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Behavior

Angst-Inkubation mit einem erweiterten Angst-Konditionierungsprotokoll für Ratten

Published: August 22, 2020 doi: 10.3791/60537
Automatic Translation
1,6, 2, 2, 3, 3, 4, 2, 2, 2,5
1School of Psychology, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, 2Animal Behavior Laboratory, Fundación Universitaria Konrad Lorenz, 3Department of Psychology, Universidad de Los Andes, 4School of Veterinary Medicine, Animal Health Department, Universidad Nacional de Colombia, 5Department of Psychology, Troy University, 6Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Summary

Wir beschreiben ein erweitertes Angstkonditionierungsprotokoll, das bei Ratten Übertraining und Angstinkubation erzeugt. Dieses Protokoll beinhaltet eine einzige Trainingseinheit mit 25 Ton-Schock-Paarungen (d. h. Übertraining) und einen Vergleich der konditionierten Gefrierreaktionen während der Kontext- und Cue-Tests 48 h (kurzfristig) und 6 Wochen (langfristig) nach dem Training.

Abstract

Emotionales Gedächtnis wurde in erster Linie mit Angst-Konditionierung Paradigmen untersucht. Angstkonditionierung ist eine Form des Lernens, durch die Individuen die Beziehungen zwischen aversiven Ereignissen und ansonsten neutralen Reizen lernen. Die am häufigsten genutzten Verfahren zum Studium emotionaler Erinnerungen beinhalten Angstkonditionierung bei Ratten. Bei diesen Aufgaben ist der unkonditionierte Stimulus (US) ein Fußschock, der ein- oder mehrmals über einzelne oder mehrere Sitzungen hinweg präsentiert wird, und die konditionierte Reaktion (CR) friert ein. In einer Version dieser Verfahren, genannt cued Angst konditionierung, wird ein Ton (konditionierter Stimulus, CS) mit Fußschocks (US) während der Trainingsphase gepaart. Während des ersten Tests werden die Tiere dem gleichen Kontext ausgesetzt, in dem das Training stattgefunden hat, und Frostreaktionen werden in Abwesenheit von Fußschocks und -tönen (d. h. einem Kontexttest) getestet. Während des zweiten Tests wird das Einfrieren gemessen, wenn der Kontext geändert wird (z. B. durch Manipulation des Geruchs und der Wände der Versuchskammer) und der Ton wird in Abwesenheit von Fußschocks (d. h. einem Cue-Test) dargestellt. Die meisten cued Angst Konditionierung Verfahren beinhalten wenige Ton-Schock-Paarungen (z.B. 1-3 Versuche in einer einzigen Sitzung). Das Interesse an weniger häufigen Versionen, die eine große Anzahl von Paarungen (d. h. Übertraining) im Zusammenhang mit dem langanhaltenden Effekt der Angstinkubation beinhalten, wächst (d. h. Angstreaktionen nehmen im Laufe der Zeit zu, ohne dass aversive Ereignisse oder konditionierte Reize ausgesetzt sind). Erweiterte Aufgaben zur Angstkonditionierung waren der Schlüssel zum Verständnis der verhaltens- und neurobiologischen Aspekte der Angstinkubation, einschließlich ihrer Beziehung zu anderen psychologischen Phänomenen (z. B. posttraumatische Belastungsstörungen). Hier beschreiben wir ein erweitertes Angstkonditionierungsprotokoll, das bei Ratten übertrainierenund inkubiert. Dieses Protokoll beinhaltet eine einzige Trainingseinheit mit 25 Ton-Schock-Paarungen (d. h. Übertraining) und einen Vergleich der konditionierten Gefrierreaktionen während der Kontext- und Cue-Tests 48 h (kurzfristig) und 6 Wochen (langfristig) nach dem Training.

Introduction

Speicher ist ein psychologischer Prozess, der verschiedene Phasen umfasst: Informationserfassung, Konsolidierung (ermöglicht die Stabilität erworbener Informationen) und Abruf (Beweis für den Konsolidierungsprozess)1. Während der Konsolidierungsphase erfolgt der Aufbau neuer synaptischer Verbindungen und die Änderung bereits bestehender Verbindungen. Dies deutet auf die Notwendigkeit für einen Zeitraum hin, in dem molekulare und physiologische Ereignisse auftreten, die für diese Veränderungen verantwortlich sind1,2. Diese physiologischen oder molekularen Veränderungen variieren, ob die abgerufenen Ereignisse emotional geladen sind oder nicht (d. h. emotionales Gedächtnis). Zum Beispiel hat die Forschung gezeigt, dass der laterale Kern und der basolaterale Amygdala-Komplex für das emotionale Gedächtnis besonders relevant sind3,4,5.

Emotionale Gedächtnisphänomene wurden in erster Linie mit Angstkonditionierung Paradigmen5,6untersucht. Angstkonditionierung ist eine Form des Lernens, durch die Individuen lernen die Beziehungen zwischen aversiven Ereignissen und ansonsten neutralen Reizen7. Angstkonditionierung Paradigmen produzieren molekulare, zelluläre, und strukturelle Veränderungen in der Amygdala. Darüber hinaus verändert Angstkonditionierung die Konnektivität des Hippocampus während der Konsolidierungs- und Abholprozesse des emotionalen Gedächtnisses.

Eines der am häufigsten verwendeten Verfahren zum Studium von Angsterinnerungen ist die klassische (Pavlovian) Konditionierung bei Ratten. Dieses Verfahren verwendet in der Regel Footshock (US) als aversiven Stimulus, der ein- oder mehrmals über eine oder mehrere Sitzungen abgegeben wird. Die konditionierte Reaktion (CR) von Ratten, die diesem Verfahren ausgesetzt sind, ist das Einfrieren (d. h. "generalisierte Immobilität, verursacht durch eine verallgemeinerte tonische Reaktion der Skelettmuskulatur der Tiere mit Ausnahme der Muskeln, die bei der Atmung verwendet werden"7 ). Diese Reaktion könnte anhand von zwei Arten von Tests bewertet werden: Kontext- und Cue-Tests. Für den Kontexttest erfährt das Probanden während der Trainingseinheit eine bestimmte Anzahl von Fußschocks und wird dann für eine definierte Zeit aus der Versuchskammer entfernt. Während der Prüfung wird das Probanden in den gleichen Kontext zurückgeführt, in dem die Ausbildung stattgefunden hat, und es werden verschiedene Maßnahmen des Einfrierens in Abwesenheit von Fußschocks (z. B. Dauer, Prozentsatz oder Häufigkeit von Gefrierepisoden) gesammelt und mit den während der Trainingsphase festgelegten Ausgangswerten verglichen. Für den zweiten Testtyp, den Cue-Test, wird während der Trainingsphase ein Stimulus (typischerweise ein Ton) mit den Fußschocks gepaart (d. h. bedingter Stimulus, CS). Nach Abschluss der Ausbildung wird das Tier für eine definierte Zeit aus dem Trainingskontext entfernt und anschließend in einen modifizierten Kontext gestellt (z.B. eine andere Versuchskammer, die unterschiedliche Wände und unterschiedliche Nriege hat). Der Cue wird dann eine bestimmte Anzahl von Malen angezeigt, und Die Gefrierreaktionen auf den Cue werden gemessen und mit den während des Trainings gesammelten Ausgangswerten verglichen. Die gängigste Version dieses Paradigmas verwendet 1 bis 3 Ton-Schock-Paarungen während einer einzelnen Trainingseinheit, gefolgt von Kontext- und Cue-Tests, die einige Stunden oder ein paar Tage später durchgeführt werden.

Andere weniger häufig implementierte Angstkonditionierungsverfahren beinhalten eine große Anzahl von Schock-Cue-Paarungen (d. h. Studien), die oft alsÜberschulungsverfahren8 bezeichnet wurden. Ein wachsendes Interesse an diesen Aufgaben hängt mit ihren langanhaltenden und erhöhten Gedächtniseffekten zusammen, die als Angstinkubation bezeichnet werden (d.h. bedingte Angstreaktionen nehmen im Laufe der Zeit zu, wenn aversive Ereignisse oder konditionierte Reize nicht mehr ausgesetzt sind)9,10,11. Ein Beispiel für solche Überschulungsverfahren ist eine Trainingsphase von 100 Ton-Schock-Paarungen, verteilt auf 10 Sitzungen, gefolgt von Kontext- und Cue-Tests, die 48 h und 30 Tage später11,12durchgeführt werden. Um ein umfangreiches Training über mehrere Tage zu vermeiden, berichtete Maren (1998), dass Übertraining in einer einzigen Sitzung mit 25 Paarungen8etabliert und optimiert werden konnte. Der Inkubationseffekt zeigt sich in deutlich höheren Konzentrationen von konditionierter Angst bei Ratten, die 31 Tage nach dem Training getestet wurden, im Vergleich zu Ratten, die 48 h danach getestet wurden. Erweiterte Aufgaben zur Angstkonditionierung waren der Schlüssel für das Verständnis von Verhaltens- und neurobiologischen Aspekten, die der Angstinkubation zugrunde liegen, einschließlich ihrer Beziehung zu anderen psychologischen Phänomenen (z. B. verzögerte posttraumatische Belastungsstörung)11,12,13.

Hier beschreiben wir ein erweitertes Angstkonditionierungsprotokoll, das bei Ratten zu Übertraining und Angstinkubation führt. Im Unterscheidet sich von anderen Paradigmen, die mehrere Tage Trainingerfordern 11, das aktuelle Protokoll ist auf eine einzelne Trainingseinheit 8konzentriert. Wir verwendeten 25 Ton-Schock-Paarungen, um höher konditionierte Gefrierreaktionen während Kontext- und Cue-Tests zu erzeugen, die 6 Wochen nach dem Training durchgeführt wurden, im Vergleich zu Tests, die 48 h danach durchgeführt wurden.

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Protocol

Das folgende Protokoll wurde vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und Nutzung der Stiftung Universitaria Konrad Lorenz (IACUC-KL) genehmigt. Die vom Internationalen Tierschutzbund Genf (1989) herausgegebene universelle Erklärung der Tierrechte und die vom ICLAS herausgegebenen ethischen Grundsätze des Experimentierens mit Tieren wurden respektiert.

1. Themenvorbereitung

  1. Wählen Sie männliche erwachsene Wistar Ratten (n = 12). Beherbergen Sie sie in Vierergruppen pro Käfig für drei Tage Akklimatisierung, vor Beginn des Trainings- und Testprotokolls. Bieten Sie Ratten während des gesamten Experiments freien Zugang zu Wasser. Kontrollieren Sie die Raumtemperatur zwischen 20 °C und 25 °C, unter einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus (Licht ein 07:00 h).
    HINWEIS: Rattenstämme hatten bei der Angstkonditionierung unterschiedliche Leistungen gezeigt. Zum Beispiel berichteten Schaap et al. (2013), dass Wistar- und Lewis-Stämme längere Daueren des Gefrierverhaltens zeigten als Fawn Hooded und Brown Norway Ratten12. Daher sollten Die Unterschiede bei Schmerzen und thermischen Schwellenwerten bewertet werden, um die Intensität und Dauer von Schocks anzupassen.
  2. Halten Sie Ratten bei 85% ihres frei fütternden Gewichts (Normalgewicht zwischen 350-400 g) aufrecht, indem Sie jeden Tag zu der gleichen Stunde eingeschränkten Zugang zu Lebensmitteln gewähren. Wiegen Sie Ratten jeden Tag zur gleichen Stunde während des Lichtzyklus. Berechnen Sie das Ad lib Gewicht (100% Gewicht) für drei Tage vor Beginn des erweiterten Angstkonditionierungstrainings.
    HINWEIS: Die im vorliegenden Experiment verwendeten Tiere wurden an weiteren Instrumentaltests getestet, die hier nicht gemeldet sind. Für diese zusätzlichen Tests war Nahrungsmittelmangel erforderlich. Diese Verfahrensänderung dürfte den Anwendungsbereich des vorliegenden Verfahrens erweitern, da sie das Potenzial für kombinierte Tests zwischen Instrumentalangst nahelegt. Studien, die nur Tests zur Konditionierung befürchten, erfordern jedoch keine Nahrungsmittelentzug.
  3. Nach dem Zufallsprinzip Probanden einer der folgenden Gruppen zuordnen: emotionale Tests 6 Wochen nach dem Training (n = 6); emotionale Prüfung 48 h nach dem Training (n = 6).
  4. Führen Sie Schulungen und Tests zu ähnlichen Stunden während der Lichtphase des Dunkellichtzyklus durch. Weisen Sie die Tiere derselben Versuchskammer zu und halten Sie die gleiche Reihenfolge der Tiere während des Trainings und der Prüfung aufrecht.
    HINWEIS: Eine zusätzliche Kontrolle, die implementiert werden könnte, ist das Ausgleichen der Reihenfolge der Tiere während der Trainings- und Testphasen. Es wird empfohlen, diese Technik zu verwenden, wenn Mehrere Gruppen bewertet werden oder verschiedene Aufgaben experimenteübergreifend angewendet werden, um einen möglichen Effekt der Aufgabenreihenfolge auf das Verhalten zu reduzieren.

2. Geräteeinstellung und Stoßkalibrierung

  1. Reinigen Sie alle Innenflächen der Versuchskammer und des Edelstahlgitterbodens mit 10% Ethanol. Wiederholen Sie dies, bevor Sie jedes Tier testen.
  2. Schließen Sie das Gerät über ein USB-Kabel an einen Computer an und starten Sie die Gefriererkennungssystemausrüstung: die CPU, den Steuerschrank, das Infrarotlicht, den aversiven Stimulator/Scrambler und den Stoßintensitätskalibrator.
    HINWEIS: Obwohl dieses Protokoll mit handelsüblichen Instrumenten (Materialtabelle)ausgeführt wurde, können Geräte und Software verschiedener Marken verwendet werden. Das Gerät besteht aus einer inneren Acryl-Quadratkammer (29,53 cm x 23,5 cm x 20,96 cm, genannt Versuchskammer), eingebettet in eine Holzkiste, die mit Kunststoff-Formik bedeckt ist. Die Außentüren ermöglichen die Isolierung von Schall, Lärm oder Licht (Dämpfung von Kastentüren). Die Kamera befindet sich seitlich im inneren Teil der Außentür. Die interne Acrylbox mit Bodenmetallgittern (36 Edelstahlstäbe, jeweils 3 mm Durchmesser und 8 mm Abstand, Mitte zu Mitte) ermöglicht die Fußabschlagabgabe. In einer der innen-seitlichen Wände befindet sich ein Lautsprecher 6 cm vom Boden entfernt, um einen auditiven Hinweis zu präsentieren.
  3. Verbinden Sie die roten und schwarzen Clips des Stoßintensitätskalibrators (d. h. positive und negative Anschlüsse) mit zwei beliebigen beliebigen Stäben auf dem Gitterboden. Schließen Sie das USB-Kabel an den entsprechenden Anschluss des Computers an. Stellen Sie sicher, dass Sie die roten und schwarzen Clips mit Balken verbinden, die durch eine andere Leiste getrennt sind.
    HINWEIS: In diesem Abschnitt wird der Kalibrierungsprozess der Stoßintensität unter Verwendung einer bestimmten Gerätemarke beschrieben, die in der Tabelle der Materialienaufgeführt ist. Der Kalibrierungsprozess kann jedoch mit verschiedenen Gerätemarken durchgeführt werden. Es wird empfohlen, die Intensität des Schocks in drei Sektoren des Gitterbodens zu kalibrieren, um zu überprüfen, ob er konsistent ist. Entfernen Sie außerdem immer Fäkalien- und Urinrückstände aus dem Gitterboden, um Störungen während der Stoßzufuhr zu vermeiden.
  4. Starten Sie die Schockintensitäts-Kalibrator-Software (Tabelle der Materialien). Wählen Sie eine Intensität von 1,0 mA in der Anwendung, indem Sie auf den Bereichspfeil klicken. Ändern Sie dann den Run/Stop-Schalter in Run.
    HINWEIS: Wir schlagen 1,0 mA basierend auf unseren Studien mit Nagetiermodellen in unserem Labor und Literatur, die einen Bereich von 0,75 mA bis 1,5 mA als ausreichend für Studien der Angst konditionierung33,34,35berichtet.
  5. Schalten Sie den aversiven Stimulator oder die Ausrüstung ein, mit der die Fußschocks geliefert werden, und schauen Sie sich die Schockintensität an, die auf dem Bedienfeld der Anwendung angezeigt wird. Stellen Sie bei Bedarf die Intensität mit dem Knopf am aversiven Stimulator auf 1,0 mA ein.
    HINWEIS: Der aversive Stimulator sollte auf "OUT" eingestellt werden, um das Experiment entsprechend zu testen, zu kalibrieren und auszuführen.

3. Kalibrierung des Gefriererkennungssystems

  1. Schließen Sie die Versuchskammer und schalldämpfende Kastentüren. Führen Sie das Tier an dieser Stelle nicht ein, da es nach Abschluss der Kalibrierung des Gefriersystems in die Kammer gelegt wird. Überprüfen Sie, ob die Lichtintensität in der Box zwischen 20 und 30 Lux liegt.
  2. Starten Sie die Software für das Gefriererkennungssystem, und öffnen Sie das Dialogfenster "Experiment-Setup". Geben Sie die Details zu den einzelnen Betreffs ein (z. B. Betreff-Identifikationsnummer, Datum und Gruppe) und laden Sie die Datei mit dem Titel "Trainingsprotokoll VFC.pro" (verfügbar unter http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
    HINWEIS: Kontext- und Cue-Tests verwenden eine andere Programmkonfiguration; Stellen Sie daher sicher, dass Sie bei jedem Test die richtige Datei verwenden. An dieser Stelle entspricht die richtige Datei "Trainingsprotokoll VFC.pro". Denken Sie daran, dass sich die entsprechende Datei während der Testphasen von der Trainingssitzung unterscheidet.
  3. Wählen Sie die entsprechende Kamera(n) aus und aktivieren Sie die Option Video speichern (falls erforderlich). Legen Sie den Bewegungsschwellenwert auf 100 und die Min-Gefrierdauer auf 30 Frames fest.
    HINWEIS: Dieser Bewegungsschwellenwert basiert auf der Größe der verwendeten Art (basierend auf der Anzahl der Pixel). Der Mindestwert für die Gefrierdauer wird vom Hersteller empfohlen. Diese Werte werden verwendet, um eine ordnungsgemäße Erkennung des Tieres in der Kammer zu gewährleisten.
  4. Stellen Sie sicher, dass der Live-Feed der gewählten Kamera(n) zusammen mit dem Bewegungsschwellendiagramm und der Zeitleiste der verschiedenen Reize, die während des Trainings angezeigt werden (z. B. Ton und Schock), auf dem Bildschirm angezeigt wird.
    HINWEIS: Mit einer anderen Marke sollte die Ausrüstungseinrichtung die Möglichkeit bieten, die Bewegungen des Tieres zu messen, um einen "Bewegungsindex" zu erkennen, der Vergleiche über die Zeit ermöglichen sollte, in der sich das Tier bewegt oder einfriert. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung einer Software, die nur mit der Videoquelle (während oder nach dem Experiment) die Zeit, in der sich das Tier in Bewegung befindet oder einfriert, erkennen kann, wie z. B. freie Software ImageFZ13, Open-Source-Toolbox in Matlab14oder ein kostenloser Klassifler tierischen Verhaltens als JAABA15.
  5. Klicken Sie dreimal auf die Option Kalibrieren, während Sie überprüfen, ob der Bewegungsindex unter 100 (Schwellenwert) bleibt. Stellen Sie dann die Zusperrung des Geräts ein, indem Sie auf die entsprechende Schaltfläche auf dem Bildschirm klicken.
    HINWEIS: In diesem Abschnitt wird ein Systemzurfrierungssystem beschrieben, bei dem eine bestimmte Gerätemarke verwendet wird, die in der Tabelle der Materialienaufgeführt ist. Wie bereits erwähnt, kann der Kalibrierungsprozess mit verschiedenen Marken von Geräten durchgeführt werden (für eine Überprüfung der verschiedenen Optionen in Ausrüstung und Software siehe Anagnostaras et al. 2010)16.

4. Erweitertes Angstkonditionstraining

  1. Transportieren Sie die Ratten in ihren mit einem Tuch bedeckten Käfigen von der Tierpflegeeinrichtung zum Verhaltenstrainingsraum im Labor. Vermeiden Sie die Exposition gegenüber Lärm oder stresserzeugenden Bedingungen während des Transports von Tieren in den Verhaltenstrainingsraum. Wenn mehrere Tiere gleichzeitig transportiert werden, bringen Sie die Tiere nur zu testen und halten Sie andere Ratten in einem Halteraum, um die experimentelle Kontrolle zu verbessern. Behandeln Sie die Tiere vor Beginn des Trainings vorsichtig 2 min lang.
    HINWEIS: Im Protokoll wurden die Tiere jeden Tag für 2 Minuten vor dem Verhaltenstraining behandelt. Nach der Handhabung wurden die Tiere in die Versuchskammer eingeführt. Wir empfahlen, Tiere zu manipulieren, um Ratten zum Forscher anzugewöhnen.
  2. Stellen Sie die Ratte in die Versuchskammer vor. Behandeln Sie es sanft an der Basis seines Schwanzes und legen Sie es auf der Mitte der Kammer. Schließen Sie die Versuchskammer und schalldämpfende Kastentüren.
  3. Starten Sie die Sitzung, indem Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen klicken. Lassen Sie die Ratte in der Kammer für 3 min akklimatisieren. Diese 3-min-Periode ist der vom Gerätehersteller empfohlene Standard und dient als Ausgangs- und Gewöhnungszeit zur Kammer.
  4. Liefern Sie 25 Ton-Schock-Paarungen (Tests) mit einem 60 s Inter-Trial Interval (ITI), beginnend mit Minute 3 der Sitzung. Präsentieren Sie den Ton (konditionierter Stimulus – CS; 90 dB SPL, 2000 Hz, 50-ms Rise Time) während der letzten 10 s jedes ITI und den Schock (unkonditionierter Stimulus – US) während der letzten 2 s jedes ITI.
    HINWEIS: Die Aktivierung der Aufnahmetaste ist davon abhängig, dass Kameras ordnungsgemäß kalibriert und gesperrt werden.
  5. Entfernen Sie die Ratte aus der Versuchskammer, wenn die 28 min Sitzung vorbei ist. Bringen Sie die Tiere in den jeweiligen Heimkäfig zurück. Transportieren Sie die Ratten in ihren mit einem Tuch bedeckten Hauskäfigen vom Verhaltenstrainingsraum zur Tierpflegeeinrichtung.
  6. Wiederholen Sie die Kalibrierung des Gefriererkennungssystems (Schritte 3.1-3.5) und die Angstkonditionierung (Schritte 4.1 und 4.3), um alle Probanden zu trainieren.
    HINWEIS: Wir empfehlen dringend, das Erkennungssystem für jedes Tier neu zu kalibrieren, um sicherzustellen, dass die Software die gleichen Parameter bei behält, wenn sie Informationen für die Gefriererkennung verarbeitet.
  7. Ruhezeit: Während dieser Zeit lassen Sie die Tiere einzeln in ihren heimischen Käfigen ruhen. Überwachen Sie das Gewicht der Tiere zweimal pro Woche während der 6 Wochen der Inkubationszeit. Manipulieren Sie jedes Tier vorsichtig für zwei min, während sie gewichtet werden.

5. Kontexttest – Einzelsitzung 10 min

  1. Setzen Sie die Tiere nach der Trainingsphase dem ersten Speichertest namens Kontexttestaus. Setzen Sie die Ratten in dieser 10-min-Phase dem gleichen Kontext aus, in dem das Training stattgefunden hat, aber keine Hinweise oder Schocks aufweisen. Transportieren Sie die Ratten in ihren überdachten Hauskäfigen (z.B. mit einem Tuch) von der Tierpflegeeinrichtung in den Verhaltensübungsraum. Denken Sie daran, dass die Tiere in Gruppen eingeteilt wurden, so dass eine Gruppe 48 h nach der Trainingsphase und die andere Gruppe 6 Wochen nach dem Training getestet wird (siehe Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: Zeitleiste des Experiments. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Reinigen Sie alle Innenflächen der Versuchskammer und des Edelstahlgitterbodens mit 10% Ethanol. Wiederholen Sie dies, bevor Sie jedes Tier testen.
  2. Kalibrierung des Gefriererkennungssystems (Schritte 3.1 bis 3.5). Öffnen Sie das Dialogfenster "Experiment-Setup", und laden Sie die Datei mit dem Namen "Context test protocol.pro", die ab http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQverfügbar ist.
    HINWEIS: Diese Datei enthält das Setup für diese experimentelle Phase, die aus keinen Stößen oder Tönen besteht.
  3. Führen Sie das Tier in die Versuchskammer ein. Behandeln Sie es sanft an der Basis seines Schwanzes und legen Sie es auf der Mitte der Kammer. Schließen Sie die Versuchskammer und schalldämpfende Kastentüren.
  4. Starten Sie die Sitzung, indem Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen klicken. Während dieser einzigen 10 min Kontext-Test-Sitzung werden keine Reize dargestellt (Schock weder Ton).
  5. Entfernen Sie das Motiv aus der Versuchskammer, wenn die 10-min-Sitzung beendet ist. Bringen Sie die Tiere in ihre jeweiligen Käfige zurück und transportieren Sie die Ratten in ihren überdachten Heimkäfigen vom Verhaltensübungsraum zur Tierpflegeeinrichtung. Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.5, um alle Probanden zu testen.

6. Cue-Test – Einzel13 min Sitzung

  1. Einen Tag nach dem Kontexttest, lassen Tiere den zweiten Speichertest namens Cue-Testunterziehen. Während dieser Phase werden die Ratten in einem anderen Kontext der Ausbildung während 13 Min.; (Töne) werden präsentiert, aber es werden keine Stöße geliefert. Transportieren Sie die Ratten in ihren mit einer Abdeckung bedeckten Käfigen von der Tierpflegeeinrichtung in den Verhaltenstrainingsraum. Testen Sie eine Gruppe 72 h nach dem Angstkonditionstraining, und testen Sie eine weitere Gruppe 6 Wochen und einen Tag nach dem Training (Abbildung 1).
    HINWEIS: Ein anderes Transportsystem (von der Tierpflegeeinrichtung zum Versuchsraum) könnte implementiert werden, um den Kontext und die Cue-Tests stärker zu differenzieren. Da die Tiere zur Trainingseinheit und Kontextprobe in ihren Heimischenkäfigen transportiert wurden, konnte während des Transports zur Cue-Test-Sitzung ein anderer Transportkäfig, Einstreu und/oder Abdeckung verwendet werden.
  2. Reinigen Sie alle Innenflächen der Versuchskammer und des Edelstahlgitterbodens mit 10% Ethanol. Wiederholen Sie dies, bevor Sie jedes Tier testen.
  3. Um den visuellen Kontext zu ändern, legen Sie die Kunststoff-Umhängewand in die Versuchskammer ein.
  4. Um den olfaktorischen Kontext zu ändern, wenden Sie 1% Essigsäure auf einen Wattestäbchen auf, und legen Sie ihn in die Metallschale unter dem Gitterboden17,18,19.
  5. Wiederholen Sie die Kalibrierung des Gefriererkennungssystems (Schritte 3.1-3.5). Laden Sie die Datei mit dem Namen "Cue test protocol.pro" Datei, die ab http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQverfügbar ist.
    HINWEIS: Diese Datei enthält das Setup für diese experimentelle Phase, die aus der Lieferung der gleichen Töne während der Trainingsphase (CS) besteht, aber in Ermangelung von Schocks (US).
  6. Führen Sie das Tier in die Versuchskammer ein. Behandeln Sie es sanft an der Basis seines Schwanzes und legen Sie es auf der Mitte der Kammer. Schließen Sie die Versuchskammer und schalldämpfende Kastentüren.
  7. Starten Sie die Sitzung, indem Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen klicken. Während der einzelnen 13-minuten-Cue-Testsitzung wird der CS-Stimulus (Ton) 10 Mal dargestellt, beginnend mit Minute 3 der Sitzung.
    HINWEIS: Die ersten 3 Min entsprechen dem Ausgangswert dieser Sitzung, gefolgt von 10 Cue-Teststudien (d. h. jeweils 10 s), die ohne Schocks mit 50 s ITIs geliefert werden. Die Lieferung von Tönen erfolgt automatisch über die zuvor geladene Datei.
  8. Entfernen Sie das Tier aus der Versuchskammer, wenn die 13-min-Sitzung beendet ist. Bringen Sie die Tiere in den jeweiligen Käfig zurück und transportieren Sie sie bedeckt zur Tierpflegeeinrichtung. Wiederholen Sie die Schritte 6.2 bis 6.5, um alle Probanden zu testen.

7. Datenanalyse

  1. Rufen Sie den allgemeinen Aktivitätsindex (d. h. den Bewegungsindex) ab, der aus dem Videostream mithilfe der Software für das Gefriererkennungssystem abgeleitet wird. Diese Software transformiert automatisch den Bewegungsindex, um den Prozentsatz der Gefrierzeit pro Sitzung und die Anzahl der gefrierenden Episoden bereitzustellen. Legen Sie den Gefrierschwellenwert auf die standardmäßige Einstellung Für mindeste Einfrierendauer des Systems fest (1 s = 30 Frames).
  2. Verwenden Sie das zusätzliche maßgeschneiderte Programm (Datei verfügbar von http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ), um zu erhalten:
    1. Verwenden Sie das Programm, um den Prozentsatz des Einfrierens während der ersten drei Minuten der Trainingseinheit (d. h. das Einfrieren der Baseline, da vor oder während dieser 3-minuten-Periode keine Schocks oder Töne dargestellt wurden) und während der ersten drei Minuten der Cue-Testsitzung zu bestimmen.
    2. Verwenden Sie das Programm, um den Prozentsatz des Einfrierens für jeden der acht 3 Min. der Trainingseinheit zu bestimmen.
    3. Verwenden Sie das Programm, um den Prozentsatz des Einfrierens während der Cue-Präsentationen (d. h. das Einfrieren während der Töne) und die No-Cue-Zeiträume (intertriale Intervalle; ITIs) sowohl für Schulungen als auch für Cue-Test-Sitzungen.
  3. Um diese Daten zu erhalten, öffnen Sie die Software für das Gefriererkennungssystem.
    1. Datei auswählen | Berichte | Batch-Komponenten-Zusammenfassung.
    2. Wählen Sie die Datei mit der Erweiterung . CMP verfügbar bei http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    3. Benennen Sie die Ausgabedatei, und ändern Sie den Bewegungsschwellenwert in 100. Klicken Sie dann auf OK.
    4. Wählen Sie die zu analysierenden Dateien aus (Erweiterung . RAW). Diese Dateien werden automatisch aus der Software des Gefriererkennungssystems generiert, wenn die Sitzung beendet ist, und entsprechen den Rohdaten jeder Sitzung. Zunächst werden die Dateien auf dem Desktop des Computers gespeichert, aber sie können in einem benutzerdefinierten Ordner (z.B. Documents-Fear Conditioning) gespeichert werden, um ihre nachfolgende Identifizierung und Öffnung zu erleichtern, wenn sie analysiert werden müssen.
    5. Öffnen Sie die Ausgabedateien (Erweiterung . CSV). Sie können in einer Tabellenkalkulationssoftware zur weiteren Analyse bearbeitet werden. Diese Datei enthält die Ergebnisse des Einfrierens während der experimentellen Sitzung.
      ANMERKUNG: Um den Gesamtprozentsatz des Einfrierens zu erhalten, teilen Sie die Zeit, die das Subjekt unbeweglich verbracht hat, auf die gesamte Sitzungszeit auf. Die Anzahl der gefrierenden Episoden kann berechnet werden, indem die Anzahl der Gefrierereignisse während der Sitzung gezählt wird. In beiden Fällen ist es notwendig, einen Bewegungsschwellenwert auf der Grundlage einer Mindesteinfrierungsdauer zu definieren. Dies ist das zeitliche Kriterium, das definiert, ob eine Freeze-Episode aufgezeichnet wird. Automatisierte Aufzeichnungssysteme können bestimmte Mengen an Frames pro Sekunde (fps) als Maß für die minimale Gefrierdauer verwenden. Bei einer Abtastrate von 30 fps wird beispielsweise eine Mindesteinfrierungsdauer von 15 Frames als Einfrieren einer Unbeweglichkeitsinstanz aufzeichnet, die für 30 s anhält.
  4. Berechnen Sie die durchschnittliche Dauer jeder Gefrierepisode für jede Sitzung (Training und beide Tests, Kontext und Cue), indem Sie die gesamte Gefrierdauer (in Sekunden) über die Gesamtzahl der Gefrierepisoden dividieren.

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Representative Results

Die prozentualen Schwankungen der Gefrierzeit in den verschiedenen Phasen der Trainingseinheit wurden für alle Probanden (n = 12) mit einem abhängigen t-Test analysiert (Tabelle 1). Die Tiere waren aktiv und erkundeten die Versuchskammer während der ersten drei Minuten der Trainingseinheit (erster Tag des Protokolls), während der keine Töne oder Schocks abgegeben wurden (d.h. Baseline-BL). Wie in Abbildung 2Adargestellt, Prozentsatz der Gefrierzeit während der nachfolgenden 25 Ton-Schock-Paarungen (M = 48,88; SE = 4,37) war signifikant höher als während BL (M = 14,65; SE = 4.05), was als Hinweis auf einen Angsterwerb angenommen wird.

Statistiktest Abbildung Phasen
Abhängiger t-Test 2A t (11) = -6,21, p < 0,001, d = 2,34
3-Min-Behälter
Wiederholte Maßnahmen ANOVA 2B F (3,75, 41,32) = 11,19, p < .001, sp2 = 0,50.
Phasen Gruppe Phasen X Gruppe
Gemischte ANOVA 2C F(3, 30) = 14,21, p < .001,sp 2 =.58 F(3, 30) = 4,63, p <2 0,05, 2 =.31 F(1, 10) = 2,06, p >,05, 22 =.17
One-Way-ANOVA 3A F(1, 10) = 6,91, p <2 0,05, 2 =.40
One-Way-ANOVA 3B F(1, 10) = 10,30, p <2 0,05, 2 =.50
One-Way-ANOVA 3C F(1, 10) = 5,83, p <. 05, 22 =.36
Gemischte ANOVA 4A F(2, 20) = 29,28, p < .001,sp 2 =.74 F(2, 20) = 2,33, p >,05, 22 =.18 F(1, 10) = 2,14, p >,05, 22 =.17
Gemischte ANOVA 4B F(1, 10) = 1,53, p >,05, 22 =.13 F(1, 10) = 3,98, p <2 0,05, 2 =.28 F(1, 10) = .23, p >.05, sp2 =.02
Gemischte ANOVA 4C F(1, 10) = 25,43, p < 0,001, 22 =.71 F(1, 10) = 6,17, p <2 0,05, 2 =.38 F(1, 10) = .22, p >.05, sp2 =.02

Tabelle 1: Statistiken, die bei der Datenanalyse verwendet werden. Für Abbildung 2Awurde der durchschnittliche Prozentsatz des Einfrierens aller Probanden (n = 12) während der ersten 3 Min. der Trainingseinheit (entsprechend der Ausgangszeit, BL) mit dem Prozentsatz des Einfrierens während der verbleibenden 25 min der Sitzung verglichen (25 Ton-Schock-Studien), die einen signifikanten Unterschied und eine große Effektgröße(Cohens d = 2,34) aufweisen. Für Abbildung 2Bwurde ein Vergleich über Abschnitte von 3 Minuten durchgeführt, der einen signifikanten Unterschied in einem ANOVA-Test mit wiederholten Messungen (BL und acht 3 Min. bin) zeigte. Für Abbildung 2Cwurden Vergleiche zwischen dem durchschnittlichen Prozentsatz des Einfrierens jeder Rattengruppe während der Baseline (BL, erste 3 Min. der Trainingseinheit), der Trainingszeit (25 Ton-Schock-Paarungen), der Kontexttestsitzung und der Cue-Testsitzung über eine gemischte ANOVA mit zwischen den Probandenfaktor der Gruppe (48 h oder 6 Wochen) und innerhalb der Probanden die Phasen (BL, Training, Kontexttest und Cue-Test) durchgeführt. Es wurden Unterschiede in Phasen und Gruppen festgestellt, jedoch nicht in der Interaktion Phases*Group. Abbildung 3A – 3B zeigt Daten über Aktivität (Panel 3A, Bewegungsindex), Einfrieren (Panel 3B, mittleres Einfrieren in Sekunden) und die Dauer von Episoden (Panel 3C, mittleres Einfrieren von Episoden in Sekunden). Diese Daten wurden mit einer einwegigen ANOVA analysiert, die Unterschiede zwischen den Gruppen in allen Messungen aufzeigte. Schließlich wurde für Abbildung 4A– 4C eine gemischte ANOVA für jedes Panel (A, B und C) durchgeführt, wobei als Zwischensubjektdiedie die Gruppe (48 h oder 6 Wochen) und innerhalb der Probanden die Phasen (BL, Training, Context Test und Cue Test) berücksichtigt wurden.

Figure 2
Abbildung 2: Trainingsphase eines erweiterten Cued-Angstkonditionierungsprotokolls. Die Daten werden als Mittelwert (Balken) und SEM (Fehlerbalken) der Gefrierantwort angezeigt. (A) zeigt den durchschnittlichen Prozentsatz des Einfrierens aller Probanden (n = 12) während der ersten 3 min der Trainingseinheit, in der keine Schocks oder Töne dargestellt wurden (Baseline, BL), und die restlichen 25 min der Sitzung (25 Ton-Schock-Studien, mit Intertrial-Intervall, ITI, von 60 s); = anders als BL (p < .001). (B) zeigt die durchschnittliche Gefrierzeit aller Tiere (n = 12) während der 3-min-Basiszeit (BL, keine Schocks oder Töne) und nachfolgenden 3 Min. der Trainingseinheit; = anders als alle verbleibenden Behälter (p < .001). (C) zeigt den durchschnittlichen Prozentsatz des Einfrierens jeder Rattengruppe (Prüfung 48 h nach dem Training; Prüfung 6 Wochen nach dem Training) während der Baseline (BL, erste 3 min der Trainingseinheit), Trainingszeit (25 Ton-Schock-Paarungen), Kontexttestsitzung und Cue-Test; * = anders als Tests nach 48 h(Mittelwert diffContext = -34.95, SE = 14.99, p < .05, Cohen es d = 1.34); a = anders als die Ausbildungszeit(mittelwert diffTraining48h = 42,51; SE = 7,28; p < .05; Cohens d = 3,03); b = anders als die Ausbildungszeit(mittelwert diffTraining6Weeks = 25,94; SE = 7,28; p < .05; Cohen es d = 1.77), Kontexttest(mean diffContext6Weeks = 50.36; SE = 10,58; p < .01; Cohen s d = 3.13) und Cue-Test(mittelwert diffCue6Weeks = 55.86; SE = 10,25; p < .01; Cohens d = 2,47). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Eine Analyse der Gefrierreaktion während der gesamten Erfassung wurde durchgeführt, indem die Trainingseinheit in acht 3 Minuten abschnitte segmentiert wurde (Abbildung 2B). Diese Daten zeigen, dass die dieser Antwort zugewiesene mittlere Zeit asympto tot in der Nähe oder bei 180 s während der ersten drei Ton-Schock-Studien (d. h. Bin 1) erreicht. Dieser Befund wurde in früheren Untersuchungen als Hinweis auf eine Überschulung11angesehen. Die ANOVA mit wiederholten Maßnahmen zeigte konsistente signifikante Unterschiede zwischen dem Basisplan und allen nachfolgenden Lagerplätzen mit großen Effektgrößen(Tabelle 1 und Tabelle 2).

Vergleich Mittlere Differenz Standardfehler p-Wert Cohen es d
Lagerplatz-Baseline vs bin 1 -60.075* 12,243 < .05 1.95
Lagerplatz-Baseline vs. Bin 2 -69.053* 16,220 < .05 1.89
Lagerplatz-Baseline vs. Bin 3 -66.197* 13,706 < .05 1.91
Lagerplatz-Baseline vs. Bin 4 -68.595* 11,969 < .05 2.08
Lagerplatz-Baseline vs. Bin 5 -65.475* 10,991 < .05 2.15
Lagerplatz-Baseline vs. Bin 6 -65.795* 13,509 < .05 2.06
Lagerplatz-Baseline vs. Bin 7 -72.900* 12,231 < .05 2.53
Lagerplatz-Baseline vs. Bin 8 -78.633* 8,692 < .001 3.37

Tabelle 2: Mittlere Differenz, Standardfehler und Effektgröße für 3 Min. bin in Abbildung 2B. Diese Tabelle zeigt die Vergleiche zwischen dem Basislagerplatz und den nachfolgenden Lagerplätzen (Abbildung 2B). Mittlere Differenz, Standardfehler und p-Wertund Cohens d werden als Index der Größe dieser Unterschiede (Effektgröße) gemeldet.

Eine gemischte ANOVA wurde durchgeführt, um Unterschiede im Prozentsatz des Einfrierens während der Aufgabe zu testen, wobei Phasen (BL, Training, Kontexttest und Cue-Test) als Innerhalb-Subjekt-Faktor und Gruppe (48 h und 6 Wochen) als Faktor zwischen den Probanden(Tabelle 1) durchgeführt wurden. Der Prozentsatz des Einfrierens aller Tiere während des Ausbildungszeitraums war deutlich höher als während des Ausgangszeitraums (siehe Abbildung 2C). Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Prozentsatz des Einfrierens während der Gedächtnistests und der Trainingszeit beobachtet (ps > .05).

Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (48 h und 6 Wochen) im Prozentsatz des Einfrierens während BL, Training und Cue-Test beobachtet (ps > .115; siehe Abbildung 2C). Umgekehrt zeigten die 6 Wochen nach dem Training getesteten Tiere während des Kontexttests deutlich höhere Einfrierungsprozentsätze als Tiere, die mit 48 h getestet wurden, mit einer großen Wirkungsgröße (siehe Abbildung 2C). Insgesamt zeigt Abbildung 2C, dass das Einfrieren während der langzeitverzögerten Kontext- und Cue-Tests (d. h. 6 Wochen nach dem Training) insgesamt deutlich höher war als während der Trainingseinheit. Der gegenteilige Rückläufige wurde in der Gruppe der Tiere beobachtet, die 48 h nach dem Training getestet wurden. Diese Unterschiede in der Gruppe der 48 h waren jedoch statistisch nicht signifikant (ps > .05). Schließlich, obwohl das Gefrierniveau Unterschiede zwischen den verschiedenen Phasen zeigte, konnten sie im Vergleich zu anderen Protokollen als niedrig angesehen werden. Eine Erklärung könnte die inhärenten methodischen Unterschiede zwischen Laboratorien oder der während des Kalibrierungsprozesses festgelegte Schwellenwert für den Bewegungsindex sein, was den Vergleich der Daten zwischen Laboratorien erschwert.

Die konditionierte Gefrierreaktion der beiden Gruppen von Probanden während des Kontexttests wurde weiter untersucht durch die Analyse anderer Maßnahmen, nämlich der durchschnittlichen Aktivität (d. h.des Bewegungsindex),der gesamten Gefrierzeit und der Gefrierzeit pro Episode. Eine einseitige ANOVA wurde verwendet, um Unterschiede zwischen diesen Variablen zu testen (Tabelle 1). Die Aktivität der Probanden, die 6 Wochen nach dem Training getestet wurden, war deutlich geringer als die der getesteten Tiere 48 h nach der Trainingseinheit (Abbildung 3A). Dementsprechend war die gesamte Gefrierzeit der Tiere, die kurz nach dem Training getestet wurden, deutlich niedriger als die der Tiere, die 6 Wochen nach dem Training getestet wurden(Abbildung 3B). Schließlich ergab eine Analyse der durchschnittlichen Dauer jeder Gefrierepisode, dass die 6 Wochen nach dem Training getesteten Tiere länger gefrierende Episoden zeigten als Tiere, die 48 h nach dem Training getestet wurden(Abbildung 3C). Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf einen Angstinkubationseffekt hin.

Figure 3
Abbildung 3: Auswirkungen eines erweiterten Cued-Angstkonditionierungsprotokolls auf das Einfrieren der Reaktion von Ratten.
Die Daten werden als Mittelwert (Balken) und SEM (Fehlerbalken) der Gefrierantwort angezeigt. (A) zeigt die Aktivität (d. h. bewegungsindex) jeder Gruppe von Probanden (Prüfung 48 h nach dem Training; Prüfung 6 Wochen nach dem Training) während des Kontexttests; * = abweichend von 6 Wochen. (B) zeigt die durchschnittliche Gesamteinfrierungszeit (in Sekunden) jeder Gruppe von Probanden während des Kontexttests; * = abweichend von 6 Wochen. (C) zeigt die durchschnittliche Dauer jeder Gefrierepisode (in Sekunden) für jede Gruppe von Probanden während des Kontexttests an; * = nur abweichend von 6 Wochen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Eine weitere Leistungsprüfung während der Cue-Testsitzung erfolgte durch Analysen von (a) Prozentsätzen des Einfrierens während der Ausgangszeiten (BL Training und BL Cue Test) und während des gesamten 10-min-Cue-Tests (zehn 10-S-Ton-Präsentationen und zehn ITIs mit 50 s - Abbildung 4A), b) durchschnittliche Gefrierzeit speziell während der 10 s-Präsentationen des Cue (Tons), sowohl für Trainings- als auch Cue-Testsitzungen(Abbildung 4B) und (c) durchschnittliche Gefrierzeit (in Sekunden) während der Zwischenintervalle der 50er Jahre (ITIs; d. h., Nur No-Ton-Perioden – Abbildung 4C). Eine gemischte ANOVA wurde verwendet, um jede dieser abhängigen Kennzahlen zu analysieren, wobei Phasen (BL Training, BL Cue Test und Cue Test) als innerhalb des Subjektfaktors und Gruppen (48 h und 6 Wochen) als Faktor zwischen den Probanden(Tabelle 1)angenommen wurden. Wie in Abbildung 4Adargestellt, erhöhte die Gruppe der Ratten, die 6 Wochen nach dem Training getestet wurden, ihren Prozentsatz des Einfrierens während der Baseline der Cue-Test-Sitzung (BL Cue Test; erste 3 min der Sitzung) und während des 10 min Cue-Tests im Vergleich zum BL-Training (d. h. vor jeder Exposition gegenüber Tönen und Schocks) signifikant. Für die nach 48 h getestete Rattengruppe(p > .05) wurde kein analoger Unterschied zwischen BL-Training und BL Cue beobachtet. Für beide Rattengruppen war der Prozentsatz des Einfrierens während des 10-min-Cue-Tests höher als während des entsprechenden Basiszeitraums derselben Sitzung (BL Cue Test), was auf einen Abrufeffekt hindeutet. Es wurden keine Unterschiede zwischen den Rattengruppen hinsichtlich des Prozentsatzes des Einfrierens über die verschiedenen Zeiträume beobachtet (ps > .05).

Abbildung 4B zeigt einen Vergleich der mittleren Gefrierzeit (in Sekunden) speziell während der 10-S-Ton-Präsentationen über Training (Ton-Schock-Paarungen) und Cue-Test (nur Tonpräsentationen). Nur Ratten getestet 6 Wochen nach dem Training deutlich erhöht die Zeit Einfrieren während des Cue.

Wie in Abbildung 4Cdargestellt, verringerte nur die Gruppe der Ratten, die nach dem Training 48 h getestet wurden, die Gefrierzeit während der ITIs von der Schulung bis zum Cue-Test signifikant. In den beiden Rattengruppen wurden keine Unterschiede in der Gefrierzeit während der ITI beobachtet (ps >.05).

Figure 4
Abbildung 4: Auswirkungen eines erweiterten Cued-Angstkonditionierungsprotokolls auf das Einfrieren der Reaktion während des Cue-Tests.
Die Daten werden als Mittelwert (Balken) und SEM (Fehlerbalken) der Gefrierantwort angezeigt. (A) zeigt den Prozentsatz des Einfrierens jeder Gruppe von Probanden (Prüfung 48 h nach dem Training; Prüfung 6 Wochen nach dem Training) während der ersten 3 min der Trainingseinheit (BL, Baseline), der ersten 3 min der Cue-Testsitzung (BL Cue) und der 10 min des Cue-Tests (Cue Test); a = anders als Cue-Test nach 48 h (Mittelwert DIFFBLTraining-Cue48h = 32,84; SE = 10,25; p < .05; Cohens d = 1,52); b = anders als BL Cue Test(MittelwertBLCue-BL6Weeks = 33,98; SE = 8,36; p < .05; Cohen es d = 1.59) und Cue Test(mittelwert diffCue-BL6Weeks = 55.86; SE = 10,25; p < .05; Cohens d = 2,47); c = anders als Cue-Test nach 48 h (MittelwertBLCue-Cue48h = 18,99; SE = 5,17; p < .05; Cohens d = .67); d = anders als Cue-Test nach 6 Wochen (Mittelwert DIFFBLCue-Cue6Weeks = 21,87; SE = 5,17; p < .05; Cohen s d = .88). (B) zeigt die durchschnittliche Gefrierzeit (in Sekunden) während des Tonses jeder Gruppe von Probanden während des Trainings und des Cue-Tests; * = anders als 6 Wochen während der Testphase des Cue-Tests(mittelwert diffTraining-Cue6Weeks = -3.14; SE = 1,37; p < .05; Cohens d = 1,64). (C) zeigt die durchschnittliche Gefrierzeit (in Sekunden) während der Intertrialintervalle (ITI) der Trainingseinheit (10 Ton-Schock-Paarungen) und des Cue-Tests (10-Ton-Präsentationen) in den beiden Rattengruppen (48 h und 6 Wochen); = anders als Training für Gruppe von Ratten getestet 48 h nach dem Training(mittel diffTraining-Cue48h = 506.16; SE = 95,08; p < .001; Cohens d = 2,48). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das derzeit erweiterte Angstkonditionierungsprotokoll ist ein effizienter und gültiger Ansatz zur Beurteilung des emotionalen Gedächtnisses über kurze (48 h) und langfristige Zeiträume (6 Wochen). So erlaubt das Protokoll, Übertraining und Angst inkubationsphänomene bei Ratten zu studieren. Zu den verschiedenen Vorteilen dieses Protokolls gehören die folgenden. Es bietet zwei Arten von Speichertests, nämlich Kontext und Cue, die es ermöglichen, die differenzielle Wirkung von zwei Verzögerungen (48 h und 6 Wochen) über Kontext- und Cue-Manipulationen zu identifizieren. Zweitens beinhaltet die Aufgabe eine einzelne 28-Minuten-Schulung, die wiederum langfristige Effekte mit einer Längerfristdauer erzeugt. Dieser Vorteil ist bemerkenswert, wenn man bedenkt, dass einige Versionen der erweiterten Angstkonditionierung mindestens 100 Schocks in 10 Trainingseinheitenbenötigen 11. Drittens bietet das Protokoll mehrere Messalternativen, die automatisch berechnet werden. Darüber hinaus gibt es steigende pharmakologische, physiologische und anatomische Beweise, die die Gültigkeit dieses Paradigmas für die Beurteilung emotionaler Gedächtnisphänomene15,16unterstützen.

Im Vergleich zu anderen Angstkonditionierungsparadigmen mit kurzen Trainingseinheiten (d.h. wenigen Studien) haben erweiterte Protokolle, die zu Überschulungseffekten führen, weniger Beachtung gefunden. Jedoch, erweiterte Angst-Konditionierung Aufgaben waren der Schlüssel zum Verständnis der Angst Inkubation zugrunde liegenden Verhaltens- und neurobiologischen Prozesse, einschließlich seiner Beziehung zu anderen psychologischen Phänomenen (z.B. verzögerte posttraumatische Belastungsstörung)11,12,13. Das vorliegende Angstkonditionierungsprotokoll erzeugt zuverlässig Angstinkubation. Dies zeigt sich bei höheren Gefrierzeiten und niedrigeren Bewegungsindizes bei Tieren, die 6 Wochen nach dem Training beurteilt wurden, im Vergleich zu Tieren, die 48 h nach dem Training getestet wurden. Darüber hinaus konnte dieser Effekt bei jeder Versuchsart unterschiedlich beobachtet werden; insbesondere längere Frostepisoden während des Kontexttests 6 Wochen nach dem Training und Inkremente während Cue-Präsentationen 6 Wochen nach dem Training. Im Zusammenhang mit diesem letztgenannten Effekt (d. h. InKremente während der Cue-Präsentationen 6 Wochen nach dem Training) scheint die Neuheit der experimentellen Situation (d. h. der neue Kontext) verworfen werden zu können, da die Ausgangstemperaturen während derselben Sitzung deutlich niedriger waren als bei den nachfolgenden Cue-Präsentationen.

Obwohl in beiden Gruppen ein Trend zum Fear Learning zu beobachten war (d. h. Unterschiede zwischen 3 min Baseline und Training), wiesen Tiere, die nach 48 h (Kontext) und 72 h (Cue) getestet wurden, bei beiden Tests keine signifikanten Unterschiede im Gefrierniveau auf. Dies kann als eine Einschränkung des Protokolls betrachtet werden, was das Ergebnis einer hohen Verhaltensvariabilität in der 48-H-Gruppe zu sein scheint (siehe Abbildung 2C). Eine methodische Änderung, die implementiert werden kann, um die Variabilität zu reduzieren und das Verfahren zu verbessern, ist die Durchführung des Kontext- und Cue-Tests 24 h nach dem Training, was in einigen Angstkonditionierungsverfahren üblich ist.

Das vorliegende Protokoll könnte in der klinischen Forschung angewendet werden23. Die starke Gedächtnisspur- und Inkubationswirkung, die sich aus ihrer Umsetzung ergibt, kann es ermöglichen, die Auswirkungen von Medikamenten zu testen, die regelmäßig zur Behandlung psychologischer und psychiatrischer Pathologien (z. B. angstlösende oder stimmungsvolle RegulatorenBehandlungen 24) auf emotionale Gedächtnisphänomene (z. B. Angstaussterben)25,26,27verwendet werden. Das Protokoll könnte somit erlauben, den Einfluss von Medikamenten auf die Speicherspur über verschiedene Zeitrahmen hinweg zu messen, einschließlich biologischer Korrelate wie Neurotransmitter und Moleküle im Zusammenhang mit der Gedächtnispflege28,29. Das Protokoll könnte auch für die Forschung mit einer translationalen Perspektive relevant sein, die vorgeschlagen hat, dass Angstparadigmen nützlich sein könnten, um präklinische Modelle von Verhaltenstherapien30 und vergleichende Studien über Angst über Arten21,22zu testen. Schließlich ist das vorliegende Protokoll aus neurobiologischer Sicht ein robustes Modell zur Untersuchung von Gehirnmechanismen, Kommunikation zwischen Strukturen, Netzwerken oder neuronalen Ensembles, die an der langfristigen Erfassung, Konsolidierung und Speicherung des emotionalen Gedächtnisses oder der Auswirkungen der Inkubation während der Entwicklung beteiligt sind32.

Einige andere Aspekte des Protokolls sind es wert, diskutiert zu werden. Während des gesamten Experiments wurde Nahrungsmittelmangel eingesetzt. Diese Entscheidung wurde getroffen, weil andere Verhaltenstests, die auf Lebensmittelbelohnungen basieren (z. B. Opern- oder Instrumentaltechniken)33,34,35 mit minimalen Änderungen integriert werden können, was das gegenwärtige Protokoll zu einer vielseitigeren Technik macht. So haben wir dieses Protokoll erfolgreich mit radbasierten Übungsprotokollen und T-Maze-Speicheraufgaben integriert. Ein weiterer Aspekt bezieht sich auf die in diesem Protokoll implementierte Gruppengröße (n=6). Obwohl es sich um eine relativ kleine Stichprobe handelte und größere Proben sicherlich empfohlen werden, gleicht die Größe des Inkubationseffekts diese Einschränkung aus (siehe Tabelle 1). Dies könnte als Vorteil dieses Protokolls angesehen werden, insbesondere in Bezug auf die Empfehlungen der Tierausschüsse, die auf dem Reduktionsprinzip basieren. Eine Einschränkung des Protokolls war, dass minimale oder keine Exposition gegenüber Fußschocks und Zeitverlauf der Angstinkubation nicht bewertet wurden. Eine zusätzliche Kontrollgruppe mit den vorher bedingungen könnte die Strenge des experimentellen Designs erhöhen.

Zu den endgültigen Empfehlungen für die beste Umsetzung und die Ergebnisse dieses Protokolls gehören die korrekte Reinigung der Versuchskammer, insbesondere des Gitterbodens, die Kalibrierung der Stoßintensitäten vor dem Training jedes Fachs (z. B. Kot und Urin reduzieren oft die Zuverlässigkeit der Stoßintensität über verschiedene Bereiche der Kammer) und die Kalibrierung des Gefriersystems (die Zuverlässigkeit der Gefriermaßnahmen hängt von der richtigen Einstellung der Bewegungsschwelle und der minimalen Gefrierdauer ab).

Dieses Protokoll könnte mit anderen Stämmen von Ratten oder anderen Nagetieren (z. B. Mäusen oder mongolischen Keimen) getestet werden, wodurch der Anwendungsbereich erweitert wird. In diesen Fällen ist es wichtig, die Stoßintensität sowie die Schwellenwerte für Bewegung und Dauer anzupassen. Die Stoßintensität, die in Angstkonditionierungsprotokollen mit Mäusen verwendet wird, reicht in der Regel 0,4 mA bis 1,5 mA, mit 0,75 mA eine oft gemeldete effektive Intensität16,36,37,,38 und 1,5 mA die höchste gemeldete Intensität39. Der mongolische Gerbil ist ein Nagetiermodell, das seltener für angstkonditionierende Forschung ausgewählt wird; jedoch wurden mongolische Gerbils erfolgreich verwendet, um zirkadiane Rhythmen bei Säugetieren zu modellieren40. Dementsprechend könnte das aktuelle Protokoll implementiert werden, um mögliche Beziehungen zwischen zirkadianen Rhythmen und emotionalem Gedächtnis zu untersuchen, beide relevant in Pathologien wie Depression, Angst oder Veränderung der Stimmung41,42. Bei Gerbils liegt ein effektiver Stoßintensitätsbereich für dieses und analoge aversive Konditionierungsprotokolle zwischen 1,0 und 4,0 mA43,44,45,46. Schließlich ist darauf hinzuweisen, dass die Bewegungs- und Dauerschwellen je nach der gewählten Art angepasst werden sollten47. Diese Schwellenwerte sind die Grenzwerte für die Bewegungsverfolgungssoftware, über der das Tierverhalten als Bewegung registriert ist und unterhalb derer die Software das Einfrieren registriert. In aversiven Konditionierungsstudien mit Mäusen und Keimen wurden effektive Bewegungs- und Dauerschwellen von 25 bzw. 30 fps (d. h. mindestens 1 s Unbeweglichkeit) bzw.30,35berichtet.

Um eine angemessene Kontrolle der aversiven Stimulation (Fußschocks) zu gewährleisten, müssen alle Bereiche des Gitterbodens die gleiche Intensität liefern. Es wird empfohlen, die Intensität des Schocks in drei Sektoren des Gitterbodens zu kalibrieren, um zu überprüfen, ob er konsistent ist. Dies verhindert, dass Tiere lernen, die Exposition gegenüber den Schocks zu reduzieren, indem sie sich an einen Ort in der Box bewegen, der eine geringere Intensität aussendet. Wenn die Kalibrierung zeigt, dass das Metallgitter nicht in allen Sektoren die gleiche Intensität liefert, entfernen Sie das Gitter vom Boden, reinigen Sie die Stäbe und ersetzen Sie das Gitter in der Kammer. Der Gitterboden muss ordnungsgemäß in die Kammer eingesetzt werden, um die beste elektrische Übertragung von der aversiven Stimulationsvorrichtung zum Gitterboden zu gewährleisten.

Der Fokus und die Blende der Gefriererkennungssystemkamera werden vom Hersteller kalibriert. Wenn jedoch eine zusätzliche Kalibrierung erforderlich ist, lösen Sie die Setschraube am Fokusring, stellen Sie ein, bis ein klares Bild erreicht ist, und ziehen Sie dann die Setschraube am Fokusring fest. Der Hersteller empfiehlt, die Linsenöffnung in maximal erschließender Position zu verriegeln. Um diese Einstellung zu erreichen, stellen Sie sicher, dass der weiße Punkt des Öffnungsrings mit der Zahl 1.4 auf dem Linsenlauf ausgerichtet ist. Es wird empfohlen, das Handbuch des Herstellers zu konsultieren. Beachten Sie, dass bei einer Anpassung des Fokus der Kamera auch die Kalibrierung der Kamera mit der entsprechenden Software erfolgen muss. Die Kamerakalibrierung erfordert eine Einstellung der Helligkeit, Verstärkung und des Verschlusses. Es wird empfohlen, das Handbuch des Herstellers zu konsultieren, um genaue Anweisungen zum Kamerakalibrierungsprozess zu erhalten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Protokoll es ermöglicht, das emotionale Gedächtnis über kurz- und langfristige Zeiträume hinweg zu testen und erzeugt eine langfristige Angstinkubation. Dieser Angst-Inkubationseffekt wird durch ein Single-Session-Overtraining erzeugt, das 6 Wochen später Effekte in Kontext- und Cue-Tests zeigt. Dies deutet auf eine starke emotionale Gedächtnisspur hin. Das aktuelle Protokoll ist ein effizienter und gültiger Ansatz, um die Komponenten des emotionalen Gedächtnisses bei Ratten zu erforschen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Finanzielle Unterstützung für diese Forschung wurde von der Stiftung Universitaria Konrad Lorenz - Fördernummer 9IN15151 - bereitgestellt. Die Autoren danken der Kommunikationsabteilung der Konrad Lorenz Universität für ihre Hilfe bei der Aufnahme und Bearbeitung des Videos, insbesondere Natalia Rivera und Andrés Serrano (Produzenten). Auch Nicole Pfaller-Sadovsky und Lucia Medina für ihre Kommentare zum Manuskript und Johanna Barrero, Dekanin der Corporacion Universitaria Iberoamericana, für institutionelle Zusammenarbeit. Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (ethanoic acid) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid
Aversive Stimulation Current Package MED Associates Inc ENV-420 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Contextual test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Cue test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Curved Wall Insert MED Associates Inc VFC-008-CWI https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Data processing.zip http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
NIR/White Light Control Box MED Associates Inc NIR-100
Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse MED Associates Inc ENV-005FPU-M https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Small Tabletop Cabinet and Power Supply MED Associates Inc SG-6080D https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) MED Associates Inc ENV-414S https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standard Fear Conditioning Chamber MED Associates Inc VFC-008 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Training protocol VFC.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Video Fear Conditioning Package for Rat MED Associates Inc MED-VFC-SCT-R https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/

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Verhalten Ausgabe 162 emotionales Gedächtnis Angstkonditionierung Angstinkubation Übertraining Einfrieren Kontextgedächtnis Cue-Speicher
Angst-Inkubation mit einem erweiterten Angst-Konditionierungsprotokoll für Ratten
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Acevedo-Triana, C., Rico, J. L., Ortega, L. A., Cardenas, M. A. N., Cardenas, F. P., Rojas, M. J., Forigua-Vargas, J. C., Cifuentes, J., Hurtado-Parrado, C. Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats. J. Vis. Exp. (162), e60537, doi:10.3791/60537 (2020).

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