Summary
Describimos una plataforma que utiliza una biblioteca de Escherichia coli isogénica resistente a antibióticos para la dereplicación de antibióticos. La identidad de un antibiótico producido por bacterias u hongos puede deducirse por el crecimiento de E. coli expresando su respectivo gen de resistencia. Esta plataforma es económicamente eficaz y eficiente en el tiempo.
Abstract
Uno de los principales desafíos en la búsqueda de nuevos antibióticos a partir de extractos de productos naturales es el redescubrimiento de compuestos comunes. Para hacer frente a este desafío, la desreplicación, que es el proceso de identificación de compuestos conocidos, se realiza en muestras de interés. Los métodos de desreplicación, como la separación analítica, seguido de la espectrometría de masas, consumen mucho tiempo y consumen muchos recursos. Para mejorar el proceso de desreplicación, hemos desarrollado la plataforma de resistencia a antibióticos (ARP). La ARP es una biblioteca de aproximadamente 100 genes de resistencia a antibióticos que han sido clonados individualmente en Escherichia coli. Esta colección de cepas tiene muchas aplicaciones, incluyendo un método rentable y fácil para la dereplicación de antibióticos. El proceso consiste en la fermentación de microbios productores de antibióticos en la superficie de platos rectangulares de Petri que contienen medio sólido, permitiendo así la secreción y difusión de metabolitos secundarios a través del medio. Después de un período de fermentación de 6 días, se elimina la biomasa microbiana, y se añade una fina superposición de agar a la placa Petri para crear una superficie lisa y permitir el crecimiento de las cepas indicadoras de E. coli. Nuestra colección de cepas ARP se fija a la superficie de la placa Petri que contiene antibióticos. La placa se incuba a continuación durante la noche para permitir el crecimiento de E. coli en la superficie de la superposición. Sólo crecen en esta superficie cepas que contienen resistencia a un antibiótico específico (o clase) permitiendo una rápida identificación del compuesto producido. Este método se ha utilizado con éxito para la identificación de los productores de antibióticos conocidos y como un medio para identificar aquellos que producen nuevos compuestos.
Introduction
Desde el descubrimiento de la penicilina en 1928, los productos naturales derivados de microorganismos ambientales han demostrado ser una rica fuente de compuestos antimicrobianos1. Aproximadamente el 80% de los antibióticos de productos naturales se derivan de bacterias del género Streptomyces y otros actinomycetes, mientras que el 20% restante es producido por las especies de hongos1. Algunos de los andamios antibiótico más comunes utilizados en la clínica, tales como los lactams, las tetraciclinas, las rifamicinas y los aminoglucósidos, fueron originalmente aislados de los microbios2. Sin embargo, debido al aumento de las bacterias multirresistentes (MDR), nuestro panel actual de antibióticos se ha vuelto menos eficaz en el tratamiento3,4. Estos incluyen los patógenos "ESKAPE" (es decir, enterococos resistentes a la vancomicina y Staphylococcus aureusresistentes a la lactam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii,y Enterobacter sp.), que son un subconjunto de bacterias consideradas asociadas al mayor riesgo por una serie de importantes autoridades de salud pública como la Organización Mundial de la Salud3,4,5. La aparición y propagación global de estos patógenos MDR da lugar a una necesidad constante de nuevos antibióticos3,4,5. Lamentablemente, las últimas dos décadas han demostrado que el descubrimiento de nuevos antibióticos de fuentes microbianas es cada vez más difícil6. Los enfoques actuales para el descubrimiento de fármacos incluyen el cribado de alto rendimiento de compuestos bioactivos, incluidas las bibliotecas de extractos de productos naturales, lo que permite probar miles de extractos en un momento dado2. Sin embargo, una vez detectada la actividad antimicrobiana, el siguiente paso es analizar el contenido del extracto crudo para identificar el componente activo y eliminar aquellos que contienen compuestos conocidos o redundantes7,8. Este proceso, conocido como desreplicación, es vital para prevenir y/o reducir significativamente el tiempo dedicado al redescubrimiento de antibióticos conocidos7,9. Aunque es un paso necesario en el descubrimiento de fármacos de productos naturales, la dereplicación es notoriamente laboriosa y requiere muchos recursos10.
Desde que Beutler y otros acuñaron por primera vez el término "desreplicación", se han realizado amplios esfuerzos para desarrollar estrategias innovadoras para la rápida identificación de antibióticos conocidos11,12. Hoy en día, las herramientas más comunes utilizadas para la desreplicación incluyen sistemas cromatográficos analíticos como cromatografía líquida de alto rendimiento, espectrometría de masas y métodos de detección basados en resonancia magnética nuclear11,13. Desafortunadamente, cada uno de estos métodos requiere el uso de costosos equipos analíticos y una sofisticada interpretación de datos.
En un intento de desarrollar un método de desreplicación que se puede realizar rápidamente sin equipo especializado, establecimos la plataforma de resistencia a antibióticos (ARP)10. El ARP se puede utilizar para el descubrimiento de adyuvantes antibióticos, la elaboración de perfiles de nuevos compuestos antibióticos contra mecanismos de resistencia conocidos, y la dereplicación de antibióticos conocidos en extractos derivados de actinobacterias y otros microbios. Aquí, nos centramos en su aplicación en la dereplicación de antibióticos. El ARP utiliza una biblioteca de cepas isogénicas de Escherichia coli que expresan genes de resistencia individuales que son eficaces contra los antibióticos más comúnmente redescubiertos14,15. Cuando la biblioteca de E. coli se cultiva en presencia de un organismo secundario productor de metabolitos, la identidad del compuesto puede deducirse por el crecimiento de cepas de E. coli que expresan su gen de resistencia asociado10. Cuando se informó por primera vez de la ARP, la biblioteca consistió en >40 genes que confieren resistencia a 16 clases de antibióticos. La plantilla de desreplicación original fue diseñada para abarcar un subconjunto de genes de resistencia por clase de antibióticos para proporcionar información sobre la subclase de antibióticos durante el proceso de desreplicación. Hoy en día, la ARP se compone de >90 genes que confieren resistencia a 18 clases de antibióticos. Utilizando nuestra extensa colección de genes de resistencia, se ha desarrollado una plantilla de desreplicación secundaria que se conoce como la plataforma de resistencia mínima a los antibióticos (MARP). Esta plantilla fue creada para eliminar la redundancia genética y simplemente proporcionar información sobre la clase general de antibióticos con la que está relacionado un metabolito desreplicado. Además, la plantilla MARP posee tanto el tipo salvaje como una cepa deficiente hiperpermeable/eflujo de E. coli BW25113 (E. coli BW25113 -bamB-tolC),en comparación con la encarnación original de la ARP, que sólo utiliza la cepa hiperpermeable. Este aspecto único crea fenotipos adicionales durante la dereplicación, lo que indica una capacidad de compuestos para cruzar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Aquí, describimos un protocolo robusto a seguir al dereplicar con el ARP y/o MARP, resaltamos los pasos más críticos a seguir, y discutimos los diversos resultados posibles.
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Protocol
1. Preparación de las existencias de glicerol de la biblioteca E. coli (a partir de inclinadores de agar)
- Rayar las cepas ARP/MARP E. coli del caldo de lisabagenia (LB) inclina sobre platos de Petri que contienen agar LB y el marcador seleccionable apropiado (Tabla 1).
- Preparar cultivos para cada una de las cepas de E. coli inoculando 3 ml de LB que contengan el marcador seleccionable apropiado con una sola colonia. Crecer durante la noche a 37oC con aireación (250 rpm).
- Combinar 800 ml de cultivo y 200 ml de glicerol estéril al 80% en un criovial de 1,8 ml. Mezcle invirtiendo los tubos 3 x 4 veces y guárdelos a -80 oC.
2. Preparación de placas de biblioteca de stock congelado ARP/MARP
- Raya las cepas ARP/MARP de las poblaciones de glicerol preparadas en la sección 1 sobre un nuevo conjunto de platos Petri que contienen agar LB y el marcador seleccionable adecuado. Crecer durante la noche a 37oC.
- Utilizando una técnica aséptica, la pipeta 500 l de caldo Mueller Hinton ajustado por cationes (MHB) desde un depósito estéril a cada pocido de una placa de pozo de 96 profundidades estéril.
- Con las placas preparadas en el paso 2.1, utilice un bastón aplicador para inocular la placa de pozo profundo 96 de acuerdo con el mapa ARP/MARP(Figura suplementaria 1 y Figura suplementaria 2). Asegúrese de que se agrega el marcador seleccionable adecuado a cada pozo. Coloque una membrana de sellado transpirable sobre la superficie de la placa de pozo profundo e incubar durante la noche a 37 oC (250 rpm).
- Asegúrese de que no haya pozos contaminados refiriéndose al mapa ARP/MARP. Repita si está contaminado. Usando un pipeteador multicanal, transfiera 100 l de cada pocal de la placa de pozo profundo a una placa inferior redonda estéril de 96 pocillos. Repita este paso para crear varias placas de biblioteca de stock congeladas.
NOTA: Lo mejor es preparar al menos 5 placas de biblioteca a la vez para evitar que se repitan los pasos 2.1-2.4 en caso de contaminación de la placa de la biblioteca de stock congelado. - Termine de hacer las placas de la biblioteca de stock congeladas ARP/MARP pipeteando 100 ml de glicerol estéril del 50% en cada pocayenyyel y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Cubra las placas con sellos de aluminio estériles y asegúrese de que cada poca está sellado individualmente.
- Numera las placas y dedica solo una placa de biblioteca de stock congelada para inocular nuevas plantillas en un momento dado. Mantenga el resto como respaldos en caso de contaminación de la placa de la biblioteca de existencias congeladas.
- Coloque la tapa de la placa en la parte superior del sello de aluminio y guárdela a -80 oC.
3. Preparación de placas de cultivo y desreplicación de semillas
- Usando un palillo aplicador, inocular 3 ml de Streptomyces antibiotic medium (SAM) (u otro medio apropiado para el organismo que se está probando) en un tubo de ensayo que contenga un cordón de vidrio estéril (para romper el micelio) con la cepa productora que debe ser replicado. Para Streptomyces, raspe suavemente las esporas de la superficie de una colonia.
- Usando el mismo palillo aplicador de madera, raya un control de esterilidad en un plato de Petri que contiene el agar de Bennett.
- Incubar el cultivo de semillas a 30oC con aireación durante 6 días (250 rpm) e incubar la placa de control de esterilidad a 30oC durante 6 días.
NOTA: Consulte la Tabla 2 para conocer las recetas de medios de SAM y Bennett. Las instrucciones anteriores son adecuadas para la mayoría de los actinomycetes. Alterar los medios de crecimiento según sea necesario para otras bacterias y hongos. - Preparar las placas de desreplicación aspirando 23 ml de agar caliente de Bennett en una pipeta serológica y dispensar 20 ml uniformemente a través de la superficie de un plato rectangular de Petri(Tabla de Materiales),dejando el resto del medio en la pipeta para evitar formación de burbujas de aire.
NOTA: Asegúrese de que la superficie que se utiliza para verter las placas está nivelada y realice este paso antes de que el agar se haya enfriado demasiado; una superficie plana es imprescindible para la fijación de bibliotecas en las siguientes etapas. - Gire suavemente la placa hasta que el medio cubra todas las áreas de la placa y no la moleste hasta que el agar se haya ajustado por completo.
- Preparar láminas de membrana de nitrocelulosa(Tabla de Materiales)utilizando una tapa rectangular de la placa Petri como plantilla de trazado para que las hojas se ajusten a la superficie de la placa de desreplicación. Corta las sábanas y autoclave en una bolsa estéril.
NOTA: Esta membrana permite que los organismos esporulen en su superficie, mientras que los metabolitos secundarios pueden excretarse en el medio inferior. Una vez cultivada, la membrana se retira para proporcionar una superficie limpia para la dereplicación. Cuanto más cerca esté el papel de membrana en la superficie del agar de Bennett, más limpio será el resultado de la desreplicación. - Compruebe la placa de control de esterilidad para asegurarse de que no hay contaminantes después de 6 días de incubación. Si no hay contaminación, retire la tapa de la placa rectangular Petri y la pipeta 200 l de cultivo de semillas sobre la superficie del agar de Bennett.
- Extiéndase uniformemente el cultivo por toda la superficie de todo el plato utilizando un hisopo de algodón estéril.
- Coloque la membrana de nitrocelulosa preparada en el paso 3.6 sobre el cultivo en la superficie de la placa Petri. Comience alineando el borde inferior de la membrana con el borde inferior de la placa Petri, y aplique lentamente la membrana desde el borde inferior hasta el borde superior de la placa.
- Utilice un hisopo de algodón estéril para suavizar las burbujas de aire que puedan haberse formado entre la interfaz membrana-agar, asegurándose de que la membrana esté al ras del agar.
- Vuelva a colocar la tapa en el plato rectangular de Petri y colóquela boca abajo en una bolsa de plástico sellada. Incubar a 30oC durante 6 días.
4. Superposición de placa de desreplicación MHB y preparación de placas de biblioteca ARP/MARP
- Después de 6 días, retire la placa de desreplicación de la incubadora de 30 oC. Usando pinzas estériles (autoclavedas o rociadas a fondo con 70% de etanol), retire cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa de la superficie del agar de Bennett.
NOTA: Este paso eliminará las esporas hidrófobas y los micelios cultivados en la superficie de la membrana para proporcionar una superficie limpia para la desreplicación, facilitando el paso 4.2. - Como se describe en el paso 3.4, asegúrese de que la superficie de trabajo esté nivelada y utilice una pipeta serológica para aspirar 23 ml de agar MHB ajustado por cationes calientes. Cree una superposición dispensando 20 ml uniformemente a través de la superficie de la placa de desreplicación, dejando el resto del medio en la pipeta para evitar la formación de burbujas de aire.
- Gire suavemente la placa hasta que el medio cubra todas las áreas y no la moleste hasta que el agar se haya ajustado por completo. Una vez enfriada y solidificada, devuelva la placa de desreplicación a la bolsa de plástico sellada y guárdela boca arriba a 4 oC durante la noche.
NOTA: Este paso permite la difusión de metabolitos secundarios desde el medio de Bennett fermentado en la superposición de agar MHB. Si la membrana de nitrocelulosa no se preparó correctamente, habrá crecimiento de esporas alrededor de los bordes de la placa, que tienen propiedades hidrofóbicas que repelen el agar MHB. No vierta la superposición encima de estas esporas porque puede resultar en la contaminación de la superposición. - El mismo día en que se vierte la superposición, inocular una nueva plantilla ARP/MARP pipeteando 100 l de cationes ajustado MHB en cada pocil de una placa de 96 pocillos.
NOTA: Para reducir la posibilidad de propagación de la contaminación durante la dereplicación, utilice una sola placa de biblioteca ARP/MARP para dereplicar solo 2 x 3 placas de desreplicación. Por lo tanto, inocular suficientes placas ARP/MARP de 96 pocillos en función del número de cepas que se dereplicarán. - Saque la placa de la biblioteca ARP/MARP de material congelado del congelador de -80 oC. Retire el sello de aluminio antes de que la condensación comience a formarse en su parte inferior, disminuyendo así la posibilidad de contaminar los pozos vecinos en la placa de la biblioteca.
- Usando herramientas de fijación estériles de 96 pocillos (u otras formas de equipo de inoculación), fija cuidadosamente la placa de la biblioteca ARP/MARP de stock congelado e inocula las placas frescas de 96 pocillos que contienen MHB. Para minimizar la contaminación durante la desreplicación, prepare tantas placas de biblioteca ARP o MARP necesarias para dereplicar solo 2 x 3 placas de desreplicación por placa de biblioteca. Esterilice las herramientas de fijación entre la inoculación de cada placa.
- Ponga un nuevo sello de aluminio estéril en la plantilla congelada una vez completada y devuélvala al congelador de -80 oC. Colocar las placas inoculadas de 96 pocillos dentro de una bolsa de plástico sellada e incubar a 37oC con aireación (250 rpm) durante 18 h.
NOTA: Las nuevas placas de la biblioteca de stock congelado se pueden preparar a partir de este paso después de asegurarse de que no haya contaminación. Añadir glicerol a la placa antes de almacenara a -80 oC como se describe en el paso 2.5.
5. Dereplicación usando el ARP/MARP
- Retire la plantilla ARP/MARP de la incubadora y asegúrese de que no haya contaminantes. Siempre desreplicación usando una plantilla que esté recién preparada y no directamente desde el stock congelado.
- Retirar las placas de desreplicación de 4oC y dejar equilibrar a temperatura ambiente. Si hay condensación, abra las tapas y deje secar en un ambiente estéril.
- Usando herramientas de fijación estériles (u otro equipo de inoculación), ancle desde la placa de la biblioteca ARP/MARP a la superficie de la superposición de agar MHB de las placas de desreplicación. Tenga cuidado de no perforar el agar. Esterilice las herramientas de fijación entre inocular cada placa de desreplicación.
- Después de fijar la plantilla en la superficie de las placas de desreplicación, deje que el inóculo de la plantilla se seque durante 3 x 5 minutos.
- Analice los resultados de la desreplicación al día siguiente comparando el crecimiento de la placa de desreplicación con los pozos que corresponden al mapa ARP/MARP(Tabla 3 y Tabla 4).
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Representative Results
Los siguientes resultados se obtuvieron cuando se desató una colección de cepas de interés productoras de antibióticos utilizando el ARP y/o ELP.
En la Figura 1se muestra un diagrama del flujo de trabajo de desreplicación ARP/MARP y los mapas de placas de biblioteca se muestran en la Figura suplementaria 1 y en la Figura complementaria 2. La Figura 2 demuestra un resultado positivo de desreplicación en el que el extracto ambiental WAC 8921 se identifica como un productor de cloramphenicol. La Figura 3 muestra una falta de crecimiento de ARP por completo, lo que indica la presencia de un antibiótico desconocido o un antibiótico menos comúnmente encontrado que no se tiene en cuenta en la placa de la biblioteca ARP/MARP. La Figura 4 muestra un patrón de crecimiento que es único para el MARP debido a su utilización tanto del tipo salvaje E. coli BW25113 como de un mutante hiperpermeable y deficiente en eflujo E. coli25113. Este resultado sugiere la presencia de un compuesto con actividad antimicrobiana que es incapaz de superar una membrana externa intacta. La Figura 5 muestra un patrón de crecimiento de E. coli que sugiere la esterilización incorrecta de las herramientas de fijación y la Figura 6 muestra un ejemplo de contaminación de la placa de la biblioteca de stock congelada ARP/MARP. La Figura 7 muestra lo que sucede si la superposición de agar se perfora durante la dereplicación. Por último, la Figura 8 muestra la contaminación relacionada con la superposición de MHB que puede ocurrir durante el proceso de desreplicación.
Figura 1: Un esquema del proceso de desreplicación. La cepa productora que se va a dereplicar se raya sobre una placa rectangular de Petri como césped y una membrana de nitrocelulosa se coloca en la parte superior. La placa se incuba durante 6 días en la que la biomasa relacionada con la cepa de producción crece en la superficie de la membrana, mientras que los metabolitos secundarios producidos se secretan en los medios de la placa Petri. Después de un período de fermentación de 6 días, se retira la membrana y se añade una superposición de MHB a la superficie del medio que contiene antibióticos para proporcionar una superficie lisa para la fijación. La biblioteca ARP/MARP E. coli, que está dispuesta en un formato de placa de 96 pocillos según los mapas ARP/MARP, se ancla a la superficie de la superposición. Después de incubar la bandeja durante la noche a 37 oC, el crecimiento de cepas de E. coli que expresan genes de resistencia específicos indica la identidad del compuesto producido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Desreplicación de un antibiótico conocido. La cepa productora WAC 8921 fue desreplicada utilizando la plantilla ARP. El crecimiento de E. coli BW25113 ábamBá tolC pGDP1:CAT en la superficie de la superposición de agar MHB indica que WAC 8921 es un productor de cloranfenicol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Desreplicación de un antibiótico desconocido. La cepa de producción WAC 9941 fue desreplicada utilizando la plantilla ARP. Se vio una falta de crecimiento de la biblioteca de E. coli en la superficie de la placa rectangular de Petri, lo que indica que WAC 9441 está produciendo un compuesto antimicrobiano desconocido o un antibiótico poco frecuente que no se tiene en cuenta en el ARP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Identificación de un compuesto antimicrobiano que no puede atravesar una membrana externa intacta. La cepa productora WAC 4178 fue desreplicada utilizando la plantilla MARP. Las cepas de E. coli BW25113 son capaces de crecer en la superficie de los medios secundarios que contienen metabolitos, mientras que todas las cepas de E. coli BW25113 ábamBátolC no pueden crecer. Esto sugiere que WAC 4178 está produciendo un compuesto antimicrobiano que no puede atravesar una membrana externa intacta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Contaminación debida a herramientas de fijación no estériles. La cepa de producción WAC 7094 fue desreplicada utilizando la plantilla ARP. La presencia de crecimiento de la biblioteca de E. coli en áreas que no tenían una cepa de E. coli asignada sugiere que las herramientas de fijación utilizadas para inocular la superposición de agar MHB de la placa rectangular de Petri no se esterilizaron adecuadamente. Esto resulta en la transferencia de cepas desconocidas de E. coli a través de la superposición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Contaminación debida a una plantilla ARP/MARP de stock congelado contaminado. La cepa de producción WAC 3683 fue desreplicada utilizando la plantilla ARP. Tres colonias distintas de E. coli crecieron en la superficie rectangular de la placa Petri: dos corresponden a E. coli BW25113bamBtolC que expresa STAT, una enzima de resistencia a la estreptotririna, y la otra corresponde a E. coli BW25113 ábamBtolC que expresa VIM-2ss, una enzima de resistencia a lactam. Debido a la falta de replicación del crecimiento de la colonia blaVIM2ss, además de la falta de resistencia cruzadaque se sabe que se produce entre estas dos clases de antibióticos, se puede suponer que una cepa distinta de E. coli tolC pGDP1: blaVIM2ss está creciendo en el pozo de la placa de la biblioteca congelada respectiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Superposición de agar MHB perforado. La cepa de producción WAC 5106 fue desreplicada utilizando la plantilla ARP. Se encontró que esta cepa era un productor de estreptomicina, como lo indica el crecimiento de E. coli BW25113 ábamBátolC pGDP3:aph(6)-Ia. Los agujeros de punción se pueden ver en la superficie de la superposición del agar MHB a lo largo del perímetro de la placa. Aunque esto no afecta a los resultados de la desreplicación, puede dificultar la interpretación de los datos a primera vista. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Contaminación de la superposición de agar MHB. El agar MHB contaminado produce un patrón de crecimiento irregular en la superficie de la superposición que se hace visible después de incubar la placa durante la noche a 37 oC. Aunque el crecimiento de E. coli todavía puede ser visible a través de la contaminación, se recomienda repetir el experimento antes de extrapolar los datos de la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Plásmido | Marcador seleccionable |
| pGDP1 | Kanamicina 50 g/ml |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | Ampicilina 100 g/ml |
| pGDP4 | |
| Ninguno | - |
Tabla 1: Marcadores seleccionables utilizados en la serie de plásmidos pGDP. Raya las cepas ARP/MARP E. coli en platos de agar Petri LB que contengan el marcador seleccionable adecuado en la concentración adecuada para cada plásmido.
| Medio | Ingrediente | Cantidad |
| Sam | Glucosa | 15 g |
| Peptona de soja | 15 g | |
| Nacl | 5 g | |
| Extracto de levadura | 1 g | |
| CaCO3 | 1 g | |
| Glicerol | 2,5 ml | |
| ddH2O | Hasta 1 L | |
| Bennett's | Almidón de patata | 10 g |
| Acidos Casamino | 2 g | |
| Extracto de levadura | 1,8 g | |
| Mezcla mineral de Czapek | 2 ml | |
| Agar (opcional) | 15 g | |
| ddH2O | Hasta 1 L | |
| Mezcla mineral de Czapek | Kcl | 10 g |
| MgSO4x 7H2O | 10 g | |
| NaNO3 | 12 g | |
| FeSO4x 7H2O | 0,2 g | |
| HCl concentrado | 200 l | |
| ddH2O | A 100 ml |
Tabla 2: Recetas para los medios de comunicación de SAM y Bennett, y mezcla mineral de Czapek. Ajuste SAM y Bennett a pH 6.8 antes de autoclave, y filtre la mezcla mineral de Czapek.
| Clase de antibióticos | Antibiótico | Gene de resistencia | E. coli Strain | Posición del pozo |
| Aminoglucósidos | Estreptomicina | aph(3'')-Ia | •bamB-tolC BW25113 | B3, G10 |
| 2- Desoxistreptamina | rmtB | •bamB-tolC BW25113 | F3, C10 | |
| Apramycina | apmA | •bamB-tolC BW25113 | C5, F8 | |
| Espectinomicina | aph(9)-Ia | •bamB-tolC BW25113 | B5, G8 | |
| Lactams | Penicilina | NDM-1 | •bamB-tolC BW25113 | B4, G9 |
| Cefalosporina | ||||
| Carbapenam | ||||
| Lincosamides | Lincosamides | ermC | •bamB-tolC BW25113 | D4, E9 |
| Macrólidos | Macrólidos | ermC | ||
| Estreptograminas tipo B | Estreptograminas tipo B | ermC | ||
| Estreptograminas tipo A | Estreptograminas tipo A | vatD | •bamB-tolC BW25113 | C3, F10 |
| Streptothricin | Streptothricin | Estadísticas | •bamB-tolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetraciclinas | Tetraciclina | tet(A) | •bamB-tolC BW25113 | D5, E8 |
| Cloramphenicols | Cloramphenicols | Gato | •bamB-tolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomicinas | Fosfomicinas | fosA | •bamB-tolC BW25113 | F6, C7 |
| Rifamicinas | Rifamicinas | Arr | •bamB-tolC BW25113 | E3, D10 |
| Polimixinas | Polimixinas | MCR-1 | tipo salvaje BW25113 | C6, F7 |
| Echinomicinas | Echinomicinas | uvrA | •bamB-tolC BW25113 | F4, C9 |
| Sidermicinas | Albomina | fhuB mutante | •bamB-tolC BW25113 | C4, F9 |
| Tuberactinomicinas | Viomicina | vph | •bamB-tolC BW25113 | F5, C8 |
| N/A | N/A | N/A | tipo salvaje BW25113 | C1, C12, F1, F12, E5, D8 |
| N/A | N/A | N/A | •bamB-tolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabla 3: Tabla de designación de pozos para las cepas ARP mínimas. Esta tabla indica en qué pozo de una placa de 96 pocillos se puede encontrar cada una de las cepas ARP mínimas de acuerdo con el mapa mínimo de placas de biblioteca ARP. La tabla también enumera a qué clase de antibióticos cada gen confiere resistencia. Tenga en cuenta que algunos genes pueden conferir resistencia a más de un antibiótico dentro de la clase de antibióticos dada.
| Clase de antibióticos | Antibiótico | Gene de resistencia | E. coli Strain | Posición del pozo |
| Aminoglucósidos | Estreptomicina | aph(3'')-Ia | •bamB-tolC BW25113 | B2, G11 |
| aph(6)-Ia | •bamB-tolC BW25113 | C6,F7 | ||
| Espectinomicina | aph(9)-Ia | •bamB-tolC BW25113 | A2, H11 | |
| Gentamicina | aac(3)-Ia | •bamB-tolC BW25113 | A3,H10 | |
| hormiga(2'')-Ia | •bamB-tolC BW25113 | A5, H8 | ||
| aph(2'')-Id | •bamB-tolC BW25113 | A4, H9 | ||
| armA | •bamB-tolC BW25113 | A6, H7 | ||
| aac(6')-aph(2'')-Ia | •bamB-tolC BW25113 | B5,G8 | ||
| Kanamicina | aph(3')-Ia | •bamB-tolC BW25113 | B4, G9 | |
| aph(3')-Illa | •bamB-tolC BW25113 | B3, G10 | ||
| Higromicina | aph(4)-Ia | •bamB-tolC BW25113 | B6,G7 | |
| Lactams | Amoxicilina | TEM-1 | •bamB-tolC BW25113 | F6, C7 |
| Ceftazidima | CTX-M-15 | •bamB-tolC BW25113 | F5, C8 | |
| Oxacilina | OXA-10 | •bamB-tolC BW25113 | G5, B8 | |
| OXA-48 | •bamB-tolC BW25113 | H5, A8 | ||
| Meropenem | IMP-7ss | •bamB-tolC BW25113 | G4, B9 | |
| KPC-2 | •bamB-tolC BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 | •bamB-tolC BW25113 | H6, A7 | ||
| Imipenem | VIM-2 | •bamB-tolC BW25113 | F4, C9 | |
| Lincosamides | Lincosamides | ermC | •bamB-tolC BW25113 | C4, F9 |
| lnu(A) | •bamB-tolC BW25113 | C5, F8 | ||
| Macrólidos | Macrólidos | ermC | •bamB-tolC BW25113 | C4, F9 |
| mphA | •bamB-tolC BW25113 | C3, F10 | ||
| mphB | •bamB-tolC BW25113 | C2, F11 | ||
| Estreptograminas tipo B | Estreptograminas tipo B | ermC | •bamB-tolC BW25113 | C4, F9 |
| Vgb | •bamB-tolC BW25113 | D4, E9 | ||
| Estreptograminas tipo A | Estreptograminas tipo A | vatD | •bamB-tolC BW25113 | D5, E8 |
| Streptothricin | Streptothricin | Estadísticas | •bamB-tolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetraciclinas | Tetraciclina | tet(M) | •bamB-tolC BW25113 | E5, D8 |
| Cloramphenicols | Cloramphenicols | Gato | •bamB-tolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomicinas | Fosfomicinas | fosA | •bamB-tolC BW25113 | H4, A9 |
| Rifamicinas | Rifamicinas | Arr | •bamB-tolC BW25113 | E3, D10 |
| N/A | N/A | N/A | •bamB-tolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabla 4: Tabla de designación de pozos para las cepas ARP. Esta tabla indica en qué pozo de una placa de 96 pocillos se puede encontrar cada una de las cepas ARP de acuerdo con el mapa de placas de biblioteca ARP. La tabla también enumera a qué clase de antibióticos cada gen confiere resistencia. Tenga en cuenta que algunos genes pueden conferir resistencia a más de un antibiótico dentro de la clase de antibióticos dada.
Figura suplementaria 1: Mapa de placas de biblioteca utilizado para la plantilla original de la plataforma de resistencia a antibióticos (ARP). Organice las cepas de E. coli respectivas en una placa de 96 pocillos utilizando este formato para asegurarse de que se incluyen todos los controles y duplicados necesarios. Esta cifra ha sido modificada de Cox et al.10. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 2: Mapa de placas de biblioteca utilizado para la plantilla de plataforma de resistencia mínima a antibióticos (MARP). Organice las cepas de E. coli respectivas en una placa de 96 pocillos utilizando este formato para asegurarse de que se incluyen todos los controles y duplicados necesarios. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito anteriormente puede aplicarse tanto al descubrimiento de nuevos compuestos antimicrobianos como a los adyuvantes que pueden utilizarse junto con los antibióticos existentes para rescatar su actividad. La plataforma aprovecha la alta especificidad del sustrato de los mecanismos de resistencia y sus antibióticos cognados, para desreplicar compuestos dentro de extractos de productos naturales crudos. Aunque el tiempo necesario para que las placas de desreplicación se preparen es largo (2 semanas), el proceso de desreplicación en sí se completa después de un único período de incubación durante la noche, que es rápido en comparación con el tiempo que puede tomar aislar y caracterizar a un compuesto de extractos crudos. Además, no se requiere ningún equipo costoso o altamente especializado, lo que hace que esta plataforma sea accesible y rentable.
Otro de los principales beneficios de esta plataforma es su flexibilidad. El ARP se puede ampliar para contener genes de resistencia que abarcan más clases de antibióticos. Esto se logra mediante el seguimiento de la literatura para la aparición de nuevas enzimas de resistencia y el uso de técnicas básicas de clonación molecular para agregar los genes a la biblioteca de E. coli. Además, la plantilla de desreplicación se puede personalizar en función del nivel deseado de especificidad de sustrato de rango amplio o estrecho que un individuo desea utilizar al dereplicar. Cualquier combinación de genes en la biblioteca de E. coli se puede utilizar para hacer nuevas placas de biblioteca con la capacidad de detectar compuestos con diferentes perfiles. Por ejemplo, podría desarrollarse una plantilla de E. coli que expresa la lactamamase para permitir la dereplicación muy específica de los lactams y sus diferentes subclases.
Mientras que esta plataforma fue diseñada inicialmente para desreplicar compuestos en medios sólidos, también se ha utilizado en medios líquidos. Esto es útil cuando se trabaja con compuestos que ya han sido purificados en los que sólo una cantidad limitada está disponible para las pruebas, o cuando se trabaja con compuestos que no se difunden fácil o consistentemente en medios sólidos. Por último, mientras que este protocolo se describió utilizando las cepas de E. coli BW25113 y BW25113 ábamB,la plataforma se puede utilizar con la biblioteca de genes de resistencia expresada en diferentes cepas de E. coli (desreplicación detolC, la plataforma se puede utilizar con la biblioteca de genes de resistencia expresada en diferentes cepas de E. coli (desreplicación fenotipos puedenvariar) . En última instancia, la plataforma de resistencia a antibióticos es flexible, tiene muchas aplicaciones y es ventajosa con otros métodos de desreplicación.
Para garantizar que se obtengan resultados reproducibles y no contaminados, es fundamental seguir las técnicas adecuadas de esterilización y asépticas. Si no lo hace, se contaminarán las herramientas de fijación, la placa de la biblioteca o la propia placa de desreplicación. Mientras que los marcadores seleccionables están presentes en la biblioteca de E. coli, lo que puede ayudar a prevenir la contaminación causada por bacterias que faltan el marcador, no impide la contaminación cruzada de las cepas utilizando el mismo marcador. Para reducir el riesgo de que esto suceda es esencial esterilizar cuidadosamente las herramientas de fijación bacteriana antes de fijar desde la placa de la biblioteca. Cada placa de biblioteca solo debe fijarse de 3 a 4 veces como máximo antes de descartaruna para una nueva plantilla. Esto evita la propagación de la contaminación en todas las placas de desreplicación si una placa de biblioteca se contamina durante el proceso de fijación. Además, no se utilizan antibióticos al inocular la placa de desreplicación, por lo que se debe tener mucho cuidado para evitar la contaminación antes de que se deja fermentar durante seis días. Otra posible fuente de contaminación está en la superposición de agar MHB de la placa de desreplicación. Si el medio de superposición está contaminado, el crecimiento solo aparecerá después de la incubación durante la noche a 37 oC después de la fijación. La contaminación por superposición puede dificultar enormemente el análisis del crecimiento de la biblioteca de E. coli en la superficie de superposición. Para reducir las posibilidades de contaminación por superposición, prepare el agar MHB fresco antes de verter la superposición. Se recomienda que hasta que un individuo se sienta cómodo con este método, las placas de desreplicación siempre deben prepararse por duplicado o triplicar de manera que, en caso de contaminación de una placa, los datos todavía se puedan extraer de la placas no contaminadas.
Por último, es importante tener en cuenta que el ARP/MARP tiene limitaciones. Este protocolo no es adecuado para la desreplicación de cepas de producción que producen más de un compuesto bioactivo. Cada cepa de la biblioteca de E. coli ha sido diseñada para expresar un solo gen de resistencia. Si un organismo produce dos antibióticos, ninguno de los genes de resistencia confiere resistencia al segundo antibiótico, lo que resultará en la muerte celular de ambas cepas. Por lo tanto, esta posibilidad debe tenerse en cuenta cuando los resultados de la desreplicación sugieren la presencia de un antibiótico novedoso porque la producción de múltiples antibióticos no puede ser detectada por la biblioteca actual de E. coli. Un enfoque que se puede tomar para combatir el desafío de dereplicar cepas que producen más de un antibiótico implica el uso del procedimiento de agar-enchufe descrito en el documento ARP original por Cox et al.10. En este método, una porción de un medio sólido fermentado se elimina de una placa que contiene antibióticos y se coloca en un césped de cepa ARP indicadora. La cepa indicadora puede ser cualquiera de las cepas resistentes de E. coli en la biblioteca ARP. Las zonas de inhibición se utilizan para comparar la bioactividad de una cepa de producción con las cepas arpa y una cepa de tipo salvaje. Las cepas arpas que forman una zona inhibitoria de tamaño disminuido en comparación con la cepa de tipo salvaje pueden resistir el compuesto que se produce. Este método ha demostrado ser eficaz para identificar cepas capaces de producir múltiples antibióticos10.
En resumen, para obtener los mejores resultados al desreplicar con el ARP/MARP se recomienda que las placas de desreplicación se preparen en duplicado o triplicado. Otros pasos críticos en el protocolo incluyen fijar de una placa de biblioteca fresca (nunca congelada) y eliminar tanta biomasa como sea posible de la cepa de producción durante la etapa de eliminación de membrana. Si se siguen todos los pasos necesarios, uno debe tener resultados de desreplicación exitosos para una cepa de producción de interés dentro de un período de tiempo de dos semanas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación en el laboratorio Wright relacionada con el ARP/MARP fue apoyada por el Fondo de Investigación de Ontario y la subvención de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (FRN-148463). Nos gustaría reconocer a Sommer Chou por ayudar en la expansión y organización de la biblioteca ARP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
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