Summary
우리는 쥐에 있는 과잉 훈련 그리고 공포 잠양을 생성하는 확장된 공포 조정 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 25톤 쇼크 페어링(즉, 과잉 교육)과 조건부 동결 응답의 비교와 함께 단일 교육 세션을 수반하며, 문맥 및 큐 테스트 중 48h(단기) 및 6주(장기)를 훈련후 수반합니다.
Abstract
정서적 기억은 주로 공포 조절 패러다임으로 연구되었습니다. 공포 컨디셔닝은 개인이 역경 사건과 그렇지 않으면 중립적 인 자극 사이의 관계를 배울 수있는 학습의 한 형태입니다. 정서적 기억을 공부하기 위한 가장 널리 이용된 절차는 쥐에 있는 공포 조정을 수반합니다. 이러한 작업에서, 무조건 자극 (미국)은 단일 또는 여러 세션에서 한 번 또는 여러 번 제시 된 풋 쇼크이며, 조건부 응답 (CR)은 동결된다. 이러한 절차의 버전에서, 라는 cued 공포 컨디셔닝, 톤 (조건된 자극, CS) 풋 쇼크와 쌍 (미국) 훈련 단계 동안. 첫 번째 테스트 중에 동물은 훈련이 일어난 것과 동일한 컨텍스트에 노출되며, 발충격과 톤이 없는 경우 동결 응답이 테스트됩니다(예: 컨텍스트 테스트). 두 번째 시험 동안, 동결은 문맥이 변경될 때 측정되며(예를 들어, 실험 챔버의 냄새와 벽을 조작하여) 발충격(즉, 큐 테스트)이 없는 상태에서 톤이 제시된다. 대부분의 공포 컨디셔닝 절차는 몇 가지 톤 쇼크 페어링을 수반한다 (예를 들어, 단일 세션에서 1-3 시험). 공포 인큐베이션 (즉, 공포 응답은 역경 이벤트 또는 조건된 자극에 추가 노출없이 시간이 지남에 따라 증가)라는 오래 지속되는 효과와 관련된 광범위한 수의 페어링 (즉, 과잉 교육)과 관련된 덜 일반적인 버전에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 확장된 공포 컨디셔닝 작업은 다른 심리적 현상(예: 외상 후 스트레스 장애)과의 관계를 포함하여 두려움 잠복기의 행동 및 신경 생물학적 측면의 이해에 핵심이 되었습니다. 여기에서, 우리는 쥐에 있는 과잉 훈련 그리고 공포 잠양을 생성하는 확장한 공포 조정 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 25톤 쇼크 페어링(즉, 과잉 교육)과 조건부 동결 응답의 비교와 함께 단일 교육 세션을 수반하며, 문맥 및 큐 테스트 중 48h(단기) 및 6주(장기)를 훈련후 수반합니다.
Introduction
메모리는 정보 수집, 통합(획득된 정보의 안정성 허용) 및 검색(통합 프로세스에 대한 증거) 등 다양한 단계를 포괄하는 심리과정입니다. 통합 단계에서는 새로운 시냅스 연결의 구축과 기존 연결 수정이 발생합니다. 이것은 이러한 변화에 대한 책임이있는 분자 및 생리적 사건이1,2에서발생하는 기간 동안의필요성을시사한다. 이러한 생리적 또는 분자 변화는 검색된 이벤트가 감정적으로 충전되는지 여부에 따라 달라집니다(즉, 정서적 기억). 예를 들어, 연구에 따르면 측면 핵 및 바소포측 편도체 복합체는 정서적 기억3,,4,5와5특히 관련이 있는 것으로 나타났다.
정서적 기억 현상은 주로 공포 컨디셔닝 패러다임5,,6로연구되었습니다. 공포 컨디셔닝은 개인이 역경 사건과 그렇지 않으면 중립적 인 자극7사이의 관계를 배울 수있는 학습의 한 형태입니다. 공포 컨디셔닝 패러다임은 편도체에 있는 분자, 세포 및 구조적인 변경을 생성합니다. 또한, 공포 컨디셔닝은 정서적 기억의 통합 및 검색 과정 동안 해마의 연결을 수정합니다.
공포 기억을 공부하기 위한 가장 일반적으로 사용되는 절차 중 하나는 쥐의 고전 (파블로비안) 컨디셔닝입니다. 이 절차는 일반적으로 발자국(미국)을 역경 자극으로 사용하며, 이는 하나 또는 여러 세션에서 한 번 또는 여러 번 전달됩니다. 이 절차에 노출된 쥐의 조절된 반응(CR)은 동결(즉, "호흡에 사용된 근육을 제외한 동물의 골격 근동의 일반화된 강장제 반응에 기인하는 일반화된부동성"). 이 응답은 컨텍스트 및 큐 테스트의 두 가지 유형에서 평가될 수 있습니다. 컨텍스트 테스트의 경우, 대상은 훈련 세션 중에 주어진 수의 풋쇼크를 겪은 다음 지정된 시간 동안 실험 챔버에서 제거됩니다. 시험 중에, 피험자는 훈련이 일어난 것과 동일한 맥락으로 반환되고, 동결의 다른 측정은 발자국(예: 기간, 백분율 또는 동결 에피소드의 빈도)의 부재에서 수집되고, 훈련 단계에서 확립된 기준 수준에 비해 수집됩니다. 두 번째 유형의 테스트, 큐 테스트의 경우, 자극(일반적으로 톤)은 훈련 단계(즉, 조건부 자극, CS)에서 풋쇼크와 결합된다. 훈련이 완료된 후, 동물은 정의된 시간 동안 훈련 컨텍스트에서 제거되고 수정된 컨텍스트(예: 벽과 다른 냄새가 다른 다른 실험 챔버)에 배치됩니다. 큐는 지정된 횟수를 제시하고 큐에 대한 동결 응답을 측정하고 훈련 중에 수집된 기준 수준에 비해 비교됩니다. 이 패러다임의 가장 일반적인 버전은 단일 교육 세션 동안 1~ 3톤의 톤 쇼크 페어링을 사용하고, 컨텍스트 및 큐 테스트가 몇 시간 또는 며칠 후에 수행되었습니다.
다른 덜 자주 구현 된 공포 컨디셔닝 절차는 종종 초과 훈련 절차8이라고불리는 광범위한 충격 큐 페어링 (즉, 예 : 예 : 예 : 예 : 예 : 예 : 예 : 시험)을 포함합니다. 이러한 작업에 대한 관심이 증가하는 것은 공포 인큐베이션(즉, 조건부 공포 응답이 시간이 지남에 따라 증가)99,10,,11에관한 것이다. 이러한 과잉 훈련 절차의 예로는 10개 세션에 걸쳐 배포된 100개의 톤 쇼크 페어링의 교육 단계가 수반되며, 그 다음에는 48시간 및 30일 후11,,12일 후에 실시된 컨텍스트 및 큐 테스트가뒤따릅니다. Maren (1998)은 며칠 에 걸쳐 광범위한 교육 확산을 피하기 위해 25 개의 페어링8과함께 단일 세션에서 과잉 교육을 확립하고 최적화 할 수 있다고보고했습니다. 잠복기 효과는 훈련 후 31 일 테스트 쥐에 조건부 공포의 상당히 높은 수준에서 입증된다, 후 테스트 쥐에 비해 48 시간. 확장된 공포 조절 작업은 다른 심리적 현상(예를 들어, 지연된 발병 후 외상 후 스트레스 장애)과의 관계를 포함하여, 근본적인 공포 잠복의 근본적인 행동 및 신경생물학적 측면의 이해를 위한 열쇠가 되었습니다 (예를 들어, 지연된 개시 후 외상 후 스트레스 장애)11,,12,,13.
여기에서, 우리는 쥐에 있는 과잉 훈련 그리고 공포 잠양을 유도하는 확장한 공포 조정 프로토콜을 기술합니다. 교육11의며칠을 필요로 다른 패러다임과 는 달리, 현재 프로토콜은 단일 교육 세션8에초점을 맞추고있다. 우리는 25 톤 충격 쌍을 사용하여 48 h 후에 실시 된 테스트와 비교하여 교육 후 6 주 동안 진행된 컨텍스트 및 큐 테스트 중에 더 높은 조건부 동결 응답을 생성했습니다.
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Protocol
다음 프로토콜은 Fundación Universitaria 콘라드 로렌츠 (IACUC-KL)의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 국제동물권연맹(1989년)이 발행한 동물권 의 보편적 선언과 ICLAS가 발행한 동물 실험의 윤리적 원칙이 존중되었다.
1. 주제 준비
- 남성 성인 위스타 쥐(n = 12)를 선택합니다. 교육 및 테스트 프로토콜이 시작되기 전에 3 일간의 적응을 위해 케이지 당 4 명으로 구성된 그룹으로 보관하십시오. 실험 기간 내내 쥐에게 물을 무료로 이용할 수 있도록 하십시오. 12h 의 밝은 어두운 주기 (07:00 h에서 켜진 조명)에서 20 °C에서 25 °C 사이의 실온을 제어하십시오.
참고 : 쥐 균주는 공포 컨디셔닝 중에 차등 성능을 보였다. 예를 들어, Schaap et al. (2013)는 Wistar와 루이스 균주가 폰 후드와 브라운 노르웨이 쥐12에비해 동결 행동의 더 긴 기간을 보였다고보고했다. 따라서 통증과 열 임계값의 차이는 충격의 강도와 지속 시간을 조정하기 위해 평가되어야합니다. - 매일 같은 시간에 제한된 음식 접근을 제공함으로써 쥐를 무상 급식 무게 (350-400g 사이의 정상 체중)에서 85 %로 유지하십시오. 가벼운 주기 동안 같은 시간에 매일 쥐의 무게. 확장 된 공포 컨디셔닝 교육이 시작되기 3 일 전에 광고 lib 무게 (100 % 무게)를 계산합니다.
참고: 본 실험에 사용된 동물은 여기에서 보고되지 않는 추가 기악 시험에서 시험되었습니다. 추가 검사를 위해서는 식량 박탈이 필요했습니다. 이 절차 적 변화는 기악 공포 결합 테스트의 잠재력을 시사하기 때문에 현재 절차의 범위를 확장 할 가능성이 있다고 가정됩니다. 그러나, 두려움 컨디셔닝 테스트를 사용 하 여 연구 음식 박탈을 필요로 하지 않습니다. - 다음 그룹 중 하나에 피사체를 무작위로 할당합니다: 훈련 후 6주 간의 정서적 테스트(n = 6); 정서적 테스트 48 훈련 후 h (n = 6).
- 어두운 빛 주기의 광상 동안 유사한 시간에 훈련 및 테스트를 수행합니다. 동일한 실험 챔버에 동물을 할당하고 훈련 및 테스트 하는 동안 동물의 동일한 순서를 유지 합니다.
참고: 구현될 수 있는 추가 제어는 훈련 및 테스트 단계에서 동물의 순서를 재조정하는 것입니다. 다중 그룹을 평가하거나 실험 전반에 걸쳐 다른 작업이 적용될 때 이 기술을 사용하여 동작에 대한 작업 순서의 가능한 효과를 줄이는 것이 좋습니다.
2. 장치 설정 및 충격 보정
- 실험 챔버와 스테인레스 스틸 그리드 바닥의 모든 내부 표면을 10 % 에탄올로 청소하십시오. 각 동물을 테스트하기 전에 반복합니다.
- CPU, 제어 캐비닛, 적외선, 역경 자극기/스크램블러, 충격 강도 교정기 등 장비를 USB 케이블을 사용하여 컴퓨터에 장비를 연결하고 동결 감지 시스템 장비를 시작합니다.
참고 : 이 프로토콜은 시판되는 악기(재료의 표)를사용하여 실행되었지만 다른 브랜드의 장비 및 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 이 장치는 플라스틱 포혈로 덮인 나무 상자에 내장 된 내부 아크릴 사각형 챔버 (29.53cm x 23.5 cm x 20.96 cm, 실험 챔버라고함)로 구성됩니다. 외부 도어를 사용하면 사운드, 노이즈 또는 라이트(상자 도어 감쇠)를 분리할 수 있습니다. 카메라는 외부 도어의 내부 부분에 측면으로 배치됩니다. 바닥 금속 그리드 (36 스테인레스 스틸 막대, 각각 3mm 직경및 간격 8mm, 중앙) 내부 아크릴 상자는 풋 쇼크 배달을 허용합니다. 내부 측면 벽 중 하나에 스피커는 청각 단서를 제시하기 위해 바닥에서 6cm입니다. - 충격 강도 교정기(예: 양수 및 음수 커넥터)의 빨간색 및 검은색 클립을 그리드 플로어의 두 개의 다른 막대에 연결합니다. USB 케이블을 컴퓨터의 해당 포트에 연결합니다. 빨간색과 검은색 클립을 다른 막대로 구분된 막대에 연결해야 합니다.
참고: 이 섹션에서는 재료 표에 언급된 특정 장비 브랜드를 사용하여 충격 강도 교정 프로세스를 설명합니다. 그러나, 교정 공정은 다양한 장비 브랜드를 사용하여 수행될 수 있다. 일관되는지 확인하기 위해 그리드 바닥의 세 가지 섹터에서 충격의 강도를 보정하는 것이 좋습니다. 또한, 충격의 전달 시 간섭을 피하기 위해 그리드 바닥에서 항상 배설물 및 소변 잔류물을 제거한다. - 충격 강도 교정기 소프트웨어(재료표)를시작합니다. 범위 화살표를 클릭하여 응용 프로그램에서 1.0 mA의 강도를 선택합니다. 그런 다음 실행/중지 스위치를 실행으로 변경합니다.
참고 : 우리는 공포 컨디셔닝33,,34,35의연구에 적합한 0.75 mA에서 1.5 mA에 범위를보고 우리의 실험실및 문학에서 설치류 모델과 우리의 연구를 기반으로 1.0mA를제안한다. - 역경 자극기 또는 풋쇼크를 전달하는 데 사용되는 장비를 켜고 응용 프로그램 패널에 표시된 충격 강도를 살펴보십시오. 필요한 경우, 비버 자극기의 손잡이를 사용하여 강도를 1.0 mA로 조정합니다.
참고: 역경 자극기는 실험을 적절하게 테스트, 보정 및 실행하려면 "OUT"로 설정해야 합니다.
3. 동결 감지 시스템 교정
- 실험 챔버와 사운드 감쇠 상자 문을 닫습니다. 동결 검출 시스템 교정이 완료된 후 챔버에 배치되기 때문에 이 시점에서 동물을 소개하지 마십시오. 상자 내부의 빛의 강도가 20~30럭스 사이인지 확인합니다.
- 동결 감지 시스템 소프트웨어를 시작하고 실험 설정 대화 창을 엽니다. 각 주제의 세부 정보(예: 제목 식별 번호, 날짜 및 그룹)를 입력하고 http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ"교육 프로토콜 VFC.pro"(http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ 사용 가능)라는 제목의 파일을 로드합니다.
참고: 컨텍스트 및 큐 테스트는 다른 프로그램 구성을 사용합니다. 따라서 각 테스트에서 올바른 파일을 사용해야 합니다. 이 시점에서 올바른 파일은 "교육 프로토콜 VFC.pro"에 해당합니다. 테스트 단계 중에는 해당 파일이 교육 세션과 다를 수 있습니다. - 해당 카메라(들)를 선택하고 비디오 저장 옵션(필요한 경우)을 확인합니다. 모션 임계값을 100으로 설정하고 최소 동결 지속 시간을 30프레임으로 설정합니다.
참고: 이 모션 임계값은 사용된 종의 크기(픽셀 수 기준)를 기반으로 합니다. 최소 동결 기간 값은 제조업체에서 권장합니다. 이러한 값은 챔버에서 동물의 적절한 인식을 보장하기 위해 사용된다. - 선택한 카메라의 라이브 피드가 모션 임계값 그래프 및 학습 중에 표시되는 다른 자극의 타임라인과 함께 화면에 나타나는지 확인합니다(예: 사운드 및 충격).
참고: 다른 브랜드를 사용하여 장비 설정은 동물의 움직임을 측정하여 동물이 움직이거나 동결되는 시간에 대한 비교를 허용해야 하는 모션의 "인덱스"를 감지할 수 있는 가능성을 제공해야 합니다. 또 다른 가능성은 (실험 중 또는 실험 후) 동물이 운동 또는 동결에있는 시간의 양을 감지 할 수있는 소프트웨어를 사용하는 것입니다, 이러한 무료 소프트웨어 ImageFZ13,Matlab에서 오픈 소스 도구 상자14,또는 JAABA15로동물 행동의 무료 분류. - 모션 인덱스가 100(임계값) 미만으로 유지되어 있는지 확인하면서 교정 옵션을 세 번 클릭합니다. 그런 다음 화면의 해당 버튼을 클릭하여 장비를 잠글 수 있도록 설정합니다.
참고: 이 섹션에서는 재료 표에 나열된 특정 장비 브랜드를 사용하여 동결 감지 시스템 교정 프로세스에 대해 설명합니다. 앞서 언급했듯이, 교정 공정은 다양한 장비 브랜드를 사용하여 수행될 수 있다(장비 및 소프트웨어의 다양한 옵션 검토를 위해 Anagnostaras 등. 2010 참조)16.
4. 확장 공포 컨디셔닝 교육
- 동물 보호 시설에서 실험실의 행동 훈련실까지 천으로 덮인 집 새장에 있는 쥐를 수송합니다. 동물을 행동 훈련실에 운반하는 동안 소음이나 스트레스 발생 조건에 노출되지 마십시오. 여러 동물이 동시에 수송되는 경우, 실험 제어를 향상시키기 위해 보유 실에서 다른 쥐를 테스트하고 유지하도록 동물을 데려. 훈련을 시작하기 전에 동물을 2 분 동안 부드럽게 처리하십시오.
참고: 프로토콜에서 동물은 행동 훈련 전에 매일 2 분 동안 처리되었습니다. 취급에 따라, 동물은 실험 챔버에 소개되었다. 우리는 쥐가 연구원에게 습관화할 수 있도록 동물을 조작하는 것이 좋습니다. - 실험 챔버에 쥐를 소개합니다. 꼬리의 밑으로 부드럽게 처리하고 챔버의 중간에 놓습니다. 실험 챔버와 사운드 감쇠 상자 문을 닫습니다.
- 레코드 버튼을 클릭하여 세션을 시작합니다. 쥐가 3 분 동안 챔버에 적응하게하십시오. 이 3 분 기간은 장비 제조업체가 권장하는 표준이며 챔버에 대한 기준 및 습관 시간 역할을합니다.
- 세션 의 분 3에서 시작 60 의 시험 간 간격 (ITI)와 스물 다섯 톤 쇼크 페어링 (시험)을 제공합니다. 각 ITI의 마지막 10s 동안 톤(조건부 자극 – CS; 90 dB SPL, 2000Hz, 50-ms Rise Time)과 각 ITI의 마지막 2s 동안 충격(무조건 자극 – 미국)을 제시한다.
참고: 녹화 버튼의 활성화는 카메라가 제대로 보정되고 잠겨 있는 조건부입니다. - 28분 세션이 끝나면 실험챔버에서 쥐를 제거합니다. 동물을 각각의 홈 케이지로 돌려놓습니다. 행동 훈련실에서 동물 보호 시설로 천으로 덮인 집 새장에 있는 쥐를 수송합니다.
- 모든 피사체를 훈련시키기 위해 동결 감지 시스템 교정(3.1-3.5단계) 및 공포 조절(4.1 단계 및 4.3단계)을 반복합니다.
참고: 각 동물의 감지 시스템을 다시 보정하여 동결 감지에 대한 정보를 처리할 때 소프트웨어가 동일한 매개 변수를 유지하도록 하는 것이 좋습니다. - 휴식 기간: 이 기간 동안, 동물들이 집 새장에서 개별적으로 쉬게 하십시오. 인큐베이션 기간 의 6 주 동안 일주일에 두 번 동물의 무게를 모니터링합니다. 각 동물을 가중치가 있는 동안 2분 동안 부드럽게 조작합니다.
5. 컨텍스트 테스트 – 단일 10 분 세션
- 훈련 단계 후, 컨텍스트 테스트라는첫 번째 메모리 테스트에 동물을 노출. 이 10 분 단계 동안, 훈련이 일어났지만 단서 또는 충격을 제시하지 않는 동일한 맥락에 쥐를 노출. 동물 보호 시설에서 행동 훈련실로 덮인 집 새장에 있는 쥐를 운반합니다(예: 천으로). 동물이 그룹으로 나뉘어져 있었고, 따라서 한 그룹은 훈련 단계 후 48h를 테스트하고 다른 그룹은 훈련 후 6 주 동안 테스트된다(그림 1참조).
그림 1: 실험 의 타임라인입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 실험 챔버와 스테인레스 스틸 그리드 바닥의 모든 내부 표면을 10 % 에탄올로 청소하십시오. 각 동물을 테스트하기 전에 반복합니다.
- 반복 동결 감지 시스템 교정(단계 3.1 ~ 3.5). 실험 설정 대화 창을 열고 http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ "컨텍스트테스트 protocol.pro"라는 파일을 로드합니다.
참고: 이 파일에는 충격이나 톤이 없는 이 실험 단계에 대한 설정이 포함되어 있습니다. - 실험 챔버에 동물을 소개합니다. 꼬리의 밑으로 부드럽게 처리하고 챔버의 중간에 놓습니다. 실험 챔버와 사운드 감쇠 상자 문을 닫습니다.
- 레코드 버튼을 클릭하여 세션을 시작합니다. 이 단일 10분 컨텍스트 테스트 세션 동안 자극이 표시되지 않습니다(충격없음 사운드).
- 10분 세션이 끝나면 실험챔버에서 피사체를 제거합니다. 동물을 각자의 새장에 돌려보내 서 덮인 집 새장에 있는 쥐를 행동 훈련실에서 동물 보호 시설로 이송합니다. 모든 과목을 테스트하기 위해 5.2-5.5 단계를 반복합니다.
6. 큐 테스트 – 단일 13 분 세션
- 컨텍스트 테스트 후 하루, 동물이 큐 테스트라는 메모리의 두 번째 테스트를 받아야한다. 이 단계 동안, 쥐 는 13 분 동안 훈련의 다른 컨텍스트에 있을 것입니다.; 신호(톤)가 표시되지만 충격은 전달되지 않습니다. 동물 보호 시설에서 행동 훈련실로 덮개로 덮인 집 새장에 있는 쥐를 수송합니다. 공포 컨디셔닝 훈련 후 그룹 72h를 테스트하고, 훈련 후 6주 및 1일 다른 그룹을 테스트한다(그림1).
참고: 동물 보호 시설에서 실험실에 이르기까지 다른 교통 시스템을 구현하여 더 많은 맥락과 큐 테스트를 차별화할 수 있습니다. 동물들이 홈 케이지의 교육 세션 및 컨텍스트 테스트 세션으로 이송되었기 때문에 큐 테스트 세션으로 가는 동안 다른 운송 케이지, 침구 및/또는 덮개를 사용할 수 있습니다. - 실험 챔버와 스테인레스 스틸 그리드 바닥의 모든 내부 표면을 10 % 에탄올로 청소하십시오. 각 동물을 테스트하기 전에 반복합니다.
- 시각적 컨텍스트를 변경하려면 주변 플라스틱 벽을 실험 챔버에 삽입합니다.
- 후각 컨텍스트를 변경하려면 면기울면에 1% 아세트산을 적용하고 그리드 플로어17,,18,,19아래의 금속 트레이에 놓습니다.
- 동결 감지 시스템 교정을 반복합니다(단계 3.1-3.5). 파일 "큐 테스트 protocol.pro" 파일을 로드하며, http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
참고: 이 파일에는 훈련 단계(CS) 동안 제시된 동일한 톤의 전달로 구성된 이 실험 단계에 대한 설정이 포함되어 있지만 충격이 없는 경우(미국). - 실험 챔버에 동물을 소개합니다. 꼬리의 밑으로 부드럽게 처리하고 챔버의 중간에 놓습니다. 실험 챔버와 사운드 감쇠 상자 문을 닫습니다.
- 레코드 버튼을 클릭하여 세션을 시작합니다. 단일 13분 큐 테스트 세션에서 CS 자극(tone)은 세션의 분 3에서 시작하여 10회 제시됩니다.
참고: 처음 3분은 이 세션의 기준선에 해당하며, 충격이 없는 경우 50s ITI로 전달된 10개의 큐 테스트 시험(즉, 각각 10초)이 전달됩니다. 이전에 로드된 파일을 사용하여 톤 전달은 자동으로 수행됩니다. - 13분 세션이 끝나면 실험실에서 동물을 제거합니다. 동물을 각 케이지로 돌려보내 동물 보호 시설로 운반하십시오. 6.2에서 6.5단계를 반복하여 모든 피험자를 테스트합니다.
7. 데이터 분석
- 동결 감지 시스템 소프트웨어를 사용하여 비디오 스트림에서 파생되는 일반 활동 지수(즉, 모션 인덱스)를 가져옵니다. 이 소프트웨어는 자동으로 모션 인덱스를 변환하여 세션당 동결 시간 의 백분율과 에피소드 동결 수를 제공합니다. 동결 임계값을 시스템의 기본 최소 동결 기간 설정(1 s = 30 프레임)으로 설정합니다.
- 추가 사용자 지정 프로그램(http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ에서 사용할 수 있는 파일)을 사용하여 다음을 얻습니다.
- 프로그램을 사용하여 교육 세션의 처음 3분 동안 동결 비율을 결정합니다(즉, 기준 동결, 충격이나 톤이 3분 기간 전에 또는 그 기간 동안 제시되지 않았기 때문에) 및 큐 테스트 세션의 처음 3분 동안.
- 이 프로그램을 사용하여 교육 세션의 83분 쓰레기통각각에 대한 동결 비율을 결정합니다.
- 이 프로그램을 사용하여 큐 프리젠 테이션 (즉, 톤 동안 동결) 및 무큐 기간 (심방 간 간격) 동안 동결의 비율을 결정합니다. IT) 교육 및 큐 테스트 세션 모두에 대해.
- 이러한 데이터를 얻으려면 동결 감지 시스템 소프트웨어를 엽니다.
- 파일 선택 | 보고서 | 일괄 구성 요소 요약입니다.
- 확장이 있는 파일을 선택합니다. cMP는 http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ 사용할 수 있습니다.
- 출력 파일의 이름을 지정하고 모션 임계값을 100으로 변경합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
- 분석할 파일을 선택합니다(확장. 원시). 이러한 파일은 세션이 끝나면 동결 감지 시스템 소프트웨어에서 자동으로 생성되며 각 세션의 원시 데이터에 해당합니다. 처음에는 파일이 컴퓨터의 바탕 화면에 저장되지만 사용자 지정 폴더(예: 문서-공포 컨디셔닝)에 저장하여 후속 식별 및 열이 필요할 때 쉽게 저장할 수 있습니다.
- 출력 파일 열기(확장. CSV). 추가 분석을 위해 스프레드시트 소프트웨어에서 편집할 수 있습니다. 이 파일에는 실험 세션 중에 동결 된 결과가 포함되어 있습니다.
참고: 전체 동결 비율을 얻으려면 총 세션 시간 동안 피사체가 움직이지 않는 시간을 나눕니다. 동결 에피소드 의 수는 세션을 통해 동결 이벤트의 수를 계산할 수 있습니다. 두 경우 모두 최소 동결 지속 시간을 기반으로 모션 임계값을 정의해야 합니다. 이것은 동결 에피소드가 기록되는지 여부를 정의하는 시간적 기준입니다. 자동 기록 시스템은 최소 동결 지속 시간을 측정하기 위해 초당 일정량(fps)을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 샘플 속도가 30fps인 경우 최소 동결 지속 시간이 15프레임으로 기록되어 30프레임에 대한 비동동성 인스턴스가 동결됩니다.
- 각 세션(교육 및 테스트, 컨텍스트 및 큐 모두)의 각 동결 에피소드의 평균 기간을 총 동결 기간(초 단위로)을 동결 에피소드 총 수에 분할하여 계산합니다.
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Representative Results
트레이닝 세션의 상이한 단계에서 동결 시간의 백분율의 변화는 부양t 테스트(표1)를사용하여 모든 과목(n=12)에 대해 분석하였다. 동물은 훈련 세션의 첫 3 분 동안 실험 챔버를 탐색하고 (프로토콜의 첫 날), 어떤 톤이나 충격이 전달되지 않는 시간 (즉, 기준선-BL). 도 2A에도시된 바와 같이, 후속 25톤 쇼크페어링(M = 48.88) 동안 동결 시간의 백분율; SE = 4.37)은BL(M = 14.65) 동안보다 현저히 높았다. SE = 4.05), 이는 공포 획득의 표시로 가정된다.
| 통계 테스트 | 그림 | 단계 | ||
| 종속 t 테스트 | 2a | t (11) = -6.21, p & .001, d = 2.34 | ||
| 3분 쓰레기통 | ||||
| 반복조치 ANOVA | 2B | F (3.75, 41.32) = 11.19, p & .001,θ p2 = .50. | ||
| 단계 | 그룹 | 단계 X 그룹 | ||
| 혼합 된 아노바 | 2C | F (3, 30) = 14.21, p & .001, θp2 =.58 | F (3, 30) = 4.63, p & .05, θp2 =.31 | F (1, 10) = 2.06, p >.05, θp2 =.17 |
| 편도 아노바 | 3a | F (1, 10) = 6.91, p & .05, θp2 =.40 | ||
| 편도 아노바 | 3B | F (1, 10) = 10.30, p & .05, θp2 =.50 | ||
| 편도 아노바 | 3c | F (1, 10) = 5.83, p & lt; 05, θp2 =.36 | ||
| 혼합 된 아노바 | 4A | F (2, 20) = 29.28, p & .001, θp2 =.74 | F (2, 20) = 2.33, p >.05, θp2 =.18 | F (1, 10) = 2.14, p >.05, θp2 =.17 |
| 혼합 된 아노바 | 4B | F (1, 10) = 1.53, p >.05, θp2 =.13 | F (1, 10) = 3.98, p & .05, θp2 =.28 | F (1, 10) = .23, p >.05, θp2 =.02 |
| 혼합 된 아노바 | 4C | F (1, 10) = 25.43, p & .001, θp2 =.71 | F (1, 10) = 6.17, p & .05, θp2 =.38 | F (1, 10) = .22, p >.05, θp2 =.02 |
표 1: 데이터 분석에 사용되는 통계입니다. 도 2A의경우, 훈련 세션의 첫 3분 동안 모든 피험자(n=12)의 동결의 평균 백분율(기준선, BL에 해당)은 세션의 나머지 25분 동안 동결의 백분율(25톤 쇼크 예심)과 비교하였다 상당한 차이 및 큰 효과 크기(Cohen'sd = 2.34). 도 2B의경우, 반복측정ANOVA 테스트(BL 및 83분 쓰레기통)에서 큰 차이를 보이는 3분의 쓰레기통에서 비교가 수행되었다. 도 2C의경우, 기준선(BL, 트레이닝 세션의 처음 3분), 트레이닝 기간(25톤-충격 페어링), 컨텍스트 테스트 세션 및 큐 테스트 세션 동안 각 쥐그룹의 동결 평균 비율 간의 비교는 대상자 간 요인(48시간 또는 6주)을 가진 혼합 ANOVA를 통해 수행되었으며, 그 내 피험자 들 단계(BL, 훈련, 맥락 테스트 및 큐 테스트)를 고려하였다. 단계 및 그룹의 차이점이 있지만 상호 작용 단계*그룹에서는 그렇지 않은 것이 발견되었습니다. 그림 3A – 3B는 활동에 대한 데이터(패널 3A, 모션 인덱스), 동결(패널 3B, 초 단위로 동결) 및 에피소드 지속 시간(패널 3C, 에피소드 가 몇 초 만에 동결됨)을 보여 주어 있습니다. 이러한 데이터는 모든 측정에서 그룹 간의 차이를 나타내는 단방향 ANOVA를 사용하여 분석되었습니다. 마지막으로, 도 4A–4C혼합 ANOVA는 각 패널(A, B 및 C)에 대해 수행되었으며, 사이 피험자 요인 그룹(48시간 또는 6주)과 피험자 내 계수 단계(BL, 교육, 컨텍스트 테스트 및 큐 테스트)를 계로 하였다.
그림 2: 확장 된 cued 공포 컨디셔닝 프로토콜의 훈련 단계. 데이터는 동결 응답의 평균(막대) 및 SEM(오류 막대)으로 표시됩니다. (A)모든 과목(n=12)의 평균 동결 비율을 나타내며, 훈련 세션의 첫 3분 동안 충격이나 톤이 제시되지 않았으며(기준선, BL), 및 나머지 25분 세션(25톤 쇼크 시험, 25톤 쇼크 시험, 임상간 간격, ITI, 60초); = BL(p & .001)과 다릅니다. (B)3분 기준 기간(BL, 충격 또는 톤 전달 없음) 및 훈련 세션의 후속 3분 쓰레기통 동안 모든 동물(n=12)의 평균 동결 시간을 나타낸다. = 나머지 모든 쓰레기통(p< .001)과 다릅니다.p (C)기준선(BL, 훈련 세션의 처음 3분), 트레이닝 기간(25톤 충격 페어링), 컨텍스트 테스트 세션 및 큐 테스트 세션 동안 각 쥐 그룹의 동결(훈련 후 48시간 테스트, 훈련 후 6주 시험)의 평균 백분율을 나타낸다. * = 48 h(평균 diff컨텍스트 = -34.95, SE = 14.99, p & .05, 코헨의 d = 1.34) 후 테스트와 다릅니다. a = 훈련 기간과 다른(평균 diffTraining48h = 42.51; SE = 7.28; p < .05; 코헨의 d = 3.03); b = 트레이닝 기간과 는 다른(평균 diff트레이닝6Weeks = 25.94; SE = 7.28; p < .05; 코헨의 d = 1.77), 컨텍스트 테스트(평균 diffContext6Weeks = 50.36; SE = 10.58; p < .01; 코헨의 d = 3.13), 및 큐 테스트(평균 diffCue6Weeks = 55.86; SE = 10.25; p < .01; 코헨의 d = 2.47). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
취득 기간 동안 동결 반응에 대한 분석은 83분 쓰레기통(그림2B)으로교육 세션을 분할하여 수행하였다. 이러한 데이터는 이 응답에 할당된 평균 시간이 처음 세 가지 톤 쇼크 시험(즉, Bin 1)에서 거의 또는 180초에 도달한다는 것을 보여줍니다. 이 발견은 이전 연구에서 과잉 훈련의 표시를 고려하고있다11. 반복 측정 ANOVA는 큰 효과 크기(표 1 및 표 2)와기준선과 모든 후속 쓰레기통 사이의 일관된 중요한 차이를 밝혔다.
| 비교 | 평균 차이 | 표준 오류 | p 값 | 코헨의 d |
| 빈 기준선 vs 빈 1 | -60.075* | 12,243 | & .05 | 1.95 |
| 빈 기준선 vs 빈 2 | -69.053* | 16,220 | & .05 | 1.89 |
| 빈 기준선 대 빈 3 | -66.197* | 13,706 | & .05 | 1.91 |
| 빈 기준선 vs 빈 4 | -68.595* | 11,969 | & .05 | 2.08 |
| 빈 기준선 대 빈 5 | -65.475* | 10,991 | & .05 | 2.15 |
| 빈 기준선 vs 빈 6 | -65.795* | 13,509 | & .05 | 2.06 |
| 빈 기준선 vs 빈 7 | -72.900* | 12,231 | & .05 | 2.53 |
| 빈 기준선 vs 빈 8 | -78.633* | 8,692 | & .001 | 3.37 |
표 2: 그림 2B에서3분 빈에 대한 평균 차이, 표준 오류 및 효과 크기. 이 표는 기준선 빈과 각 후속저장소(그림 2B)의비교를 보여 주었습니다. 평균 차이, 표준 오차 및 p-값및 코헨의 d는 이러한 차이의 크기(효과 크기)의 인덱스로 보고됩니다.
혼합 ANOVA는 과제 중 동결 비율의 차이를 테스트하기 위해 실시되었으며, 주제 내 인자 및 그룹(48h 및 6주)으로서 단계(BL, 교육, 컨텍스트 테스트 및 큐 테스트)를 주체 계수 계수(표1)로갖는 것이다. 훈련 기간 동안 모든 동물의 동결 비율은 기준 기간 동안보다 상당히 높았다(그림 2C참조). 메모리 테스트 중 동결 비율과 훈련기간(p>.05) 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
두 그룹(48h 및 6주)의 차이는 BL, 훈련 및 큐테스트(ps> .115; 그림 2C참조)에서 동결의 백분율로 관찰되지 않았다. 반대로, 훈련 후 6주 간 테스트된 동물은 48h에서 테스트된 동물보다 문맥 테스트 중에 동결비율이 현저히 높은 것으로 나타났으며, 큰 효과 크기(그림 2C참조). 전반적으로, 그림 2C는 장기 지연 컨텍스트 및 큐 테스트 (즉, 훈련 후 6 주) 훈련 세션 동안보다 전반적으로 상당히 높았다는 것을 보여줍니다. 반대 감소 추세는 훈련 후 48 h를 테스트 한 동물의 그룹에서 관찰되었다. 그러나, 48h의 그룹에서 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(ps > .05). 마지막으로, 동결 수준은 다른 단계에 걸쳐 차이를 보였지만 다른 프로토콜에 비해 낮은 것으로 간주 될 수 있습니다. 한 가지 설명은 교정 과정에서 설정된 실험실 또는 모션 인덱스 임계값 간의 고유한 방법론적 차이일 수 있으므로 실험실 간의 데이터를 비교하기가 어려울 수 있습니다.
컨텍스트 테스트 중 두 그룹의 조건부 동결 반응은 다른 측정값, 즉 평균 활동(즉, 모션 인덱스), 에피소드당 총 동결 시간 및 동결 시간을분석하여 더욱 탐구하였다. 이러한변수(표 1)에서차이를 테스트하는 데 단방향 ANOVA가 사용되었습니다. 훈련 후 6주 후에 시험된 피험자의 활동은 훈련 세션(그림 3A)이후 48h를 테스트한 동물보다 현저히낮았다. 이에 따라, 훈련 직후 테스트된 동물의 총 동결 시간은 6주후(도 3B)보다현저히 낮았다. 마지막으로, 각 동결 에피소드의 평균 지속 시간을 분석한 결과, 훈련 후 6주 간 테스트된 동물은 훈련 후 48h를 테스트한 동물보다 더 긴 동결 에피소드를나타냈다(그림 3C). 전부, 이 사실 인정은 공포 잠복기 효력을 표시합니다.
그림 3: 쥐의 동결 반응에 확장 된 cued 공포 컨디셔닝 프로토콜의 효과.
데이터는 동결 응답의 평균(막대) 및 SEM(오류 막대)으로 표시됩니다. (A)각 과목 그룹의 활동(즉, 모션 인덱스)을 컨텍스트 테스트 중에(훈련 후 48시간 테스트, 훈련 후 6주 테스트)를 나타낸다. * = 6 주에서다른. (B)문맥 시험 중 각 피험자의 평균 총 동결 시간(초)을 나타낸다; * = 6 주에서다른. (C)문맥 시험 중 각 피험자 집단에 대한 각 동결 에피소드(초)의 평균 지속시간을 나타낸다. * = 6 주에서만 다릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
큐 테스트 세션 중 성능에 대한 추가 검사는 기준 기간(BL 트레이닝 및 BL Cue Test) 및 전체 10분 큐 테스트(10개의 톤 프리젠테이션 및 50s- 그림 4A)동안 동결비율(A) 백분율을 분석하여 수행하였다. (b) 50s 간 심방 간격(ITI; 즉,,) 50s 간 간격 동안 (b) 큐(tone)의 10s 프리젠테이션 동안, 트레이닝 및 큐 테스트 세션(도4B)및 (c) 평균 동결 시간(초)에 대해, 노톤 기간만 – 그림 4C). 혼합 ANOVA는 이러한 각 종속 측정값을 분석하여 단계(BL 훈련, BL 큐 테스트 및 큐 테스트)를 피험자 인자 및 그룹(48시간 및 6주)을 과목 계수로 가정하는 데 사용되었다(표1). groups 그림 4A에나타난 바와 같이, 훈련 후 6주 동안 테스트된 쥐군은 CUE 테스트 세션의 기준선(BL Cue Test; 세션의 처음 3분) 및 BL 훈련(즉, 톤 및 충격에 노출되기 전)과 비교하여 10분 큐 테스트 중 동결 비율을 크게 증가시켰습니다. BL 훈련과 BL 큐 사이의 유사 차도 48h(p > .05) 후에 시험된 쥐의 단에 대해 관찰되지 않았다. 쥐의 두 그룹에 대 한, 10 분 큐 테스트 동안 동결의 백분율 은 동일한 세션의 해당 기준 기간 동안 보다 높았다 (BL 큐 테스트), 검색 효과 제안. 다른 기간에 걸쳐 동결의 비율에 쥐의 그룹 사이에 차이가 관찰되지 않았다(ps > .05).
도 4B는 트레이닝(톤 쇼크 페어링) 및 큐 테스트(톤 프레젠테이션만)에서 10s 톤 프레젠테이션 동안 평균 동결 시간(초)을 비교합니다. 만 쥐 테스트 6 훈련 후 주 크게 큐 동안 동결 시간의 양을 증가.
마지막으로, 도 4C에도시된 바와 같이, 훈련 후 48h를 테스트한 쥐군만이 훈련 세션에서 큐 테스트까지 ITI 동안 동결 시간을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다. ITI 기간 동안 동결 시간에 차이가 쥐의 두ps 그룹에 걸쳐 관찰되지 않았다 (ps>.05).
그림 4: 큐 테스트 중 응답을 동결하는 데 대한 확장된 공포 컨디셔닝 프로토콜의 효과입니다.
데이터는 동결 응답의 평균(막대) 및 SEM(오류 막대)으로 표시됩니다. (A)훈련 세션(BL, 기준선) 첫 3분 동안 각 피험자(훈련 후 48시간 테스트, 훈련 후 6주 시험)의 동결 비율을 나타내며, 큐 테스트 세션(BL Cue)의 첫 3분 및 큐 테스트(Cue Test)의 10분; a = 48h 후 큐 테스트와 다른(평균 diffBLTraining-Cue48h = 32.84; SE = 10.25; p < .05; 코헨의 d = 1.52); b = BL 큐 테스트와 는 다른(평균 diffBLCue-BL6Weeks = 33.98; SE = 8.36; p < .05; 코헨의 d = 1.59) 및 큐 테스트(평균 diff큐-BL6Weeks = 55.86; SE = 10.25; p < .05; 코헨의 d = 2.47); c = 48h 후 큐 테스트와 다른(평균 diffBLCue-Cue48h = 18.99; SE = 5.17; p < .05; 코헨의 d = .67); d = 6 주 후 큐 테스트와 다른(평균 diffBLCue-Cue6Weeks = 21.87; SE = 5.17; p < .05; 코헨의 d = .88). (B)훈련 및 큐 테스트 동안 각 과목 그룹의 큐(tone) 동안 평균 동결 시간(초)을 나타낸다; * = 큐 테스트 기간 동안 6 주와 다른(평균 diff훈련 -Cue6Weeks = -3.14; SE = 1.37; p < .05; 코헨의 d = 1.64). (C)훈련 세션(10톤 쇼크 페어링)과 큐 테스트(10톤 전용 프리젠테이션)의 심방 간격(ITI) 동안 쥐의 두 그룹(48h 및 6주)의 평균 동결 시간(초)을 나타낸다. = 훈련 후 48h를 테스트한 쥐 의 그룹에 대한 훈련과 는 다른(평균 diff트레이닝-Cue48h = 506.16; SE = 95.08; p < .001; 코헨의 d = 2.48). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
현재 확장된 공포 조절 프로토콜은 짧고(48시간) 및 장기 기간(6주)에 걸쳐 정서적 기억을 평가하는 효율적이고 타당한 방법입니다. 따라서, 프로토콜은 쥐에 있는 과잉 훈련 및 공포 잠복기 현상을 공부할 수 있습니다. 이 프로토콜의 다른 장점 중 에는 다음과 같습니다. 컨텍스트 및 큐 조작에 걸쳐 두 지연(48시간 및 6주)의 차등 효과를 식별할 수 있는 두 가지 유형의 메모리 테스트(즉 컨텍스트 및 큐)를 제공합니다. 둘째, 이 작업은 28분 간의 교육 세션을 수반하며, 이는 몇 주 연장되는 장기적인 효과를 생성합니다. 이 장점은 확장 된 공포 컨디셔닝의 일부 버전이 훈련11의10 세션에서 적어도 100 충격이 필요하다는 점을 고려하면 놀랍습니다. 셋째, 프로토콜은 자동으로 계산되는 몇 가지 측정 대안을 제공합니다. 또한, 정서적 기억 현상을 평가하기 위한 이 패러다임의 타당성을 뒷받침하는 약리학, 생리학적 및 해부학적 증거가 탑재되어 있다15,,16.
짧은 교육 세션 (즉, 몇 가지 시험)을 가진 다른 공포 컨디셔닝 패러다임과 비교하여 과잉 훈련 효과를 초래하는 확장 된 프로토콜은 덜 주의를 기울였습니다. 그러나, 확장된 공포 조절 작업은 다른 심리적 현상(예를 들어, 지연된 개시 후 외상후 스트레스 장애)과의 관계를 포함하여 공포 인큐베이션의 근본적인 행동 및 신경 생물학적 과정의 이해에 핵심이 되어 왔다11,,12,,13. 현재의 공포 조절 프로토콜은 공포 의자 배양을 안정적으로 생성합니다. 이는 훈련 후 6주 후에 평가된 동물의 높은 동결 시간 및 하부 운동 지수로 입증되며, 훈련 후 48시간 동안 테스트된 동물과 비교하면 됩니다. 또한, 이 효과는 각 테스트 유형에서 차별화된 것으로 관찰될 수 있다. 특히, 문맥 테스트 중 더 긴 동결 에피소드 6 훈련 후 주 및 큐 프리젠 테이션 동안 동결에 증분 6 훈련 후 주 6 주. 이러한 후자의 효과(즉, 훈련 후 6주 동안 동결의 증분)과 관련해서는 같은 세션 중 기준 동결 수준이 후속 큐 프리젠테이션 보다 현저히 낮았기 때문에 실험 상황(즉, 새로운 문맥)의 참신함을 버릴 수 있는 것으로 보인다.
공포 학습을 향한 추세는 두 그룹 (즉, 3 분 기준선과 훈련 사이의 차이)에서 분명했지만, 48 h (컨텍스트) 및 72 h (큐) 후에 테스트 된 동물은 두 테스트 동안 동결 수준에 상당한 차이를 나타내지 않았습니다. 이는 48h 그룹에서 높은 행동 변동성의 결과로 보이는 프로토콜의 제한으로 간주될 수 있습니다(그림 2C참조). 가변성을 줄이고 절차를 개선하기 위해 구현할 수 있는 방법론적 변화는 일부 공포 컨디셔닝 절차에서 흔히 볼 수 있는 교육 후 24h의 문맥 및 큐 테스트를 수행하는 것입니다.
본 프로토콜은 임상연구(23)에적용될 수 있다. 그 구현에서 유래 강한 메모리 추적 및 인큐베이션 효과 정기적으로 심리적 및 정신 병리 치료에 사용 하는 약물의 효과 테스트 할 수 있습니다 (예를 들어, 완화 또는 기분 조절 치료24)정서적 메모리 현상에 (예를 들어, 공포 소멸)25,,26,,27. 이와 같이 프로토콜은 신경 전달 물질 및 메모리 유지 보수와 관련된 분자와 같은 생물학적 상관 관계를 포함하여 다른 시간 프레임에 걸쳐 메모리 추적에 대한 약물의 영향을 측정 할 수 있습니다28,,29. 프로토콜은 또한 공포 패러다임이 종21,,22에걸쳐 공포에 대한 행동 치료30의 전임상 모델과 비교 연구를 테스트하는 데 유용 할 수 있음을 제안했다 번역 관점연구를위한 관련성이 있을 수 있습니다. 마지막으로, 신경생물학적 관점에서, 본 프로토콜은 뇌 메커니즘, 구조 간 통신, 네트워크 또는 신경 앙상블 간의 장기적인 습득, 정서적 기억의 통합 및 저장, 또는 개발 중 인큐베이션의효과(32)를연구하는 견고한 모델이다.
프로토콜의 다른 측면은 논의 할 가치가있다. 음식 박탈은 실험 내내 이용되었습니다. 이 결정은 식품 보상 (예를 들어, 작동 또는 기악 기술)에 기초한 그밖 행동 시험 (예를 들면, 작동또는 기악 기술)33,,34,,35는 현재 프로토콜을 더 다재다능한 기술 만들기, 최소 변경과 통합될 수 있기 때문에 채택되었습니다. 예를 들어 이 프로토콜을 휠 기반 운동 프로토콜 및 T-미로 메모리 작업과 성공적으로 통합했습니다. 또 다른 측면은 이 프로토콜에서 구현된 그룹 크기(n=6)와 관련이 있습니다. 비교적 작은 샘플이었으며 더 큰 샘플이 확실히 권장되지만 인큐베이션 효과의 크기는 이러한 제한을 보상합니다(표 1참조). 이는 특히 감소 원칙에 따라 동물 위원회의 권고사항에 관한 이 프로토콜의 이점으로 간주될 수 있습니다. 프로토콜의 제한은 발자국에 최소한의 또는 전혀 노출이 없고 공포 잠복기의 시간 과정은 평가되지 않았다는 것입니다. 이전 조건이 있는 추가 제어 그룹은 실험 설계의 엄격함을 증가시킬 수 있습니다.
이 프로토콜의 최상의 구현 및 결과에 대한 최종 권장 사항은 실험 챔버의 올바른 세척, 특히 그리드 바닥, 각 과목을 훈련하기 전에 충격 강도의 교정(예를 들어, 대변과 소변은 종종 챔버의 다른 영역에 걸쳐 충격 강도의 신뢰성을 감소) 및 동결 검출 시스템 교정 (동결 조치의 신뢰성은 모션 임계 값의 적절한 설정및 최소한의 동결 기간에 따라 달라집니다).
이 프로토콜은 쥐 또는 그밖 설치류의 그밖 긴장으로 시험될 수 있었습니다 (예를 들면, 마우스 또는 몽골 gerbils), 응용프로그램의 범위를 넓히는. 이러한 경우 충격 강도 및 동작 및 지속 시간 임계값을 조정하는 것이 중요합니다. 마우스를 이용한 공포 컨디셔닝 프로토콜에 사용되는 충격 강도는 전형적으로 0.4mA에서 1.5mA사이이며, 0.75mA는 종종 보고된 유효 강도16,,36,,37,38 및1.5mA에서 가장 높은 보고 강도39를보고한다. 몽골 게르빌은 공포 컨디셔닝 연구를 위해 덜 자주 선택되는 설치류 모델입니다. 그러나 몽골 게르빌은 포유류40에서circadian 리듬을 모델링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 따라서, 현재의 프로토콜은 circadian 리듬과 정서적 기억 사이의 잠재적 인 관계를 연구하기 위해 구현 될 수있다, 둘 다 우울증과 같은 병리에 관련, 불안 또는 기분의 변경(41,,42). gerbils의 경우, 이 및 유사 역경 컨디셔닝 프로토콜에 대한 효과적인 충격 강도 범위는 1.0과 4.0 mA43,,44,,45,,46사이이다. 마지막으로,47로선택한 종에 따라 모션 및 지속 시간 임계값을 조정해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 이러한 임계값은 이동 추적 소프트웨어에 설정된 제한이며, 그 이상으로 동물 동작이 이동으로 등록되고 소프트웨어가 동결을 등록하는 아래입니다. 마우스와 게르빌을 갖는 역경 컨디셔닝 연구에서, 보고된 효과적인 운동 및 지속 시간 임계값은 각각30, 35로,25 및 30fps(즉, 최소 1s 부동성)입니다.35
역경 자극(풋쇼크)을 적절히 제어하려면 그리드 바닥의 모든 섹터가 동일한 강도를 제공해야 합니다. 일관되는지 확인하기 위해 그리드 바닥의 세 가지 섹터에서 충격의 강도를 보정하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 동물이 더 낮은 강도를 방출하는 상자의 장소로 이동하여 충격에 대한 노출을 줄이는 법을 배우는 것을 방지합니다. 보정결과 금속 그리드가 모든 섹터에서 동일한 강도를 제공하지 않는 것으로 나타나면 바닥에서 그리드를 제거하고 막대를 청소하고 챔버의 그리드를 교체합니다. 그리드 플로어는 역경 자극 장치에서 그리드 바닥으로 의 최상의 전기 전송을 보장하기 위해 챔버에 적절하게 삽입되어야 합니다.
동결 감지 시스템 카메라의 초점과 조리개는 제조업체에서 보정합니다. 그러나 추가 보정이 필요한 경우 포커스 링의 세트프를 느슨하게 하고 선명한 이미지가 달성될 때까지 조정한 다음 포커스 링의 세트를 조입니다. 제조업체는 렌즈 를 최대 열린 위치에 고정하는 것이 좋습니다. 이 설정을 달성하려면 오프닝 링의 흰색 점이 렌즈 배럴의 숫자 1.4와 정렬되어 있는지 확인합니다. 제조업체의 설명서를 참조 하는 것이 좋습니다. 카메라의 포커스를 조정한 경우 해당 소프트웨어를 사용하여 카메라 의 보정도 수행해야 합니다. 카메라 교정은 밝기, 게인 및 셔터를 조정해야 합니다. 카메라 교정 프로세스에 대한 정확한 지침은 제조업체의 설명서에 문의하는 것이 좋습니다.
결론적으로, 프로토콜은 단기 및 장기 기간에 걸쳐 정서적 기억을 테스트 할 수 있으며 장기 공포 인큐베이션을 생성합니다. 이 공포 인큐베이션 효과는 단일 세션 오버 트레이닝을 통해 생성되며, 이는 6주 후 컨텍스트 및 큐 테스트에서 효과를 보여줍니다. 이것은 강한 정서적 기억 추적을 제안한다. 현재 프로토콜은 쥐의 정서적 기억의 구성 요소를 탐구하는 효율적이고 유효한 접근 방식입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구에 대한 재정 지원은 Fundación Universitaria 콘라드 로렌츠에 의해 제공되었다 - 보조금 번호 9IN15151. 저자는 콘라드 로렌츠 대학의 커뮤니케이션 부서에 비디오, 특히 나탈리아 리베라와 안드레스 세라노 (프로듀서)를 녹화하고 편집하는 데 도움을 주셔서 감사합니다. 또한, 니콜 프폴러-사도프스키와 루시아 메디나는 원고에 대한 자신의 의견에 대한, 요한나 바레로, 코포라시온 대학 이베로 아메리카나에서 딘, 제도적 협력을 위해. 저자는 이해상충이 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid (ethanoic acid) | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid | ||
| Aversive Stimulation Current Package | MED Associates Inc | ENV-420 | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Contextual test protocol.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Cue test protocol.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Curved Wall Insert | MED Associates Inc | VFC-008-CWI | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Data processing.zip | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| NIR/White Light Control Box | MED Associates Inc | NIR-100 | |
| Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse | MED Associates Inc | ENV-005FPU-M | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Small Tabletop Cabinet and Power Supply | MED Associates Inc | SG-6080D | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) | MED Associates Inc | ENV-414S | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Standard Fear Conditioning Chamber | MED Associates Inc | VFC-008 | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Training protocol VFC.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Video Fear Conditioning Package for Rat | MED Associates Inc | MED-VFC-SCT-R | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
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