Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Angst Incubatie met behulp van een uitgebreide Angst-Conditioning Protocol voor ratten

Published: August 22, 2020 doi: 10.3791/60537
Automatic Translation
1,6, 2, 2, 3, 3, 4, 2, 2, 2,5
1School of Psychology, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, 2Animal Behavior Laboratory, Fundación Universitaria Konrad Lorenz, 3Department of Psychology, Universidad de Los Andes, 4School of Veterinary Medicine, Animal Health Department, Universidad Nacional de Colombia, 5Department of Psychology, Troy University, 6Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Summary

We beschrijven een uitgebreid angst-conditionering protocol dat overtraining produceert en angst incubatie bij ratten. Dit protocol omvat een enkele trainingssessie met 25 tone-shock pairings (d.w.z. overtraining) en een vergelijking van geconditioneerde vriesreacties tijdens context- en cuetests 48 uur (korte termijn) en 6 weken (lange termijn) na de training.

Abstract

Emotioneel geheugen is voornamelijk bestudeerd met angst-conditionerende paradigma's. Angst conditionering is een vorm van leren waardoor individuen leren de relaties tussen aversieve gebeurtenissen en anderszins neutrale stimuli. De meest gebruikte procedures voor het bestuderen van emotionele herinneringen met zich meebrengen angst conditionering bij ratten. In deze taken, de ongeconditioneerde stimulus (VS) is een voetschok een of meerdere keren gepresenteerd over enkele of meerdere sessies, en de geconditioneerde reactie (CR) is bevriezen. In een versie van deze procedures, genaamd cued angst conditionering, een toon (geconditioneerde stimulus, CS) wordt gepaard met voetschokken (US) tijdens de trainingsfase. Tijdens de eerste proef worden dieren blootgesteld aan dezelfde context waarin de training heeft plaatsgevonden, en worden de vriesreacties getest bij afwezigheid van voetschokken en tonen (d.w.z. een contexttest). Tijdens de tweede test wordt het bevriezen gemeten wanneer de context wordt gewijzigd (bijvoorbeeld door het manipuleren van de geur en muren van de experimentele kamer) en de toon wordt gepresenteerd bij afwezigheid van voetschokken (d.w.z. een cue-test). De meeste cued angst conditionering procedures leiden tot weinig toon-shock combinaties (bijvoorbeeld, 1-3 proeven in een enkele sessie). Er is een groeiende belangstelling voor minder voorkomende versies met een uitgebreid aantal combinaties (d.w.z. overtraining) in verband met het langdurige effect dat angstinbezubatie wordt genoemd (d.w.z. angstreacties nemen na verloop van tijd toe zonder verdere blootstelling aan aversieve gebeurtenissen of geconditioneerde stimuli). Uitgebreide angst-conditionering taken zijn de sleutel tot het begrip van angst incubatie gedrags-en neurobiologische aspecten, met inbegrip van de relatie met andere psychologische verschijnselen (bijvoorbeeld post-traumatische stress stoornis). Hier beschrijven we een uitgebreid angst-conditioneringsprotocol dat overtraining produceert en angst voor incubatie bij ratten. Dit protocol omvat een enkele trainingssessie met 25 tone-shock pairings (d.w.z. overtraining) en een vergelijking van geconditioneerde vriesreacties tijdens context- en cuetests 48 uur (korte termijn) en 6 weken (lange termijn) na de training.

Introduction

Geheugen is een psychologisch proces dat verschillende fasen omvat: informatieverwerving, consolidatie (zorgt voor de stabiliteit van verkregen informatie) en ophalen (bewijs voor het consolidatieproces)1. Tijdens de consolidatiefase vinden de oprichting van nieuwe synaptische verbindingen en de wijziging van reeds bestaande verbindingen plaats. Dit suggereert de noodzaak voor een periode waarin moleculaire en fysiologische gebeurtenissen die verantwoordelijk zijn voor deze veranderingen optreden1,2. Deze fysiologische of moleculaire veranderingen variëren of de opgehaalde gebeurtenissen emotioneel geladen zijn of niet (d.w.z. emotioneel geheugen). Zo heeft onderzoek aangetoond dat de laterale kern en het basolaterale amygdala-complex bijzonder relevant zijn voor emotioneel geheugen3,4,5.

Emotionele geheugen verschijnselen zijn voornamelijk bestudeerd met angst conditionering paradigma's5,6. Angst conditionering is een vorm van leren waardoor individuen leren de relaties tussen aversieve gebeurtenissen en anders neutrale stimuli7. Angst conditionering paradigma's produceren moleculaire, cellulaire, en structurele veranderingen in de amygdala. Bovendien wijzigt angstconditionering de connectiviteit van de hippocampus tijdens de consolidatie- en ophaalprocessen van emotioneel geheugen.

Een van de meest gebruikte procedures voor het bestuderen van angst herinneringen is klassieke (Pavlov) conditionering bij ratten. Deze procedure maakt meestal gebruik van footshock (US) als de aversieve stimulus, die een of meerdere keren wordt geleverd over een of meerdere sessies. De geconditioneerde respons (CR) van ratten die aan deze procedure worden blootgesteld, is bevriezing (d.w.z. "gegeneraliseerde immobiliteit veroorzaakt door een algemene tonische respons van het skelet van de dieren, behalve die spieren die worden gebruikt bij de ademhaling"7 ). Deze respons kan worden beoordeeld op twee soorten tests: context- en cuetests. Voor de contexttest ondergaat het onderwerp een bepaald aantal voetschokken tijdens de training en wordt het vervolgens gedurende een bepaalde tijd uit de experimentele kamer verwijderd. Tijdens de test wordt het onderwerp teruggebracht naar dezelfde context waarin de opleiding heeft plaatsgevonden en worden verschillende vriesmaatregelen verzameld bij afwezigheid van voetschokken (bijvoorbeeld duur, percentage of frequentie van bevriezingse episodes) en in vergelijking met de basisniveaus die tijdens de trainingsfase zijn vastgesteld. Voor het tweede type test, cue test, wordt een stimulus (meestal een toon) gekoppeld aan de voetschokken tijdens de trainingsfase (d.w.z. voorwaardelijke stimulus, CS). Na de training wordt het dier gedurende een bepaalde tijd uit de trainingscontext verwijderd en vervolgens in een gewijzigde context geplaatst (bijvoorbeeld een andere experimentele kamer met verschillende vormen van muren en verschillende geurgeuren). De cue wordt vervolgens een bepaald aantal keren gepresenteerd en de bevriezing van de reacties op de cue wordt gemeten en vergeleken met basislijnniveaus die tijdens de training worden verzameld. De meest voorkomende versie van dit paradigma maakt gebruik van 1 tot 3 tone-shock pairings tijdens een enkele trainingssessie, gevolgd door context- en cuetests die een aantal uren of een paar dagen later zijn uitgevoerd.

Andere minder vaak geïmplementeerde angstconditioneringsprocedures omvatten een uitgebreid aantal shock-cue-koppelingen (d.w.z. proeven), die vaak overtrainingsprocedures worden genoemd8. Een groeiende belangstelling voor deze taken is gerelateerd aan hun langdurige en verhoogde geheugeneffecten genaamd angst incubatie (dat wil zeggen, geconditioneerde angst reacties toenemen na verloop van tijd in de afwezigheid van verdere blootstelling aan aversieve gebeurtenissen of geconditioneerde stimuli)9,10,11. Een voorbeeld van dergelijke overtrainingsprocedures omvat een trainingsfase van 100 toonschokkoppelingen verdeeld over 10 sessies, gevolgd door context- en cuetests die 48 uur en 30 dagen later11,12worden uitgevoerd . Om uitgebreide training over meerdere dagen te vermijden, meldde Maren (1998) dat overtraining in één sessie met 25 combinaties8kon worden opgezet en geoptimaliseerd. Het incubatieeffect blijkt in aanzienlijk hogere niveaus van geconditioneerde angst bij ratten getest 31 dagen na de training, in vergelijking met ratten getest 48 uur na. Uitgebreide angst-conditionering taken zijn van cruciaal belang voor het begrip van gedrags-en neurobiologische aspecten die ten grondslag liggen aan angst incubatie, met inbegrip van de relatie met andere psychologische verschijnselen (bijvoorbeeld, vertraagde-onset posttraumatische stress stoornis)11,12,13.

Hier beschrijven we een uitgebreid angst-conditioneringsprotocol dat overtraining induceert en angst vreest voor incubatie bij ratten. Anders dan andere paradigma's die meerdere dagen trainingvereisen 11, is het huidige protocol gericht op één trainingssessie8. We gebruikten 25 tone-shock pairings om hogere geconditioneerde vriesreacties te produceren tijdens de context en cue tests uitgevoerd 6 weken na de training, in vergelijking met tests uitgevoerd 48 uur na.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het volgende protocol werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Fundación Universitaria Konrad Lorenz (IACUC-KL). De universele verklaring van dierenrechten uitgegeven door International League of Animal Rights, Genève, Zwitserland (1989), en ethische principes van experimenten met dieren uitgegeven door ICLAS werden gerespecteerd.

1.

  1. Selecteer mannelijke volwassen Wistar ratten (n = 12). Huis ze in groepen van vier per kooi gedurende drie dagen van acclimatisatie, voorafgaand aan het begin van de opleiding en het testen protocol. Geef ratten gratis toegang tot water tijdens het experiment. Controleer de kamertemperatuur tussen 20 °C tot 25 °C, onder een licht-donkere cyclus van 12 uur (lampjes aan om 07:00 uur).
    OPMERKING: Rattenstammen hadden differentiële prestaties vertoond tijdens angst conditionering. Bijvoorbeeld, Schaap et al. (2013) gemeld dat Wistar en Lewis stammen toonde langere duur van bevriezing gedrag in vergelijking met Fawn Hooded en Brown Norway ratten12. Zo moeten verschillen in pijn en thermische drempel worden beoordeeld om de intensiteit en duur van schokken aan te passen.
  2. Houd ratten op 85% van hun vrije voedergewicht (normaal gewicht tussen 350-400 g) door het geven van beperkte toegang tot voedsel op hetzelfde uur elke dag. Weeg ratten elke dag op hetzelfde uur tijdens de lichtcyclus. Bereken het ad lib gewicht (100% gewicht) gedurende drie dagen voor het begin van uitgebreide angst-conditioning training.
    OPMERKING: Dieren die in het onderhavige experiment werden gebruikt, zijn getest op aanvullende instrumentele tests die hier niet worden gemeld. Voor die aanvullende tests was voedselprivatie nodig. Deze procedurele variatie zal het toepassingsgebied van de huidige procedure waarschijnlijk uitbreiden, aangezien het de mogelijkheid voor gecombineerde instrumentele angsttests suggereert. Echter, studies met alleen angst conditionering tests zal geen voedseltekort vereisen.
  3. Personen willekeurig toewijzen aan een van de volgende groepen: emotionele tests 6 weken na de training (n = 6); emotionele testen 48 uur na de training (n = 6).
  4. Trainings- en tests uitvoeren op vergelijkbare uren, tijdens de lichtfase van de donkere lichtcyclus. Wijs de dieren toe aan dezelfde experimentele kamer en houd dezelfde volgorde van dieren vast tijdens de training en het testen.
    OPMERKING: Een extra controle die kan worden uitgevoerd, is het tegenwicht van de volgorde van dieren tijdens trainings- en testfasen. We raden u aan deze techniek te gebruiken wanneer groepen met meerdere groepen worden beoordeeld of verschillende taken worden toegepast in verschillende experimenten, om een mogelijk effect van taakvolgorde op gedrag te verminderen.

2. Instelling van apparaten en schokkalibratie

  1. Reinig alle binnenoppervlakken van de experimentele kamer en de roestvrijstalen roostervloer met 10% ethanol. Herhaal dit voordat u elk dier test.
  2. Sluit de apparatuur aan op een computer met behulp van een USB-kabel en start de apparatuur voor het vriesdetectiesysteem: de CPU, de besturingskast, het infraroodlicht, de aversieve stimulator/scrambler en de schokintensiteitskalibrator.
    OPMERKING: Hoewel dit protocol is uitgevoerd met behulp van commercieel beschikbare instrumenten(Table of Materials),kunnen apparatuur en software van verschillende merken worden gebruikt. Het apparaat bestaat uit een interne acryl vierkante kamer (29,53 cm x 23,5 cm x 20,96 cm, de experimentele kamer genoemd) ingebed in een houten doos bedekt met plastic mierenzuur. De externe deuren maken het mogelijk om geluid, geluid of licht te isoleren (dempende boxdeuren). De camera bevindt zich zijdelings in het interne deel van de buitendeur. De interne acryldoos met vloermetalen roosters (36 roestvrijstalen staven, elk van 3 mm diameter en verdeeld 8 mm, centrum tot centrum) maakt voetshock levering mogelijk. In een van de intern-laterale wanden bevindt zich een luidspreker op 6 cm van de vloer om een auditieve cue te presenteren.
  3. Sluit de rode en zwarte clips van de schokintensiteit calibrator (d.w.z. positieve en negatieve connectoren) aan twee verschillende staven op de roostervloer. Sluit de USB-kabel aan op de bijbehorende poort van de computer. Zorg ervoor dat u de rode en zwarte clips aansluit op balken die door een andere balk zijn gescheiden.
    OPMERKING: In deze sectie wordt het kalibratieproces voor schokintensiteit beschreven met behulp van een specifiek merk apparatuur dat in de tabel met materialenwordt genoemd. Het kalibratieproces kan echter worden uitgevoerd met behulp van verschillende merken apparatuur. Het wordt aanbevolen om de intensiteit van de schok in drie sectoren van de netvloer te kalibreren om te controleren of deze consistent is. Verwijder bovendien altijd fecale en urineresten van de netvloer om interferentie tijdens de levering van de schok te voorkomen.
  4. Start de schok-intensiteit calibrator software(Table of Materials). Kies een intensiteit van 1,0 mA in de toepassing door op de bereikpijl te klikken. Wijzig vervolgens de schakelaar Uitvoeren/stoppen in Uitvoeren.
    OPMERKING: Wij stellen 1,0 mA voor op basis van onze studies met knaagdiermodellen in ons lab en literatuur die een bereik van 0,75 mA tot 1,5 mA rapporteert als geschikt voor studies naar angst conditionering33,34,35.
  5. Schakel de aversieve stimulator of de apparatuur die wordt gebruikt om de voetschokken te leveren en kijk naar de schokintensiteit weergegeven op het paneel van de toepassing. Pas indien nodig de intensiteit aan op 1,0 mA met behulp van de knop op de aversieve stimulator.
    OPMERKING: Aversieve stimulator moet worden ingesteld op "OUT" om het experiment op de juiste manier te testen, te kalibreren en uit te voeren.

3. Kalibratie van het detectiesysteem

  1. Sluit de experimentele kamer en geluidsdempende boxdeuren. Introduceer het dier op dit punt niet, omdat het in de kamer wordt geplaatst nadat de kalibratie van het vriesdetectiesysteem is voltooid. Controleer of de lichtintensiteit in de doos tussen de 20 en 30 lux ligt.
  2. Start de software voor het bevriesdetectiesysteem en open het venster Voor het instellen van het experiment. Voer de details van elk onderwerp in (zoals onderwerpidentificatienummer, datum en groep) en laad het bestand met de titel "Training protocol VFC.pro" (beschikbaar op http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
    OPMERKING: Context- en actietests gebruiken een andere programmaconfiguratie; zorg er dus voor dat u bij elke test het juiste bestand gebruikt. Op dit moment komt het juiste bestand overeen met "Training protocol VFC.pro". Vergeet niet dat tijdens testfasen het bestand dat overeenkomt, anders is dan de trainingssessie.
  3. Kies de bijbehorende camera(s) en controleer de optie Video opslaan (indien nodig). Stel de bewegingsdrempel in op 100 en Min Freeze-duur op 30 frames.
    OPMERKING: Deze waarde voor bewegingsdrempel is gebaseerd op de grootte van de gebruikte soorten (op basis van het aantal pixels). Minimale vriesduur waarde wordt aanbevolen door de fabrikant. Deze waarden worden gebruikt om een goede herkenning van het dier in de kamer te garanderen.
  4. Controleer of de live feed van de gekozen camera(s) op het scherm verschijnt, samen met de bewegingsdrempelgrafiek en de tijdlijn van de verschillende stimuli die tijdens de training worden gepresenteerd (bijvoorbeeld geluid en schok).
    OPMERKING: Met behulp van een ander merk moet de installatie van de apparatuur de mogelijkheid bieden om de bewegingen van het dier te meten om een "index" van beweging te detecteren die vergelijkingen mogelijk moet maken over de hoeveelheid tijd die het dier beweegt of invriest. Een andere mogelijkheid is het gebruik van een software die met alleen de videobron (tijdens of na het experiment) kan detecteren hoeveel tijd het dier in beweging is of invriezen, zoals vrije software ImageFZ13,open-source toolbox in Matlab14, of een vrije classificatie van dierlijk gedrag als JAABA15.
  5. Klik drie keer op de optie Kalibreren en controleer of de bewegingsindex onder de 100 (drempelwaarde) blijft. Stel vervolgens de apparatuur in om te vergrendelen door op de bijbehorende knop op het scherm te klikken.
    OPMERKING: In deze sectie wordt een kalibratieproces voor het vriesdetectiesysteem beschreven met behulp van een specifiek merk van apparatuur die in de tabel met materialen wordtvermeld. Zoals eerder vermeld, kan het kalibratieproces worden uitgevoerd met behulp van verschillende merken van apparatuur (voor een herziening van de verschillende opties in apparatuur en software zie Anagnostaras et al. 2010)16.

4. Uitgebreide angst conditionering opleiding

  1. Vervoer de ratten in hun kooien, bedekt met een doek, van de dierenopvang naar de gedragstrainingsruimte in het laboratorium. Vermijd blootstelling aan lawaai of stressgenererende omstandigheden tijdens het vervoer van dieren naar de gedragstrainingsruimte. Als meerdere dieren tegelijkertijd worden vervoerd, breng dan alleen de te testen dieren mee en houd andere ratten in een bedrijfsruimte om de experimentele controle te verbeteren. Behandel de dieren voorzichtig gedurende 2 minuten voordat u aan de training begint.
    OPMERKING: In het protocol werden de dieren elke dag gedurende 2 minuten behandeld voor gedragstraining. Na behandeling werden dieren in de experimentele kamer geïntroduceerd. We adviseerden om dieren te manipuleren om ratten gewend te stellen aan de onderzoeker.
  2. Laat de rat kennismaken met de experimentele kamer. Behandel het voorzichtig door de basis van zijn staart en plaats het op het midden van de kamer. Sluit de experimentele kamer en geluidsdempende boxdeuren.
  3. Start de sessie door op de knop Opnemen te klikken. Laat de rat 3 minuten wennen aan de kamer. Deze periode van 3 minuten is de standaard die door de fabrikant van de apparatuur wordt aanbevolen en dient als basis- en gewenningstijd aan de kamer.
  4. Lever vijfentwintig tone-shock koppelingen (trials) met een Inter-Trial Interval (ITI) van 60 s, te beginnen op minuut 3 van de sessie. Presenteer de toon (geconditioneerde stimulus – CS; 90 dB SPL, 2000 Hz, 50-ms Rise Time) tijdens de laatste 10 s van elke ITI, en de schok (ongeconditioneerde stimulus – US) tijdens de laatste 2 s van elke ITI.
    OPMERKING: De activering van de knop Opnemen is afhankelijk van het feit dat camera's correct zijn gekalibreerd en vergrendeld.
  5. Haal de rat uit de experimentele kamer wanneer de 28 minuten durende sessie voorbij is. Breng dieren terug naar de respectievelijke thuiskooi. Vervoer de ratten in hun kooien bedekt met een doek van de gedragstrainingsruimte naar de dierenopvang.
  6. Herhaal de kalibratie van het vriesdetectiesysteem (stappen 3.1-3.5) en vreesconditionering (stappen 4.1 en 4.3) om alle onderwerpen te trainen.
    OPMERKING: We raden ten zeerste aan om het detectiesysteem voor elk dier opnieuw te kalibreren om ervoor te zorgen dat de software dezelfde parameters onderhoudt wanneer het informatie verwerkt voor het bevriezen van detectie.
  7. Rustperiode: Tijdens deze periode, hebben de dieren rusten individueel in hun kooien thuis. Controleer het gewicht van de dieren twee maal per week gedurende de 6 weken van de incubatietijd. Manipuleer elk dier zachtjes gedurende twee minuten terwijl ze worden gewogen.

5. Contexttest – enkele sessie van 10 minuten

  1. Stel de dieren na de trainingsfase bloot aan de eerste geheugentest, contexttestgenaamd. Tijdens deze 10 minuten fase, bloot stellen van de ratten aan dezelfde context waarin de opleiding plaatsvond, maar geen signalen of schokken. Vervoer de ratten in hun overdekte kooien (bijvoorbeeld met een doek) van de dierenopvang naar de gedragstrainingsruimte. Houd er rekening mee dat de dieren in groepen zijn verdeeld, waardoor één groep 48 uur na de trainingsfase wordt getest en de andere groep 6 weken na de training wordt getest (zie figuur 1).

Figure 1
Figuur 1: Tijdlijn van het experiment. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Reinig alle binnenoppervlakken van de experimentele kamer en de roestvrijstalen roostervloer met 10% ethanol. Herhaal dit voordat u elk dier test.
  2. Herhaal de kalibratie van het detectiesysteem herhalen (stappen 3.1 tot en met 3,5). Open het dialoogvenster Experiment-instelling en laad het bestand met de naam 'Contexttest protocol.pro', dat beschikbaar is bij http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    OPMERKING: Dit bestand bevat de setup voor deze experimentele fase die bestaat uit geen schokken of tonen.
  3. Laat het dier kennismaken met de experimentele kamer. Behandel het voorzichtig door de basis van zijn staart en plaats het op het midden van de kamer. Sluit de experimentele kamer en geluidsdempende boxdeuren.
  4. Start de sessie door op de knop Opnemen te klikken. Tijdens deze enkele contexttestsessie van 10 minuten worden geen stimuli gepresenteerd (schok noch geluid).
  5. Verwijder het onderwerp uit de experimentele kamer wanneer de 10 minuten sessie voorbij is. Breng de dieren terug naar hun respectievelijke kooien en vervoer de ratten in hun overdekte kooien van de gedragstrainingsruimte naar de dierenopvang. Herhaal stap 5.2-5.5 om alle onderwerpen te testen.

6. Cue test – enkele 13 min sessie

  1. Een dag na de context test, hebben dieren ondergaan de tweede test van het geheugen genaamd cue test. Tijdens deze fase zullen de ratten zich in een andere context van training gedurende 13 min. signalen (tonen) worden gepresenteerd, maar er worden geen schokken geleverd. Vervoer de ratten in hun kooien bedekt met een dekking van de dierenopvang naar de gedragstrainingsruimte. Test een groep 72 uur na de angst conditionering training, en test een andere groep 6 weken en een dag na de training (Figuur 1).
    OPMERKING: Een ander transportsysteem (van de dierenverzorgingsinstelling naar de experimentele ruimte) zou kunnen worden geïmplementeerd om meer de context- en cuetests te onderscheiden. Aangezien de dieren in hun kooien naar de trainingssessie en contexttest werden vervoerd, kon tijdens het transport naar de cue-testsessie een andere transportkooi, beddengoed en/of afdekking worden gebruikt.
  2. Reinig alle binnenoppervlakken van de experimentele kamer en de roestvrijstalen roostervloer met 10% ethanol. Herhaal dit voordat u elk dier test.
  3. Om de visuele context te veranderen, plaatst u de kunststof omliggende muur in de experimentele kamer.
  4. Om de reukcontext te veranderen, breng u 1% azijnzuur aan op een wattenstaafje met katoen en plaatst u het in de metalen lade onder de roostervloer17,18,19.
  5. Herhaal de kalibratie van het vriesdetectiesysteem (stap 3.1-3.5). Laad het bestand met de naam bestand 'Cue-test protocol.pro'-bestand, dat beschikbaar is bij http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    OPMERKING: Dit bestand bevat de opstelling voor deze experimentele fase, die bestaat uit de levering van dezelfde tonen gepresenteerd tijdens de trainingsfase (CS), maar bij afwezigheid van schokken (VS).
  6. Laat het dier kennismaken met de experimentele kamer. Behandel het voorzichtig door de basis van zijn staart en plaats het op het midden van de kamer. Sluit de experimentele kamer en geluidsdempende boxdeuren.
  7. Start de sessie door op de knop Opnemen te klikken. Tijdens de enkele 13 min cue testsessie wordt de CS stimulus (toon) 10 keer gepresenteerd, te beginnen op minuut 3 van de sessie.
    OPMERKING: De eerste 3 min komen overeen met de basislijn van deze sessie, gevolgd door 10 cue test trials (dat wil zeggen, 10 s per stuk) geleverd met 50 s ITI's bij afwezigheid van schokken. De levering van tonen gebeurt automatisch, via het eerder geladen bestand.
  8. Haal het dier uit de experimentele kamer wanneer de 13 minuten durende sessie voorbij is. Breng de dieren terug naar de betreffende kooi en vervoer ze naar de dierenopvang. Herhaal stap 6.2 tot en met 6,5 om alle proefpersonen te testen.

7. Gegevensanalyse

  1. Verkrijg de algemene activiteitsindex (d.w.z. bewegingsindex) die is afgeleid van de videostream met behulp van de software van het vriesdetectiesysteem. Deze software transformeert automatisch de bewegingsindex om het percentage vriestijd per sessie en het aantal vriesafleveringen te bieden. Stel de vriesdrempel in op de standaardinstelling Minimale vriesduur van het systeem (1 s = 30 frames).
  2. Gebruik het aanvullende aangepaste programma (bestand beschikbaar vanaf http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ)om het mogelijk te maken:
    1. Gebruik het programma om het percentage bevriezing te bepalen tijdens de eerste drie minuten van de trainingssessie (d.w.z. bevriezing bij aanvang, omdat er geen schokken of tonen werden gepresenteerd voor of tijdens die periode van 3 minuten) en tijdens de eerste drie minuten van de cue-testsessie.
    2. Gebruik het programma om het percentage bevriezing te bepalen voor elk van de acht 3 minuten bakken van de trainingssessie.
    3. Gebruik het programma om het percentage bevriezing te bepalen tijdens de cue-presentaties (d.w.z. bevriezing tijdens de tonen) en no-cue perioden (tussenliggende intertriumintervallen; ITI's), voor zowel trainings- als cue-testsessies.
  3. Open de software van het vriesdetectiesysteem om deze gegevens te verkrijgen.
    1. Bestand selecteren | Verslagen | Samenvatting batchcomponent.
    2. Selecteer het bestand met extensie . CMP verkrijgbaar bij http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    3. Geef het uitvoerbestand een naam en wijzig bewegingsdrempel in een 100. Klik vervolgens op OK.
    4. Selecteer de bestanden die moeten worden geanalyseerd (extensie . RAW). Deze bestanden worden automatisch gegenereerd uit de software van het vriesdetectiesysteem wanneer de sessie voorbij is en komen overeen met de ruwe gegevens van elke sessie. In eerste instantie worden de bestanden opgeslagen op het bureaublad van de computer, maar ze kunnen worden opgeslagen in een aangepaste map (bijvoorbeeld Documenten-Angst conditionering) om hun latere identificatie en opening te vergemakkelijken wanneer ze moeten worden geanalyseerd.
    5. Open de uitvoerbestanden (extensie . CSV). Ze kunnen worden bewerkt in een spreadsheet software voor verdere analyse. Dit bestand bevat de resultaten van het bevriezen tijdens de experimentele sessie.
      OPMERKING: Als u het totale percentage bevriezing wilt verkrijgen, deelt u de tijd die het onderwerp onbeweeglijk heeft doorgebracht over de totale sessietijd. Het aantal vriesafleveringen kan worden berekend door het aantal vriesgebeurtenissen tijdens de sessie te tellen. In beide gevallen is het noodzakelijk om een bewegingsdrempel te definiëren op basis van een minimale vriesduur. Dit is het temporele criterium dat bepaalt of een Freeze Episode is opgenomen. Geautomatiseerde systemen van opname kunnen bepaalde hoeveelheid frames per seconde (fps) gebruiken als een maat voor de minimale vriesduur. Bijvoorbeeld, met een sample rate van 30 fps, een minimale vriesduur van 15 frames zal opnemen als bevriezing van een instantie van immobiliteit die duren voor 30 s.
  4. Bereken de gemiddelde duur van elke vriesaflevering voor elke sessie (training en beide tests, context en cue) door de totale vriesduur (in seconden) te delen over het totale aantal vriesafleveringen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Variaties in het percentage vriestijd tijdens verschillende fasen van de trainingssessie werden geanalyseerd voor alle proefpersonen (n = 12) met behulp van een afhankelijke t-test (tabel 1). Dieren waren actief en onderzochten de experimentele kamer tijdens de eerste drie minuten van de training (eerste dag van het protocol), tijd waarin geen tonen of schokken werden geleverd (d.w.z. baseline-BL). Zoals blijkt uit figuur 2A, percentage van de vriestijd tijdens de daaropvolgende 25 toonschokarrangies (M = 48,88; SE = 4,37) was aanzienlijk hoger dan tijdens BL (M = 14,65; SE = 4,05), die wordt aangenomen als een indicatie van angst overname.

Statistische test Figuur Fasen
Afhankelijke t-test 2A t (11) = -6,21, p < .001, d = 2,34
3-min bakken
Herhaalde maatregelen ANOVA 2B F (3,75, 41,32) = 11,19, p < .001, ηp2 = .50.
Fasen Groep Fase x-groep
Gemengde ANOVA 2C F(3, 30) = 14,21, p < .001, ηp2 =.58 F(3, 30) = 4,63, p < .05, ηp2 =.31 F(1, 10) = 2,06, p >.05, ηp2 =.17
One-Way ANOVA 3A F(1, 10) = 6,91, p < .05, ηp2 =,40
One-Way ANOVA 3B F(1, 10) = 10,30, p < .05, ηp2 =,50
One-Way ANOVA 3C F(1, 10) = 5,83, p <. 05.2
Gemengde ANOVA 4A F(2, 20) = 29,28, p < .001, ηp2 =.74 F(2, 20) = 2,33, p >.05, ηp2 =.18 F(1, 10) = 2,14, p >.05, ηp2 =.17
Gemengde ANOVA 4B 4B F(1, 10) = 1,53, p >.05, ηp2 =.13 F(1, 10) = 3,98, p < .05, ηp2 =.28 F(1, 10) = .23, p >.05, ηp2 =.02
Gemengde ANOVA 4C F(1, 10) = 25,43, p < .001, ηp2 =.71 F(1, 10) = 6,17, p < .05, ηp2 =.38 F(1, 10) = .22, p >.05, ηp2 =.02

Tabel 1: Statistieken die worden gebruikt in de gegevensanalyse. Voor figuur 2Awerd het gemiddelde percentage bevriezing van alle proefpersonen (n = 12) tijdens de eerste 3 min van de trainingssessie (overeenkomend met baseline, BL) vergeleken met het percentage bevriezing tijdens de resterende 25 minuten van de sessie (25 tone-shock trials) met een significant verschil en een groot effectgrootte (Cohen's d = 2,34). Voor figuur 2Bwerd een vergelijking gemaakt over bakken van 3 minuten met een significant verschil in een ANOVA-test met herhaalde metingen (BL en acht 3 minuten bakken). Voor figuur 2Cwerden vergelijkingen tussen het gemiddelde percentage bevriezing van elke groep ratten tijdens de aanvang (BL, eerste 3 min van de trainingssessie), trainingsperiode (25 tone-shock pairings), contexttestsessie en cuetestsessie uitgevoerd via een Gemengde ANOVA met tussen-proefpersonen factor de groep (48 uur of 6 weken) en binnen-factor de fasen (BL, Training, Context en Cue Test). Verschillen in fasen en groep, maar niet in de interactie Fasen * Groep werden gevonden. Figuur 3A – 3B toont gegevens over de activiteit (paneel 3A, bewegingsindex), bevriezing (paneel 3B, gemiddelde bevriezing in seconden) en duur van afleveringen (paneel 3C, gemiddelde bevriezing afleveringen in seconden). Deze gegevens werden geanalyseerd met behulp van een One-way ANOVA, die verschillen tussen groepen in alle metingen aangaf. Ten slotte werd voor figuur 4A – 4C een Gemengde ANOVA uitgevoerd voor elk panel (A, B en C), met tussen-proefpersonen factor de groep (48 uur of 6 weken) en binnen-onderwerpen factor de fasen (BL, Training, Context Test en Cue Test).

Figure 2
Figuur 2: Trainingsfase van een uitgebreid cued fear conditioning protocol. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde (balken) en de SEM (foutbalken) van de bevriezingsreactie. aA) het gemiddelde percentage bevriezing van alle proefpersonen (n = 12) vertoont tijdens de eerste 3 min van de training, waarin geen schokken of tonen werden gepresenteerd (baseline, BL), en de resterende 25 minuten van de sessie (25 tone-shock trials, met tussenruimte, ITI, van 60 s); = anders dan BL (p < .001). b) de gemiddelde vriestijd van alle dieren (n = 12) vertoont tijdens de aanvangsperiode van 3 minuten (BL, geen schokken of geleverde tonen) en de daaropvolgende 3 minuten bakken van de training; = anders dan alle resterende bakken(p < .001). c) het gemiddelde percentage van het bevriezen van elke groep ratten (testen 48 uur na de training; testen 6 weken na de training) tijdens de aanvang (BL, eerste 3 min van de training), trainingsperiode (25 toonschokkoppelingen), contexttestsessie en cue-testsessie; * = anders dan testen na 48 uur (gemiddelde diffContext = -34.95, SE = 14.99, p < .05, Cohen's d = 1.34); a = anders dan de opleidingsperiode (gemiddelde diffTraining48h = 42,51; SE = 7,28; p < .05; Cohen's d = 3,03); b = verschilt van de opleidingsperiode (gemiddelde diffTraining6Weeks = 25,94; SE = 7,28; p < .05; Cohen's d = 1.77), contexttest (gemiddelde diffContext6Weeks = 50.36; SE = 10,58; p < .01; Cohen's d = 3.13), en cue test (gemiddelde diffCue6Weeks = 55.86; SE = 10,25; p < .01; Cohen's d = 2.47). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Een analyse van de bevriezing respons tijdens de overname werd uitgevoerd door het segmenteren van de training sessie in acht 3 min bakken (Figuur 2B). Deze gegevens tonen aan dat de gemiddelde tijd die aan deze respons wordt toegewezen, tijdens de eerste drie toonschokproeven (d.w.z. Bin 1) asymptote in de buurt van of bij 180 s bereikt. Deze bevinding is in eerder onderzoek beschouwd als een indicatie van overtraining11. Herhaalde metingen ANOVA toonde consistente significante verschillen aan tussen de basislijn en alle volgende opslaglocaties, met grote effectgroottes(tabel 1 en tabel 2).

Vergelijking Gemiddelde verschil Standaardfout p-waarde Cohen's d
Basislijn bin vs bin 1 -60.075* 12,243 < .05 1.95
Basislijn bin vs bin 2 -69.053* 16,220 < .05 1.89
Basislijn bin vs bin 3 -66.197* 13,706 < .05 1.91
Basislijn bin vs bin 4 -68.595* 11,969 < .05 2.08
Basislijn bin vs bin 5 -65.475* 10,991 < .05 2.15
Basislijn bin vs bin 6 -65.795* 13,509 < .05 2.06
Basislijn bin vs bin 7 -72.900* 12,231 < .05 2.53
Basislijn bin vs bin 8 -78.633* 8,692 < .001 3.37

Tabel 2: Gemiddelde verschil, standaardfout en effectgrootte voor 3 minbakken in figuur 2B. In deze tabel worden de vergelijkingen weergegeven tussen de basislijnopslaglocatie en elk van de volgende opslaglocaties(figuur 2B). Gemiddelde verschil, standaardfout, en p-waardeen Cohen's d worden gerapporteerd als een index van de grootte van deze verschillen (effectgrootte).

Een gemengde ANOVA werd uitgevoerd om verschillen in percentage van het bevriezen tijdens de taak te testen, met fasen (BL, opleiding, contexttest, en cue test) als de binnen-onderwerpfactor en groep (48 h en 6 weken) als de tussen-onderwerpen factor (Tabel 1). Het percentage van de bevriezing van alle dieren tijdens de opleidingsperiode was aanzienlijk hoger dan tijdens de aanvangsperiode (zie figuur 2C). Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen het percentage bevriezing tijdens de geheugentests en de trainingsperiode(ps > .05).

Er werden geen significante verschillen tussen de twee groepen (48 uur en 6 weken) waargenomen in het percentage bevriezing tijdens BL, training en cue-test(ps > .115; zie figuur 2C). Daarentegen vertoonden de dieren die 6 weken na de training zijn getest, aanzienlijk hogere vriespercentages tijdens de contexttest dan bij 48 uur geteste dieren met een groot effect (zie figuur 2C). Over het geheel genomen blijkt uit figuur 2C dat het bevriezen tijdens langdurige vertraagde context en cue-tests (d.w.z. 6 weken na de training) over het algemeen aanzienlijk hoger was dan tijdens de trainingssessie. De tegenovergestelde dalende trend werd waargenomen in de groep dieren die 48 uur na de training werden getest. Deze verschillen in de groep van 48 uur waren echter statistisch niet significant(ps > .05). Ten slotte, hoewel het vriesniveau verschillen vertoonde tussen verschillende fasen, konden ze als laag worden beschouwd in vergelijking met andere protocollen. Een verklaring zou kunnen zijn inherente methodologische verschillen tussen laboratoria of de bewegingsindex drempel vastgesteld tijdens het kalibratieproces, waardoor de vergelijking van gegevens tussen laboratoria moeilijk.

De geconditioneerde bevriezingsrespons van de twee groepen proefpersonen tijdens de contexttest werd verder onderzocht door analyse van andere maatregelen , namelijk de gemiddelde activiteit (d.w.z., bewegingsindex), totale vriestijd en vriestijd per aflevering. Een one-way ANOVA werd gebruikt om verschillen tussen deze variabelen te testen(tabel 1). De activiteit van proefpersonen die 6 weken na de training werden getest, was aanzienlijk lager dan die van dieren die 48 uur na de training werden getest (figuur 3A). De totale vriestijd van dieren die kort na de training werden getest, was derhalve aanzienlijk lager dan die van dieren die 6 weken na (figuur 3B) zijn getest. Ten slotte bleek uit een analyse van de gemiddelde duur van elke vriesaflevering dat dieren die 6 weken na de training werden getest, langere vriesafleveringen vertoonden dan dieren die na de training 48 uur na de training werden getest (figuur 3C). Al met al wijzen deze bevindingen op een angst incubatieeffect.

Figure 3
Figuur 3: Effecten van een uitgebreid cued fear conditioning protocol op bevriezing reactie van ratten.
Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde (balken) en de SEM (foutbalken) van de bevriezingsreactie. aA) tijdens de contexttest de activiteit (d.w.z. bewegingsindex) van elke groep proefpersonen (testen 48 uur na de training; testen 6 weken na de training) vertoont; * = anders dan 6 weken. bB) de gemiddelde totale vriestijd (in seconden) van elke groep proefpersonen tijdens de contexttest; * = anders dan 6 weken. cC) de gemiddelde duur van elke vriesepise (in seconden) voor elke groep proefpersonen tijdens de contexttest; * = alleen anders dan 6 weken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Een verder onderzoek van de prestaties tijdens de cue test sessie werd uitgevoerd door middel van analyses van (a) percentages van bevriezing tijdens baseline perioden (BL Training en BL Cue Test) en tijdens de gehele 10 min cue test (tien 10 s toon presentaties en tien ITI's van 50 s - Figuur 4A), b) gemiddelde vriestijd specifiek tijdens de 10 s presentaties van de cue (toon), voor zowel Training en Cue Test sessies (Figuur 4B), en (c) gemiddelde vriestijd (in seconden) tijdens de 50 s intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intertrial intervals (IT's; d.w.z., no-tone perioden alleen – Figuur 4C). Een gemengde ANOVA werd gebruikt om elk van deze afhankelijke maatregelen te analyseren, uitgaande van fasen (BL Training, BL Cue Test, en Cue Test) als de binnen-onderwerpen factor en groepen (48 uur en 6 weken) als de tussen-onderwerpen factor (Tabel 1). Zoals aangegeven op figuur 4A, verhoogde de groep ratten 6 weken na de training hun percentage bevriezing aanzienlijk tijdens de basislijn van de Cue Test-sessie (BL Cue-test; eerste 3 min van de sessie) en tijdens de 10 min Cue-test, in vergelijking met BL-training (d.w.z. voorafgaand aan blootstelling aan tonen en schokken). Geen analoog verschil tussen BL training en BL Cue werd waargenomen voor de groep ratten getest na 48 uur(p > .05). Voor beide groepen ratten was het percentage bevriezing tijdens de 10 min Cue-test hoger dan tijdens de overeenkomstige basislijnperiode van diezelfde sessie (BL Cue Test), wat een terugwinningseffect suggereert. Er werden geen verschillen waargenomen tussen de groepen ratten op percentage van het bevriezen over de verschillende perioden(ps > .05).

Figuur 4B toont een vergelijking van de gemiddelde vriestijd (in seconden) specifiek tijdens de 10 s toonpresentaties op Training (tone-shock pairings) en Cue Test (alleen toonpresentaties). Alleen ratten getest 6 weken na de training aanzienlijk verhoogd de hoeveelheid tijd bevriezen tijdens de cue.

Ten slotte, zoals blijkt uit figuur 4C,alleen de groep ratten getest 48 uur na de training aanzienlijk verminderd de vriestijd tijdens de ITI's van de training sessie naar de Cue Test. Er werden geen verschillen in vriestijd tijdens de ITI's waargenomen tussen de twee groepen ratten(ps >.05).

Figure 4
Figuur 4: Effecten van een uitgebreide cued angst conditionering protocol op bevriezing reactie tijdens de cue test.
Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde (balken) en de SEM (foutbalken) van de bevriezingsreactie. (A) het percentage bevriezing van elke groep proefpersonen (testen 48 uur na de training; testen 6 weken na de training) tijdens de eerste 3 min van de trainingssessie (BL, baseline), de eerste 3 min van de cue test sessie (BL Cue) en de 10 min van de cue test (Cue Test); a = verschilt van de Cue-test na 48 uur (gemiddelde diffBLTraining-Cue48h = 32,84; SE = 10,25; p < .05; Cohen's d = 1,52); b = verschilt van de BL Cue-test (gemiddelde diffBLCue-BL6Weeks = 33,98; SE = 8,36; p < .05; Cohen's d = 1.59) en Cue Test (gemiddelde diffCue-BL6Weeks = 55.86; SE = 10,25; p < .05; Cohen's d = 2.47); c = verschilt van cue test na 48 uur (gemiddelde diffBLCue-Cue48h = 18,99; SE = 5,17; p < .05; Cohens d = .67); d = verschilt van cue test na 6 weken (gemiddelde diffBLCue-Cue6Weeks = 21,87; SE = 5,17; p < .05; Cohens d = .88). (B) de gemiddelde vriestijd (in seconden) tijdens de cue (toon) van elke groep proefpersonen tijdens de training en de Cue-test; * = verschilt van 6 weken tijdens de testperiode van cue test(gemiddelde diffTraining-Cue6Weeks = -3.14; SE = 1,37; p < .05; Cohens d = 1,64). (C) de gemiddelde vriestijd (in seconden) tijdens de intertrial intervallen (ITI) van de trainingssessie (10 tone-shock pairings) en de Cue Test (10 tone-only presentaties) over de twee groepen ratten (48 uur en 6 weken); = anders dan training voor groep ratten die 48 uur na de training is getest(gemiddelde diffTraining-Cue48h = 506,16; SE = 95,08; p < .001; Cohen's d = 2.48). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het huidige uitgebreide angst-conditioneringsprotocol is een efficiënte en valide aanpak om emotioneel geheugen te beoordelen over korte (48 uur) en lange termijn (6 weken). Zo maakt het protocol het mogelijk om overtraining te bestuderen en incubatieverschijnselen bij ratten te vrezen. Onder de verschillende voordelen van dit protocol zijn de volgende. Het biedt twee soorten geheugentests, namelijk context en cue, die het mogelijk maken om het differentiële effect van twee vertragingen (48 uur en 6 weken) in context en cue manipulaties te identificeren. Ten tweede omvat de taak één training van 28 minuten, die op zijn beurt langetermijneffecten oplevert die zich met enkele weken uitstrekken. Dit voordeel is opmerkelijk, gezien het feit dat sommige versies van uitgebreide angst conditionering ten minste 100 schokken nodig hebben in 10 sessies van training11. Ten derde biedt het protocol verschillende meetalternatieven, die automatisch worden berekend. Daarnaast is er toenemende farmacologische, fysiologische en anatomische bewijs dat de geldigheid van dit paradigma ondersteunt voor de beoordeling van emotionele geheugen verschijnselen15,16.

Vergeleken met andere angst-conditionering paradigma's met korte trainingen (dat wil zeggen, weinig proeven), uitgebreide protocollen die resulteren in overtraining effecten hebben minder aandacht gekregen. Uitgebreide angst-conditioneringstaken zijn echter de sleutel tot het begrijpen van de onderliggende gedrags- en neurobiologische processen van angst incubatie, waaronder de relatie met andere psychologische verschijnselen (bijvoorbeeld, vertraagde posttraumatische stressstoornis)11,12,13. Het huidige angst-conditionering protocol produceert op betrouwbare wijze angst incubatie. Dit wordt aangetoond met hogere vriestijden en lagere bewegingsindexen bij dieren die 6 weken na de training worden beoordeeld, in vergelijking met dieren die 48 uur na de training zijn getest. Bovendien kan dit effect in elk van de soorten tests verschillend worden waargenomen; met name langere vriesafleveringen tijdens de contexttest 6 weken na de training en stappen in bevriezing tijdens cue presentaties 6 weken na de training. In verband met dit laatste effect (d.w.z. invriezen tijdens cue presentaties 6 weken na de training), lijkt het erop dat de nieuwheid van de experimentele situatie (d.w.z. nieuwe context) kan worden weggegooid, aangezien de bevriezingsniveaus bij de basislijn tijdens diezelfde sessie aanzienlijk lager waren dan tijdens de daaropvolgende cue-presentaties.

Hoewel in beide groepen een trend naar angstleren zichtbaar was (d.w.z. verschillen tussen 3 min basislijn en opleiding), vertoonden dieren die na 48 uur (context) en 72 uur (cue) werden getest geen significante verschillen in vriesniveau tijdens beide tests. Dit kan worden beschouwd als een beperking van het protocol, dat lijkt het resultaat van hoge gedragsvariabiliteit in de 48 h groep (zie figuur 2C). Een methodologische verandering die kan worden uitgevoerd om de variabiliteit te verminderen en de procedure te verbeteren is het uitvoeren van de context en cue test 24 uur na de training, die gebruikelijk is in sommige angst conditionering procedures.

Het huidige protocol kan worden toegepast in klinisch onderzoek23. Het sterke geheugenspoor- en incubatieeffect dat het gevolg is van de implementatie ervan kan het mogelijk maken om de effecten te testen van medicijnen die regelmatig worden gebruikt voor de behandeling van psychologische en psychiatrische pathologieën (bijvoorbeeld anxiolytische of stemmingsregelaars behandelingen24) op emotionele geheugenverschijnselen (bijvoorbeeld angst uitsterven)25,26,27. Het protocol zou dus kunnen toestaan om de invloed van medicijnen op het geheugen spoor te meten over verschillende termijnen, met inbegrip van biologische correlaten zoals neurotransmitters en moleculen met betrekking tot geheugen onderhoud28,29. Het protocol kan ook van belang zijn voor onderzoek met een translationeel perspectief, dat heeft voorgesteld dat angstparadigma's nuttig kunnen zijn om preklinische modellen van gedragstherapieën30 en vergelijkende studies over angst over soorten21,22te testen . Ten slotte, vanuit een neurobiologische visie, het huidige protocol is een robuust model om hersenmechanismen, communicatie tussen structuren, netwerken of neuronale ensembles die betrokken zijn bij de lange termijn verwerving, consolidatie en opslag van emotioneel geheugen, of effecten van incubatie tijdens de ontwikkeling32studie .

Enkele andere aspecten van het protocol zijn het bespreken waard. Voedseltekort werd gebruikt tijdens het experiment. Deze beslissing werd genomen omdat andere gedragstests op basis van voedselbeloningen (bijvoorbeeld operant of instrumentale technieken)33,34,35 kunnen worden geïntegreerd met minimale wijzigingen, waardoor het huidige protocol een meer veelzijdige techniek wordt. Zo hebben we dit protocol met succes geïntegreerd met wielgebaseerde oefenprotocollen en T-maze geheugentaken. Een ander aspect is gerelateerd aan de groepsgrootte (n=6) die in dit protocol wordt geïmplementeerd. Hoewel het een relatief kleine steekproef was en grotere monsters zeker worden aanbevolen, compenseert de grootte van het incubatieeffect deze beperking (zie tabel 1). Dit kan worden beschouwd als een voordeel van dit protocol, met name met betrekking tot de aanbevelingen van de dierencommissies op basis van het reductiebeginsel. Een beperking van het protocol was dat minimale of geen blootstelling aan voetschokken en tijdsloop van angst incubatie niet werden geëvalueerd. Een extra controlegroep met de vóór voorwaarden zou de strengheid van het experimentele ontwerp kunnen verhogen.

De definitieve aanbevelingen voor de beste uitvoering en resultaten van dit protocol omvatten een correcte reiniging van de experimentele kamer, met name de roostervloer, kalibratie van de schokintensiteiten voorafgaand aan de training van elk onderwerp (bijvoorbeeld uitwerpselen en urine verminderen vaak de betrouwbaarheid van de schokintensiteit in verschillende delen van de kamer) en de kalibratie van het detectiesysteem (de betrouwbaarheid van de vriesmaatregelen hangt af van een goede instelling van de bewegingsdrempel en minimale vriesduur).

Dit protocol kan worden getest met andere stammen van ratten of andere knaagdieren (bijvoorbeeld muizen of Mongoolse gerbils), waardoor het toepassingsgebied van toepassingen wordt uitgebreid. In die gevallen is het belangrijk om de schokintensiteit en bewegings- en duurdrempels aan te passen. De schokintensiteit die wordt gebruikt bij angstconditioneringsprotocollen met muizen varieert meestal 0,4 mA tot 1,5 mA, met 0,75 mA een vaak gerapporteerde effectieve intensiteit16,36,37,38 en 1,5 mA de hoogste gerapporteerde intensiteit39. De Mongoolse gerbil is een knaagdier model minder vaak gekozen uit angst conditionering onderzoek; Mongoolse gerbils zijn echter met succes gebruikt om circadiane ritmes bij zoogdieren40te modelleren. Dienovereenkomstig kan het huidige protocol worden geïmplementeerd om mogelijke relaties tussen circadiane ritmes en emotioneel geheugen te bestuderen, beide relevant in pathologieën zoals depressie, angst of verandering van stemming41,42. In het geval van gerbils ligt een effectief schokintensiteitsbereik voor deze en analoge aversieve conditioneringsprotocollen tussen 1,0 en 4,0 mA43,44,45,46. Tot slot is het belangrijk op te merken dat de bewegings- en duurdrempels moeten worden aangepast afhankelijk van de gekozen soorten47. Deze drempels zijn de limieten die zijn vastgesteld op de bewegingsvolgsoftware, waarboven het gedrag van dieren wordt geregistreerd als beweging en waaronder de software bevriezing registreert. In aversieve conditioneringsstudies met muizen en gerbils zijn de gerapporteerde effectieve bewegings- en duurdrempels respectievelijk 25 en 30 fps (d.w.z. minimaal 1 s immobiliteit), respectievelijk30,35.

Om een adequate controle van aversieve stimulatie (voetschokken) te garanderen, moeten alle sectoren van de netvloer dezelfde intensiteit leveren. Het wordt aanbevolen om de intensiteit van de schok in drie sectoren van de netvloer te kalibreren om te controleren of deze consistent is. Dit voorkomt dat dieren leren om blootstelling aan de schokken te verminderen door te verhuizen naar een plaats in de doos die een lagere intensiteit uitzendt. Als uit de kalibratie blijkt dat het metalen rooster niet in alle sectoren dezelfde intensiteit levert, verwijdert u het raster van de vloer, reinigt u de staven en vervangt u het raster in de kamer. De roostervloer moet goed in de kamer worden geplaatst om de beste elektrische transmissie van de aversieve stimulatie naar de netvloer te garanderen.

De focus en het diafragma van de camera van het vriesdetectiesysteem wordt gekalibreerd door de fabrikant. Als er echter extra kalibratie nodig is, maak de setcrew op de focusring los, pas u aan totdat een duidelijk beeld is bereikt en draai de spancrew op de focusring aan. De fabrikant raadt aan de lensopening in de maximale open positie te vergrendelen. Om deze instelling te bereiken, moet u ervoor zorgen dat het witte punt van de openingsring is uitgelijnd met het getal 1.4 op de lensvat. Het wordt aanbevolen om de handleiding van de fabrikant te raadplegen. Houd er rekening mee dat als de focus van de camera is aangepast, kalibratie van de camera met behulp van de bijbehorende software ook moet plaatsvinden. Camerakalibratie vereist aanpassing van de helderheid, versterking en sluiter. Het wordt aanbevolen om de handleiding van de fabrikant te raadplegen voor nauwkeurige instructies over het camerakalibratieproces.

Tot slot, het protocol maakt het mogelijk om emotioneel geheugen te testen over korte en lange termijn periodes en produceert op lange termijn angst incubatie. Dit angst-incubatieeffect wordt gegenereerd via een overtraining van één sessie, die effecten 6 weken later in context en cue-tests laat zien. Dit suggereert een sterk emotioneel geheugen spoor. Het huidige protocol is een efficiënte en geldige aanpak om de componenten van emotioneel geheugen bij ratten te verkennen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Financiële steun voor dit onderzoek werd verleend door Fundación Universitaria Konrad Lorenz - subsidienummer 9IN15151. De auteurs willen de afdeling Communicatie van de Konrad Lorenz University bedanken voor hun hulp bij het opnemen en bewerken van de video, in het bijzonder Natalia Rivera en Andrés Serrano (Producers). Ook Nicole Pfaller-Sadovsky en Lucia Medina voor hun opmerkingen over het manuscript, en Johanna Barrero, decaan bij Corporacion Universitaria Iberoamericana, voor institutionele samenwerking. De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (ethanoic acid) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid
Aversive Stimulation Current Package MED Associates Inc ENV-420 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Contextual test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Cue test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Curved Wall Insert MED Associates Inc VFC-008-CWI https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Data processing.zip http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
NIR/White Light Control Box MED Associates Inc NIR-100
Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse MED Associates Inc ENV-005FPU-M https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Small Tabletop Cabinet and Power Supply MED Associates Inc SG-6080D https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) MED Associates Inc ENV-414S https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standard Fear Conditioning Chamber MED Associates Inc VFC-008 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Training protocol VFC.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Video Fear Conditioning Package for Rat MED Associates Inc MED-VFC-SCT-R https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nature Reviews Neuroscience. 6 (2), 119-130 (2005).
  2. Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, P. W., Kida, S. Activation of LVGCCs and CB1 receptors required for destabilization of reactivated contextual fear memories. Learning & Memory. 15 (6), 426-433 (2008).
  3. Hermans, E. J., et al. How the amygdala affects emotional memory by altering brain network properties. Neurobiology of Learning and Memory. 112, 2-16 (2014).
  4. Moryś, J., Berdel, B., Jagalska-Majewska, H., ŁUczyńSka, A. The basolateral amygdaloid complex -its development, morphology and functions. Folia Morphologica. 58 (3), 29-46 (1998).
  5. LeDoux, J. E. Emotional memory systems in the brain. Behavioural Brain Research. 58 (1-2), 69-79 (1993).
  6. Labar, K. S. Beyond fear: Emotional memory mechanisms in the human brain. Current Directions in Psychological Science. 16 (4), 173-177 (2007).
  7. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  8. Maren, S. Overtraining Does Not Mitigate Contextual Fear Conditioning Deficits Produced by Neurotoxic Lesions of the Basolateral Amygdala. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 3097-3097 (1998).
  9. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, Unit-6.27 (2013).
  10. Morrow, J. D., Saunders, B. T., Maren, S., Robinson, T. E. Sign-tracking to an appetitive cue predicts incubation of conditioned fear in rats. Behavioural Brain Research. 276, 59-66 (2015).
  11. Pickens, C. L., Golden, S. A., Adams-Deutsch, T., Nair, S. G., Shaham, Y. Long-lasting incubation of conditioned fear in rats. Biological Psychiatry. 65 (10), 881-886 (2009).
  12. Schaap, M. W. H., et al. Nociception and Conditioned Fear in Rats: Strains Matter. PLoS ONE. 8 (12), 83339 (2013).
  13. Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871 (2014).
  14. Patel, T. P., et al. An open-source toolbox for automated phenotyping of mice in behavioral tasks. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 349 (2014).
  15. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: Interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  16. Anagnostaras, S. G. Automated assessment of Pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the VideoFreeze system. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 4 (58), (2010).
  17. Moyer, J. R., Brown, T. H. Impaired Trace and Contextual Fear Conditioning in Aged Rats. Behavioral Neuroscience. 120 (3), 612-624 (2006).
  18. Schuette, S. R., Hobson, S. Conditioned contextual fear memory to assess natural forgetting and cognitive enhancement in rats. Journal of Biological Methods. 5 (3), 99 (2018).
  19. Chang, C. H., et al. Fear extinction in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 (SUPPL. 47) (2009).
  20. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, 1-18 (2013).
  21. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  22. Vetere, G., et al. Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice Article Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice. Neuron. 94 (2), 363-374 (2017).
  23. Koob, G. F., Zimmer, A. Chapter 9 - Animal models of psychiatric disorders. Neurobiology of Psychiatric Disorders. 106, 137-166 (2012).
  24. Bourin, M. Animal models for screening anxiolytic-like drugs: a perspective. Dialogues in clinical neuroscience. 17 (3), 295-303 (2015).
  25. Murray, S. B., et al. Fear as a translational mechanism in the psychopathology of anorexia nervosa. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 95, 383-395 (2018).
  26. Pamplona, F. A., et al. Prolonged fear incubation leads to generalized avoidance behavior in mice. Journal of Psychiatric Research. 45 (3), 354-360 (2011).
  27. Török, B., Sipos, E., Pivac, N., Zelena, D. Modelling posttraumatic stress disorders in animals. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 90, 117-133 (2019).
  28. Bhakta, A., Gavini, K., Yang, E., Lyman-Henley, L., Parameshwaran, K. Chronic traumatic stress impairs memory in mice: Potential roles of acetylcholine, neuroinflammation and corticotropin releasing factor expression in the hippocampus. Behavioural Brain Research. 335, 32-40 (2017).
  29. Uniyal, A., et al. Pharmacological rewriting of fear memories: A beacon for post-traumatic stress disorder. European Journal of Pharmacology. , 172824 (2019).
  30. Barad, M. Fear extinction in rodents: basic insight to clinical promise. Current Opinion in Neurobiology. 15 (6), 710-715 (2005).
  31. Haaker, J., et al. Making translation work: Harmonizing cross-species methodology in the behavioural neuroscience of Pavlovian fear conditioning. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 107, 329-345 (2019).
  32. Heroux, N. A., Horgan, C. J., Pinizzotto, C. C., Rosen, J. B., Stanton, M. E. Medial prefrontal and ventral hippocampal contributions to incidental context learning and memory in adolescent rats. Neurobiology of Learning and Memory. 166, 107091 (2019).
  33. Rossi, M. A., Yin, H. H. Methods for Studying Habitual Behavior in Mice. Current Protocols in Neuroscience. 60 (1), 8-29 (2012).
  34. Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant Procedures for Assessing Behavioral Flexibility in Rats. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  35. Zoccolan, D., Di Filippo, A. Methodological Approaches to the Behavioural Investigation of Visual Perception in Rodents. Handbook of Behavioral Neuroscience. , Elsevier B.V. (2018).
  36. Lguensat, A., Bentefour, Y., Bennis, M., Ba-M'hamed, S., Garcia, R. Susceptibility and Resilience to PTSD-Like Symptoms in Mice Are Associated with Opposite Dendritic Changes in the Prelimbic and Infralimbic Cortices Following Trauma. Neuroscience. 418, 166-176 (2019).
  37. Li, Q., et al. N-Acetyl Serotonin Protects Neural Progenitor Cells Against Oxidative Stress-Induced Apoptosis and Improves Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus Following Traumatic Brain Injury. Journal of Molecular Neuroscience. 67 (4), 574-588 (2019).
  38. Pantoni, M. M., Carmack, S. A., Hammam, L., Anagnostaras, S. G. Dopamine and norepinephrine transporter inhibition for long-term fear memory enhancement. Behavioural Brain Research. 378 (112266), 112266 (2020).
  39. Smith, K. L., et al. Microglial cell hyper-ramification and neuronal dendritic spine loss in the hippocampus and medial prefrontal cortex in a mouse model of PTSD. Brain, Behavior, and Immunity. 80, 889-899 (2019).
  40. Liu, X., Zheng, X., Liu, Y., Du, X., Chen, Z. Effects of adaptation to handling on the circadian rhythmicity of blood solutes in Mongolian gerbils. Animal Models and Experimental. 2 (2), 127-131 (2019).
  41. Landgraf, D., McCarthy, M. J., Welsh, D. K. The role of the circadian clock in animal models of mood disorders. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 344-359 (2014).
  42. Refinetti, R., Kenagy, G. J. Diurnally active rodents for laboratory research. Laboratory annimals. 52 (6), 577-587 (2018).
  43. Hurtado-Parrado, C., et al. Assessing Mongolian gerbil emotional behavior: effects of two shock intensities and response-independent shocks during an extended inhibitory-avoidance task. PeerJ. 5, (2017).
  44. Frey, P., Eng, S., Gavinf, W. Conditioned suppression in the gerbil. Behavior Research Methods & Instrumentation. 4 (5), 245-249 (1972).
  45. Woolley, M. L., Haman, M., Higgins, G. A., Ballard, T. M. Investigating the effect of bilateral amygdala lesions on fear conditioning and social interaction in the male Mongolian gerbil. Brain Research. 1078 (1), 151-158 (2006).
  46. Ballard, T. M., Sänger, S., Higgins, G. a Inhibition of shock-induced foot tapping behaviour in the gerbil by a tachykinin NK1 receptor antagonist. European Journal of Pharmacology. 412 (3), 255-264 (2001).
  47. Luyten, L., Schroyens, N., Hermans, D., Beckers, T. Parameter optimization for automated behavior assessment: plug-and-play or trial-and-error. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8 (28), (2014).

Tags

Gedrag Probleem 162 emotioneel geheugen angst conditionering angst incubatie overtraining bevriezing context geheugen cue geheugen
Angst Incubatie met behulp van een uitgebreide Angst-Conditioning Protocol voor ratten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Acevedo-Triana, C., Rico, J. L.,… More

Acevedo-Triana, C., Rico, J. L., Ortega, L. A., Cardenas, M. A. N., Cardenas, F. P., Rojas, M. J., Forigua-Vargas, J. C., Cifuentes, J., Hurtado-Parrado, C. Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats. J. Vis. Exp. (162), e60537, doi:10.3791/60537 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter