Summary
פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ליפוזומים וכיצד ניתן להשתמש בקיבוע על פני השטח ולעבור באופן אינדיבידואלי בצורה מקבילה מסיבית תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבר מאפשר לכמת את הגודל והאחידות בין ליפוזומים בודדים של האוכלוסייה.
Abstract
רוב המחקרים המעסיקים ליפוזומים כמו מערכות מודל ממברנה או ספקיות משלוח התרופות מסתמך על שיטות קריאה-out בצובר ובכך מיסודה מניח את כל ליפוזומים של ההרכב להיות זהה. עם זאת, פלטפורמות ניסיוני חדש מסוגל להתבונן ליפוזומים ברמת החלקיק היחיד הפכו את האפשרות לבצע מחקרים מתוחכמים ביותר וכמותיים על אינטראקציות חלבונים-קרום או הספק הסמים מאפיינים על ליפוזומים בודדים, וכך הימנעות שגיאות מהרכב בממוצע. כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה, גילוי וניתוח של ליפוזומים בודדים באמצעות שיטת מיקרוסקופ מבוססת-פלואורסצנטית, הקלה על מדידות מסוג יחיד-חלקיק. ההתקנה מאפשרת הדמיה בודדים ליפוזומים בצורה מקבילה מסיבית והוא מועסק כדי לחשוף את הגודל הפנים לדוגמה ומלא הומופאות. בנוסף, הפרוטוקול מתאר את יתרונותיו של הלומדים ליפוזומים ברמה האחת, את מגבלות השיטת העבודה, ואת התכונות החשובות שיש לשקול בעת שינוי אותה כדי ללמוד שאלות מחקר אחרות.
Introduction
ליפוזומים הם שלפוחיות מבוססות פוספוליפיד כדוריים המשמשות בכבדות במחקר בסיסי ומיושם. הם מתפקדים כמו מערכות מודל מעולה ממברנה, מכיוון התכונות הפיזיוכימיות שלהם יכול להיות מניפולציות בקלות על ידי שינוי הרכיבים השומנים המרכיבים את ליפופי1,2. גם, ליפוזומים מהווים את מערכת התרופות משלוח הסמים הנפוץ ביותר, מציע פרמקוקינטיקה משופרת, פרמקודינמיקה, כמו גם גבוהה תאימות3.
במשך שנים רבות, ליפוזומים כבר נחקרו בעיקר באמצעות שיטות בצובר, מתן גישה רק לערכי לקרוא ממוצע ההרכב. זה הוביל את רוב המחקרים האלה כדי להניח כי כל ליפוזומים בהרכב זהים. עם זאת, ערכי הרכב-ממוצעים נכונים רק אם ערכת הנתונים הבסיסית מופצת באופן אחיד סביב הערך הממוצע, אך יכולה לייצג מסקנה שקרית ומשוחדת אם ערכת הנתונים כוללת אוכלוסיות עצמאיות מרובות, לדוגמה. בנוסף, בהנחה כי ההרכב מתכוון לייצג את כל האוכלוסייה יכול להתעלם המידע שעמום בתוך האינגניות בין ליפוזומים. רק לאחרונה יש מספר כמותי התפתחה כי הם מסוגלים לחקור ליפוזומים בודד, חשיפת מיני הומומטר גדול בין ליפוזומים בודדים ביחס למאפיינים הפיזיקליים חשוב כולל ליפופי גודל4, הרכב ליפיד5,6, ו-כימוס יעילות7, הדגשת החשיבות של ליפוזומים ברמת ליפו
אזור מחקר שבו אנסמבל ממוצע של ליפוכמה נכסים הוכח לתוצאות הטיה הוא לומד ליפופי מספר אינטראקציות חלבונים-ממברנה תלויי-גודל8,9. באופן מסורתי, החוקרים לומדים תהליכים כאלה הוגבלה להכנת ליפוזומים עם קטרים שונים הממוצע האנסמבל ידי שחול באמצעות מסננים עם מידות נקבוביות שונות9. עם זאת, לחילוץ הקוטר של ליפוזומים בודדים באמצעות ליפולי בודד כמה בחני חשף האוכלוסייה הגדולה חופפים, עם הבלטת ליפוזומים באמצעות 100 ננומטר ו 200 ננומטר מסננים המציגים עד 70% חופפים בהתפלגות גודלם4. זה יכול באופן חמור הטיה מדידות בצובר של ליפוכמה בגודל תלויי חלבון ממברנה אינטראקציות10. ביצוע לימודי האינטראקציה עם חלבון הממברנה באמצעות ליפובי היחיד, החוקרים במקום ניצל את גודל-פולידידיש בתוך המדגם, ומאפשר להם ללמוד מגוון רחב של ליפופי קטרים בתוך כל ניסוי בודד, הקלה תגליות חדשות של איך עקמומיות ממברנה הרכב יכול להשפיע על גיוס חלבונים לממברנות4,11,12 שדה נוסף שבו היישום של ליפולי בודד כמה בחני יש הוכיחה אינסטרומנטלי הוא במחקרים מכניסטיים של חלבון מתווכת ממברנה פיוז'ן13,14. עבור מדידות קינטית כזו, היכולת ללמוד אירועי היתוך בודדים להקל על הצורך בסנכרון ניסיוני של תהליך היתוך, ומאפשר תובנות מכניסטיות חדשות שאחרת אבדו בחישוב ממוצע הזמן הזמני של הרכב בכמויות גדולות. בנוסף, ליפוזומים בודדים שימשו כפיגום קרום, המאפשר את המדידה של חלבונים בודדים ומציע ידע חדשעל הדינמיקה הקונסטרוקטיבית חלבוןמבנית 15,16. יתר על כן, הגדרות כגון פרוטאוליפוכמה מבוסס מבוססי שאפשרו ללמוד את הפונקציה של מובילים בודדים חלבון טראנסממברנלי17 הנקבוביות מכלולי חלבון מתחמי18 , כמו גם את המנגנון של ביואקטיבית ממברנה החדירות-פפטידים19. ליפוזומים בודדים יש גם בשימוש כמו nanofluiאידיקה של חומר רך עם פני השטח ליפוזומים יחיד לשמש לתאי התגובות אנזימטיות בכרכים של 10-19 L, הגדלת התפוקה והמורכבות של בחני ההקרנה הקרנת המוצר עם צריכת מוצר מינימלי20.
לאחרונה, ליפולי בודד מסוימים שימשו לאפיון ליפוזומים של משלוחי סמים ברמת פירוט בעבר לא מראש. החוקרים היו מסוגלים לכמת משמעותי המגון eities בכמות של פולימר מחובר למשטח של ליפוזומים בודדים21. ליפומים בודדים כמה בחני מותר גם מדידות של ליפוזומים משלוח סמים במדיה מורכבת, כגון פלזמה דם, חשיפת כיצד אלמנטים מעוגן ליפופי כמה משטח באמצעות עוגנים שומנים בדם יכול להיות פגיע לדיסוציאציה כאשר ליפוזומים חשופים לתנאים לחקות אותם מנוסים במהלך vivo מחזור22. בסך הכל, צדדיות והשימושיות של ליפופי בודד מתימוכין על ידי מגוון גדול של בעיות כיוונונים אלה המועסקים לכתובת, ואנו לדמיין כי המתודולוגיה תמשיך להתפתח ולמצוא שימוש בתחומים מדעיים חדשים.
כאן אנו מתארים ליפוכי מיקרוסקופ בודד מבוסס על בסיס אחד מסוים המאפשר ליפוזומים בודדים ללמוד באופן תפוקה גבוהה (איור 1). כדי להמחיש את השיטה, אנו משתמשים בו כדי לכמת את הגודל והסדר הפנימי בין ליפוזומים נפרדים בתוך הרכב. המנה מעסיקה הדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ליפוזומים בודדים מקיבוע על משטח זכוכית פסיבי. אנו מתארים תחילה את השלבים הקריטיים בליפומה תהליך הייצור המבטיח ליפובי פלורסנט מתאים לתיוג ולשתק. לאחר מכן, אנו מתארים את ההכנה לפני השטח הדרוש כדי להקל על היפוטיזציה לפני חלוקת ההליך להבטחת ליפומים מתאימים בצפיפות המשטח. אנו דנים בפרמטרי המיקרוסקופיה החשובים לרכישת תמונות באיכות גבוהה ולתיחום כיצד לבצע ניתוח נתונים פשוט, ולאפשר הוצאה של ליפופי גודל והומוגניות. פרוטוקול גנרי זה אמור לספק בסיס טוב לחוקר המעוניין לפתח את הבדיקה הנוספת לעניין המחקר הספציפי שלו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ליפומין הכנה
הערה: בקצרה, הכנת ליפוזומים כוללת בדרך כלל שלושה צעדים קריטיים: 1) הכנת סרטי השומנים היבשים של הרכב השומנים הרצוי; 2) הסבה של השומנים להיווצרות ליפוזומים; ו-3) שליטה על הגודל ועל הליגליות של האוכלוסייה ליפוכמה.
- שוקלים את השומנים וממיסים אותם ב tert-butanol: מים (9:1) בבקבוקונים זכוכית.
- התמוססות POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-גליקו-3-פוספולולין; MW = 760 g/מול) עד 50 mM.
- התמוססות הכולסטרול (MW = 387 g/מול) עד 25 מ"מ.
- התמוססות סמים-Atto488 (1, 2-dioleoyl-sn-גלילארו-3-פוספופאנאואמין-Atto488; MW = 1,316 g/מול) עד 0.1 mM.
- התמוססות סמים-Atto655 (1, 2-dioleoyl-sn-גלילארו-3-פוספופאנאואמין-Atto655; MW = 1,368 g/מול) עד 0.1 mM.
- התמוססות DSPE-PEG2000-ביוטין (1, 2-distearyl-sn-מלגליקו-3-פוספולטאואמין-N-[ביוטיקסיל (פוליאתילן גליקול)-2000]; MW = 3,017 g/מול) עד 0.1 mM.
הערה: מחממים את השומנים עד 55 ° צ' ומשתמשים בערבוב מגנטי כדי להבטיח פירוק מלא של השומנים. לחלופין, השתמשו באמבט sonication. מניות השומנים שאינם בשימוש ניתן לאחסן ב-20 ° c במשך מספר חודשים.
- לערבב את המניות ליפיד שהוכנו בשלב 1.1 ליחס מולרי של popc: כולסטרול: סמים-Atto488: סמים-Atto655: סמים-יתד-biotin 68.95:30:0.5:0.5, על ידי הוספת 138 μl של popc, 120 μl של כולסטרול, 500 μl של כל fluorescently תווית השומנים, ו-50 μ DSPE-פג-biotin לבקבוקון זכוכית טרי.
הערה: ליפוזה המדויק הרכב ניתן לשנות בקלות כדי לטפל בשאלה ספציפית של עניין. ראה דיון לפרטים נוספים. - שחרר את המכסה של בקבוקון הזכוכית, והקפא את הבקבוקון בחנקן נוזלי.
- ליאופליז תערובת השומנים הקפואה בלילה.
- הוסף 1 מ מ של 200 mM D-sorbitol מאגר (sorbitol מאגר) לשומנים יבש.
- מחממים את התערובת ל 45 ° c וחושפים את החום המגנטי לפחות 1 h.
הערה: על המאגר לשקף את השאלה הספציפית הנדונה (למשל, תנאים פיסיולוגיים ללימוד אינטראקציות ממברנה-חלבון, או מאגר ספציפי מאושר קליני לחקר ליפוזומים באספקת סמים). עם זאת, אם מאגר מסוים אינו נדרש לצורך המחקר, ניתן להחיל מאגר ללא יונים על מנת להקטין את הריבוי של הליזומים. - להקפיא את ההשעיה ליפיד על ידי טבילה במבחנה בחנקן נוזלי, ולחכות עד ההשעיה קפואה לחלוטין.
- טובלים את ההשעיה הקפואה באמבט חימום ב-55 ° c עד שהתערובת מופפה לחלוטין.
- חזור על שלבים 1.7 ו 1.8 עד ליפוכמה ההשעיה נחשף סך של 11 מחזורי הקפאה/הפשרה.
הערה: מחזורי הקפאה/הפשרה חוזרות ונשנות הראו להפחית את הלייפוזציה23, שהיא בעלת חשיבות עליונה לדיוק של ליפובי היחיד, כאשר ליפוזומים רב למינלי יהיה להטות את עוצמת הקרינה לעומת ליפוקו יחס גודל של ליפוזומים. מרבית המלונות בדרך כלל מאוד נמוכים כאשר כוללים יותר מ-0.5% השומנים בניסוח (כגון נעשה בדרך כלל בליזומים לאספקת סמים)24. - הבלטת ליפומה ההשעיה פעם אחת דרך מסנן פוליקרבונט 800 ננומטר באמצעות ערכת הבלטה מיני. בצע את הוראות היצרן להרכבת ערכת ההבלטה (ראה טבלת חומרים).
- אחסן את הליזומים ב -4 ° c בלילה.
2. הכנת פני שטח לחדר הדמיה
- להכין סרום האלסמין (BSA; 1 מ"ג/mL), BSA-biotin (1 מ"ג/mL) ו streptavidin (0.025 mg/mL) ב 10 מ"מ HEPES (4-(2-הידרולוקסיל) -1-החומצה הפפרילאנאנייתהסינית) 95 מ"מ מאגר (מאגר HEPES).
הערה: כדי למנוע פרץ ליפוזומתית, מאגר סורביטול המשמש לשימוש חוזר ומאגר hepes המשמש להכנה לפני השטח צריך להיות איזוטוניק. לכן מומלץ לבדוק את האוסמגליות של המאגרים לפני הניסוי. - מערבבים 1,200 μL של BSA ו 120 μL של BSA-biotin ולהוסיף 300 μL של התערובת לכל טוב ב 8 שקופית גם עבור מיקרוסקופ.
הערה: כאן אנו משתמשים מסחרית זמין 8 מיקרוסקופ טוב עם תחתית זכוכית (ראה שולחן חומרים), אבל הפרוטוקול יכול בקלות להתאים לתאי מיקרוסקופ מותאמים אישית. - מודיית את השקופית במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- שטוף את השקופית 8x עם 300 μL של מאגר HEPES.
הערה: היזהרו לא לעזוב את הבארות ללא מאגר במשך יותר מכמה שניות, כמו לייבש את פני השטח יפגע בו. יתר על כן, להיזהר לא לשרוט את פני השטח עם העצה הפיפטה כמו זה יהיה גם נזק זה. לכן, כאשר משפל את החוצץ מבאר, עשה זאת מהקצה או מהפינה. - הוסף 250 μL של streptavidin ו-דגירה עבור 10 דקות ב RT.
- חזור על 8 שוטף המתואר בשלב 2.4.
- אחסן את שקופית המיקרוסקופ עם 300 μl של מאגר סורביטול בכל באר ב-4 ° c. אידוי של הממס יפגע את פני השטח, כך לשים את שקופית המיקרוסקופ בצלחת פטרי ולחתום אותו עם parafilm אלא אם השקופית מוכנה משמש מיד.
3. ליפוזציה
- לדלל את הליפוכמה השעיה על 20 μm סה כ השומנים במאגר סורביטול. ההליך בסעיף 1 תניב ליפוכמה השעיה של כ 10 מ"מ השומנים הכולל.
- מניחים את השקופית על המיקרוסקופ ומתמקדים על פני השטח של התא באמצעות אות השתקפות לייזר מוגבר מממשק זכוכית/מאגר כמדריך.
- רוחצים את חדר 4x עם 300 μL של מאגר HEPES טרי.
- הוסף 10 μL של ליפומטר מדולל מניות (20 μM השומנים הכולל) לצינור מיקרוצנטריפוגה.
- להוציא 100 μL של מאגר מהתא, להוסיף את צינור מיקרוצנטריפוגה מוכן בשלב 3.4, לערבב כראוי, ולשים את 110 μL חזרה לתוך החדר.
- לשים את הדגימה מתחת למיקרוסקופ, ולהשתמש הגדרת מיקרוסקופ רודינטלית מסוגל לזהות אות מתוך ליפופי כמה fluorophore (s) כדי להתבונן ליפוזומים להיות מנופף על פני השטח.
- המטרה עבור ליפוכמה צפיפות פני השטח כי הוא בו דליל מספיק כדי להשבית ליפוזומים בודדים צפוף מספיק כדי לסייע מדידות תפוקה גבוהה. בדרך כלל שימוש בשדה מ50 יקרומטר x 50 יקרומטר של השקפה, 300 ליפוזומים לכל מסגרת מיטבית (איור 2). ניתן להשיג זאת בדרך כלל תוך 5 עד 10 דקות.
הערה: אם מזוהים רק חלקיקי פלורסנט הנעים במהירות בשדה הראייה, היעדרות או ריכוז נמוך מדי של כל אחד מהרכיבים הקריטיים לתהליך השתק (BSA-biotin, streptavidin, סמים-יתד-biotin) עשוי להיות הגורם. אם לא מזוהים ליפוזומים זה יכול להיות קשור לריכוז נמוך של ליפוזומים, הגדרות לא נאות עבור גילוי הקרינה, או להדמיה עם מטוס מוקד לא במשטח הזכוכית. - לאחר ליפופי מתאים מסוימים צפיפות המשטח הוא הגיע, לשטוף את חדר 3x עם 200 μL של מאגר HEPES.
הערה: הקפד לשים לב כי הקינטיקה המשתק תלויה גם ביפופי מאפיינים כגון גודל וחיוב, ולכן צריך תמיד להיות ממוטב עבור כל ליפושים בניסוח.
4. רכישת תמונה
הערה: סעיף זה יהיה תלוי הרבה על מערכת המיקרוסקופ זמין לחוקר ביצוע הניסוי. לפיכך, ההנחיות הכלליות לביצוע ההדמיה יוסברו. עם זאת, את ההגדרות המדויקות וכיצד להחיל אותם ישתנו בין הגדרות המיקרוסקופ השונים. לדוגמה, מערכות מסוימות מאפשרות בחירה בכל שילוב של מסנני פליטה הרצויה, בעוד שיקרוסקופים אחרים מצוידים במסננים ספציפיים ומוגדרים מראש.
- הגדר את המיקרוסקופ ליצירת ליפוזומים בודדים. כדי להבטיח איכות תמונה אופטימלית וניתוח נתונים בעקבות השימוש ברזולוציה גבוהה של גוני אפור וערכת פיקסל המאפשרת ליפוזומים בודדים. עומק קצת של 16 ו לפחות 1,024 x 1,024 פיקסלים עבור 50 יקרומטר x 50 האזור יקרומטר מומלץ. אם זמין, קו-ממוצע יכול טובה להיות מוחל על הפחתת רעש (למשל, 3 סריקות לכל שורה).
- בחר כוח לייזר עירור ששניהם מבטיח מסגרת למסגרת משמעותית הלבנת ואות חזקה מספיק כדי להפלות באופן ברור ליפוזומים בודדים מהרקע. ההגדרה האופטימלית תהיה תלויה במיקרוסקופ הספציפי המשמש כמו גם שילוב fluorophore. ודאו שגלאי הגלאים אינם רוויים, משום שפעולה זו מהווה הטיה בעוצמת הקוונדות.
- הדמיה הן סמים-Atto488 ו-סמים-Atto655 fluorophores ב ליפוזומים דורש הדמיה של ערוצים מרובים. לכן, ודא שכל אחד מהערוצים מחושב ברצף כדי להימנע מעירור צולב. לדוגמה, ראשית לצלם תמונה אחת על ידי מרגש ב 488 ננומטר ופליטת הקריאה ב 495-560 nm. לאחר מכן, לקחת תמונה נוספת על ידי מרגש ב 633 ננומטר אבל קריאה בלבד 660-710 nm. הפרטים יהיו תלויים במערכת המיקרוסקופ (למשל, אשר לייזרים ומסננים) זמין.
- הקפידו לכסות אזורים שונים של פני השטח, לרכוש לפחות 10 תמונות של המדגם, ובכך הדמיה לפחות 3,000 ליפוזומים בודדים. אם צפיפות פני השטח נמוכה מ 300 ליפוזומים/מסגרת, לרכוש תמונות נוספות. הקפד למקד מחדש את המיקרוסקופ עבור כל תמונה חדשה.
הערה: עבור הדמיה של שני ערוצים, הקפד לתת שם לקבצי התמונה כך שזוגות של תמונות עם ליפוזומים זהים בערוצי הזריחה השונים יכולים להיות מזוהים בקלות במהלך ניתוח נתונים. - כדי לכמת את חוסר הוודאות הניסיוני הנוגע למדידה של הומוגניות, התמונה באותו אזור של ליפוזומים לפני ואחרי התמקדות מחדש (ראה איור 3 ותיאור בטקסט).
- לייצא את התמונות מתוכנת המיקרוסקופ כמו קבצי tiff. לייצא את שני הערוצים של ליפוזומים אותו בנפרד.
5. ניתוח נתונים
הערה: מתוכנן במיוחד רוטינות התאמה גאוסיאנית אוטומטיות מיוחדות שהועסקו בעבר6,11,12. עם זאת, כדי להגביר את ישימות השיטה, תהליך ניתוח נתונים שניתן ליישם בקלות בכל המעבדות מתואר.
- טען את הזוג המתאים של תמונות. tiff של שני ערוצי זריחה שונים באותו שדה הדמיה לתוכנה של פיג'י (פיג'י Is רק ImageJ).
- בתפריט ' תמונה ', בחרו ' צבע' והשתמשו בפונקציה ' מזג ערוץ ' ליצירת שילוב של שני הערוצים.
- בדוק אם ליפוזומים התמונה בשני ערוצים שונים להציג לוקליזציה טובה או אם הסחף גלוי התרחש.
הערה: במקרה של הסחף בין שני ערוצי הזריחה (המזוהה כהיסט X שיטתי ושווה בין האות בשני הערוצים), ניתן לתרגם את אחת המסגרות באמצעות שינוי הצורה ≫ תרגם פונקציה בתפריט תמונה של פיג'י. עם זאת, טיפול צריך להילקח עם מניפולציה תמונה כזאת. לכן מומלץ במקום זאת להימנע מסחיפה ככל האפשר בעת הדמיה של ליפוזומים. - ודא שתוסף ה-ComDet (v. 0.3.6.1 או חדש) מותקן, או בצע פעולה זו בתפריט התוספים .
- פתח את תוסף ComDet כדי לזהות חלקיקים על ידי הולך לתפריט תוספים ובחירה comdet v. 0.3.6.1 ≫ לזהות חלקיקים.
- ב ComDet, הקפד לבחור את לזהות חלקיקים על שני הערוצים פונקציה בנפרד . הגדר את המרחק המירבי בין נקודות מקומיות משותפות בדומה לגודל החלקיקים המשוער. בדרך כלל, 4 פיקסלים מתאימים להגדרות המתוארות כאן.
- היחס אות לרעש צריך לאפשר זיהוי של חלקיקים אפילו עמום עם כמות נמוכה של זריחה. ב ComDet, להגדיר את היחס הזה ל 3 על ידי הגדרת רגישות של איתור בשני הערוצים חלקיקים עמום מאוד (SNR = 3).
הערה: בעוד ערך SNR זה מתאים בדרך כלל, ייתכן שיהיה צורך להגדיר אותו גבוה יותר (למשל, אם יש הרבה רעש התמונה שניתן לזהות כמו ליפוזומים ולהוביל חיוביים שווא). - ודא שהתיבות המכילות את ההתאמה לשפות אחרות וחלקיקים שאותרו בשני הערוצים נבדקים, לפני שתקיש על אישור.
- לאחר הפעלת הניתוח, יופיעו שני חלונות מוקפצים עם תוצאות ותקציר . יצא את תוצאות טבלת הנתונים המכילות את נתוני הלוקליזציה (קואורדינטות חלקיקים ועוצמה משולבת של כל חלקיק שזוהה) לתוכנת טיפול בנתונים של בחירה על-ידי שמירת הטבלה כקובץ. txt וייבואם לתוכנה.
- ודא כי כל ליפוכמה נכלל רק פעם אחת בערכת הנתונים ולא הן channel1/channel2, כמו גם channel2/channel1 יחס. לכן, סנן את הנתונים כך שרק Abs_frame = 1 יותוו בשלב 5.11.
הערה: על-ידי בחירת מקומי = 1, ניתן להסיר תוצאות חיוביות שגויות מרעש בתמונות מהניתוח. עם זאת, כל ליפוזומים עם רק אחד משני רכיבי פלורסנט הנוכחי יהיה גם נשלל מהניתוח, ובכך פוטנציאל הסרת נקודות נתונים חשובים מהניתוח. - התווה היסטוגרמה של העמודה עם נתונים המכילים את יחס העוצמה עבור כל ליפומה שאותר.
- מידת ההומוגניות עבור מערכת ליפוזומלית למדה מיוצגת על ידי רוחב של התפלגות יחס אינטנסיביות. כדי לכמת את הסטיות, התאם את יחס העוצמה להיסטוגרמה באמצעות פונקציה גאוסיאנית וחלץ את הממוצע (μ) ואת סטיית התקן (סיגמא). עיין בסעיף תוצאות הנציג.
- כעת ניתן לחשב ערך עבור מידת האינגניות (DI) באמצעות מקדם הווריאציה המוגדרת כ-DI = סיגמא/μ.
6. ליפופי גודל כיול
- להוציא חלק ליפוכמה מלאי, ו הבלטת 21x דרך מסנן פוליקרבונט 50 ננומטר כמתואר בשלב 1.10.
- לדלל את ליפוזומים על ידי הוספת 10 μl של ליפופי כמה ההשעיה כדי 800 μl של מאגר סורביטול בשפופרת מיקרוצנטריפוגה.
- להעביר את ליפוזה מדולל מדגם לקובט לשימוש יחיד פוליפרופילן.
- מדדו את הגודל באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS). לבצע לפחות שלושה מסלולים עצמאיים כדי למדוד את גודל ומפזרים של ליפוכמה ההשעיה.
הערה: במקרה הצורך, השתמש ביפופה מרוכז יותר למדידה. חלופות DLS (למשל, ניתוח מעקב ננו-חלקיק) ניתן גם להחיל על מדידת הגודל של ליפוזומים. תיאור של אופן הביצוע של קביעת גודל החלקיקים הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה. - תמונה ליפוזומים כיול על המיקרוסקופ תוך שימוש בדיוק באותן הגדרות נסיוניות כפי שהוגדרו בשלבים 4.1 ו 4.2.
- לחלץ את העוצמה המשולבת עבור כל ליפופי כיול בתמונות כיול: לחלץ את גיליון התוצאות מסוננים המכיל ליפוכמה עוצמות הזריחה כפי שמתואר בשלבים 5.1-5.10. מטבלת התוצאות, חלץ את העמודה "אינטנט Int".
- בגלל העוצמה המשולבת הכולל של ליפוכמה המסומנים בקרום שלה הוא פרופורציונלי לאזור פני השטח של ליפוכמה, ולכן הוא פרופורציונלי לריבוע הקוטר שלה, העלילה השורש הריבועי בעוצמה היסטוגרמה של העוצמה הפלואורסצנטית של ה ליפוזומים כיול.
- להתאים את היסטוגרמה עוצמה משולבת המיוצר בשלב 6.7 עם התפלגות רגילה יומן ולחלץ את העוצמה הפלואורסצנטית הממוצע של ליפוזומים כיול.
- כדי לקבוע את הקשר בין עוצמת השורש הריבועי (IntSqrt) ליפופי גודל, לחשב את פקטור תיקון (ג) באמצעות ליפופי ממוצע בקוטר (Dia) שוקלת את המספר שהתקבל מדידות DLS: Dia = c x intsqrt הוא שווה ל C = Dia/intsqrt.
- חישוב ערכי IntSqrt עבור היפוזומים בניסוי ההומוגניות והמירו אותם לקטרים על-ידי הכפלה בפקטור התיקון.
- התווה את ערך יחס העוצמה כפונקציה של קוטר ליפוזומים המתנומיים של הקומורים, ובכך משיג את האינוגניות כפונקציה של ליפופי גודל עבור אוכלוסייה של ליפוזומים המשתרעים על-פני כ-800 ננומטר על-ידי 50 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול המתואר מאפשר לדמות ליפוזומים בודדים בצורה מקבילה מסיבית (איור 1). השטח המוצלח של ליפוזומים צריך להיות מיידי בבירור על התוספת של הפתרון ליפופי לחדר (שלב 3.6 בפרוטוקול) כנקודות עקיפה מוגבלת בעוצמה להופיע בתמונה (איור 1B ואיור 1ג).
כדי להשיג סטטיסטיקות טובות ולנצל את יכולות התפוקה הגבוהה של היכולת, יש ליצור בתמונה כמה אלפי ליפוזומים. על מנת לעשות זאת במספר סביר של תמונות, מומלץ לשתק מספיק ליפוזומים כדי להגיע לצפיפות של 300 ליפוזומים במסגרת, כמו זה יביא את מספר התמונות לכל מדגם עד ~ 10, ובכך להגביל את מספר התמונות שיש לרכוש ולנתח. צפיפות נמוכה יותר תהפוך את ניתוח הנתונים לארוך יותר זמן, בעוד צפיפות גבוהה יותר יכול לעשות את זה מאתגר עבור תוכנת ניתוח התמונה כדי להבדיל ליפוזומים בודד. כדי לקבל רושם חזותי של מה שנראה. כמו 300 ליפוזומים, ראה איור 2 יש לציין, עם זאת, כי עבור יישומים מסוימים (למשל, אינטראקציות חלבון ממברנה עם חלבון שנוטה לעורר כריכת רקע חזק אל פני השטח BSA) מומלץ להשתמש בצפיפות מעט נמוכה יותר, כגון באיור 2a בחלק העליון של הימנית.
לעיתים, בעת רכישת תמונות קשה להשיג את כל השדה של התצוגה בפוקוס הנכון, כפי שמודגם באיור 2ב. בעיות כאלה עשוי לציין כי צלחת המדגם הוא הטיית, אשר יכול לנבוע הצלחת לא להיות ממוקם כראוי על מחזיק הדגימה על המיקרוסקופ. כמו כן, אם הליזומים נראים גדולים ומטושטשים, המאגר בחדר עשוי היה להיות התאדה והמשטח התייבש. חשוב במיוחד לשמור על בעיה זו במקרה של הדמיה לפרקי זמן ארוכים או בעת ביצוע מדידות בטמפרטורות גבוהות מ-RT. כדי להמחיש את ההבדל בין מאוחסן כראוי ליפוזומים מיובשים, תמונה של המדגם אותו לפני ואחרי ייבוש החדר מוצג באיור 2ג.
לאחר שהבטיח איכות תמונה אופטימלית, העוצמה המשולבת עבור כל ליפותיים בשני ערוצי ההדמיה ניתן לחלץ בעקבות השלבים בסעיף 5 של פרוטוקול זה. פעולה זו תיצור רשימה של ערכי עוצמה ייחודי, המאפשר לנו לחשב את יחס האינטנסיביות עבור כל ליפופי בודדים. הערכים האינטימיים מוערכים מיחס היסטורגרמות בעצימות, בדרך כלל חושפים התפלגות גאוסיאנית סביב ערך יחס ממוצע (איור 3א). שים לב שאם סטיות חזקות מהתפלגות גאוס מוצגות (איור 3ב), היא מציינת בעיה של רגישות לאיתור עבור לפחות אחד מערוצי ההדמיה, ומציעה שקבוצת משנה של ליפוזומים המציגה אות חלש יותר לא נכללו. זה יכול להיות בגלל מגבלת הזיהוי של מערכת ההדמיה, או למעט ליפוזומים בניתוח נתונים (למשל, בעת החלת סף מינימלי מסוים; ראה שלב 5.7).
חישוב ערך ה-DI כפי שמתואר בצעדים 5.11-5.13 בפרוטוקול יספק מידה כמותית של ההומוגניות בין היפוזומים בודדים של ההכנה. עבור מערכת ליפוזומיום למד כאן, DI = 0.23 ± 0.01 (איור 3ג). ערך זה יכול לשמש כדי להשוות באופן שיטתי כיצד ליפוכמה מאפיינים או שיטות הכנה משפיעים על ההומוגניות. כדי להציג את המשמעות של ערך DI, אנו מתייחסים התפלגות נורמלית המוצגת על ידי היסטוגרמה יחס האינטנסיביות, כלומר הם יצייתו -95 99.7 הניסיוני 68 הכלל. כלל זה מתאר את אחוז האוכלוסיה הנופל בתוך אחת, שתיים ושלוש סטיות סטנדרטיות סביב הערך הממוצע. עבור ערך DI של 0.23 ± 0.01 נמצא כאן, משמעות הדבר היא כי 32% של ליפוזומים באוכלוסיה יהיה יחס אינטנסיביות שונה על ידי יותר מ 23% מן היחס מרושע של ההרכב (איור 3D).
עבור ניסוי בקרת הדמיה באותו ליפוזומים לפני ואחרי התמקדות מחדש (סעיף 4.6), את אותו ניתוח נתונים התוויית התוצאה של הניסוי בפועל מבוצע. פעולה זו מאפשרת לכמת את חוסר הוודאות הניסיוני של ערך DI, אשר נמצא להיות DIאי-ודאות = 0.10 ± 0.01 (איור 3E). למרות שערך דיודאות יהיה תלוי במערכת הדמיה מועסקים, הוא נמצא כי הגדרות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בעקביות להצמיח ערכים דיודאות של סביב 0.105,6. ערך ה-DI של DI = 0.23 ± 0.01 נמצא עבור מערכת ליפוזומלית כאן הוא יותר מפעמיים אי ודאות ניסיוני, אשר מציע נוכחות של הומוגניות משמעותית בין ליפוזומים בודדים של ההכנה.
ביצוע ניסוי כיול הגודל המתואר בסעיף 6 יאפשר ליפוכי שרירותי ערכים בעלי עוצמה להיהפך לקטרים פיזיים ב-nanometers. השיטה אומתה כנגד טכניקות דימות אחרות25 כגון מיקרוסקופ אלקטרוני קריוגני, אשר יש לו יכולת לפתור בצורה מלאכותית את ליפוזומים בגודל nanometer, אם כי עם תפוקה נמוכה הרבה יותר. הדמיה של דגימת השליטה באמצעות הגדרות מיקרוסקופ בדיוק כפי שנעשה בשימוש עבור ניסויים בפועל, כעת ניתן לתאם את ליפופי משמעות בעוצמה ליפוכי משמעות בקוטר נקבע על ידי DLS (איור 4א). השלב הבא הוא לתאר את ליפוכמה התפלגות בעצימות, אשר בהתבסס על האילוצים הפיזיים נגד יצירת ליפוזומים קטנים מאוד, בדרך כלל להציג התפלגות רגילה יומן (איור 4ב). אם ההתפלגות אינה מתוארת היטב על-ידי רישום התפלגות נורמלית (בדרך כלל בשל ליפוזומים חסרים עם ערכים בעצימות נמוכה) זה אומר שחלק של האוכלוסייה חלק ליפוקה לא נכלל עקב רגישות נמוכה לזיהוי מיקרוסקופ או פרמטרים קפדנית מדי במהלך ניתוח נתונים (איור 4ג). חשוב לתפוס ולטפל בנושאים אלה כדי להבטיח פרשנות נתונים לא משוחדת. בשלב הבא, ניתן להמיר את ערכי העוצמה של כל ליפופי הפרט באיור 4ב' לקטרים בפועל באמצעות פקטור התיקון שנקבע באיור 4א (איור 4ד). לאחר קביעת הגודל של כל ליפוכמה, DI כפונקציה של קוטר יכול עכשיו להיחקר על ידי התוויית היחס האינטנסיביות לעומת קוטר עבור ליפוכמה בודדים (איור 4E). מבנה הנתונים הדומה למשפך זה מאשר את הממצאים המוקדמים שערך ה-DI מגדיל כאשר ליפופי גודל מקטין את6. וחשוב מכך, העלייה הסימטרית בהתפשטות יחסי האינטנסיביות סביב ערך ממוצע מרמזת על כך שאין וריאציה תלוית-גודל שיטתית בהרכב הממוצע של ליפוזומים.
איור 1: ליפוזה בודד מסוים. (א) ליפוזומים מנוסחים עם תוכן שווה התווית של ליפידים שכותרתו סמים-Atto488 ו-סמים-Atto655 ו קיבוע על משטח bsa באמצעות הצמדה biotin/streptavidin. (ב) ליפוזומים ללא קיבוע הם התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, המאפשר זיהוי של עוצמות הזריחה של הליזומים בודדים. קנה מידה ברים = 8 μm. (ג) זום של האזור הירוק ב (ב) מתואר מגרש בעוצמה משטח עבור שני ליפוזומים סמוכים המציגים אות פלורסנט הפוכה בין שני הערוצים, הממחישות את המושג של הומוגניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אופטימיזציה ומלכודות. (A) השמאלית העליונה מראה 29 ליפוזומים מקיבוע ב-50 יקרומטר x 50 יקרומטר מסגרת. אלה הם מעט ליפוזומים לכל מסגרת כדי לנצל את האפשרות לחקירת תפוקה גבוהה של ליפופי הומוגניות. הימנית העליונה מראה 123 ליפוזומים לכל מסגרת. זוהי צפיפות תת-אופטימלית, אך ניתן להשתמש בה אם רכשת תמונות רבות. השמאלית התחתונה מראה 300 ליפוזומים לכל מסגרת. זה אופטימלי עבור הפרוטוקול המתואר כאן. הימנית התחתונה מראה יותר מ 1,500 ליפוזומים לכל מסגרת, אשר רבים מדי כדי להבדיל ליפוזומים בודדים. יש סיכון גבוה כי נקודה אחת יהיה בעצם שני ליפוזומים מקיבוע בתוך אותה נקודה מוגבלת עקיפה. (ב) אם החדר אינו ממוקם כראוי הדגימה, מקבל את כל השדה של השקפה בפוקוס הנכון יהיה בלתי אפשרי. במיקרוגרף השמאלי הצלחת מסתובבת מסביב לציר החוצה, ומעניקה לפינה השמאלית התחתונה מחוץ לפוקוס. במיקרוגרף הימני הצלחת מטיית סביב ציר האורך, ומעניקה להטיה כבדה יותר. שתי הפינה השמאלית התחתונה והימנית העליונה מחוץ לפוקוס. (ג) אם הדמיה לפרקי זמן ארוכים או בטמפרטורות גבוהות, המאגר עלול להתאדות, דבר שיוביל לייבוש מחוץ לחדר. אנו מומחש כאן התרחיש הזה על ידי ליפוזומים הדמיה לפני ואחרי החדר נותר להתייבש למשך 3 דקות, ואז מחדש על ידי הוספת מאגר טרי לחדר. ליפוזומים וכתוצאה מכך גדול יותר, מטושטש, יש עוצמת קרינה נמוכה יותר, ונראה להתפשט על הצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יחס עוצמת היסטגרמות עבור כימות ליפובי מספר הומוגניות. (א) יחס האינטנסיביות של סמים-Atto488 ו-Atto655-הקרינה של סמים עבור כל ליפופי בודדים המותווים כהיסטוגרמה. (ב) התפלגות גאוסימית קטומה המדגימה את בעיית הרגישות הפוטנציאלית, במהלך הדמיה או בשלב הטיפול בנתונים. (ג) התאמת היסטוגרמה האינטנסיביות באמצעות פונקציה גאוסיאנית מאפשרת לחלץ את הממוצע וסטיית התקן המשמשים לחישוב ערך ה-DI. (ד) ערך די של 0.23 יכול להיות מתורגם ל 32% של האוכלוסייה שונה על ידי יותר מ -23% מן היחס ממוצע טוחנת של ההרכב. (ה) ניסוי בקרת הדמיה של ליפוזומים זהה לפני ואחרי התמקדות מחדש ולאחר מכן ביצוע אותו תהליך טיפול בנתונים כמו עבור הניסוי בפועל. הדבר מאפשר לקבוע את השגיאה הניסיונית עבור הקוונפיקציה של DI. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: המרת ליפוכמה אינטנסיביות לקוטר הפיזי של ננומטר. (א) היסטוגרמה ליפוזומים של 50 ננומטר לעומת נתוני DLS על מנת לקבוע את פקטור הכיול. (ב) היסטוגרמה של ערך Intsqrt מהיפוזומים הניסיוניים מניבה בדרך כלל התפלגות באופן נורמלי בגלל האילוצים הפיזיים נגד יצירת ליפוזומים קטנים מאוד. (ג) היסטוגרמה לא-נורמלית של Intsqrt מציינת בעיות עם רגישות לזיהוי או שליפוזומים קטנים לא נכללו במהלך טיפול בנתונים. (ד) ליפופי עוצמות ב (ב) מומרים ליפובי בפועל מספר קטרים באמצעות פקטור התיקון. (ה) יחס האינטנסיביות של כל ליפופי התוויה כפונקציה של ליפוכמה בקוטר יכול כעת להיות מוצג המאפשר חקירה של הומוגניות כפונקציה של ליפופי גודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חשוב לציין כי בעוד אנו מתארים בפרוטרוט כיצד שיטת ליפוזומים בודדים ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההומוגניות בין ליפוזומים בודדים, הפלטפורמה היא מאוד צדדי. כפי שהוצג בעבר ונדונו במבוא, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם כדי ללמוד היבטים של היתוך קרום קרום, החלבונים-ממברנה האינטראקציות, או ליפוזומא האפיון הספק התרופה. עבור כל שאלה מדעית להיות ממוען, הכוח של ליפופה אחת הכדאיות טמון ביכולת לזהות את הרכיבים הבודדים של ההרכב, ובכך בעל הבדיקה הכמותית, לא מוטה על ידי אנסמבל ממוצע אפקטים.
ליפובי היחיד מתאים באופן אופטימלי ליצירת הדמיה של פני השטח כגון השתקפות פנימית מוחלטת או מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, שבו הנקודות כיוון Z יכול לחסל את הרקע לא רצוי מהפתרון מעל ליפוכמה שכבה. עם זאת, היבט זה הוא החשוב ביותר עבור מחקרים בהם התווית באופן פלואורוסקופים, כגון פפטידים, חלבונים, או ליפוזומים אחרים נוספים לפתרון ולהישאר שם במהלך הדמיה. לדוגמה, אם נעשה שימוש בבקשה בתבנית המתוארת בפירוט כאן, כאשר צבעי הפלורסנט מוגבלים לליפוזומים הניתנים לקיבוע, ניתן לבצע את היכולת בעיקרון באמצעות מיקרוסקופ נרחב יותר בשטח רחב יותר, ולספק את הזיהוי מערכת רגישה מספיק
א-פריורי אין מגבלות ביחס לשיטה המשמשת להכנת הליזומים המשמשים בתוך הבחינה. כאן אנו מתארים בפרוטרוט את השימוש בטכניקת ייבוש הקפאה. עם זאת, כלורופורם בעבר מבוססי שומנים בדם או שיטות הזרקת אתנול שנעשו ליפוזומים בשימוש באולם5,6. פרמטר קריטי הוא הכללה של שבריר דקה של שומנים ביולוגיים בתערובת השומנים כדי להבטיח השתק (0.05 מול% מומלץ). עוד אלמנט הכרחי הוא לכלול כמות קטנה של שומנים בעלי תווית השומנים. בסך הכל, את הכמות של ליפיד-צבע נוסף יש לשמור נמוך ככל האפשר הן להימנע השפעות מקוצ'ינג וכדי למנוע את השומנים-לצבוע מתוך שינוי משמעותי את המאפיינים הפיזיקליים של ליפוכמה. הגבול התחתון של כמות לצבוע השומנים מוגדר על ידי הריכוז, שבו וריאציה סטוכסטית במספר של צבעים בודדים השומנים ליפופי הופך משמעותי לעומת הכמות הממוצעת של צבעי השומנים (ראה לארסן ואח '6 לדיון מעמיק). הולך מתחת למגבלה זו תציג ודאות גדולה בעוצמות שחולצו. לבסוף, את כמות הצבע של השומנים צריך להיות גבוה מספיק לזיהוי מדויק של ליפוזומים בודד עם יחס טוב של אות לרעש. בעוד קריטריון זה של כמובן תלוי במערכת הדמיה, מצאנו כי ריכוזי צבע שומנים בין 0.05 ו 0.5 מול% לעבוד היטב ברוב המכריע של המקרים.
כדי לבחור איזה צבע שומנים לכלול ליפוכמה, התנאי הראשון הוא הריגוש ומאפייני פליטה להתאים את יכולות התאורה והגילוי של מערכת ההדמיה. שנית, כדי להגדיל את הרגישות ואת הדיוק של השיטה אנו ממליצים להשתמש בצבעים עם התשואות הקוואנטים גבוהה ופוטויציבות, ואנחנו בעבר בהצלחה בשימוש צבעים עם אורכי גל עירור שונים6,11. הטיפול צריך להילקח בבחירת עוגנים ליפיד עם תכונות כימיות דומות, כדי להבטיח כי חלוקת השומנים אינה מובילה לחוסר הומוגניות גבוהה באופן מלאכותי. לדוגמה, עבור פרוטוקול זה, יש לנו מעוגן גם fluorophores באמצעות סמים, בעוד שיש fluorop, אחד על סמים ועוד על DPPE יכול להוביל fluoropהור הטרוליקשרים שאינם קשורים האינגניות הטבועה באוכלוסייה ליפוכמה. במיוחד עבור הדמיה בצבע כפול חשוב לבחור צבעים עם עירור צר ספקטרום פליטה ואת החפיפה הספקטרלי הקטן ביותר ככל האפשר כדי למנוע דימום משמעותי דרך, לחצות לדבר, ואת העברת אנרגיה בתהודה הזריחה (לדאוג) בין צבעים וערוצים. כדי למנוע חפצים הקשורים וריאציה בסביבה fluorophore אנו מעדיפים לעבוד עם צבעים, אשר הוכחו בניסויים כדי להראות הנטייה הנמוכה ביותר של קרום הממברנה כפי שנקבע על ידי יוז ואח '26. לבסוף, אם ליפופי מסוים הרכב השומנים הוא לא דרישה קשה לעיצוב ניסיוני, זה יכול להיות מועיל לכלול עד 10 מול% של שומנים טעונה שלילית כדי להבטיח כי ליפוזומים בודדים להדוף אחד את השני והם מוחדרים ביעילות כמו ליפוזומים אחד12.
יתרון מסוים של ליפוא בודד הוא נפח ניסיוני קטן, אשר יכול להפחית במידה ניכרת את כמות התרכובות יקר או נדיר המשמש לכל ניסוי. כאן אנו מתארים את השימוש בתאים סטנדרטיים וזמינים מסחרית עם נפח ניסיוני בין 150 – 300 μL. אולם, חדרי מיקרוסקופ מתוצרת אישית שיכולים להקטין את עוצמת הקול לטווח של 50 – 80 μL ניתן להשתמש. כמו כן, ליפוכמה הצריכה היא נמוכה מאוד, עם ריכוז סופי סביב 2 μM סה כ השומנים.
חיסרון של ליפובי היחיד הוא שקשה לשלוט בריכוז השומנים בחדר בשל הווריאציות בנטיות השתק שתוארו לעיל. בנוסף, ביחס ליישום היכולת ללמוד אינטראקציות ממברנה-חלבון, הוא מאתגר לקבוע את הריכוז או מספר החלבונים המאוגדים ישירות מעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית.
כאשר משתמשים בליפוזומים באותה השיטה כמו מערכות מודל ממברנה (למשל, כדי ללמוד את האינטראקציה הממברנה של תרכובות פלורסנט, פפטידים, או חלבונים) חשוב להבטיח מחייב נמוך לא ספציפי לרכיבי החלבון המקל על ה קיבעון. אם זה לא המקרה, ניתן לזהות אות רקע גבוה שעלול למנוע זיהוי של הכריכה הספציפית ליפוזומים. אם הרקע הגבוה שאינו ספציפי מזוהה, הפחיתו בעבר בהצלחה את הרקע על ידי שינוי מstreptavidin לNeutravidin או avidin.
ביצוע ליפוכמה בודד באמצעות טכניקות אחרות כגון זרימה cy, לנסות להציע תפוקה מוגברת לזיהוי לעומת השיטה המבוססת על מיקרוסקופ. עם זאת, בהינתן כי מדחום זרם ממוטב ללמוד דגימות הרבה יותר גדול ובהיר כמו תאים, מערכת האיתור של רוב אינו רגיש מספיק כדי לזהות את הקרינה החלשה יחסית של ליפופי בודדים. אז בעוד הזרימה החדשה והרגישה יותר cy, מפותחת בעזרת המיקרוסקופ המבוסס על מיקרוסקופ מציעה את הפתרון הטוב ביותר להסבר ליפופי מסוימים כאשר מבוצע ביעילות וניטור אלפי ליפוזומים לכל ניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי המועצה הדנית למחקר עצמאי [גרנט מספר 5054-00165B].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
