Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Liposomen und wie diese auf einer Oberfläche immobilisiert und mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie massiv parallel abgebildet werden können. Dies ermöglicht die Quantifizierung der Größe und der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen der Population.
Abstract
Die meisten Forschungen, die Liposomen als Membranmodellsysteme oder Arzneimittelzufuhrträger einsetzen, basieren auf Massenauslesetechniken und gehen daher von einer identischen Liposomen des Ensembles aus. Neue experimentelle Plattformen, die Liposomen auf Einteilchenebene beobachten können, haben es jedoch ermöglicht, hochentwickelte und quantitative Studien über Protein-Membran-Wechselwirkungen oder Wirkstoffträgereigenschaften an einzelnen Liposomen durchzuführen. fehlervermeidung durch Ensemble-Mittelung. Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung, Detektion und Analyse einzelner Liposomen mit hilfe eines fluoreszenzbasierten Mikroskopie-Assays vor, der solche Einzelpartikelmessungen erleichtert. Das Setup ermöglicht die massive parallele Abbildung einzelner Liposomen und wird eingesetzt, um die Größe der Intra-Proben und kompositorische Inhomogenitäten aufzudecken. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Vorteile der Untersuchung von Liposomen auf der ebene Liposomenebene, die Grenzen des Assays und die wichtigen Merkmale, die bei der Änderung berücksichtigt werden müssen, um andere Forschungsfragen zu untersuchen.
Introduction
Liposomen sind sphärische Phospholipid-basierte Vesikel, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Forschung stark verwendet werden. Sie fungieren als ausgezeichnete Membranmodellsysteme, da ihre physiochemischen Eigenschaften leicht durch Variation der Lipidkomponenten, aus denen das Liposomen 1,2besteht, manipuliert werden können. Auch Liposomen bilden das am häufigsten verwendete Nanocarrier-System für die Arzneimittelabgabe und bieten eine verbesserte Pharmakokinetik und Pharmakodynamik sowie eine hohe Biokompatibilität3.
Seit vielen Jahren werden Liposomen hauptsächlich mit Massentechniken untersucht, so dass nur Zugang zu ensembledurchschnittlichen Auslesewerten besteht. Dies hat dazu geführt, dass die meisten dieser Studien davon ausgegangen sind, dass alle Liposomen im Ensemble identisch sind. Solche ensemble-gemittelten Werte sind jedoch nur dann korrekt, wenn das zugrunde liegende Dataset gleichmäßig um den Mittelwert verteilt ist, kann jedoch eine falsche und verzerrte Schlussfolgerung darstellen, wenn das Dataset z. B. mehrere unabhängige Ebenen enthält. Darüber hinaus kann die Annahme, dass das Ensemble die gesamte Bevölkerung repräsentieren soll, die Informationen übersehen, die in der Inhomogenität zwischen Liposomen enthalten sind. Erst vor kurzem sind quantitative Assays aufgetaucht, die in der Lage sind, einzelne Liposomen zu untersuchen, die große Inhomogenitäten zwischen einzelnen Liposomen in Bezug auf wichtige physikalisch-chemische Eigenschaften wie Liposomengröße4,Lipidzusammensetzung5,6und Verkapselungseffizienz7aufdecken, was die Bedeutung der Untersuchung von Liposomen auf der Ebene der einzelnen Liposomen unterstreicht.
Ein Forschungsgebiet, in dem die Ensemble-Mittelung der Liposomen-Eigenschaften gezeigt wurde, um Verzerrungergebnisse zu untersuchen, ist die Untersuchung von Liposomengrößenabhängigen Protein-Membran-Wechselwirkungen8,9. Traditionell beschränkten sich Forscher, die solche Prozesse untersuchen, auf die Herstellung von Liposomen mit unterschiedlichen durchschnittlichen Ensembledurchmessern durch Extrusion durch Filter mit unterschiedlichen Porengrößen9. Die Extraktion des Durchmessers einzelner Liposomen mit einzelnen Liposomen-Assays hat jedoch große Populationsüberlappungen ergeben, wobei Liposomen mit 100 nm und 200 nm Filtern extrudiert werden, die bis zu 70 % überlappen in ihrer Größenverteilung4. Dies könnte Massenmessungen von liposomen größenabhängigen Protein-Membran-Wechselwirkungen stark verzerrt10. Durch die Durchführung der Membran-Protein-Interaktionsstudien mit dem einzigen Liposomen-Assay nutzten die Forscher stattdessen die Größen-Polydispersität innerhalb der Probe, so dass sie eine breite Palette von Liposomendurchmessern in jedem einzelnen Experiment untersuchen konnten, was neue Entdeckungen darüber ermöglichte, wie Membrankrümmung und -zusammensetzung die Proteinrekrutierung an Membranen4,11,12beeinflussen können. Ein weiteres Feld, in dem sich die Anwendung einzelner Liposomen-Assays als instrumentelle Seithers erwiesen hat, ist die mechanistische Entwicklung der proteinvermittelten Membranfusion13,14. Für solche kinetischen Messungen hat die Fähigkeit, einzelne Fusionsereignisse zu untersuchen, die Notwendigkeit einer experimentellen Synchronisation des Fusionsprozesses verringert und neue mechanistische Einsichten ermöglicht, die sonst in der räumzeitlichen Mittelung in Massenensemblemessungen verloren gegangen wären. Zusätzlich wurden einzelne Liposomen als Membrangerüst eingesetzt, das die Messung einzelner Proteine ermöglichte und neue Erkenntnisse über die Transmembranproteinstrukturdynamik15,16. Darüber hinaus ermöglichten solche proteoliposome-basierten Setups die Untersuchung der Funktion einzelner Transmembrantransporter17 und porenbildender Proteinkomplexe18 sowie des Mechanismus bioaktiver membranpermeabilisierender Peptide19. Einzelne Liposomen wurden auch als Weichstoff-Nanofluidik mit oberflächenimmobilisierten Einzelliposomen verwendet, die als Kammern für enzymatische Reaktionen in Volumen von 10-19 L dienten, wodurch der Durchsatz und die Komplexität der Screening-Assays mit minimalem Produktverbrauch20erhöht werden.
Kürzlich wurden einzelne Liposomen-Assays zur Charakterisierung von Wirkstoffabgabe-Liposomen auf einer bisher unvorhergesagten Detaillierungsebene verwendet. Die Forscher konnten signifikante Inhomogenitäten in der Menge an Polymer quantifizieren, die an der Oberfläche einzelner Liposomen befestigt ist21. Die einzelnen Liposomen-Assays erlaubten auch Messungen von Liposomen der Arzneimittelabgabe in komplexen Medien wie Blutplasma, die aufzeigen, wie Elemente, die durch Lipidanker an der Liposomenoberfläche verankert sind, anfällig für Dissoziation sein können, wenn Liposomen Bedingungen ausgesetzt sind, die jene imitieren, die während der in vivo Zirkulation nachgeahmt werden22. Insgesamt werden die Vielseitigkeit und Nützlichkeit der einzelnen Liposomen-Assays durch die große Vielfalt der Probleme belegt, die diese Setups angehen, und wir gehen davon aus, dass die Methodik weiter entwickelt wird und in neuen wissenschaftlichen Bereichen Anwendung findet.
Hier beschreiben wir einen fluoreszenzmikroskopischen Einzelliposomen-Assay, der es ermöglicht, einzelne Liposomen in einer Hochdurchsatz-Manier zu untersuchen (Abbildung 1). Um die Methode zu veranschaulichen, verwenden wir sie, um die Größe und kompositorische Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen innerhalb eines Ensembles zu quantifizieren. Der Test verwendet Fluoreszenzmikroskop-Bildgebung von einzelnen Liposomen, die auf einer passivierten Glasoberfläche immobilisiert sind. Wir beschreiben zunächst die kritischen Schritte im Liposomen-Herstellungsprozess, der eine ordnungsgemäße fluoreszierende Liposomenkennzeichnung und Immobilisierung sicherstellt. Anschließend beschreiben wir die Oberflächenvorbereitung, die erforderlich ist, um die Liposomenimmobilisierung zu erleichtern, bevor wir das Verfahren zur Sicherstellung geeigneter Liposomenoberflächendichten skizzieren. Wir besprechen die Mikroskopieparameter, die für den Erwerb hochwertiger Bilder wichtig sind, und zeigen, wie eine einfache Datenanalyse durchgeführt werden kann, die die Extraktion von Liposomengröße und kompositorische Inhomogenität ermöglicht. Dieses generische Protokoll sollte dem interessierten Forscher eine gute Grundlage bieten, um den Assay für sein spezifisches Forschungsinteresse weiterzuentwickeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Liposomen-Vorbereitung
HINWEIS: Kurz gesagt, die Herstellung von Liposomen umfasst in der Regel drei entscheidende Schritte: 1) Herstellung von trockenen Lipidfilmen der gewünschten Lipidzusammensetzung; 2) Rehydratation der Lipide zur Bildung von Liposomen; und 3) Kontrolle der Größe und Lamellenität der Liposomenpopulation.
- Die Lipide abwägen und in tert-butanol:wasser (9:1) in Glasfläschchen auflösen.
- POPC auflösen (1-Palmitoyl-2-Oleoyl-Glycero-3-Phosphocholin; MW = 760 g/mol) bis 50 mM.
- Cholesterin (MW = 387 g/mol) bis 25 mM auflösen.
- DOPE-Atto488 (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamin-Atto488 auflösen; MW = 1.316 g/mol) bis 0,1 mM.
- DOPE-Atto655 (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamin-Atto655 auflösen; MW = 1.368 g/mol) bis 0,1 mM.
- DSPE-PEG2000-Biotin (1,2-Distearyl-sn-glycero-3-phosphatethanolamin-N-[Biotinyl(Polyethylenglycol)-2000]; MW = 3.017 g/mol) bis 0,1 mM.
HINWEIS: Erhitzen Sie Lipide auf 55 °C und verwenden Sie magnetisches Rühren, um eine vollständige Auflösung der Lipide zu gewährleisten. Alternativ können Sie ein Beschallungsbad verwenden. Nicht verwendete Lipidbestände können mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.
- Mischen Sie die in Schritt 1.1 hergestellten Lipidbestände zu einem Molarenverhältnis von POPC:cholesterin:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotin 68.95:30:0.5:0.5:0.05, durch Zugabe von 138 l POPC, 120 l Cholesterin, 500 l jedes fluoreszierend markierten Lipids und 50 DSPE-PEG-Biotin zu einer frischen Glasdurchstechflasche.
HINWEIS: Die genaue Liposomenzusammensetzung kann leicht geändert werden, um die spezifische Frage des Interesses zu adressieren. Weitere Informationen finden Sie in der Diskussion. - Lösen Sie den Deckel der Glasdurchstechflasche und frieren Sie die Durchstechflasche in flüssigem Stickstoff ein.
- Lyophilisieren Sie die gefrorene Lipidmischung über Nacht.
- 1 ml 200 mM D-Sorbitolpuffer (Sorbitolpuffer) zu den trockenen Lipiden hinzufügen.
- Das Gemisch auf 45 °C erhitzen und mindestens 1 h dem magnetischen Rühren aussetzen.
HINWEIS: Der Puffer sollte die spezifische Frage widerspiegeln, die behandelt wird (z. B. physiologische Bedingungen für die Untersuchung von Membran-Protein-Wechselwirkungen oder einen spezifischen klinisch zugelassenen Puffer für die Untersuchung von Liposomen der Arzneimittelabgabe). Wenn jedoch kein spezifischer Puffer für die Studie benötigt wird, kann ein Puffer ohne Ionen für die Rehydratation angewendet werden, um die Multilamellarität der Liposomen zu reduzieren. - Die Lipidsuspension einfrieren, indem Sie die Durchstechflasche in flüssigen Stickstoff tauchen, und warten Sie, bis die Suspension vollständig eingefroren ist.
- Die gefrorene Suspension in einem Heizbad bei 55 °C tauchen, bis das Gemisch vollständig aufgetaut ist.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.7 und 1.8, bis die Liposomensuspension insgesamt 11 Frost-/Tauzyklen ausgesetzt ist.
HINWEIS: Wiederholte Frost-/Tauzyklen haben gezeigt, dass liposome multilamellarity23reduziert wird, was für die Genauigkeit des einzelnen Liposomen-Assays von größter Bedeutung ist, da multilamellare Liposomen die Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Liposomengrößenverhältnis der Liposomen verzerren. Die Multilamellarität ist in der Regel von Natur aus niedrig, wenn mehr als 0,5% PEGylyliertes Lipid in der Formulierung (wie üblich in Liposomen für die Medikamentenabgabe)24. - Extrudieren Sie die Liposomensuspension einmal durch einen 800 nm Polycarbonatfilter mit einem Mini-Extrusionskit. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Montage des Extrusionskits (siehe Tabelle der Materialien).
- Die Liposomen über Nacht bei 4 °C lagern.
2. Oberflächenvorbereitung der Bildgebungskammer
- Rinderserumalbumin (BSA; 1 mg/ml), BSA-Biotin (1 mg/ml) und Streptavidin (0,025 mg/ml) in 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure) 95 mM NaCl-Puffer (HEPES-Puffer) zubereiten.
HINWEIS: Um liposomalen Ausbruch zu verhindern, sollten der Für die Rehydratation verwendete Sorbitolpuffer und der HEPES-Puffer, der für die Oberflächenvorbereitung verwendet wird, isotonisch sein. Es wird daher empfohlen, die Osmolarität der Puffer vor dem Experiment zu überprüfen. - Mischen Sie 1.200 l BSA und 120 l BSA-Biotin und fügen Sie jedem Bohrgut 300 l des Gemischs in einem 8-Well-Dia für die Mikroskopie hinzu.
HINWEIS: Hier verwenden wir ein handelsübliches 8-Well-Mikroskop-Dia mit Einem Glasboden (siehe Materialtabelle), aber das Protokoll kann leicht an kundenspezifische Mikroskopkammern angepasst werden. - Inkubieren Sie die Rutsche für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
- Waschen Sie das Dia 8x mit 300 l HEPES Puffer.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Brunnen nicht für mehr als ein paar Sekunden ohne Puffer zu lassen, da das Austrocknen der Oberfläche sie beschädigen wird. Achten Sie außerdem darauf, die Oberfläche nicht mit der Pipettenspitze zu zerkratzen, da dies auch sie beschädigen wird. Wenn Sie also Puffer von einem Brunnen aus ansaugen, tun Sie dies von der Kante oder Ecke aus. - Fügen Sie 250 L Streptavidin hinzu und brüten Sie 10 min bei RT.
- Wiederholen Sie die in Schritt 2.4 beschriebenen 8 Wähbe.
- Bewahren Sie das Mikroskopschlitten mit 300 l Sorbitolpuffer in jedem Brunnen bei 4 °C auf. Die Verdunstung des Lösungsmittels wird die Oberfläche beschädigen, so setzen Sie das Mikroskop-Dia in eine Petrischale und versiegeln Sie es mit Parafilm, es sei denn, der vorbereitete Schlitten wird sofort verwendet.
3. Liposome immobilisieren
- Verdünnen Sie die Liposomensuspension im Sorbitolpuffer auf ca. 20 M Gesamtfett. Das Verfahren in Abschnitt 1 ergibt eine Liposomensuspension von ca. 10 mM Gesamtlipid.
- Platzieren Sie das Dia auf dem Mikroskop und fokussieren Sie sich auf die Oberfläche der Kammer mit dem erhöhten Laserreflexionssignal von der Glas-Puffer-Schnittstelle als Führung.
- Waschen Sie die Kammer 4x mit 300 l frischem HEPES-Puffer.
- Fügen Sie einem Mikrozentrifugenröhrchen 10 l verdünnten Liposomenbestand (20 M Gesamtfett) hinzu.
- Nehmen Sie 100 l Puffer aus der Kammer heraus, fügen Sie dem in Schritt 3.4 hergestellten Mikrozentrifugenrohr das Mikrozentrifugenrohr hinzu, mischen Sie es richtig, und legen Sie die 110 l wieder in die Kammer.
- Stellen Sie die Probe unter das Mikroskop, und verwenden Sie eine rudimentale Mikroskopeinstellung, die in der Lage ist, Signale aus dem/den Liposomenfluorophor(en) zu erkennen, um zu beobachten, wie die Liposomen auf der Oberfläche immobilisiert werden.
- Ziel einer Liposomen-Oberflächendichte, die gleichzeitig spärlich genug ist, um einzelne Liposomen zu entuten und so dicht genug ist, dass sie Messungen mit hohem Durchsatz ermöglicht. In der Regel ist die Verwendung eines Sichtfelds von 50 x 50 m optimal (Abbildung 2). Dies kann in der Regel innerhalb von 5 x 10 min erreicht werden.
HINWEIS: Wenn nur schnell bewegliche Fluoreszenzpartikel im Sichtfeld nachgewiesen werden, könnte eine Abwesenheit oder zu geringe Konzentration einer der für den Immobilisierungsprozess kritischen Komponenten (BSA-Biotin, Streptavidin, DOPE-PEG-Biotin) die Ursache sein. Wenn keine Liposomen nachgewiesen werden, könnte es entweder mit einer geringen Konzentration von Liposomen, unsachgemäßen Einstellungen für die Fluoreszenzdetektion oder möglicherweise mit einer Fokalebene, die nicht an der Glasoberfläche liegt, zusammenhängen. - Sobald eine entsprechende Liposomen-Oberflächendichte erreicht ist, waschen Sie die Kammer 3x mit 200 l HEPES-Puffer.
HINWEIS: Beachten Sie, dass die Immobilisierungskinetik auch von Liposomeneigenschaften wie Größe und Ladung abhängt und daher immer für jede Liposomenformulierung optimiert werden sollte.
4. Bildaufnahme
HINWEIS: Dieser Abschnitt hängt stark vom Mikroskopsystem ab, das dem Forscher zur Durchführung des Experiments zur Verfügung steht. Daher werden allgemeine Richtlinien für die Durchführung der Bildgebung beschrieben. Die genauen Einstellungen und deren Anwendung variieren jedoch zwischen den verschiedenen Mikroskop-Setups. Beispielsweise ermöglichen einige Systeme die Auswahl beliebiger Emissionsfilterkombinationen, während andere Mikroskope mit speziellen, voreingestellten Filtern ausgestattet sind.
- Richten Sie das Mikroskop für die Abbildung einzelner Liposomen ein. Um eine optimale Bildqualität und anschließende Datenanalyse zu gewährleisten, verwenden Sie eine hohe Graustufenauflösung und ein Pixelschema, das ein Oversampling einzelner Liposomen ermöglicht. Es wird eine Bittiefe von 16 und mindestens 1.024 x 1.024 Pixel für eine Fläche von 50 x 50 mm empfohlen. Falls verfügbar, kann die Line-Mittelung vorteilhaft angewendet werden, um Rauschen zu reduzieren (z. B. 3 Scans pro Zeile).
- Wählen Sie eine Anregungslaserleistung, die sowohl eine nicht signifikante Frame-to-Frame-Bleaching als auch ein starkes Signal gewährleistet, um einzelne Liposomen deutlich vom Hintergrund zu unterscheiden. Die optimale Einstellung hängt vom verwendeten Mikroskop sowie der Fluorophor-Kombination ab. Stellen Sie sicher, dass Detektoren nicht gesättigt sind, da dies die Intensitätsquantifizierung verzerrt.
- Die Bildgebung sowohl der Fluorophore DOPE-Atto488 als auch des DOPE-Atto655 in den Liposomen erfordert die Abbildung mehrerer Kanäle. Stellen Sie daher sicher, dass jeder Kanal sequenziell abgebildet wird, um eine Kreuzerregung zu vermeiden. Nehmen Sie z. B. zuerst ein Bild, indem Sie es mit 488 nm spannend machen und die Aussenentwicklung bei 495-560 nm. Danach nehmen Sie ein anderes Bild durch spannend bei 633 nm, aber Die Ablesung nur bei 660-710 nm. Die Besonderheiten hängen vom mikroskopischen System (z.B. welche Laser und Filter) abhängen.
- Achten Sie darauf, verschiedene Bereiche der Oberfläche abzudecken, mindestens 10 Bilder der Probe zu erfassen und so mindestens 3.000 einzelne Liposomen zu bilden. Wenn die Oberflächendichte unter 300 Liposomen/Rahmen liegt, erfassen Sie mehr Bilder. Stellen Sie sicher, dass Sie das Mikroskop für jedes neue Bild neu fokussieren.
HINWEIS: Achten Sie bei der Zweikanal-Bildgebung darauf, die Bilddateien so zu benennen, dass Bildpaare mit den gleichen Liposomen in verschiedenen Fluoreszenzkanälen während der Datenanalyse leicht identifiziert werden können. - Um die experimentelle Unsicherheit im Zusammenhang mit der Messung der kompositorischen Inhomogenität zu quantifizieren, stellen Sie sich den gleichen Bereich von Liposomen vor und nach der Neuausrichtung vor (siehe Abbildung 3 und Beschreibung im Text).
- Exportieren Sie die Bilder aus der Mikroskopsoftware als .tiff-Dateien. Exportieren Sie die beiden Kanäle der gleichen Liposomen einzeln.
5. Datenanalyse
HINWEIS: Speziell entwickelte automatisierte 2D Gaußsche Montageroutinen wurden zuvor eingesetzt6,11,12. Um die Anwendbarkeit der Methode zu erhöhen, wird jedoch ein Datenanalyseprozess beschrieben, der in allen Laboratorien einfach implementiert werden kann.
- Laden Sie das entsprechende Paar von .tiff-Bildern von zwei verschiedenen Fluoreszenzkanälen im selben Bildgebungsfeld in die FIJI-Software (FIJI Is Just ImageJ).
- Wählen Sie im Menü Bild Farbeaus, und verwenden Sie die Funktion Kanal zusammenführen, um eine Kombination der beiden Kanäle zu erstellen.
- Beobachten Sie, ob die liposomen, die in zwei verschiedenen Kanälen abgebildet sind, eine gute Kolokalisierung aufweisen oder ob eine sichtbare Drift aufgetreten ist.
HINWEIS: Im Falle einer Drift zwischen den beiden Fluoreszenzkanälen (als systematischer und gleicher X-Y-Offset zwischen dem Signal in den beiden Kanälen erkannt) kann einer der Frames mit der Funktion Transformieren > Übersetzen im Bildmenü von FIJI übersetzt werden. Bei solchen Bildmanipulationen sollte jedoch Vorsicht geboten sein. Es wird daher empfohlen, bei der Abbildung der Liposomen so weit wie möglich Driften zu vermeiden. - Stellen Sie sicher, dass das ComDet-Plugin (v.0.3.6.1 oder neuer) installiert ist, oder tun Sie dies im Plugins-Menü.
- Öffnen Sie das ComDet-Plugin, um Partikel zu erkennen, indem Sie zum Plugins-Menü gehen und ComDet v.0.3.6.1 > Partikel erkennenauswählen.
- Stellen Sie in ComDet sicher, dass Sie die Funktion Partikel auf beiden Kanälen einzeln erkennen. Legen Sie die maximale Entfernung zwischen kolokalisierten Punkten fest, die der Größe der ungefähren Partikelähnelt. Normalerweise sind 4 Pixel für die hier beschriebenen Einstellungen geeignet.
- Das Signal-Rausch-Verhältnis sollte den Nachweis von selbst schwachen Partikeln mit geringer Fluoreszenzmenge ermöglichen. Legen Sie in ComDet dieses Verhältnis auf 3 fest, indem Sie die Empfindlichkeit der Erkennung in beiden Kanälen auf Sehr dim Partikel (SNR = 3)setzen.
HINWEIS: Obwohl dieser SNR-Wert in der Regel angemessen ist, kann es notwendig sein, ihn höher zu setzen (z. B. wenn es eine Menge Bildrauschen gibt, die als Liposomen identifiziert werden können und zu falschen Positivwerten führen). - Stellen Sie sicher, dass die Felder mit Co-Lokalisierung berechnen und Plot-erkannte Partikel in beiden Kanälen aktiviert sind, bevor Sie OKdrücken.
- Nach dem Ausführen der Analyse werden zwei Popupfenster mit Ergebnissen und Zusammenfassung angezeigt. Exportieren Sie die Datentabelle Ergebnisse, die die Kolokalisierungsdaten (Partikelkoordinaten und integrierte Intensität jedes entdeckten Partikels) enthalten, in eine Datenverarbeitungssoftware ihrer Wahl, indem Sie die Tabelle als .txt-Datei speichern und in die Software importieren.
- Stellen Sie sicher, dass jedes Liposom nur einmal im Datensatz enthalten ist und nicht sowohl das Channel1/channel2 als auch das Channel2/Channel1-Verhältnis. Filtern Sie also die Daten, sodass nur Abs_frame = 1 in Schritt 5.11 dargestellt wird.
HINWEIS: Durch die Auswahl von Colocalized = 1können falsche Positivmeldungen aus rauschenden Bildern aus der Analyse entfernt werden. Aber auch Liposomen mit nur einer der beiden vorhandenen fluoreszierenden Komponenten werden von der Analyse ausgeschlossen, wodurch möglicherweise wichtige Datenpunkte aus der Analyse entfernt werden. - Zeichnen Sie ein Histogramm der Spalte mit Daten, die das Intensitätsverhältnis für jedes erkannte Liposom enthalten.
- Der Grad der kompositorischen Inhomogenität für das untersuchte liposomale System wird durch die Breite der Intensitätsverhältnisverteilung dargestellt. Um die Inhomogenität zu quantifizieren, passen Sie das Intensitätsverhältnis Histogramm mit einer Gaußschen Funktion an und extrahieren Sie den Mittelwert () und die Standardabweichung (Sigma). Siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
- Ein Wert für den Grad der Inhomogenität (DI) kann nun mit dem Variationskoeffizienten berechnet werden, der als DI = Sigma / B definiert ist.
6. LiposomeN-Größenkalibrierung
- Nehmen Sie einen Teil des Liposomenbestands heraus und extrudieren Sie 21x durch einen 50 nm Polycarbonatfilter, wie in Schritt 1.10 beschrieben.
- Verdünnen Sie die Liposomen, indem Sie 10 l der Liposomensuspension zu 800 l Sorbitpuffer in einem Mikrozentrifugenrohr hinzufügen.
- Die verdünnte Liposomenprobe in eine Polypropylen-Einwegküvette übertragen.
- Messen Sie die Größe mit der dynamischen Lichtstreuung (DLS). Führen Sie mindestens drei unabhängige Durchläufe durch, um die Größe und Polydispersität der Liposomensuspension zu messen.
HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf eine konzentriertere Liposomensuspension für die Messung. Alternativen zu DLS (z.B. Nanopartikel-Tracking-Analyse) können auch zur Messung der Größe der Liposomen eingesetzt werden. Eine Beschreibung, wie eine solche Partikelgrößenbestimmung ausgeführt werden kann, geht über den Rahmen dieses Protokolls hinaus. - Bildn die Kalibrierliposomen auf dem Mikroskop mit genau den gleichen experimentellen Einstellungen wie in den Schritten 4.1 und 4.2 definiert.
- Extrahieren Sie die integrierte Intensität für jedes Kalibrierliposom in den Kalibrierbildern: Extrahieren Sie das gefilterte Ergebnisblatt mit liposomen Fluoreszenzintensitäten, wie in den Schritten 5.1-5.10 beschrieben. Extrahieren Sie aus der Ergebnistabelle die Spalte "IntegratedInt".
- Da die gesamte integrierte Intensität eines in seiner Membran beschrifteten Liposomenproportionalzur der Oberfläche des Liposoms und somit proportional zum Quadrat seines Durchmessers ist, zeichnen Sie ein quadratisches Wurzelintensitätshistogramm der Fluoreszenzintensität des Kalibrierung liposomen.
- Passen Sie das integrierte Intensitätshistogramm in Schritt 6.7 mit einer Log-Normalverteilung an und extrahieren Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der Kalibrierliposomen.
- Um die Beziehung zwischen der Quadratwurzelintensität (IntSqrt) und der Liposomengröße zu bestimmen, berechnen Sie den Korrekturfaktor (C) mit dem durchschnittlichen Liposomendurchmesser (Dia), der durch die Anzahl der DLS-Messungen gewogen wird: Dia = C x IntSqrt entspricht C = Dia / IntSqrt.
- Berechnen Sie IntSqrt-Werte für die Liposomen im Kompositorischen Inhomogenitätsexperiment und wandeln Sie diese in Durchmesser um, indem Sie sie mit dem Korrekturfaktor multiplizieren.
- Plotten Sie den Intensitätsverhältniswert als Funktion des Durchmessers für die kompositorischen Inhomogenitätsliposomen und erreichen So die Inhomogenität als Funktion der Liposomengröße für eine Population von Liposomen, die sich von ca. 50 nm bis 800 nm erstrecken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nach dem beschriebenen Protokoll ist es möglich, einzelne Liposomen massiv parallel abzubilden (Abbildung 1). Die erfolgreiche Oberflächenimmobilisierung von Liposomen sollte sofort bei Zugabe der Liposomenlösung in die Kammer sichtbar sein (Schritt 3.6 im Protokoll), da beugungsbegrenzte Intensitätsflecken im Bild erscheinen sollten (Abbildung 1B und Abbildung 1C).
Um gute Statistiken zu erhalten und die Hochdurchsatzfähigkeiten des Assays auszunutzen, sollten mehrere tausend Liposomen abgebildet werden. Um dies in einer angemessenen Anzahl von Bildern zu tun, wird empfohlen, genügend Liposomen zu immobilisieren, um eine Dichte von 300 bis 400 Liposomen pro Frame zu erreichen, da dies die Anzahl der Bilder pro Probe auf 10 ' senken wird, wodurch die Anzahl der Bilder, die erfasst und analysiert werden müssen, begrenzt wird. Eine niedrigere Dichte macht die Datenanalyse zeitaufwändiger, während eine höhere Dichte es für die Bildanalysesoftware schwierig machen kann, einzelne Liposomen zu unterscheiden. Um einen visuellen Eindruck davon zu erhalten, wie 300 bis 400 Liposomen aussehen, siehe Abbildung 2A. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass für einige Anwendungen (z. B. Membran-Protein-Wechselwirkungen mit einem Protein, das dazu neigt, eine starke Hintergrundbindung an die BSA-Oberfläche auszulösen) empfohlen wird, eine etwas niedrigere Dichte zu verwenden, wie in Abbildung 2A oben rechts.
Gelegentlich ist es beim Erfassen von Bildern schwierig, das gesamte Sichtfeld richtig in den Fokus zu rücken, wie in Abbildung 2Bdargestellt. Solche Probleme können darauf hindeuten, dass die Probenplatte kippt, was sich daraus ergeben kann, dass die Platte nicht richtig auf dem Probenhalter auf dem Mikroskop platziert wird. Auch wenn die Liposomen groß und verschwommen erscheinen, könnte der Puffer in der Kammer verdampft und die Oberfläche ausgetrocknet sein. Es ist besonders wichtig, dieses Problem bei der Bildgebung für längere Zeiträume oder bei Messungen bei Temperaturen über RT im Auge zu behalten. Zur Veranschaulichung des Unterschieds zwischen ordnungsgemäß gelagerten und ausgetrockneten Liposomen ist in Abbildung 2Cein Bild derselben Probe vor und nach dem Austrocknen der Kammer dargestellt.
Nach optimaler Bildqualität kann die integrierte Intensität für jedes Liposom in den beiden Bildverarbeitungskanälen nach den Schritten in Abschnitt 5 dieses Protokolls extrahiert werden. Dadurch wird eine Liste von eindeutigen Intensitätswerten erstellt, die es uns ermöglichen, das Intensitätsverhältnis für jedes einzelne Liposom zu berechnen. Die kompositorische Inhomogenität wird anhand von Intensitätsverhältnishistogrammen ausgewertet, die typischerweise eine Gaußsche Verteilung um einen Mittelwert aufweisen (Abbildung 3A). Beachten Sie, dass, wenn starke Abweichungen von einer Gaußschen Verteilung beobachtet werden (Abbildung 3B), es auf ein Erkennungsempfindlichkeitsproblem für mindestens einen der Bildverarbeitungskanäle hindeutet, was darauf hindeutet, dass eine Teilmenge von Liposomen, die ein schwächeres Signal zeigen, ausgeschlossen wurde. Dies kann sowohl auf die Nachweisgrenze des Bildgebungssystems als auch auf den Ausschluss von Liposomen in der Datenanalyse zurückzuführen sein (z. B. bei DerAnwendung eines bestimmten Mindestschwellenwerts; siehe Schritt 5.7).
Die Berechnung des DI-Wertes, wie in den Schritten 5.11-5.13 im Protokoll beschrieben, liefert ein quantitatives Maß für die kompositorische Inhomogenität zwischen den einzelnen Liposomen der Zubereitung. Für das hier untersuchte liposomale System di = 0,23 x 0,01 (Abbildung 3C). Dieser Wert kann verwendet werden, um systematisch zu vergleichen, wie unterschiedliche Liposomeneigenschaften oder Zubereitungsmethoden die kompositorische Inhomogenität beeinflussen. Um die Bedeutung des DI-Werts zu konzipieren, beziehen wir uns auf die Normalverteilung, die durch das Histogramm des Intensitätsverhältnisses angezeigt wird, was bedeutet, dass sie der empirischen 68-95-99.7-Regel gehorchen. Diese Regel beschreibt den Prozentsatz einer Grundgesamtheit, der innerhalb von eins, zwei und drei Standardabweichungen um den Mittelwert liegt. Für den hier gefundenen DI-Wert von 0,23 x 0,01 bedeutet dies, dass 32 % der Liposomen in der Population ein Intensitätsverhältnis aufweisen, das sich um mehr als 23 % vom mittleren Molverhältnis des Ensembles unterscheidet (Abbildung 3D).
Für das Kontrollexperiment, das die gleichen Liposomen vor und nach der Neufokussierung abbilden (Abschnitt 4.6), wird die gleiche Datenanalyse und Ergebnisdarstellung wie für das eigentliche Experiment durchgeführt. Dies ermöglicht die Quantifizierung der experimentellen Unsicherheit des DI-Wertes, bei der festgestellt wurde, dassDI-Unsicherheit = 0,10 x 0,01 (Abbildung 3E). Obwohl derDI-Unsicherheitswert vom verwendeten Bildgebungssystem abhängt, wurde festgestellt, dass konfokale Mikroskop-Setups konsequentDI-Unsicherheitswerte von etwa 0,105,6ergeben. Der DI-Wert von DI = 0,23 x 0,01, der hier für das liposomale System gefunden wurde, ist mehr als doppelt so hoch wie die experimentelle Unsicherheit, was auf das Vorhandensein einer signifikanten kompositorischen Inhomogenität zwischen den einzelnen Liposomen der Zubereitung hindeutet.
Durch die Durchführung des in Abschnitt 6 beschriebenen Größenkalibrierungsexperiments können die beliebigen Liposomenintensitätswerte in Nanometer in physikalische Durchmesser umgewandelt werden. Das Verfahren wurde gegen andere bildgebende Verfahren25 wie die kryogene Elektronenmikroskopie validiert, die die nanometergroßen Liposomen optisch auflösen kann, wenn auch mit einem viel geringeren Durchsatz. Mit der Abbildung der Kontrollprobe mit den exakt gleichen Mikroskopeinstellungen wie bei den eigentlichen Experimenten ist es nun möglich, die mittlere Liposomenintensität mit dem durch DLS ermittelten mittleren Liposomendurchmesser zu korrelieren (Abbildung 4A). Der nächste Schritt besteht darin, die Liposomen-Intensitätsverteilung darzustellen, die auf den physikalischen Einschränkungen gegen das Erstellen extrem kleiner Liposomen basiert und in der Regel eine Log-Normalverteilung anzeigt (Abbildung 4B). Wenn die Verteilung nicht gut durch eine Log-Normalverteilung beschrieben wird (meist aufgrund fehlender Liposomen mit niedrigen Intensitätswerten), bedeutet dies, dass ein Teil der Liposomenpopulation entweder aufgrund einer geringen Mikroskop-Erkennungsempfindlichkeit oder zu strenger Parameter während der Datenanalyse ausgeschlossen wurde (Abbildung 4C). Es ist wichtig, diese Fragen aufzufangen und anzugehen, um eine unvoreingenommene Dateninterpretation zu gewährleisten. Als Nächstes können die Intensitätswerte für jedes einzelne Liposom in Abbildung 4B mit dem in Abbildung 4A (Abbildung 4D)ermittelten Korrekturfaktor in tatsächliche Durchmesser konvertiert werden. Nach der Bestimmung der Größe jedes Liposomen kann der DI als Funktion des Durchmessers nun untersucht werden, indem das Intensitätsverhältnis im Vergleich zum Durchmesser für jedes einzelne Liposome dargestellt wird (Abbildung 4E). Diese trichterartige Datenstruktur bestätigt frühere Befunde, dass der DI-Wert steigt, wenn die Liposomengröße abnimmt6. Wichtig ist, dass die symmetrische Zunahme der Streuung der Intensitätsverhältnisse um einen Mittelwert darauf hindeutet, dass es keine systematische größenabhängige Variation in der durchschnittlichen Zusammensetzung von Liposomen gibt.
Abbildung 1: Der einzelne Liposomen-Assay. (A) Liposomen werden mit einem äquimolaren Gehalt der fluoreszierend gekennzeichneten Lipide DOPE-Atto488 und DOPE-Atto655 formuliert und auf einer BSA-Oberfläche mit einem Biotin/Streptavidin-Gestänge immobilisiert. (B) Die immobilisierten Liposomen werden mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet, das den Nachweis der Fluoreszenzintensitäten aus den einzelnen Liposomen ermöglicht. Skalenbalken = 8 m . (C) Zoom der grünen Fläche in (B) dargestellt als Oberflächenintensitätsdiagramm für zwei benachbarte Liposomen, die invertiertes Fluoreszenzsignal zwischen den beiden Kanälen anzeigen, was das Konzept der kompositorischen Inhomogenität veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Optimierung und Fallstricke. (A) Die obere linke Seite zeigt 29 Liposomen, die in einem 50 x 50 m Rahmen immobilisiert sind. Dies sind zu wenige Liposomen pro Frame, um die Möglichkeit einer Hochdurchsatzuntersuchung der Liposomeninhomogenität zu nutzen. Die obere rechte Seite zeigt 123 Liposomen pro Frame. Dies ist eine suboptimale Dichte, kann aber verwendet werden, wenn viele Bilder aufgenommen werden. Die untere linke Seite zeigt 300 bis 400 Liposomen pro Frame. Dies ist optimal für das hier beschriebene Protokoll. Die untere rechte Seite zeigt mehr als 1.500 Liposomen pro Frame, was zu viele sind, um einzelne Liposomen zu unterscheiden. Es besteht ein hohes Risiko, dass ein einzelner Fleck tatsächlich zwei Liposomen ist, die innerhalb derselben beugungsbegrenzten Stelle immobilisiert werden. (B) Wenn die Kammer nicht richtig in den Probenhalter gelegt ist, ist es unmöglich, das gesamte Sichtfeld richtig in den Mittelpunkt zu rücken. In der linken Mikographie neigt sich die Platte um die Traversenachse, wodurch die linke untere Ecke außer Fokus fällt. In der rechten Mikrographie kippt die Platte um die Längsachse, was zu einer schwereren Neigung führt. Sowohl die linke als auch die obere rechte Ecke sind außer Fokus. (C) Bei längerer Bildgebung oder bei erhöhten Temperaturen kann der Puffer verdampfen, was zum Austrocknen der Kammer führt. Wir illustrierten dieses Szenario hier, indem wir Liposomen vor und nach dem Trocknen der Kammer für 3 min abbilden und dann durch Zugabe von frischem Puffer in die Kammer rewetted wurden. Die resultierenden Liposomen sind größer, verschwommen, haben eine geringere Fluoreszenzintensität und scheinen auf der Platte verteilt zu sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Intensitätsverhältnis Histogramme zur Quantifizierung der liposomen kompositorischen Inhomogenität. (A) Das Intensitätsverhältnis von DOPE-Atto488 und DOPE-Atto655 Fluoreszenz für jedes einzelne Liposomen, das als Histogramm dargestellt wird. (B) Eine abgeschnittene Gaußsche Verteilung, die ein potenzielles Sensitivitätsproblem veranschaulicht, entweder während der Bildgebung oder im Datenbehandlungsschritt. (C) Die Anpassung des Intensitätshistogramms mit einer Gaußschen Funktion ermöglicht es, den Mittelwert und die Standardabweichung zu extrahieren, die zur Berechnung des DI-Wertes verwendet werden. (D) Ein DI-Wert von 0,23 kann in 32 % der Bevölkerung übersetzt werden, die sich um mehr als 23 % vom mittleren Molverhältnis des Ensembles unterscheiden. (E) Kontrollexperiment, das die gleichen Liposomen vor und nach der Neufokussierung abbilden und dann das gleiche Datenbehandlungsverfahren wie für das eigentliche Experiment durchführt. Dadurch kann der Versuchsfehler für die DI-Quantifizierung ermittelt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Konvertieren der Liposomenintensität in physikalischen Durchmesser in nm. (A) Intensitätshistogramm der 50 nm extrudierten Kalibrierliposomen im Vergleich zu den DLS-Daten, um den Kalibrierfaktor zu bestimmen. (B) Ein Histogramm des IntSqrt-Wertes aus den experimentellen Liposomen ergibt in der Regel eine Log-Normalverteilung aufgrund der physikalischen Einschränkungen gegen die Erstellung sehr kleiner Liposomen. (C) Ein nicht lognormales IntSqrt-Werthistogramm weist entweder auf Probleme mit der Nachweisempfindlichkeit hin oder kleine Liposomen wurden bei der Datenbehandlung ausgeschlossen. (D) Liposomenintensitäten in (B) werden mit dem Korrekturfaktor in tatsächliche Liposomendurchmesser umgewandelt. (E) Das Intensitätsverhältnis jedes Liposomen, das als Funktion des Liposomendurchmessers dargestellt wird, kann nun angezeigt werden, so dass die Untersuchung der kompositorischen Inhomogenität in Abhängigkeit von Liposomengröße möglich ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Es ist wichtig zu beachten, dass wir zwar detailliert beschreiben, wie der einzelne Liposomen-Assay verwendet werden kann, um die kompositorische Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen zu untersuchen, die Plattform jedoch sehr vielseitig ist. Wie bereits in der Einleitung gezeigt und diskutiert, kann das Protokoll leicht angepasst werden, um Aspekte der Membran-Membran-Fusion, Protein-Membran-Wechselwirkungen oder liposomalen Wirkstoffträgercharakterisierung zu studieren. Bei allen wissenschaftlichen Fragen, die angesprochen werden, liegt die Kraft des einzelnen Liposomen-Assays in der Fähigkeit, die einzelnen Komponenten des Ensembles zu erkennen und somit eine quantitative Auslesung zu haben, die nicht durch Ensemblemittelungseffekte verzerrt wird.
Der einzelne Liposomen-Assay eignet sich optimal für oberflächenbildgebende Modalitäten wie totale Innenreflexion oder konfokales Mikroskop, bei dem die Z-Richtungssektion unerwünschte Hintergrundfluoreszenz aus der Lösung oberhalb der Liposomenschicht eliminieren kann. Dieser Aspekt ist jedoch am wichtigsten für Studien, bei denen fluoreszierend markierte Verbindungen wie Peptide, Proteine oder andere Liposomen der Lösung zugesetzt werden und dort während der Bildgebung verbleiben. Wenn der Assay z. B. in dem hier beschriebenen Format verwendet wird, in dem die fluoreszierenden Farbstoffe auf die immobilisierten Liposomen beschränkt sind, könnte der Assay grundsätzlich mit breiter verfügbaren Weitfeldmikroskopen durchgeführt werden, um den Nachweis zu erbringen. System ist sensibel genug.
A priori gibt es keine Einschränkungen in Bezug auf die Methode zur Herstellung der Liposomen in der Assay verwendet. Hier beschreiben wir detailliert den Einsatz einer Gefriertrocknungstechnik. Jedoch, zuvor Chloroform-basierte Lipid-Rehydratation oder Ethanol-Injektions-basierte Techniken wurden verwendet, um Liposomen im Assayverwendet5,6. Ein kritischer Parameter ist die Aufnahme eines winzigen Bruchteils von biotinylierten Lipiden in das Lipidgemisch, um eine Immobilisierung zu gewährleisten (0,05 Mol% empfohlen). Ein weiteres notwendiges Element ist es, eine kleine Menge fluoreszierend markierten Lipid s. Insgesamt sollte die Menge an Lipid-Farbstoff so gering wie möglich gehalten werden, um sowohl Abschrecken-Effekte zu vermeiden und zu vermeiden, dass der Lipidfarbstoff die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Liposoms signifikant verändert. Die untere Grenze der Fettfarbe wird durch die Konzentration festgelegt, bei der die stochastische Variation in der Anzahl der einzelnen Lipidfarbstoffe pro Liposom im Vergleich zur durchschnittlichen Menge an Lipidfarbstoffen signifikant wird (siehe Larsen et al.6 für eine eingehende Diskussion). Wenn wir diese Grenze überschreiten, werden große Unsicherheiten in den extrahierten Intensitäten mit sich bringen. Schließlich muss die Menge an Lipidfarbstoff hoch genug sein, um die einzelnen Liposomen mit einem guten Signal-Rausch-Verhältnis genau zu detektieren. Während dieses Kriterium natürlich stark vom Bildgebungssystem abhängt, haben wir festgestellt, dass Lipidfarbstoffkonzentrationen zwischen 0,05 und 0,5 Mol% in den allermeisten Fällen gut funktionieren.
Um zu wählen, welchen Lipidfarbstoff in das Liposom aufgenommen werden soll, ist die erste Voraussetzung, dass die Anregungs- und Emissionseigenschaften mit den Beleuchtungs- und Detektionsfähigkeiten des Bildgebungssystems übereinstimmen. Zweitens, um die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Methode zu erhöhen, empfehlen wir die Verwendung von Farbstoffen mit hohen Quantenausbeuten und Photostabilität, und wir haben zuvor erfolgreich Farbstoffe mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen6,11verwendet. Bei der Auswahl von Lipidankern mit ähnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften sollte darauf geachtet werden, dass die Lipidpartitionierung nicht zu künstlich hoher Inhomogenität führt. Für dieses Protokoll haben wir beispielsweise beide Fluorophore mit DOPE verankert, während ein Fluorophor auf DOPE und ein anderes auf DPPE zu Fluorophorverteilungsheterogenitäten führen könnte, die nicht mit der inhärenten Inhomogenität in der Liposomenpopulation zusammenhängen. Gerade für die Dual-Farbbildgebung ist es wichtig, Farbstoffe mit engen Anregungs- und Emissionsspektren und möglichst kleinster Spektralüberlappung zu wählen, um signifikante Durchblutungen, Quergespräche und Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) zwischen Farbstoffen und Kanälen zu vermeiden. Um Artefakte im Zusammenhang mit Variationen in der Fluorophor-Umgebung zu vermeiden, ziehen wir es vor, mit Farbstoffen zu arbeiten, die sich als experimentell erwiesen haben, um eine extrem geringe Membraninteraktionsneigung zu zeigen, wie sie von Hughes et al.26bestimmt wird. Schließlich, wenn eine bestimmte Liposomen-Lipid-Zusammensetzung ist keine harte Anforderung für das experimentelle Design, kann es vorteilhaft sein, bis zu 10 Mol% der negativ geladenen Lipide enthalten, um sicherzustellen, dass einzelne Liposomen sich gegenseitig abstoßen und effizient als einzelne Liposomen immobilisiert werden12.
Ein Vorteil des einzelnen Liposomen-Assays ist das geringe Versuchsvolumen, das die Menge an teuren oder seltenen Verbindungen, die pro Experiment verwendet werden, erheblich reduzieren kann. Hier beschreiben wir den Einsatz von Standard- und handelsüblichen Kammern mit einem Versuchsvolumen zwischen 150–300 l. Es können jedoch kundenspezifische Mikroskopkammern verwendet werden, die das Volumen auf einen Bereich von 50–80 l reduzieren können. Auch der Liposomenverbrauch ist sehr gering, mit einer Endkonzentration von ca. 2 m Gesamtfett.
Ein Nachteil des einzelnen Liposomen-Assays ist, dass es aufgrund der oben beschriebenen Schwankungen der Immobilisierungstendenzen schwierig ist, die Lipidkonzentration in der Kammer zu kontrollieren. Darüber hinaus ist es in Bezug auf die Anwendung des Assays zur Untersuchung von Membran-Protein-Wechselwirkungen schwierig, die Konzentration oder Anzahl gebundener Proteine direkt aus der Fluoreszenzintensität zu bestimmen.
Bei der Verwendung der Liposomen im Assay als Membranmodellsysteme (z. B. zur Untersuchung der Membraninteraktion von fluoreszierenden Verbindungen, Peptiden oder Proteinen) ist es wichtig, eine geringe unspezifische Bindung an die Proteinkomponenten zu gewährleisten, die die Immobilisierung. Ist dies nicht der Fall, kann ein hohes Hintergrundsignal erkannt werden, das den Nachweis der spezifischen Bindung an die Liposomen verhindern könnte. Wenn ein hoher unspezifischer Hintergrund festgestellt wird, haben wir den Hintergrund zuvor erfolgreich reduziert, indem wir von Streptavidin zu Neutravidin oder Avidin gewechselt sind.
Die Durchführung der Einzelliposomende mit anderen Techniken wie der Durchflusszytometrie könnte im Vergleich zum mikroskopischen Assay möglicherweise einen erhöhten Nachweisdurchsatz bieten. Da jedoch Durchflusszytometer für die Untersuchung viel größerer und hellerer Proben wie Zellen optimiert sind, ist das Detektionssystem der meisten nicht empfindlich genug, um die relativ schwache Fluoreszenz eines einzelnen Liposoms zu erkennen. Während also neue und empfindlichere Durchflusszytometrie entwickelt wird, bietet der mikroskopische Assay die beste Lösung für die Aufklärung liposomer Inhomogenitäten, wenn sie effizient durchgeführt werden, und die Überwachung tausender Liposomen pro Experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Dänischen Rat für unabhängige Forschung [Zuschussnummer 5054-00165B] finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
