l'identité du composé produit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Déplication d'un antibiotique connu. La souche de production WAC 8921 a été dépliquée à l'aide du modèle ARP. Croissance de E. coli BW25113 -bamB-tolC pGDP1:CAT à la surface de la pariation d'agar MHB indique que WAC 8921 est un producteur de chloramphenicol. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Déplication d'un antibiotique inconnu. La souche de production WAC 9941 a été dépliquée à l'aide du modèle ARP. Un manque de croissance de bibliothèque d'E. coli a été vu sur la surface du plat rectangulaire de Petri, indiquant que WAC 9441 produit un composé antimicrobien inconnu ou un antibiotique rare qui n'est pas pris en compte dans l'ARP. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Identification d'un composé antimicrobien qui ne peut pas traverser une membrane externe intacte. La souche de production WAC 4178 a été dépliquée à l'aide du modèle MARP. Les souches de E. coli BW25113 sont capables de se développer à la surface du média secondaire contenant des métabolites, alors que toutes les souches d'E. coli BW25113 -bamB-tolC ne peuvent pas se développer. Ceci suggère que WAC 4178 produit un composé antimicrobien qui ne peut pas traverser une membrane externe intacte. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Contamination due à des outils d'épinglage non stériles. La souche de production WAC 7094 a été dépliquée à l'aide du modèle ARP. La présence de la croissance de la bibliothèque E. coli dans les zones qui n'avaient pas de souche E. coli assignée suggère que les outils d'épinglage utilisés pour inoculer la parure d'agar MHB du plat rectangulaire Petri n'ont pas été correctement stérilisés. Il en résulte le transfert de souches inconnues d'E. coli à travers la pose de la perce. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Contamination due à un stock congelé contaminé modèle ARP/MARP. La souche de production WAC 3683 a été dépliquée à l'aide du modèle ARP. Trois colonies distinctes d'E. coli se sont développées sur la surface rectangulaire du plat Petri : deux correspondent à E. coli BW25113 -bamBtolC exprimant STAT, une enzyme de résistance à la streptothcine, et l'autre correspond à E. coli BW25113 -bamB-tolC exprimant VIM-2ss, une enzyme de résistance au lactam. En raison de l'absence de reproduction de la croissance de la colonie blaVIM2ss, en plus de l'absence de résistance croisée connue pour se produire entre ces deux classes d'antibiotiques, on peut supposer qu'une souche autre que E. coli 'bamB tolC pGDP1: blaVIM2ss est en croissance dans la plaque de bibliothèque congelée respective bien. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : La perce-gar ue percée du MHB. La souche de production WAC 5106 a été dépliquée à l'aide du modèle ARP. Cette souche s'est avérée être un producteur de streptomycine, comme l'indique la croissance d'E. coli BW25113 -bamB-tolC pGDP3:aph(6)-Ia. Des trous de perforation peuvent être vus sur la surface de la pare-balles mHB le long du périmètre de la plaque. Bien que cela n'affecte pas les résultats de la déplication, il peut rendre les données difficiles à interpréter à première vue. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Contamination de la pergée MHB. L'agar contaminé de MHB produit un modèle irrégulier de croissance sur la surface de la surface de la surface qui devient visible après avoir incubé la plaque pendant la nuit à 37 oC. Bien que la croissance d'E. coli puisse encore être visible par la contamination, il est conseillé de répéter l'expérience avant d'extrapoler les données de la plaque. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Plasmide | Marqueur sélectionnable |
| pGDP1 (en) | Kanamycine 50 g/mL |
| pGDP2 (en) | |
| pGDP3 (en) | Ampicilline 100 g/mL |
| pGDP4 (en) | |
| aucun | - |
Tableau 1 : Marqueurs sélectionnables utilisés dans la série plasmide pGDP. Étrier les souches ARP/MARP E. coli sur des plats LB agar Petri contenant le marqueur sélectionnable approprié à la bonne concentration pour chaque plasmide.
| médias | ingrédient | quantité |
| Sam | glucose | 15 g |
| Peptone de soja | 15 g | |
| Nacl | 5 g | |
| extrait | 1 g | |
| CaCO3 | 1 g | |
| Glycérol | 2,5 ml | |
| ddH2O | À 1 L | |
| Bennett | Fécule | 10 g |
| Acides casamino | 2 g | |
| extrait | 1,8 g | |
| Mélange minéral Czapek | 2 mL | |
| Agar (facultatif) | 15 g | |
| ddH2O | À 1 L | |
| Mélange minéral Czapek | Kcl | 10 g |
| MgSO47H2O | 10 g | |
| NaNO3 Annonces | 12 g | |
| FeSO47H2O | 0,2 g | |
| HCl concentré | 200 l | |
| ddH2O | À 100 ml |
Tableau 2 : Recettes pour les médias de SAM et Bennett, et le mélange minéral Czapek. Ajustez SAM et Bennett's au pH 6.8 avant d'autoclacter, et filtrez stériliser le mélange minéral Czapek.
| Classe d'antibiotiques | antibiotique | Gène de résistance | E. coli Strain | Bien position |
| Aminoglycosides | Streptomycine | aph(3'')-Ia | BW25113 | B3, G10 |
| 2- Deoxystreptamine | rmtB (en) | BW25113 | F3, C10 | |
| Apramycine (Apramycine) | Apma | BW25113 | C5, F8 | |
| Spectinomycine | aph(9)-Ia | BW25113 | B5, G8 | |
| Les lactams de l'A | pénicilline | NDM-1 (en) | BW25113 | B4, G9 |
| Céphalosporine | ||||
| Carbapenam Carbapenam | ||||
| Lincosamides (Lincosamides) | Lincosamides (Lincosamides) | ermC | BW25113 | D4, E9 |
| Macrolides | Macrolides | ermC | ||
| Streptogramins de type B | Streptogramins de type B | ermC | ||
| Streptogramins de type A | Streptogramins de type A | vatD | BW25113 | C3, F10 |
| La streptothcine | La streptothcine | Stat | BW25113 | D3, E10 |
| Tétracyclines | Tétracycline | tet(A) | BW25113 | D5, E8 |
| Chloramphenicols (Chloramphenicols) | Chloramphenicols (Chloramphenicols) | félin | BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycines | Fosfomycines | Fosa | BW25113 | F6, C7 |
| Rifamycines | Rifamycines | Arr | BW25113 | E3, D10 |
| Polymyxines | Polymyxines | MCR-1 | sauvage de type BW25113 | C6, F7 |
| Échinomycines | Échinomycines | uvrA (en) | BW25113 | F4, C9 |
| Les sideromycines | Albomycine | fhuB mutant | BW25113 | C4, F9 |
| Tuberactinomycines | Viomycine (Viomycine) | vph (en) | BW25113 | F5, C8 |
| ne s'applique pas | ne s'applique pas | ne s'applique pas | sauvage de type BW25113 | C1, C12, F1, F12, E5, D8 |
| ne s'applique pas | ne s'applique pas | ne s'applique pas | BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tableau 3 : Tableau de désignation des puits pour les souches minimales d'ARP. Ce tableau indique le puits d'une plaque de 96 puits dans laquelle chacune des souches minimales d'ARP peut être trouvée selon la carte minimale de plaque de bibliothèque d'ARP. Le tableau énumère également la classe d'antibiotiques à laquelle chaque gène confère une résistance. Veuillez noter que certains gènes peuvent conférer une résistance à plus d'un antibiotique dans la classe d'antibiotiques donnée.
| Classe d'antibiotiques | antibiotique | Gène de résistance | E. coli Strain | Bien position |
| Aminoglycosides | Streptomycine | aph(3'')-Ia | BW25113 | B2, G11 |
| aph(6)-Ia | BW25113 | C6,F7 | ||
| Spectinomycine | aph(9)-Ia | BW25113 | A2, H11 | |
| Gentamicine | aac(3)-Ia | BW25113 | A3,H10 | |
| fourmi(2'')-Ia | BW25113 | A5, H8 | ||
| aph(2'')-Id | BW25113 | A4, H9 | ||
| Arma | BW25113 | A6, H7 | ||
| aac(6')-aph(2'')-Ia | BW25113 | B5,G8 (En) | ||
| Kanamycine | aph(3')-Ia | BW25113 | B4, G9 | |
| aph(3')-Illa | BW25113 | B3, G10 | ||
| Hygromycine (Hygromycine) | aph(4)-Ia | BW25113 | B6,G7 | |
| Les lactams de l'A | Amoxicillin | TEM-1 (en) | BW25113 | F6, C7 |
| Ceftazidime | CTX-M-15 | BW25113 | F5, C8 | |
| Oxacillin (Oxacillin) | OXA-10 (en) | BW25113 | G5, B8 | |
| OXA-48 (en) | BW25113 | H5, A8 | ||
| Meropenem | IMP-7ss | BW25113 | G4, B9 | |
| KPC-2 (en anglais seulement) | BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 (en) | BW25113 | H6, A7 | ||
| Imipenem Imipenem | VIM-2 | BW25113 | F4, C9 | |
| Lincosamides (Lincosamides) | Lincosamides (Lincosamides) | ermC | BW25113 | C4, F9 |
| lnu(A) | BW25113 | C5, F8 | ||
| Macrolides | Macrolides | ermC | BW25113 | C4, F9 |
| mphA (en) | BW25113 | C3, F10 | ||
| mphB (en) | BW25113 | C2, F11 | ||
| Streptogramins de type B | Streptogramins de type B | ermC | BW25113 | C4, F9 |
| Vgb | BW25113 | D4, E9 | ||
| Streptogramins de type A | Streptogramins de type A | vatD | BW25113 | D5, E8 |
| La streptothcine | La streptothcine | Stat | BW25113 | D3, E10 |
| Tétracyclines | Tétracycline | tet(M) | BW25113 | E5, D8 |
| Chloramphenicols (Chloramphenicols) | Chloramphenicols (Chloramphenicols) | félin | BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycines | Fosfomycines | Fosa | BW25113 | H4, A9 |
| Rifamycines | Rifamycines | Arr | BW25113 | E3, D10 |
| ne s'applique pas | ne s'applique pas | ne s'applique pas | BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tableau 4 : Tableau de désignation des puits pour les souches ARP. Ce tableau indique le puits d'une plaque de 96 puits dans laquelle chacune des souches ARP peut être trouvée selon la carte de la plaque de bibliothèque ARP. Le tableau énumère également la classe d'antibiotiques à laquelle chaque gène confère une résistance. Veuillez noter que certains gènes peuvent conférer une résistance à plus d'un antibiotique dans la classe d'antibiotiques donnée.
Figure supplémentaire 1 : Carte des plaques de bibliothèque utilisée pour le modèle original de plate-forme de résistance aux antibiotiques (ARP). Organisez les souches E. coli respectives dans une plaque de 96 puits en utilisant ce format pour vous assurer que tous les contrôles et doublons nécessaires sont inclus. Ce chiffre a été modifié à partir de Cox et coll.10. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 2 : Carte des plaques de bibliothèque utilisée pour le modèle minimal de plate-forme de résistance aux antibiotiques (MARP). Organisez les souches E. coli respectives dans une plaque de 96 puits en utilisant ce format pour vous assurer que tous les contrôles et doublons nécessaires sont inclus. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
Le protocole décrit ci-dessus peut être appliqué à la découverte de nouveaux composés antimicrobiens et d'adjuvants qui peuvent être utilisés en conjonction avec les antibiotiques existants pour sauver leur activité. La plate-forme tire parti de la grande spécificité du substrat des mécanismes de résistance et de leurs antibiotiques cognés, pour dématérialiser les composés dans les extraits bruts de produits naturels. Bien que le temps nécessaire à la préparation des plaques de déplication soit long (environ 2 semaines), le processus de déplication lui-même est terminé après une seule période d'incubation de nuit, ce qui est rapide par rapport au temps qu'il peut prendre pour isoler et caractériser un composé d'extraits bruts. De plus, aucun équipement coûteux ou hautement spécialisé n'est nécessaire, ce qui rend cette plate-forme accessible et rentable.
Un autre avantage majeur de cette plate-forme est sa flexibilité. L'ARP peut être élargi pour contenir des gènes de résistance qui englobent plus de classes d'antibiotiques. Ceci est réalisé en surveillant la littérature pour l'émergence de nouvelles enzymes de résistance et en utilisant des techniques de clonage moléculaires de base pour ajouter les gènes à la bibliothèque E. coli. En outre, le modèle de déplication est personnalisable en fonction du niveau souhaité de spécificité du substrat à large ou à portée étroite qu'un individu veut utiliser lors de la déplication. Toute combinaison de gènes dans la bibliothèque E. coli peut être utilisée pour fabriquer de nouvelles plaques de bibliothèque avec la capacité de détecter des composés avec des profils différents. Par exemple, un modèle E. coli exprimant la lactamase pourrait être mis au point pour permettre la déplication très spécifique des lactams et de leurs différentes sous-classes.
Alors que cette plate-forme a été initialement conçu pour dérépliquer les composés sur les médias solides, il a également été fonctionne dans les médias liquides. Ceci est utile lorsque l'on travaille avec des composés qui ont déjà été purifiés dans lequel seule une quantité limitée est disponible pour les tests, ou lorsque vous travaillez avec des composés qui ne diffusent pas facilement ou uniformément dans les médias solides. Enfin, alors que ce protocole a été décrit à l'aide des souches D. coli BW25113 et BW25113 -bamB-tolC, la plate-forme peut être utilisée avec la bibliothèque de gènes de résistance exprimée dans différentes souches de E. coli (déplication phénotypes peuvent varier). En fin de compte, la plate-forme de résistance aux antibiotiques est flexible, a de nombreuses applications, et est avantageux par-dessus d'autres méthodes de déplication.
Pour s'assurer que les résultats reproductibles et non contaminés sont obtenus, il est essentiel de suivre la stérilisation et les techniques aseptiques appropriées. Si vous ne le faites pas, vous contaminerez les outils d'épinglage, la plaque de bibliothèque ou la plaque de déplication elle-même. Bien que des marqueurs sélectionnables soient présents dans la bibliothèque E. coli, ce qui peut aider à prévenir la contamination causée par des bactéries qui manquent le marqueur, il n'empêche pas la contamination croisée des souches à l'aide du même marqueur. Pour réduire le risque que cela se produise, il est essentiel de stériliser soigneusement les outils d'épinglage bactérien avant de s'épingler à partir de la plaque de bibliothèque. Chaque plaque de bibliothèque ne doit être épinglée qu'à partir de 3 à 4 fois maximum avant d'être mise au rebut pour un nouveau modèle. Cela empêche la propagation de la contamination sur toutes les plaques de déplication si une plaque de bibliothèque est contaminée pendant le processus d'épinglage. En outre, aucun antibiotique n'est utilisé lors de l'inoculation de la plaque de déplication et un soin doit être pris pour prévenir la contamination avant qu'il ne soit laissé fermenter pendant six jours. Une autre source possible de contamination est dans la pariation d'agar MHB de la plaque de déplication. Si le support de la pose est contaminé, la croissance n'apparaîtra qu'après l'incubation de nuit à 37 oC après l'épinglage. La contamination par la pareille peut rendre extrêmement difficile l'analyse de la croissance de la bibliothèque E. coli sur la surface de la perle. Pour réduire les risques de contamination par la pareille, préparer une gélose MHB fraîche avant de verser la perceuse. Il est recommandé que jusqu'à ce qu'une personne soit à l'aise avec cette méthode, les plaques de déplication doivent toujours être préparées en double ou en tripler de telle sorte qu'en cas de contamination d'une plaque, les données peuvent encore être extraites de l'espoir plaques non contaminées.
Enfin, il est important de noter que l'ARP/MARP a des limites. Ce protocole ne convient pas à la déplication des souches productrices qui produisent plus d'un composé bioactif. Chaque souche de la bibliothèque E. coli a été conçue pour exprimer un seul gène de résistance. Si deux antibiotiques sont produits par un organisme, aucun gène de résistance ne conférera de résistance au deuxième antibiotique, entraînant ainsi la mort cellulaire des deux souches. Ainsi, cette possibilité doit être envisagée lorsque les résultats de la déplication suggèrent la présence d'un nouvel antibiotique parce que la production d'antibiotiques multiples ne peut pas être détectée par la bibliothèque actuelle de la construction unique E. coli. Une approche qui peut être prise pour lutter contre le défi de déplication des souches qui produisent plus d'un antibiotique consiste à utiliser la procédure agar-plug décrite dans le document original ARP par Cox et al.10. Dans cette méthode, une partie d'un milieu solide fermenté est retirée d'une plaque contenant des antibiotiques et placée sur une pelouse de souche ARP indicateur. La souche d'indicateur peut être n'importe laquelle des souches résistantes d'E. coli dans la bibliothèque d'ARP. Des zones d'inhibition sont ensuite utilisées pour comparer la bioactivité d'une souche productrice à des souches ARP et à une souche de type sauvage. Les souches ARP qui forment une zone inhibitrice de taille réduite par rapport à la souche de type sauvage peuvent résister au composé produit. Cette méthode s'est avérée efficace pour identifier les souches capables de produire plusieurs antibiotiques10.
En résumé, pour obtenir les meilleurs résultats lors de la déplication avec l'ARP/MARP, il est recommandé que les plaques de déplication soient préparées en double ou en triple. D'autres étapes critiques dans le protocole incluent l'épinglage d'une plaque de bibliothèque fraîche (jamais congelée) et l'élimination autant de biomasse que possible de la souche de production pendant l'étape d'enlèvement de membrane. Si toutes les étapes nécessaires sont suivies, on devrait avoir des résultats réussis de déplication pour une souche de production d'intérêt dans un délai de deux semaines.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
La recherche dans le laboratoire Wright relative à l'ARP/MARP a été appuyée par le Fonds de recherche de l'Ontario et la subvention des Instituts de recherche en santé du Canada (FRN-148463). Nous tenons à remercier Sommer Chou d'avoir aidé à l'expansion et à l'organisation de la bibliothèque de l'ARP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
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