Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Страх Инкубации с использованием расширенного страх кондиционирования протокол для крыс

Published: August 22, 2020 doi: 10.3791/60537
Automatic Translation
1,6, 2, 2, 3, 3, 4, 2, 2, 2,5
1School of Psychology, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, 2Animal Behavior Laboratory, Fundación Universitaria Konrad Lorenz, 3Department of Psychology, Universidad de Los Andes, 4School of Veterinary Medicine, Animal Health Department, Universidad Nacional de Colombia, 5Department of Psychology, Troy University, 6Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Summary

Мы описываем расширенный протокол кондиционирования страха, который производит перетренированность и инкубацию страха у крыс. Этот протокол предполагает одну тренировку с 25 тон-шок пар (т.е. перетренированность) и сравнение условных ответов замораживания во время контекста и биток испытаний 48 ч (краткосрочные) и 6 недель (долгосрочный) после обучения.

Abstract

Эмоциональная память была в первую очередь изучены со страхом кондиционирования парадигм. Страх кондиционирования является одной из форм обучения, с помощью которого люди узнают отношения между aversive событий и в противном случае нейтральные стимулы. Наиболее широко используемые процедуры для изучения эмоциональных воспоминаний влечет за собой страх кондиционирования у крыс. В этих задачах, безусловный стимул (США) является footshock представлен один или несколько раз в течение одного или нескольких сессий, и условный ответ (CR) является замораживание. В версии этих процедур, называется cued страх кондиционирования, тон (условный стимул, CS) в паре с footshocks (США) во время фазы обучения. Во время первого испытания животные подвергаются воздействию того же контекста, в котором проходила тренировка, и ответы на замораживание проверяются при отсутствии footshocks и тонов (т.е. контекстного теста). Во время второго теста, замораживание измеряется, когда контекст изменяется (например, путем манипулирования запахом и стенками экспериментальной камеры) и тон представлен в отсутствие footshocks (т.е. тест кия). Большинство процедур кондиционирования страха cued подразумевали немногие спаривания тон-шок (например, 1-3 испытания в одной сессии). Растет интерес к менее распространенным версиям, включающим большое количество сопряжений (т.е. перетренированность), связанных с длительным эффектом, называемым инкубацией страха (т.е. реакции страха увеличиваются с течением времени без дальнейшего воздействия на аверсивные события или условные стимулы). Расширенные задачи по кондиционированию страха были ключом к пониманию поведенческих и нейробиологических аспектов инкубации страха, включая его связь с другими психологическими явлениями (например, посттравматическое стрессовое расстройство). Здесь мы описываем расширенный протокол кондиционирования страха, который производит перетренированность и инкубацию страха у крыс. Этот протокол предполагает одну тренировку с 25 тон-шок пар (т.е. перетренированность) и сравнение условных ответов замораживания во время контекста и биток испытаний 48 ч (краткосрочные) и 6 недель (долгосрочный) после обучения.

Introduction

Память – это психологический процесс, охватывающий различные этапы: сбор информации, консолидация (позволяет стабильность приобретенной информации) и поиск (доказательства процесса консолидации)1. На этапе консолидации происходит создание новых синаптических соединений и модификация уже существующих соединений. Это говорит о необходимости в течение периода времени, в течение которого молекулярные и физиологические события, ответственные за эти изменения происходят1,2. Эти физиологические или молекулярные изменения варьируются в зависимости от того, эмоционально ли полученные события заряжены или нет (т.е. эмоциональная память). Например, исследования показали, что боковое ядро и басотеральная миндалина комплекса особенно актуальны для эмоциональной памяти3,,4,5.

Эмоциональное явление памяти были в первую очередь изучены со страхом кондиционированияпарадигмы 5,6. Страх кондиционирования является одной из форм обучения, с помощью которого люди узнают отношения между aversive событий и иным нейтральным стимулов7. Парадигмы кондиционирования страха производят молекулярные, клеточные и структурные изменения в миндалине. Кроме того, кондиционирование страха изменяет связь гиппокампа во время консолидации и поиска процессов эмоциональной памяти.

Одной из наиболее часто используемых процедур для изучения воспоминаний страха является классическая (Павловская) кондиционирование у крыс. Эта процедура обычно использует footshock (США) в качестве aversive стимул, который поставляется один или несколько раз в течение одного или нескольких сессий. Условный ответ (CR) крыс, подвергшихся воздействию этой процедуры является замораживание (т.е. "обобщенная неподвижность, вызванная обобщенной тонизирующей реакцией скелетной мускулатуры животных, за исключением тех мышц, которые используются в дыхании"7 ). Этот ответ можно оценить по двум типам тестов: тесты контекста и сигнала. Для контекстного теста, предмет проходит определенное количество footshocks во время тренировки, а затем удаляется из экспериментальной камеры в течение определенного времени. Во время проверки предмет возвращается в тот же контекст, в котором проводилась подготовка, и различные меры замораживания собираются в отсутствие footshocks (например, продолжительность, процент или частота эпизодов замораживания), и по сравнению с базовыми уровнями, установленными на этапе обучения. Для второго типа теста, тест на биток, стимул (обычно тон) в паре с footshocks во время фазы обучения (т.е., условный стимул, CS). После завершения обучения животное удаляется из тренировочного контекста на определенное время и впоследствии помещается в измененный контекст (например, другая экспериментальная камера, которая имеет различные формы стен и разный запах). Затем сигнал представляется определенное количество раз, и замораживание ответы на кий измеряются и по сравнению с базовыми уровнями, собранными во время обучения. Наиболее распространенная версия этой парадигмы использует от 1 до 3 тон-шок пар во время одной тренировки, а затем контекст и биток тесты, проведенные несколько часов или несколько дней спустя.

Другие менее часто осуществляемые процедуры кондиционирования страха включают в себя большое количество ударных кий пар (т.е. испытаний), которые часто называются процедуры перетренированности8. Растущий интерес к этим задачам связан с их длительными и повышенными эффектами памяти, называемыми инкубацией страха (т.е. обусловленные реакции страха увеличиваются с течением времени в отсутствие дальнейшего воздействия на побочные события или условные стимулы)9,,10,11. Пример таких процедур перетренированности влечет за собой учебный этап из 100 тоном-шоковых пар, распределенных по 10 сессиям, за которыми следуют тесты контекста и сигнала, проведенные 48 ч и 30 дней спустя11,12. Чтобы избежать обширной подготовки распространяется в течение нескольких дней, Марен (1998) сообщил, что перетренированность может быть создана и оптимизирована в одну сессию с 25 пар8. Эффект инкубации проявляется в значительно более высоких уровнях кондиционированного страха у крыс, проверенных через 31 день после тренировки, по сравнению с крысами, тестируемыми 48 ч после. Расширенные задачи по кондиционированию страха были ключевыми для понимания поведенческих и нейробиологических аспектов, лежащих в основе инкубации страха, включая его связь с другими психологическими явлениями (например, задержкой начала посттравматического стрессового расстройства)11,12,13.

Здесь мы описываем расширенный протокол кондиционирования страха, который вызывает перетренированность и инкубацию страха у крыс. В отличие от других парадигм, которые требуют нескольких дней обучения11, текущий протокол ориентирован на одну тренировку8. Мы использовали 25 тон-шок пар для получения более высоких обусловленных замораживания ответов во время контекста и биток испытаний, проведенных через 6 недель после тренировки, по сравнению с тестами, проведенными 48 ч после.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Следующий протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Фонда Университета Конрада Лоренца (IACUC-KL). Соблюдались всеобщая декларация прав животных, изданная Международной лигой прав животных (1989 год), и этические принципы экспериментов с животными, изданные ICLAS.

1. Тема подготовки

  1. Выберите самцов взрослых крыс Wistar (n No 12). Разместите их в группах по четыре на клетку в течение трех дней акклиматизации, до начала обучения и тестирования протокола. Обеспечить крысы с бесплатным доступом к воде на протяжении всего эксперимента. Управление комнатной температурой от 20 до 25 градусов по Цельсию, под 12 ч светло-темного цикла (свет в 07:00 ч).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы штаммы показали дифференциальную производительность во время страха кондиционирования. Например, Schaap et al. (2013) сообщили, что штаммы Wistar и Lewis показали более длительную продолжительность замораживания поведения по сравнению с крысами Fawn Hooded и Brown Norway12. Таким образом, различия в боли и теплового порога должны быть оценены для корректировки интенсивности и продолжительности ударов.
  2. Поддерживайте крыс на 85% от их свободного кормления веса (нормальный вес между 350-400 г), предоставляя ограниченный доступ к пище в тот же час каждый день. Взвешивать крыс каждый день в один и тот же час во время светового цикла. Рассчитайте вес ad lib (100% веса) за три дня до начала расширенной тренировки по кондиционированию страха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, используемые в данном эксперименте, были протестированы на дополнительных инструментальных тестах, о которые здесь не сообщают. Для проведения этих дополнительных испытаний требуется лишение продовольствия. Предполагается, что такое процедурное изменение, что может расширить сферу действия настоящей процедуры, поскольку оно предполагает возможность проведения инструментальных комбинированных испытаний. Тем не менее, исследования, использующие только страх кондиционирования тесты не потребует лишения пищи.
  3. Случайно назначить предметы одной из следующих групп: эмоциональное тестирование через 6 недель после тренировки (n No 6); эмоциональное тестирование 48 ч после тренировки (n No 6).
  4. Выполняйте тренировки и тесты в аналогичные часы, во время светлой фазы цикла темного света. Назначьте животных в ту же экспериментальную камеру и поддерживать тот же порядок животных во время тренировки и тестирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный контроль, который может быть реализован, уравновешивает порядок животных на этапах обучения и тестирования. Мы рекомендуем использовать этот метод при оценке групп кратных или применении различных задач в ходе экспериментов, чтобы уменьшить возможное влияние заказа задач на поведение.

2. Установка аппарата и калибровка удара

  1. Очистите все внутренние поверхности экспериментальной камеры и пола сетки из нержавеющей стали 10% этанола. Повторите перед тестированием каждого животного.
  2. Подключите оборудование к компьютеру с помощью USB-кабеля и запустите оборудование системы обнаружения замораживания: процессор, контрольный кабинет, инфракрасный свет, аверсивный стимулятор/скремблер и калибровщик ударно-интенсивности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот протокол был выполнен с использованием коммерчески доступных инструментов(Таблица материалов), оборудование и программное обеспечение различных марок могут быть использованы. Аппарат состоит из внутренней акриловой квадратной камеры (29,53 см х 23,5 см х 20,96 см, называемая экспериментальной камерой), встроенной в деревянную коробку, покрытую пластиковой формией. Внешние двери позволяют изолировать звук, шум или свет (ослабления дверей коробки). Камера расположена поздняя во внутренней части внешней двери. Внутренний акриловый ящик с напольными металлическими сетками (36 стержней из нержавеющей стали, каждый диаметром 3 мм и расположенный 8 мм, от центра до центра) позволяет доставку ног. В одной из внутренне-боковых стен, динамик расположен 6 см от пола, чтобы представить слуховой кий.
  3. Подключите красные и черные зажимы калибратора интенсивности удара (т.е. положительные и отрицательные разъемы) к 2 любым по-разному стержням на поле решетки. Подключите USB-кабель к соответствующему порту компьютера. Убедитесь в том, чтобы подключить красные и черные клипы к барам, разделенным другим баром.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается процесс калибровки интенсивности удара с использованием конкретной марки оборудования, упомянутого в таблице материалов. Тем не менее, процесс калибровки может быть выполнен с использованием различных марок оборудования. Рекомендуется откалибровать интенсивность удара в трех секторах сетки пола, чтобы убедиться, что он соответствует. Кроме того, всегда удаляйте остатки фекалий и мочи с пола сетки, чтобы избежать помех во время доставки шока.
  4. Начало ударной интенсивности калибровочного программного обеспечения (Таблица материалов). Выберите интенсивность 1,0 мА в приложении, нажав на стрелку диапазона. Затем измените переключатель Run/Stop на Run.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы предлагаем 1.0 мA на основе наших исследований с моделями грызунов в нашей лаборатории и литературе, которая сообщает диапазоне от 0,75 мА до 1,5 мА как адекватные для исследований страха кондиционирования33,34,35.
  5. Включите аверсивный стимулятор или оборудование, используемое для доставки footshocks и посмотреть на интенсивность удара отображается на панели приложения. При необходимости отрегулируйте интенсивность до 1,0 мА с помощью ручки на аверсивном стимуляторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аверсивный стимулятор должен быть установлен на "OUT", чтобы надлежащим образом проверить, откалибровать и запустить эксперимент.

3. Калибровка системы обнаружения замораживания

  1. Закройте экспериментальные камерные и звукоустойные двери коробки. Не введите животное на данный момент, так как он будет помещен в камеру после калибровки системы обнаружения замерзания была завершена. Убедитесь, что интенсивность света внутри коробки составляет от 20 до 30 люкс.
  2. Запустите программное обеспечение системы обнаружения замораживания замораживания и откройте окно диалога настройки эксперимента. Введите сведения о каждом предмете (например, идентификационный номер субъекта, дата и группа) и загрузите файл под названием "Протокол обучения VFC.pro" (доступен по адресу http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тесты контекста и сигнала используют другую конфигурацию программы; таким образом, не забудьте использовать правильный файл на каждом тесте. На данный момент правильный файл соответствует "Протокол обучения VFC.pro". Помните, что на этапах тестирования соответствующий файл будет отличаться от тренировки.
  3. Выберите соответствующую камеру (ы) и проверьте опцию Сохранить видео (при необходимости). Установите порог движения до 100, а Мин Замораживание Продолжительность до 30 кадров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение порога движения основано на размере используемого вида (в зависимости от количества пикселей). Минимальное значение срока заморозки рекомендуется производителем. Эти значения используются для обеспечения надлежащего распознавания животного в камере.
  4. Убедитесь, что живой канал с выбранной камеры (ы) появляется на экране вместе с графиком порога движения и временной шкалой различных стимулов, которые представлены во время обучения (например, звук и шок).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя другой бренд, установка оборудования должна предлагать возможность измерения движений животного для обнаружения "индекса" движения, который должен позволить сравнения на количество времени животное движется или замораживания. Другая возможность заключается в использовании программного обеспечения, которое только с видео-источника (во время или после эксперимента) может обнаружить количество времени животное находится в движении или замораживания, таких как свободное программное обеспечение ImageF13, с открытым исходным кодом инструментарий в Matlab14, или свободный классификатор поведения животных, как JAABA15.
  5. Нажмите на опцию Calibrate три раза, проверяя, что индекс движения остается ниже 100 (порог). Затем установите оборудование для блокировки, нажав на соответствующую кнопку на экране.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается процесс калибровки системы обнаружения замораживания с использованием определенной марки оборудования, указанного в таблице материалов. Как уже упоминалось ранее, процесс калибровки может быть проведен с использованием различных марок оборудования (для рассмотрения различных вариантов в оборудовании и программном обеспечении см. Anagnostaras et al. 2010)16.

4. Расширенный страх кондиционирования подготовки

  1. Транспорт крыс в своих домашних клетках, покрытых тканью, от объекта по уходу за животными в поведенческий учебный зал в лаборатории. Избегайте воздействия шума или стресс-генерирующих условий во время транспортировки животных в поведенческий тренировочный зал. Если несколько животных перевозятся в то же время, только принести животных для тестирования и поддерживать других крыс в комнате для хранения для повышения экспериментального контроля. Аккуратно обращайтесь с животными в течение 2 минут перед началом тренировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе, животные были обработаны каждый день в течение 2 минут до поведенческих тренировок. После обработки, животные были введены в экспериментальной камере. Мы рекомендовали манипулировать животными, чтобы крысы привыкли к исследователю.
  2. Введите крысу в экспериментальную камеру. Обработайте его осторожно, по основанию хвоста и поместите его на середину камеры. Закройте экспериментальные камерные и звукоустойные двери коробки.
  3. Начните сеанс, нажав на кнопку Запись. Пусть крыса акклиматизироваться к камере в течение 3 минут. Этот 3-минутный период является стандартом, рекомендованным производителем оборудования и служит базовым и привычным временем для камеры.
  4. Доставка двадцать пять тон-шок пар (испытания) с 60-х Меж-Trial Interval (ITI), начиная с минуты 3 сессии. Представить тон (условный стимул - CS; 90 дБ SPL, 2000 Гц, 50-мс Время подъема) в течение последних 10 с каждого ITI, и шок (безусловный стимул - США) в течение последних 2 с каждого ITI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Активация кнопки Записи обусловлена правильной калибровкой и блокировкой камер.
  5. Удалите крысу из экспериментальной камеры, когда 28 мин сессии закончилась. Верните животных в соответствующую домашнюю клетку. Транспорт крыс в своих домашних клетках, покрытых тканью из поведенческой комнаты подготовки в учреждение по уходу за животными.
  6. Повторите калибровку системы обнаружения замораживания (шаги 3.1-3.5) и страх кондиционирования (шаги 4.1 и 4.3) для обучения всех субъектов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы настоятельно рекомендуем перекалибровать систему обнаружения для каждого животного, чтобы убедиться, что программное обеспечение поддерживает те же параметры, когда он обрабатывает информацию для обнаружения замораживания.
  7. Период отдыха: В течение этого периода, животные отдыхают индивидуально в своих домашних клетках. Мониторинг веса животных два раза в неделю в течение 6 недель инкубационного периода. Аккуратно манипулировать каждым животным в течение двух минут, пока они взвешены.

5. Контекстный тест - один 10 мин сессии

  1. После этапа обучения, подвергать животных первый тест памяти называется контекстный тест. Во время этой фазы 10 мин, подвергать крыс в том же контексте, в котором обучение состоялось, но не представляют сигналы или потрясений. Транспорт крыс в их крытых домашних клетках (например, с тканью) из центра по уходу за животными в комнату поведенческой подготовки. Имейте в виду, что животные были разделены на группы, таким образом, одна группа тестируется 48 ч после этапа обучения, а другая группа тестируется через 6 недель после тренировки (см. рисунок 1).

Figure 1
Рисунок 1: Хронология эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Очистите все внутренние поверхности экспериментальной камеры и пола сетки из нержавеющей стали 10% этанола. Повторите перед тестированием каждого животного.
  2. Повторите калибровку системы обнаружения замораживания (шаги от 3,1 до 3,5). Откройте окно диалога настройки Эксперимента и загрузите файл под названием "Контекстный тест protocol.pro", который доступен из http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот файл содержит настройку для этой экспериментальной фазы, которая не состоит из каких-либо ударов или тонов.
  3. Введите животное в экспериментальную камеру. Обработайте его осторожно, по основанию хвоста и поместите его на середину камеры. Закройте экспериментальные камерные и звукоустойные двери коробки.
  4. Начните сеанс, нажав на кнопку Запись. Во время этой одной 10-минутной сессии контекст-теста, никакие стимулы не представлены (шок ни звук).
  5. Удалите предмет из экспериментальной камеры, когда 10 мин сессии закончилась. Верните животных в соответствующие клетки и транспортите крыс в закрытых домашних клетках из поведенческого тренировочного зала в учреждение по уходу за животными. Повторите шаги 5.2-5.5 для проверки всех предметов.

6. Тест Cue - один 13 мин сессии

  1. На следующий день после контекстного теста, животные проходят второй тест памяти называется кий-тест. На этом этапе, крысы будут находиться в другом контексте подготовки в течение 13 минут.; сигналы (тоны) представлены, но никаких потрясений не доставляются. Транспорт крыс в своих домашних клетках, покрытых крышкой от объекта по уходу за животными в поведенческой комнате подготовки. Проверьте группу 72 ч после боя кондиционирования подготовки, и проверить другую группу 6 недель и один день после тренировки (Рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно было бы внедрить другую систему транспортировки (от учреждения по уходу за животными до экспериментальной комнаты), чтобы дифференцировать более контекст и тесты. Так как животные были доставлены на тренировку и сеанс контекстного тестирования в своих домашних клетках, во время транспортировки на тестовую сессию можно было использовать другую транспортную клетку, постельные принадлежности и/или покрытие.
  2. Очистите все внутренние поверхности экспериментальной камеры и пола сетки из нержавеющей стали 10% этанола. Повторите перед тестированием каждого животного.
  3. Чтобы изменить визуальный контекст, вставьте пластиковую окружающую стену в экспериментальную камеру.
  4. Чтобы изменить обонятельный контекст, нанесите 1% уксусную кислоту на тампон с наконечником хлопка и поместите его в металлический лоток ниже сетки17,,18,,19.
  5. Повторите калибровку системы обнаружения замораживания (шаги 3.1-3.5). Загрузите файл под названием файл "Cue test protocol.pro" файл, который доступен из http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот файл содержит настройку для этой экспериментальной фазы, которая состоит из доставки тех же тонов, представленных на этапе обучения (CS), но при отсутствии потрясений (США).
  6. Введите животное в экспериментальную камеру. Обработайте его осторожно, по основанию хвоста и поместите его на середину камеры. Закройте экспериментальные камерные и звукоустойные двери коробки.
  7. Начните сеанс, нажав на кнопку Запись. Во время одного 13 мин кий тест сессии, CS стимул (тон) представлен 10 раз, начиная с минуты 3 сессии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первые 3 мин соответствуют базовому уровню этой сессии, а затем 10 кий тестовых испытаний (то есть, 10 с каждый) поставляется с 50 С ITIs в отсутствие потрясений. Доставка тонов происходит автоматически, используя ранее загруженный файл.
  8. Удалите животное из экспериментальной камеры, когда 13 мин сессии закончилась. Верните животных в соответствующую клетку и транспортите их в учреждение по уходу за животными. Повторите шаги 6.2 через 6.5 для проверки всех предметов.

7. Анализ данных

  1. Получить индекс общей активности (т.е. индекс движения), полученный из видеопотока с помощью программного обеспечения системы обнаружения замораживания. Это программное обеспечение автоматически преобразует индекс движения, чтобы обеспечить процент времени замораживания за сеанс и количество эпизодов замораживания. Установите порог замораживания до параметра минимальной продолжительности замораживания по умолчанию (1 с 30 кадров).
  2. Используйте дополнительную пользовательскую программу (файл, доступный из http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ)для получения:
    1. Используйте программу для определения процента замораживания в течение первых трех минут тренировки (т.е. замораживание базового уровня, так как до или в течение этого 3-минутного периода не было представлено никаких потрясений или тонов) и в течение первых трех минут сеанса теста.
    2. Используйте программу, чтобы определить процент замораживания для каждого из восьми 3 мин бункеров тренировки.
    3. Используйте программу для определения процента замораживания во время презентаций биток (т.е. замораживания во время тонов) и периодов без кия (межпросердные интервалы; ITIs), как для обучения, так и для кий-тестов.
  3. Чтобы получить эти данные, откройте программное обеспечение системы обнаружения замораживания.
    1. Выберите файл Отчеты Пакет Компонент резюме.
    2. Выберите файл с расширением . CMP доступен с http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    3. Назовите выходной файл и измените порог движения на 100. Затем нажмите OK.
    4. Выберите файлы для анализа (расширение . СЫРОЙ). Эти файлы автоматически генерируются из программного обеспечения системы обнаружения замораживания, когда сеанс закончен, и соответствуют необработанным данным каждой сессии. Первоначально файлы сохраняются на рабочем столе компьютера, но они могут храниться в пользовательской папке (например, кондиционирование documents-Fear), чтобы облегчить их последующую идентификацию и открытие, когда они должны быть проанализированы.
    5. Откройте выходные файлы (расширение . CSV). Они могут быть отредактированы в программном обеспечении электронной таблицы для дальнейшего анализа. Этот файл содержит результаты замораживания во время экспериментальной сессии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить общий процент замораживания, разделите время, которое субъект провел неподвижно, за общее время сеанса. Количество эпизодов замораживания можно подсчитать, подсчитывая количество событий замораживания через сеанс. В обоих случаях необходимо определить порог движения на основе минимальной продолжительности замораживания. Это временный критерий, который определяет, регистрируется ли эпизод замораживания. Автоматизированные системы записи могут использовать определенное количество кадров в секунду (fps) в качестве меры минимальной продолжительности замораживания. Например, при частоте выборки 30 кадров в секунду минимальная продолжительность замораживания в 15 кадров будет записываться как замораживание экземпляра неподвижности, который длится 30 с.
  4. Рассчитайте среднюю продолжительность каждого эпизода замораживания для каждой сессии (обучение и оба теста, контекст и кий) путем деления общей продолжительности замораживания (в секундах) на общее количество эпизодов замораживания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Вариации в процентном соотношении времени замораживания на разных этапах тренировки были проанализированы по всем предметам (n No 12) с помощью зависимого теста т (Таблица 1). В течение первых трех минут тренировки (первый день протокола) животные были активны и исследовали экспериментальную камеру ( иссяка, то время, в течение которого не было доставлено ни тонов, ни ударов (т.е. базовый-BL). Как показано на рисунке 2A, процент времени замораживания во время последующих 25 тон-шок пар (M No 48,88; SE No 4,37) был значительно выше, чем во время BL( M No 14,65; SE No 4.05), что предполагается как признак приобретения страха.

Статистический тест Рисунок Этапов
Зависимый т Тест 2a t (11) -6.21, р-л; .001, d 2.34
3-мин бункеры
Повторные меры ANOVA 2B F (3,75, 41,32) - 11,19, стр.p2
Этапов Группы Фазы X Группа
Смешанные ANOVA 2C F(3, 30) 14.21, р-л; .001,п. 2 No 58 F(3, 30) 4,63, р-л; 0,05,п. 2 й.31 F(1, 10) ю 2,06, р-р2
АНОВА с односторонним путем 3a F(1, 10) 6,91, р-л; 0,05,п. 2 й.40
АНОВА с односторонним путем 3B F(1, 10) 10.30, р-л; 0,05,п. 2 й.50
АНОВА с односторонним путем 3c F(1, 10) 5,83, р-л;. 05,2 й.36
Смешанные ANOVA 4А F(2, 20) ю 29.28, р-л; .001,п. 2 No.74 F(2, 20) ю 2,33, р-р2 F(1, 10) ю 2,14, р-р2
Смешанные ANOVA 4b F(1, 10) 1,53, р-р2 F(1, 10) 3,98, р-л; 0,05,п. 2 й.28 F(1, 10) . . . . . . . .2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Смешанные ANOVA 4C F(1, 10) ю 25.43, р-л; .001,п. 2 No.71 F(1, 10) 6,17, р-л; 0,05,.2 й.38 F (1, 10) . . . . . . . .2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Таблица 1: Статистика, используемая при анализе данных. Для рисунка 2A, средний процент замораживания всех предметов (n No 12) в течение первых 3 минут тренировки (соответствующий базовому, BL) был по сравнению с процентом замораживания в течение оставшихся 25 минут сессии (25 тон-шок испытаний), показывающих значительную разницу и большой размер эффекта (Коэн в d No 2,34). Для рисунка 2B,сравнение было выполнено через бункеры 3 минуты, показывающие существенную разницу в повторных мер ANOVA тест (BL и восемь 3 мин бункеров). Для рисунка 2C, сравнения между средним процентом замораживания каждой группы крыс во время базового (BL, первые 3 минуты тренировки), период тренировки (25 тон-шок пар), сеанс испытания смысла, и тренировка сигнала испытание были дирижированы через Смешанный ANOVA с фактором между-субъектами группа (48 h или 6 неделей) и внутри-субъекты фактор фазы фазы (BL, Тренировка, Испытание и Испытание Cue). Были обнаружены различия в фазах и группе, но не в фазах взаимодействия. Рисунок 3A - 3B показывает данные о активности (панель 3A, индекс движения), замораживании (панель 3B, среднее замораживание в секундах) и продолжительности эпизодов (панель 3C, означает замораживание эпизодов в секундах). Эти данные были проанализированы с помощью односторонней ANOVA, которая указала различия между группами во всех измерениях. Наконец, для рисунка 4A - 4C для каждой панели (A, B и C), имея как между субъектами фактор группы (48 ч или 6 недель) и в пределах субъектов фактор фаз (BL, Обучение, Контекстный тест и Cue Test).

Figure 2
Рисунок 2: Фаза обучения расширенного протокола кондиционирования страха. Данные отображаются как среднее значение (бары) и SEM (бары ошибок) ответа на замораживание. (A) показывает средний процент замораживания всех предметов (n No 12) в течение первых 3 минут тренировки, в течение которых не было представлено никаких потрясений или тонов (базовый, BL), а остальные 25 мин сессии (25 тоном-шоковых испытаний, с межпрорным интервалом, ITI, 60 с); - отличается от BL(p q lt; .001). (B) показывает среднее время замерзания всех животных (n No 12) в течение 3 мин базового периода (BL, без ударов или тонов доставлены) и последующие 3 мин бункеров учебной сессии; - отличается от всех остальных бункеров(р-лт; .001). (C) показывает средний процент замораживания каждой группы крыс (тестирование 48 ч после тренировки; тестирование через 6 недель после тренировки) во время базового уровня (BL, первые 3 мины тренировки), период тренировки (25 тон-шоковых пар), сеанс тестирования контекста, и сеанс теста сигнала; - отличается от тестирования после 48 ч(средний диффКонтекст - -34,95, SE - 14,99, р-л; 0,05, Коэнский d 1,34); a - отличается от периода обучения(средний диффTraining48h 42.51; SE No 7,28; p Зтт; 0,05; Коэн в d No 3,03); b - отличается от периода обучения(средний диффTraining6Weeks 25,94; SE No 7,28; p Зтт; 0,05; Коэн в d No 1,77), контекстный тест(средний диффContext6Weeks ю 50,36; SE No 10,58; р Зтт; 0,01; Коэн в d No 3,13), и биток тест(средний диффCue6Weeks ю 55,86; SE 10,25; р Зтт; 0,01; Коэн в d No 2,47). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Анализ замораживания ответ на протяжении всего приобретения был проведен путем сегментации учебной сессии в восьми 3 мин бункеров (Рисунок 2B). Эти данные показывают, что среднее время, отведенное для этого ответа достигает бессимптомного вблизи или на 180 с в течение первых трех тон-шок испытаний (т.е., Бин 1). Этот вывод был рассмотрен в предыдущих исследованиях указанием перетренированности11. Повторные меры ANOVA выявили последовательные значительные различия между базовыми и всеми последующими ячейками с большими размерами эффекта(Таблица 1 и Таблица 2).

Сравнение Средняя разница Стандартная ошибка p значение Коэна d
Базовый уровень бин vs бен 1 -60.075* 12,243 Зтт; 0,05 1.95
Базовый уровень бин против бен 2 -69.053* 16,220 Зтт; 0,05 1.89
Базовый уровень бин vs бен 3 -66.197* 13,706 Зтт; 0,05 1.91
Бин базовый против бен 4 -68.595* 11,969 Зтт; 0,05 2.08
Бин базовый против бен 5 -65.475* 10,991 Зтт; 0,05 2.15
Бин базовый против бен 6 -65.795* 13,509 Зтт; 0,05 2.06
Бин базовый против бен 7 -72.900* 12,231 Зтт; 0,05 2.53
Бин базовый против бен 8 -78.633* 8,692 Зтт; .001 3.37

Таблица 2: Средняя разница, стандартная ошибка и размер эффекта для 3 мин бункеров на рисунке 2B. В этой таблице показаны сравнения между базовым беном и каждым из последующих ячеек(рисунок 2B). Средняя разница, стандартная ошибка и p-значениеи Коэн d сообщаются как индекс размера этих различий (размер эффекта).

Смешанный ANOVA был проведен для проверки различий в процентном соотношении замораживания во время задачи, имеющих фазы (BL, обучение, контекстный тест, и биток тест) в качестве внутриутспого фактора и группы (48 ч и 6 недель) в качестве фактора между субъектами(Таблица 1). Процент замораживания всех животных в течение учебного периода был значительно выше, чем в базовый период (см. рисунок 2С). Не наблюдалось существенных различий между процентом замораживания во время тестов памяти и учебным периодом(ps, 0,05).

Никаких существенных различий между двумя группами (48 ч и 6 недель) наблюдалось в процентном соотношении замораживания во время BL, обучение, и биток тест(рс йgt; .115; см. Рисунок 2C). И наоборот, животные, протестированные через 6 недель после тренировки, показали значительно более высокий процент замораживания во время контекстного теста, чем животные, протестированные на 48 ч, с большим размером эффекта (см. рисунок 2C). В целом, рисунок 2C показывает, что замораживание во время длительного задержки контекста и кий-тестов (т.е. 6 недель после тренировки) в целом было значительно выше, чем во время тренировки. Противоположная тенденция к снижению наблюдалась в группе животных, которые были протестированы 48 ч после тренировки. Тем не менее, эти различия в группе 48 ч не были статистически значимыми(ps; .05). Наконец, хотя уровень замораживания показал различия между различными этапами, их можно считать низкими по сравнению с другими протоколами. Одним из объяснений могут быть присущие методологические различия между лабораториями или порог индекса движения, установленный в процессе калибровки, что затрудняет сопоставление данных между лабораториями.

Условный ответ замораживания двух групп субъектов в ходе контекстного теста был дополнительно изучен с помощью анализа других показателей, а именно средней активности (т.е.индекса движения), общего времени замораживания и времени замораживания за эпизод. Для проверки различий по этим переменным(таблица 1)использовалась одностоятельная ANOVA. Активность предметов, которые были протестированы через 6 недель после тренировки, была значительно ниже, чем у животных, протестированных на 48 ч после тренировки(рисунок 3A). Соответственно, общее время замерзания животных, протестированных вскоре после тренировки, было значительно ниже, чем у животных, проверенных через 6 недель после(рисунок 3B). Наконец, анализ средней продолжительности каждого эпизода замораживания показал, что животные испытания 6 недель после тренировки отображается больше замораживания эпизодов, чем животные испытания 48 ч после тренировки (Рисунок 3C). В целом, эти выводы указывают на эффект инкубации страха.

Figure 3
Рисунок 3: Эффекты расширенного cued страх кондиционирования протокола на замораживание ответ крыс.
Данные отображаются как среднее значение (бары) и SEM (бары ошибок) ответа на замораживание. (A) показывает активность (т.е. индекс движения) каждой группы субъектов (тестирование 48 ч после тренировки; тестирование через 6 недель после тренировки) во время контекстного теста; - отличается от 6 недель. (B) показывает среднее общее время замораживания (в секундах) каждой группы испытуемых во время тестов контекста; - отличается от 6 недель. (C) показывает среднюю продолжительность каждого эпизода замораживания (в секундах) для каждой группы субъектов во время проверки контекста; - только отличается от 6 недель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Дальнейшее изучение производительности во время сеанса теста сигнала было проведено с помощью анализа (а) процент замораживания в базовые периоды (BL Training и BL Cue Test) и в течение всего 10-минутного теста сигнала (десять презентаций тон 10 с и десять ITIs 50 s - Рисунок 4A), b) среднее время замораживания специально во время 10 с презентаций кия (тон), как для обучения и Cue испытаний сессий(рисунок 4B), и (с) среднее время замораживания (в секундах) в течение 50 с межпросердных интервалов (ITIs; т.е., без тона периоды только - Рисунок 4C). Смешанный ANOVA был использован для анализа каждого из этих зависимых мер, предполагая фазы (BL Обучение, BL Cue Test, и Cue Test) в качестве фактора внутри субъектов и групп (48 ч и 6 недель) в качестве фактора между субъектами (Таблица 1). Как показано на рисунке 4A, группа крыс испытания 6 недель после тренировки значительно увеличили свой процент замораживания во время базовой сессии Cue Test (BL Cue Test; первые 3 мин сессии) и в течение 10 минут Cue Test, по сравнению с BL подготовки (т.е. до любого воздействия тонов и потрясений). Аналогичная разница между обучением BL и BL Cue не наблюдалась для группы крыс, протестированных после 48 ч(р-р; 0,05). Для обеих групп крыс, процент замораживания в течение 10 минут Cue Испытаний был выше, чем во время соответствующего базового периода той же сессии (BL Cue Test), который предлагает эффект поиска. Не наблюдалось различий между группами крыс в процентах от замораживания в разные периоды(ps

Рисунок 4B показывает сравнение среднего времени замораживания (в секундах) специально во время презентаций тона 10 s через Тренировку (пары тон-шока) и испытание Cue (только представления тона). Только крысы испытания 6 недель после тренировки значительно увеличило количество времени замораживания во время кия.

Наконец, как показано на рисунке 4C, только группа крыс испытания 48 ч после тренировки значительно снизилось время замораживания во время ITIs от тренировки к тесту Cue. Никаких различий в времени замораживания во время ITIs наблюдались в двух группах крыс(ps

Figure 4
Рисунок 4: Эффекты расширенного cued страх кондиционирования протокола на замораживание ответ во время теста кий.
Данные отображаются как среднее значение (бары) и SEM (бары ошибок) ответа на замораживание. (A) показывает процент замораживания каждой группы предметов (тестирование 48 ч после тренировки; тестирование 6 недель после тренировки) в течение первых 3 минут тренировки (BL, базовый уровень), первые 3 мин кия тестовой сессии (BL Cue) и 10 мин кий-тест (Cue Test); a отличается от теста Cue после 48 ч (средний диффBLTraining-Cue48h 32.84; SE 10,25; p Зтт; 0,05; Коэн в d No 1,52); b - отличается от BL Cue Test(средний диффBLCue-BL6Weeks - 33,98; SE 8,36; p Зтт; 0,05; Коэн в d No 1,59) и Cue испытаний(средний диффCue-BL6Weeks ю 55,86; SE 10,25; p Зтт; 0,05; Коэн в d No 2,47); c - отличается от Cue Test после 48 ч (средний диффBLCue-Cue48h 18.99; SE 5,17; p Зтт; 0,05; Коэн d .67); d - отличается от Cue Test после 6 недель (средний диффBLCue-Cue6Weeks 21,87; SE 5,17; p Зтт; 0,05; Коэн в d и .88). (B) показывает среднее время замерзания (в секундах) во время сигнала (тон) каждой группы предметов во время тренировки и испытания Cue; - отличается от 6 недель в течение испытательного периода Cue Test(средний диффОбучение-Cue6Weeks - -3.14; SE 1,37; p Зтт; 0,05; Коэн d No 1,64). (C) показывает среднее время замерзания (в секундах) во время межпроктовых интервалов (ITI) учебной сессии (10 тон-шоковых пар) и Cue Test (10 тон-только презентаций) через две группы крыс (48 ч и 6 недель); - отличается от обучения для группы крыс, проверенных 48 ч после тренировки(среднее диффОбучение-Cue48h 506.16; SE No 95.08; р Зтт; .001; Коэн в d No 2,48). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Нынешний расширенный протокол кондиционирования страха является эффективным и действенным подходом для оценки эмоциональной памяти в короткие (48 ч) и долгосрочные периоды (6 недель). Таким образом, протокол позволяет изучать перетренированность и страх инкубационных явлений у крыс. Среди различных преимуществ этого протокола следующие. Он предлагает два типа тестов памяти, а именно контекст и сигнал, которые позволяют определить дифференциальный эффект двух задержек (48 ч и 6 недель) в контексте и кий манипуляции. Во-вторых, эта задача предполагает проведение одной 28-минутной тренировки, которая, в свою очередь, дает долгосрочные последствия, которые продлеваются на несколько недель. Это преимущество примечательно, учитывая, что некоторые версии расширенного страха кондиционирования необходимо по крайней мере 100 потрясений через 10 сессий подготовки11. В-третьих, протокол предлагает несколько альтернатив измерения, которые рассчитываются автоматически. Кроме того, есть монтаж фармакологических, физиологических и анатомических доказательств, которые поддерживают обоснованность этой парадигмы для оценки явлений эмоциональной памяти15,16.

По сравнению с другими парадигмами, связанными с кондиционированием страха, с краткими учебными занятиями (т.е. несколькими испытаниями), расширенные протоколы, которые приводят к эффектам перетренированности, получили меньше внимания. Тем не менее, расширенные задачи по кондиционированию страха были ключом к пониманию страха инкубации основных поведенческих и нейробиологических процессов, в том числе его связь с другими психологическими явлениями (например, отсроченное посттравматическое стрессовое расстройство)11,12,13. Нынешний протокол кондиционирования страха надежно производит инкубацию страха. Это проявляется при более высоком времени замерзания и более низких индексах движения у животных, оцениваемых через 6 недель после тренировки, по сравнению с животными, проверенными на 48 ч после тренировки. Кроме того, этот эффект можно было наблюдать дифференцированно в каждом из типов теста; в частности, больше замораживания эпизодов во время контекстного теста 6 недель после обучения и шагом в замораживании во время сигнал презентации 6 недель после тренировки. В связи с этим последним эффектом (т.е. шагом в замораживании во время презентаций сигнала через 6 недель после обучения), представляется, что новизна экспериментальной ситуации (т.е. новый контекст) может быть отброшена, поскольку базовые уровни замораживания в течение той же сессии были значительно ниже, чем во время последующих презентаций.

Хотя тенденция к обучению страху была очевидна в обеих группах (т.е. различия между 3 мин базового уровня и подготовки кадров), животные, которые были протестированы после 48 ч (контекст) и 72 ч (ки) не проявляют значительных различий в уровне замораживания во время обоих тестов. Это можно считать ограничением протокола, который кажется результатом высокой поведенческой изменчивости в группе 48 ч (см. рисунок 2C). Методологическое изменение, которое может быть реализовано в целях уменьшения изменчивости и улучшения процедуры, заключается в проведении теста контекста и битка 24 ч после тренировки, что часто встречается в некоторых процедурах кондиционирования страха.

Настоящий протокол может быть применен в клинических исследованиях23. Сильный след памяти и инкубационный эффект, который является результатом его реализации может позволить проверить эффекты лекарств, регулярно используемых для лечения психологических и психиатрических патологий (например, анксиолитические или настроение регуляторов лечения24) на эмоциональной памяти явлений (например, страх вымирания)25,26,27. Протокол таким образом может позволить измерить влияние лекарств на след памяти через различные временные рамки, в том числе биологические корреляты, такие как нейротрансмиттеры имолекулы,связанные с поддержанием памяти28,29. Протокол также может быть актуальным для исследований с точки зрения перевода, который предложил, что парадигмы страха может быть полезным для тестирования доклинических моделей поведенческой терапии30 и сравнительных исследований по страху между видами21,22. Наконец, с нейробиологического взгляда, настоящий протокол представляет собой надежную модель для изучения механизмов мозга, связи между структурами, сетями или нейронными ансамблями, участвующими в долгосрочном приобретении, консолидации и хранении эмоциональной памяти, или последствиях инкубации во время разработки32.

Некоторые другие аспекты протокола заслуживают обсуждения. На протяжении всего эксперимента использовались лишения пищи. Это решение было принято потому, что другие поведенческие тесты, основанные на пищевых наградах (например, оперные или инструментальные методы)33,,34,35 могут быть интегрированы с минимальными изменениями, что делает нынешний протокол более универсальной техникой. Например, мы успешно интегрировали этот протокол с протоколами упражнений на основе колес и задачами памяти T-лабиринта. Другой аспект связан с размером группы (n'6), реализованным в этом протоколе. Хотя это была относительно небольшая выборка, и более крупные образцы, безусловно, рекомендуется, размер эффекта инкубации компенсирует это ограничение (см. таблицу 1). Это можно считать преимуществом этого протокола, особенно в отношении рекомендаций комитетов по животным, основанных на принципе сокращения. Ограничение протокола заключалось в том, что минимальные воздействия или отсутствие контакта с footshocks и время курса страха инкубации не были оценены. Дополнительная контрольная группа с досхуей может увеличить строгость экспериментальной конструкции.

Окончательные рекомендации по наилучшей реализации и результаты этого протокола включают правильную очистку экспериментальной камеры, особенно сетки пола, калибровка интенсивности удара перед тренировкой каждого предмета (например, кала и моча часто снижают надежность интенсивности удара в различных областях камеры) и калибровка системы обнаружения замерзания (надежность мер замораживания зависит от правильного установления порога движения и минимальной продолжительности замерзания).

Этот протокол может быть протестирован с другими штаммами крыс или других грызунов (например, мышей или монгольских песчаник), расширяя сферу применения. В этих случаях важно регулировать интенсивность удара, а также пороги движения и продолжительности. Интенсивность удара, используемая в протоколах кондиционирования страха с мышами, обычно колеблется от 0,4 мА до 1,5 мА, с 0,75 мА часто сообщается эффективная интенсивность16,36,37,38 и 1,5 мА самая высокая зарегистрированная интенсивность39. Монгольская песчанка является модель грызунов реже выбирают для страха кондиционирования исследований; однако, монгольские песчанки были успешно использованы для моделирования циркадных ритмов у млекопитающих40. Соответственно, текущий протокол может быть реализован для изучения потенциальных связей между циркадными ритмами и эмоциональной памятью, оба из них имеют отношение к таким патологиям, как депрессия, тревога или изменение настроения41,,42. В случае песчанки, эффективный диапазон интенсивности удара для этого и аналогичных аверсивных протоколов кондиционирования составляет от 1,0 до 4,0 мА43,,44,,45,46. Наконец, важно отметить, что пороги движения и продолжительности должны корректироваться в зависимости от выбранного вида47. Эти пороги являются ограничениями, установленными на программном обеспечении отслеживания движения, выше которых поведение животных регистрируется как движение, и ниже которых программное обеспечение регистрирует замораживание. В aversive кондиционирования исследований с мышами и песчанки, эффективное движение и продолжительность пороги сообщили были 25 и 30 кадров в секунду (т.е. минимум 1 с неподвижности), соответственно30,35.

Для обеспечения адекватного контроля аверсивной стимуляции (футшоков) все сектора сетки пола должны обеспечивать одинаковую интенсивность. Рекомендуется откалибровать интенсивность удара в трех секторах сетки пола, чтобы убедиться, что он соответствует. Это предотвращает животных от обучения, чтобы уменьшить воздействие потрясений, перемещаясь в место в коробке, которая испускает меньшую интенсивность. Если калибровка показывает, что металлическая сетка не обеспечивает одинаковой интенсивности во всех секторах, удалите сетку с пола, очистите стержни и замените сетку в камере. Пол сетки должен быть должным образом вставлен в камеру, чтобы обеспечить лучшую электрическую передачу от аверсивного устройства стимуляции на пол сетки.

Фокус и диафрагма камеры системы обнаружения замораживания откалибровываются производителем. Однако, если требуется дополнительная калибровка, ослабить setscrew на фокус-кольце, настроить до четкого изображения достигается, а затем затянуть setscrew на фокус кольцо. Производитель рекомендует заблокировать отверстие объектива в максимально открытом положении. Для достижения этой настройки убедитесь, что белая точка открываюющего кольца выравнивается с числом 1.4 на стволе объектива. Рекомендуется проконсультироваться с руководством производителя. Обратите внимание, что если фокус камеры был скорректирован, калибровка камеры с помощью соответствующего программного обеспечения также должна произойти. Калибровка камеры требует регулировки яркости, усиления и затвора. Рекомендуется проконсультироваться с руководством производителя для получения точных инструкций по процессу калибровки камеры.

В заключение, протокол позволяет проверить эмоциональную память в течение коротких и длительных периодов и производит долгосрочный инкубационный страх. Этот эффект страх-инкубации генерируется через односессионные перетренированность, которая показывает эффекты 6 недель спустя в контексте и биток испытаний. Это говорит о сильном эмоциональном следе памяти. Текущий протокол является эффективным и действительным подходом к изучению компонентов эмоциональной памяти у крыс.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Финансовую поддержку этому исследованию оказал Фонд университета Конрад Лоренц - грант No 9IN15151. Авторы хотели бы поблагодарить отдел коммуникаций Университета Конрада Лоренца за помощь в записи и редактировании видео, в частности, Наталью Риверу и Андреса Серрано (продюсеры). Кроме того, Николь Пфаллер-Садовский и Люсия Медина за свои комментарии по рукописи, и Johanna Барреро, декан Corporacion Universitaria Iberoamericana, для институционального сотрудничества. У авторов нет конфликта интересов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (ethanoic acid) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid
Aversive Stimulation Current Package MED Associates Inc ENV-420 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Contextual test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Cue test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Curved Wall Insert MED Associates Inc VFC-008-CWI https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Data processing.zip http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
NIR/White Light Control Box MED Associates Inc NIR-100
Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse MED Associates Inc ENV-005FPU-M https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Small Tabletop Cabinet and Power Supply MED Associates Inc SG-6080D https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) MED Associates Inc ENV-414S https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standard Fear Conditioning Chamber MED Associates Inc VFC-008 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Training protocol VFC.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Video Fear Conditioning Package for Rat MED Associates Inc MED-VFC-SCT-R https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nature Reviews Neuroscience. 6 (2), 119-130 (2005).
  2. Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, P. W., Kida, S. Activation of LVGCCs and CB1 receptors required for destabilization of reactivated contextual fear memories. Learning & Memory. 15 (6), 426-433 (2008).
  3. Hermans, E. J., et al. How the amygdala affects emotional memory by altering brain network properties. Neurobiology of Learning and Memory. 112, 2-16 (2014).
  4. Moryś, J., Berdel, B., Jagalska-Majewska, H., ŁUczyńSka, A. The basolateral amygdaloid complex -its development, morphology and functions. Folia Morphologica. 58 (3), 29-46 (1998).
  5. LeDoux, J. E. Emotional memory systems in the brain. Behavioural Brain Research. 58 (1-2), 69-79 (1993).
  6. Labar, K. S. Beyond fear: Emotional memory mechanisms in the human brain. Current Directions in Psychological Science. 16 (4), 173-177 (2007).
  7. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  8. Maren, S. Overtraining Does Not Mitigate Contextual Fear Conditioning Deficits Produced by Neurotoxic Lesions of the Basolateral Amygdala. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 3097-3097 (1998).
  9. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, Unit-6.27 (2013).
  10. Morrow, J. D., Saunders, B. T., Maren, S., Robinson, T. E. Sign-tracking to an appetitive cue predicts incubation of conditioned fear in rats. Behavioural Brain Research. 276, 59-66 (2015).
  11. Pickens, C. L., Golden, S. A., Adams-Deutsch, T., Nair, S. G., Shaham, Y. Long-lasting incubation of conditioned fear in rats. Biological Psychiatry. 65 (10), 881-886 (2009).
  12. Schaap, M. W. H., et al. Nociception and Conditioned Fear in Rats: Strains Matter. PLoS ONE. 8 (12), 83339 (2013).
  13. Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871 (2014).
  14. Patel, T. P., et al. An open-source toolbox for automated phenotyping of mice in behavioral tasks. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 349 (2014).
  15. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: Interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  16. Anagnostaras, S. G. Automated assessment of Pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the VideoFreeze system. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 4 (58), (2010).
  17. Moyer, J. R., Brown, T. H. Impaired Trace and Contextual Fear Conditioning in Aged Rats. Behavioral Neuroscience. 120 (3), 612-624 (2006).
  18. Schuette, S. R., Hobson, S. Conditioned contextual fear memory to assess natural forgetting and cognitive enhancement in rats. Journal of Biological Methods. 5 (3), 99 (2018).
  19. Chang, C. H., et al. Fear extinction in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 (SUPPL. 47) (2009).
  20. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, 1-18 (2013).
  21. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  22. Vetere, G., et al. Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice Article Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice. Neuron. 94 (2), 363-374 (2017).
  23. Koob, G. F., Zimmer, A. Chapter 9 - Animal models of psychiatric disorders. Neurobiology of Psychiatric Disorders. 106, 137-166 (2012).
  24. Bourin, M. Animal models for screening anxiolytic-like drugs: a perspective. Dialogues in clinical neuroscience. 17 (3), 295-303 (2015).
  25. Murray, S. B., et al. Fear as a translational mechanism in the psychopathology of anorexia nervosa. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 95, 383-395 (2018).
  26. Pamplona, F. A., et al. Prolonged fear incubation leads to generalized avoidance behavior in mice. Journal of Psychiatric Research. 45 (3), 354-360 (2011).
  27. Török, B., Sipos, E., Pivac, N., Zelena, D. Modelling posttraumatic stress disorders in animals. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 90, 117-133 (2019).
  28. Bhakta, A., Gavini, K., Yang, E., Lyman-Henley, L., Parameshwaran, K. Chronic traumatic stress impairs memory in mice: Potential roles of acetylcholine, neuroinflammation and corticotropin releasing factor expression in the hippocampus. Behavioural Brain Research. 335, 32-40 (2017).
  29. Uniyal, A., et al. Pharmacological rewriting of fear memories: A beacon for post-traumatic stress disorder. European Journal of Pharmacology. , 172824 (2019).
  30. Barad, M. Fear extinction in rodents: basic insight to clinical promise. Current Opinion in Neurobiology. 15 (6), 710-715 (2005).
  31. Haaker, J., et al. Making translation work: Harmonizing cross-species methodology in the behavioural neuroscience of Pavlovian fear conditioning. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 107, 329-345 (2019).
  32. Heroux, N. A., Horgan, C. J., Pinizzotto, C. C., Rosen, J. B., Stanton, M. E. Medial prefrontal and ventral hippocampal contributions to incidental context learning and memory in adolescent rats. Neurobiology of Learning and Memory. 166, 107091 (2019).
  33. Rossi, M. A., Yin, H. H. Methods for Studying Habitual Behavior in Mice. Current Protocols in Neuroscience. 60 (1), 8-29 (2012).
  34. Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant Procedures for Assessing Behavioral Flexibility in Rats. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  35. Zoccolan, D., Di Filippo, A. Methodological Approaches to the Behavioural Investigation of Visual Perception in Rodents. Handbook of Behavioral Neuroscience. , Elsevier B.V. (2018).
  36. Lguensat, A., Bentefour, Y., Bennis, M., Ba-M'hamed, S., Garcia, R. Susceptibility and Resilience to PTSD-Like Symptoms in Mice Are Associated with Opposite Dendritic Changes in the Prelimbic and Infralimbic Cortices Following Trauma. Neuroscience. 418, 166-176 (2019).
  37. Li, Q., et al. N-Acetyl Serotonin Protects Neural Progenitor Cells Against Oxidative Stress-Induced Apoptosis and Improves Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus Following Traumatic Brain Injury. Journal of Molecular Neuroscience. 67 (4), 574-588 (2019).
  38. Pantoni, M. M., Carmack, S. A., Hammam, L., Anagnostaras, S. G. Dopamine and norepinephrine transporter inhibition for long-term fear memory enhancement. Behavioural Brain Research. 378 (112266), 112266 (2020).
  39. Smith, K. L., et al. Microglial cell hyper-ramification and neuronal dendritic spine loss in the hippocampus and medial prefrontal cortex in a mouse model of PTSD. Brain, Behavior, and Immunity. 80, 889-899 (2019).
  40. Liu, X., Zheng, X., Liu, Y., Du, X., Chen, Z. Effects of adaptation to handling on the circadian rhythmicity of blood solutes in Mongolian gerbils. Animal Models and Experimental. 2 (2), 127-131 (2019).
  41. Landgraf, D., McCarthy, M. J., Welsh, D. K. The role of the circadian clock in animal models of mood disorders. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 344-359 (2014).
  42. Refinetti, R., Kenagy, G. J. Diurnally active rodents for laboratory research. Laboratory annimals. 52 (6), 577-587 (2018).
  43. Hurtado-Parrado, C., et al. Assessing Mongolian gerbil emotional behavior: effects of two shock intensities and response-independent shocks during an extended inhibitory-avoidance task. PeerJ. 5, (2017).
  44. Frey, P., Eng, S., Gavinf, W. Conditioned suppression in the gerbil. Behavior Research Methods & Instrumentation. 4 (5), 245-249 (1972).
  45. Woolley, M. L., Haman, M., Higgins, G. A., Ballard, T. M. Investigating the effect of bilateral amygdala lesions on fear conditioning and social interaction in the male Mongolian gerbil. Brain Research. 1078 (1), 151-158 (2006).
  46. Ballard, T. M., Sänger, S., Higgins, G. a Inhibition of shock-induced foot tapping behaviour in the gerbil by a tachykinin NK1 receptor antagonist. European Journal of Pharmacology. 412 (3), 255-264 (2001).
  47. Luyten, L., Schroyens, N., Hermans, D., Beckers, T. Parameter optimization for automated behavior assessment: plug-and-play or trial-and-error. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8 (28), (2014).

Tags

Поведение Выпуск 162 эмоциональная память страх кондиционирования страх инкубации перетренированность замораживание контекст памяти кий памяти
Страх Инкубации с использованием расширенного страх кондиционирования протокол для крыс
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Acevedo-Triana, C., Rico, J. L.,… More

Acevedo-Triana, C., Rico, J. L., Ortega, L. A., Cardenas, M. A. N., Cardenas, F. P., Rojas, M. J., Forigua-Vargas, J. C., Cifuentes, J., Hurtado-Parrado, C. Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats. J. Vis. Exp. (162), e60537, doi:10.3791/60537 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter