Summary
Este protocolo describe la fabricación de liposomas y cómo estos pueden ser inmovilizados en una superficie e imágenes individualmente de una manera paralela masiva utilizando microscopía de fluorescencia. Esto permite la cuantificación del tamaño y la inhomogeneidad compositiva entre los liposomas individuales de la población.
Abstract
La mayoría de las investigaciones que emplean liposomas como sistemas de modelos de membrana o portadores de administración de fármacos se basa en técnicas de lectura a granel y por lo tanto intrínsecamente asume que todos los liposomas del conjunto son idénticos. Sin embargo, las nuevas plataformas experimentales capaces de observar liposomas a nivel de una sola partícula han hecho posible realizar estudios altamente sofisticados y cuantitativos sobre interacciones proteína-membrana o propiedades portadoras de fármacos en liposomas individuales, evitando así errores derivados del promedio del conjunto. Aquí presentamos un protocolo para preparar, detectar y analizar liposomas individuales mediante un ensayo de microscopía basado en fluorescencia, facilitando tales mediciones de una sola partícula. La configuración permite tomar imágenes de liposomas individuales de forma paralela masiva y se emplea para revelar el tamaño intramuestra y las inhomogeneidades compositivas. Además, el protocolo describe las ventajas de estudiar liposomas a nivel de liposomas individuales, las limitaciones del ensayo y las características importantes a tener en cuenta al modificarlo para estudiar otras preguntas de investigación.
Introduction
Los liposomas son vesículas esféricas a base de fosfolípidos que se utilizan en gran medida tanto en la investigación básica como en la aplicada. Funcionan como excelentes sistemas de modelos de membrana, ya que sus propiedades fisioquímicas se pueden manipular fácilmente variando los componentes lipídicos que componen el liposoma1,2. Además, los liposomas constituyen el sistema de nanoportadores de administración de fármacos más utilizado, ofreciendo una mejor farmacocinética y farmacodinámica, así como una alta biocompatibilidad3.
Durante muchos años, los liposomas se han estudiado principalmente utilizando técnicas a granel, dando sólo acceso a los valores de lectura promedio del conjunto. Esto ha llevado a la mayoría de estos estudios a suponer que todos los liposomas en el conjunto son idénticos. Sin embargo, estos valores promediados por conjunto solo son correctos si el conjunto de datos subyacente se distribuye uniformemente alrededor del valor medio, pero puede representar una conclusión falsa y sesgada si el conjunto de datos incluye varias poblaciones independientes, por ejemplo. Además, suponiendo que el conjunto signifique representar a toda la población puede pasar por alto la información contenida dentro de la inhomogeneidad entre liposomas. Sólo recientemente han surgido ensayos cuantitativos que son capaces de sondear liposomas individuales, revelando grandes inhomogeneidades entre liposomas individuales con respecto a propiedades fisicoquímicas importantes incluyendo liposomas tamaño4, composición de lípidos5,6,y encapsulación eficiencia7, destacando la importancia de estudiar liposomas en el nivel de liposomas individuales.
Un área de investigación donde el promediado de conjunto de propiedades de liposomas se ha demostrado para sesgar los resultados está estudiando las interacciones proteína-membrana dependientes del tamaño de liposomas8,9. Tradicionalmente, los investigadores que estudian estos procesos se han limitado a la preparación de liposomas con diferentes diámetros medios de conjunto por extrusión a través de filtros con diferentes tamaños de poros 9. Sin embargo, la extracción del diámetro de los liposomas individuales utilizando ensayos de liposomas individuales ha revelado grandes solapamientos de población, con liposomas extruidos utilizando filtros de 100 nm y 200 nm que muestran hasta un 70% de superposición en su distribución de tamaño4. Esto podría sesgar severamente las mediciones a granel de las interacciones proteína-membrana dependientes del tamaño liposoma10. Realizando los estudios de interacción membrana-proteína utilizando el ensayo de un solo liposomas, los investigadores en su lugar aprovecharon el tamaño-polidispersidad dentro de la muestra, lo que les permite estudiar una amplia gama de diámetros de liposoma dentro de cada experimento individual, facilitando nuevos descubrimientos de cómo la curvatura de la membrana y la composición pueden afectar el reclutamiento de proteínas a las membranas4,11,12. Otro campo donde la aplicación de ensayos de un solo liposoma ha demostrado ser instrumental es en estudios mecánicos de fusión de membrana mediada por proteínas13,14. Para tales mediciones cinéticas, la capacidad de estudiar eventos de fusión individuales alivió la necesidad de la sincronización experimental del proceso de fusión, permitiendo nuevas perspectivas mecanicistas que de otro modo se habrían perdido en el promedio espaciotemporal realizado en mediciones de conjuntos a granel. Además, se han utilizado liposomas individuales como andamio de membrana, permitiendo la medición de proteínas individuales y ofreciendo nuevos conocimientos sobre la dinámica estructural de proteínas transmembranas15,16. Además, tales configuraciones basadas en proteoliposomas hicieron posible estudiar la función de los transportadores transmembranas individuales17 y los complejos proteicos formados poros18, así como el mecanismo de los péptidos bioactivos permeabilizadores de membrana19. Los liposomas individuales también se han utilizado como nanofluídicos de materia blanda con liposomas individuales inmovilizados en superficie que sirven como cámaras para reacciones enzimáticas en volúmenes de 10-19 L, aumentando el rendimiento y la complejidad de los ensayos de cribado con un consumo mínimo de producto20.
Recientemente, ensayos de liposomas individuales se han utilizado para caracterizar liposomas de administración de medicamentos en un nivel de detalle previamente sin pre-enpreenented. Los investigadores fueron capaces de cuantificar inhomogeneidades significativas en la cantidad de polímero unido a la superficie de liposomas individuales21. Los ensayos de un solo liposomas también permitieron mediciones de liposomas de administración de fármacos en medios complejos, como plasma sanguíneo, revelando cómo los elementos anclados a la superficie liposoma a través de anclajes lipídicos pueden ser susceptibles a la disociación cuando los liposomas están expuestos a condiciones que imitan a los experimentados durante la circulación in vivo22. En general, la versatilidad y utilidad de los ensayos de un solo liposo se corroboran por la gran variedad de problemas que estas configuraciones se han empleado para abordar, y imaginamos que la metodología continuará desarrollándose y encontrando uso en nuevos campos científicos.
Aquí describimos un ensayo de liposomas único basado en microscopía de fluorescencia que permite estudiar liposomas individuales de una manera de alto rendimiento(Figura 1). Para ilustrar el método, lo usamos para cuantificar el tamaño y la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales dentro de un conjunto. El ensayo emplea imágenes de microscopio de fluorescencia de liposomas individuales inmovilizados en una superficie de vidrio pasivado. Primero describimos los pasos críticos en el proceso de fabricación de liposomas que asegura el etiquetado y la inmovilización adecuados de liposomas fluorescentes. A continuación, describimos la preparación de la superficie necesaria para facilitar la inmovilización de liposomas antes de esbozar el procedimiento para asegurar densidades superficiales de liposomas adecuadas. Discutimos los parámetros de microscopía importantes para adquirir imágenes de alta calidad y delinear cómo realizar un análisis de datos simple, permitiendo la extracción de tamaño de liposomas e inhomogeneidad compositiva. Este protocolo genérico debe proporcionar una buena base para que el investigador interesado desarrolle el ensayo para su interés específico de investigación.
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Protocol
1. Preparación de liposomas
NOTA: Brevemente, la preparación de liposomas generalmente incluye tres pasos cruciales: 1) preparación de películas de lípidos secos de la composición lipídica deseada; 2) rehidratación de los lípidos para la formación de liposomas; y 3) controlar el tamaño y lamelaridad de la población de liposomas.
- Pesar los lípidos y disolverlos en tert-butanol:agua (9:1) en viales de vidrio.
- Disolver POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosfocolina; MW a 760 g/mol) a 50 mM.
- Disolver el colesterol (MW a 387 g/mol) a 25 mM.
- Disolver DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-Atto488; MW a 1.316 g/mol) a 0,1 mM.
- Disolver DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-Atto655; MW a 1.368 g/mol) a 0,1 mM.
- Disolver DSPE-PEG2000-biotina (1,2-aadisteryl-sn-glycero-3-phosphatethanolamine-N-[biotinyl(polietilenglicol)-2000]; MW a 3.017 g/mol) a 0,1 mM.
NOTA: Calienta los lípidos a 55oC y usa la agitación magnética para asegurar la disolución completa de los lípidos. Alternativamente, utilice un baño de sonicación. Las existencias de lípidos no utilizados se pueden almacenar a -20 oC durante varios meses.
- Mezclar las reservas de lípidos preparadas en el paso 1.1 a una relación molar de POPC:colesterol:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotina 68.95:30:0.5:0.5:0.05, añadiendo 138 ol de POPC, 120 ol de colesterol 500 l de cada lípido fluorescente, y 50 L de lípidos fluorescentes, y 50 L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípido sfluorescent, y 50L de lípido s fluorescente, y 50L de lípido sfluorescent, y 50L de lípido. DSPE-PEG-biotina a un vial de vidrio fresco.
NOTA: La composición de liposomas exacta se puede modificar fácilmente con el fin de abordar la cuestión específica de interés. Consulte la discusión para obtener más detalles. - Afloje la tapa del vial de vidrio y congele el vial a presión en nitrógeno líquido.
- Liofilizar la mezcla de lípidos congelados durante la noche.
- Añadir 1 mL de 200 mM de tampón D-sorbitol (buffer de sorbitol) a los lípidos secos.
- Calentar la mezcla a 45oC y exponerla a agitación magnética durante al menos 1 h.
NOTA: El tampón debe reflejar la pregunta específica que se está abordando (por ejemplo, condiciones fisiológicas para el estudio de las interacciones entre membrana y proteína, o un tampón clínicamente aprobado específicamente para estudiar los liposomas de administración de medicamentos). Sin embargo, si no se requiere un tampón específico para el estudio, se puede aplicar un tampón sin iones para la rehidratación con el fin de reducir la multilamelaridad de los liposomas. - Congele la suspensión lipídica sumergiendo el vial en nitrógeno líquido y espere hasta que la suspensión esté completamente congelada.
- Sumerja la suspensión congelada en un baño de calentamiento a 55 oC hasta que la mezcla esté completamente descongelada.
- Repita los pasos 1.7 y 1.8 hasta que la suspensión de liposoma haya estado expuesta a un total de 11 ciclos de congelación/descongelación.
NOTA: Los ciclos repetidos de congelación/descongelación han demostrado reducir la multilamelaridadliposoma 23,que es primordial para la precisión del ensayo de un solo liposomas, ya que los liposomas multilamelares sesgarán la intensidad de fluorescencia frente a la relación de tamaño de los liposomas. La multilamelaridad suele ser intrínsecamente baja cuando se incluyen más de 0,5% de lípidos PEGylated en la formulación (como comúnmente se hace en liposomas para la administración de fármacos)24. - Extruya la suspensión de liposomas una vez a través de un filtro de policarbonato de 800 nm utilizando un mini kit de extrusión. Siga las instrucciones del fabricante para el montaje del kit de extrusión (consulte Tabla de materiales).
- Almacene los liposomas a 4oC durante la noche.
2. Preparación superficial de la cámara de imágenes
- Preparar albúmina sérica bovina (BSA; 1 mg/ml), BSA-biotina (1 mg/ml) y estreptavidina (0,025 mg/ml) en 10 mM de HEPES (4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic acid) 95 mM NaCl buffer (buffer HEPES).
NOTA: Para evitar la ráfaga liposomal, el tampón de sorbitol utilizado para la rehidratación y el tampón HEPES utilizado para la preparación de la superficie deben ser isotónicos. Por lo tanto, se recomienda comprobar la osmolaridad de los tampones antes del experimento. - Mezclar 1.200 l de BSA y 120 l de biotina de BSA y añadir 300 ml de la mezcla a cada poca en una diapositiva de 8 pocillos para microscopía.
NOTA: Aquí utilizamos una diapositiva de microscopio de 8 pozos disponible comercialmente con un fondo de vidrio (ver Tabla de Materiales),pero el protocolo se puede adaptar fácilmente a las cámaras de microscopio personalizadas. - Incubar el tobogán durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Lave la corredera 8x con 300 ml de tampón HEPES.
NOTA: Tenga cuidado de no dejar los pozos sin tampón durante más de unos segundos, ya que el secado de la superficie lo dañará. Además, tenga cuidado de no rayar la superficie con la punta de la pipeta, ya que esto también la dañará. Por lo tanto, al aspirar el búfer de un pozo, hacerlo desde el borde o la esquina. - Añadir 250 l de estreptavidina e incubar durante 10 min a RT.
- Repita los 8 lavados descritos en el paso 2.4.
- Almacene la corredera del microscopio con 300 ml de tampón de sorbitol en cada poca a 4 oC. La evaporación del disolvente dañará la superficie, así que coloque el portaobjetos del microscopio en una placa Petri y séllelo con parafilm a menos que el portaobjetos preparado se utilice inmediatamente.
3. Inmovilización liposoma
- Diluir la suspensión de liposomas a unos 20 éM de lípidos totales en el tampón de sorbitol. El procedimiento en la sección 1 producirá una suspensión liposoma de aproximadamente 10 mM de lípido total.
- Coloque la diapositiva en el microscopio y concéntrese en la superficie de la cámara utilizando la señal de reflexión láser aumentada de la interfaz de vidrio/buffer como guía.
- Lave la cámara 4x con 300 ml de tampón HEPES fresco.
- Añadir 10 l de liposoma diluido (20 m de lípido total) a un tubo de microcentrífuga.
- Saque 100 ml de tampón de la cámara, agréguelo al tubo de microcentrífuga preparado en el paso 3.4, mezcle correctamente y vuelva a colocar los 110 ml en la cámara.
- Coloque la muestra bajo el microscopio y utilice un ajuste de microscopio rudimental capaz de detectar la señal del fluoróforo liposome para observar los liposomas que se están inmovilizando en la superficie.
- Apunta a una densidad superficial liposoma que sea lo suficientemente dispersa como para identificar liposomas individuales y lo suficientemente densa como para facilitar mediciones de alto rendimiento. Normalmente se utiliza un campo de visión de 50 m x 50 m, es óptimo de 300 a 400 liposomas por fotograma(Figura 2). Esto se puede lograr generalmente dentro de 5 a 10 minutos.
NOTA: Si sólo se detectan partículas fluorescentes que se mueven rápidamente en el campo de visión, la causa podría ser una ausencia o una concentración demasiado baja de cualquiera de los componentes críticos para el proceso de inmovilización (BSA-biotina, estreptavidina, DOPE-PEG-biotina). Si no se detectan liposomas, podría estar relacionado con una baja concentración de liposomas, ajustes incorrectos para la detección de fluorescencia o potencialmente imágenes con un plano focal que no esté en la superficie del vidrio. - Una vez que se alcance una densidad superficial liposoma adecuada, lave la cámara 3 veces con 200 ml de tampón HEPES.
NOTA: Tenga en cuenta que la cinética inmovilizada también depende de propiedades liposoma como el tamaño y la carga y por lo tanto siempre debe optimizarse para cada formulación de liposomas.
4. Adquisición de imágenes
NOTA: Esta sección dependerá mucho del sistema del microscopio disponible para el investigador que realice el experimento. Por lo tanto, se describirán las pautas generales sobre cómo realizar la imagen. Sin embargo, los ajustes exactos y cómo aplicarlos variarán entre las diferentes configuraciones del microscopio. Por ejemplo, algunos sistemas permiten elegir cualquier combinación de filtros de emisión deseada, mientras que otros microscopios están equipados con filtros específicos y preestablecidos.
- Configure el microscopio para tomar imágenes de liposomas individuales. Para garantizar una calidad de imagen óptima y el análisis de datos posterior, utilice una alta resolución en escala de grises y un esquema de píxeles que permita sobremuestrear liposomas individuales. Se recomienda una profundidad de bits de 16 y al menos 1.024 x 1.024 píxeles para un área de 50 á m x 50 m. Si está disponible, el promediado de línea se puede aplicar de forma beneficiosa para reducir el ruido (por ejemplo, 3 escaneos por línea).
- Seleccione una potencia láser de excitación que garantice un blanqueo de fotograma a fotograma no significativo y una señal lo suficientemente fuerte como para discriminar claramente los liposomas individuales desde el fondo. El ajuste óptimo dependerá del microscopio específico utilizado, así como de la combinación de fluoróforos. Asegúrese de que los detectores no estén saturados, ya que esto sesgará la cuantificación de intensidad.
- La toma de imágenes de los fluoróforos DOPE-Atto488 y DOPE-Atto655 en los liposomas requiere imágenes de múltiples canales. Por lo tanto, asegúrese de que cada canal se toma una imagen secuencialmente para evitar la excitación cruzada. Por ejemplo, primero tome una imagen excitando a 488 nm y leyendo la emisión a 495 a 560 nm. A partir de entonces, tomar otra imagen por emocionante en 633 nm, pero la emisión de la lectura sólo a 660-710 nm. Los detalles dependerán del sistema del microscopio (por ejemplo, qué láseres y filtros) disponibles.
- Asegúrese de cubrir diferentes áreas de la superficie, adquiriendo al menos 10 imágenes de la muestra, por lo tanto, toma imágenes de al menos 3.000 liposomas individuales. Si la densidad de la superficie es inferior a 300 liposomas/marco, adquiera más imágenes. Asegúrese de reenfocar el microscopio para cada nueva imagen.
NOTA: Para las imágenes de dos canales, asegúrese de asignar un nombre a los archivos de imagen para que los pares de imágenes con los mismos liposomas en diferentes canales de fluorescencia se puedan identificar fácilmente durante el análisis de datos. - Para cuantificar la incertidumbre experimental relativa a la medición de la inhomogeneidad compositiva, idee la misma zona de liposomas antes y después de la reorientación (véase la figura 3 y la descripción en el texto).
- Exporte las imágenes desde el software del microscopio como archivos .tiff. Exportar los dos canales de los mismos liposomas individualmente.
5. Análisis de datos
NOTA: Las rutinas de ajuste 2D Gaussianas especialmente desarrolladas se han empleado previamente6,11,12. Sin embargo, para aumentar la aplicabilidad del método se describe un proceso de análisis de datos que se puede implementar fácilmente en todos los laboratorios.
- Cargue el par correspondiente de imágenes .tiff de dos canales de fluorescencia diferentes en el mismo campo de imágenes en el software FIJI (FIJI Is Just ImageJ).
- En el menú Imagen, elija Colory utilice la función Combinar canal para crear un compuesto de los dos canales.
- Observe si los liposomas que se muestran en dos canales diferentes muestran una buena colocación o si se produjo una deriva visible.
NOTA: En caso de deriva entre los dos canales de fluorescencia (reconocido como un desplazamiento X-Y sistemático e igual entre la señal en los dos canales), uno de los fotogramas se puede traducir utilizando la función Transformar > Traducir en el menú Imagen de FIJI. Sin embargo, se debe tener cuidado con dicha manipulación de la imagen. Por lo tanto, se recomienda evitar la deriva tanto como sea posible al tomar imágenes de los liposomas. - Asegúrese de que el complemento ComDet (v.0.3.6.1 o posterior) esté instalado, o haga esto en el menú Plugins.
- Abra el plugin ComDet para detectar partículas yendo al menú Plugins y eligiendo ComDet v.0.3.6.1 > Detectar partículas.
- En ComDet, asegúrese de elegir la función Detectar partículas en ambos canales individualmente. Establezca la Distancia máxima entre puntos colocalizados similar al tamaño aproximado de partículas. Por lo general, 4 píxeles es adecuado para la configuración que se describe aquí.
- La relación señal-ruido debe permitir la detección de partículas tenues incluso con una baja cantidad de fluorescencia. En ComDet, establezca esta relación en 3 estableciendo la Sensibilidad de Detección en ambos canales en Partículas muy tenues (SNR n.o 3).
NOTA: Si bien este valor SNR suele ser apropiado, podría ser necesario establecerlo más alto (por ejemplo, si hay mucho ruido de imagen que puede identificarse como liposomas y dar lugar a falsos positivos). - Asegúrese de que las casillas con Calcular colocalización y Trazar partículas detectadas en ambos canales estén marcadas, antes de pulsar OK.
- Después de ejecutar el análisis, se mostrarán dos ventanas emergentes con Resultados y Resumen. Exportar la tabla de datos Resultados que contienen los datos de colocalización (coordenadas de partículas e intensidad integrada de cada partícula detectada) a un software de gestión de datos de su elección guardando la tabla como un archivo .txt e importándola en el software.
- Asegúrese de que cada liposoma solo se incluye una vez en el conjunto de datos y no tanto el channel1/channel2 como la relación channel2/channel1. Por lo tanto, filtre los datos de modo que solo se trace Abs_frame 1 en el paso 5.11.
NOTA: Al elegir Colocalizado n.o 1, se pueden eliminar del análisis falsos positivos del ruido de las imágenes. Sin embargo, los liposomas con sólo uno de los dos componentes fluorescentes presentes también serán excluidos del análisis, eliminando así potencialmente puntos de datos importantes del análisis. - Trazar un histograma de la columna con datos que contienen la relación de intensidad para cada liposoma detectado.
- El grado de inhomogeneidad compositiva para el sistema liposomal estudiado está representado por la anchura de la distribución de la relación de intensidad. Para cuantificar la inhomogeneidad, ajuste el histograma de la relación de intensidad con una función gaussiana y extraiga la media (o) y la desviación estándar (sigma). Consulte la sección Resultados del representante.
- Ahora se puede calcular un valor para el grado de inhomogeneidad (DI) utilizando el coeficiente de variación definido como DI - sigma / .
6. Calibración del tamaño del liposomas
- Saque parte del stock de liposomas y extruya 21 veces a través de un filtro de policarbonato de 50 nm como se describe en el paso 1.10.
- Diluir los liposomas añadiendo 10 s de la suspensión de liposomas a 800 l de tampón de sorbitol en un tubo de microcentrífuga.
- Transfiera la muestra de liposomas diluidos a una cubeta de polipropileno de un solo uso.
- Mida el tamaño mediante la dispersión dinámica de la luz (DLS). Realice al menos tres corridas independientes para medir el tamaño y la polidispersidad de la suspensión liposoma.
NOTA: Si es necesario, utilice una suspensión de liposoma más concentrada para la medición. También se pueden aplicar alternativas a la DLS (por ejemplo, análisis de seguimiento de nanopartículas) para medir el tamaño de los liposomas. Una descripción de cómo ejecutar dicha determinación de tamaño de partícula está fuera del alcance de este protocolo. - Imagen de los liposomas de calibración en el microscopio utilizando exactamente los mismos ajustes experimentales definidos en los pasos 4.1 y 4.2.
- Extraer la intensidad integrada para cada liposoma de calibración en las imágenes de calibración: Extraiga la hoja de resultados filtrada que contiene intensidades de fluorescencia liposoma como se describe en los pasos 5.1 a 5.10. En la tabla de resultados, extraiga la columna "IntegratedInt".
- Debido a que la intensidad total integrada de un liposomas etiquetado en su membrana es proporcional a la superficie del liposo y por lo tanto es proporcional al cuadrado de su diámetro, trazar un histograma de intensidad de raíz cuadrada de la intensidad de fluorescencia de la liposomas de calibración.
- Ajuste el histograma de intensidad integrado producido en el paso 6.7 con una distribución normal de registro y extraiga la intensidad de fluorescencia media de los liposomas de calibración.
- Para determinar la relación entre la intensidad de la raíz cuadrada (IntSqrt) y el tamaño de los liposomas, calcule el factor de corrección (C) utilizando el diámetro medio de liposomas (Dia) ponderado por el número obtenido de las mediciones de DLS: Dia x C x IntSqrt es equivalente a C á Dia / IntSqrt.
- Calcular los valores de IntSqrt para los liposomas en el experimento de inhomogeneidad compositiva y convertirlos en diámetros multiplicándolos con el factor de corrección.
- Trazar el valor de la relación de intensidad en función del diámetro de los liposomas de inhomogeneidad compositiva, logrando así la inhomogeneidad en función del tamaño de los liposomas para una población de liposomas que abarcan aproximadamente 50 nm a 800 nm.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo descrito permite crear imágenes de liposomas individuales de forma paralela masiva(Figura 1). La inmovilización superficial exitosa de liposomas debe ser inmediatamente evidente tras la adición de la solución de liposomas a la cámara (paso 3.6 en el protocolo) ya que las manchas de intensidad limitada de difracción deben aparecer en la imagen(Figura 1B y Figura 1C).
Con el fin de lograr buenas estadísticas y explotar las capacidades de alto rendimiento del ensayo, varios miles de liposomas deben ser imágenes. Para hacer esto en un número razonable de imágenes, se recomienda inmovilizar suficientes liposomas para lograr una densidad de 300-400 liposomas por fotograma, ya que esto reducirá el número de imágenes por muestra a 10 euros, limitando así el número de imágenes que se deben adquirir y analizar. Una densidad más baja hará que el análisis de datos consuma más tiempo, mientras que una densidad más alta puede hacer que sea difícil para el software de análisis de imágenes distinguir liposomas individuales. Para obtener una impresión visual de cómo se ven los liposomas 300-400, consulte la Figura 2A. Cabe señalar, sin embargo, que para algunas aplicaciones (por ejemplo, interacciones membrana-proteína con una proteína que tiende a obtener una fuerte unión de fondo a la superficie de La BSA) se recomienda utilizar una densidad ligeramente inferior, como en la Figura 2A en la parte superior derecha.
Ocasionalmente, al adquirir imágenes es difícil poner todo el campo de visión en el enfoque adecuado, como se ilustra en la Figura 2B. Tales problemas podrían indicar que la placa de muestra se está inclinando, lo que puede surgir de que la placa no se coloque correctamente en el soporte de la muestra en el microscopio. Además, si los liposomas parecen grandes y borrosos, el tampón de la cámara podría haberse evaporado y la superficie se haya secado. Es especialmente importante tener este problema en mente al tomar imágenes durante largos períodos de tiempo o al realizar mediciones a temperaturas superiores a RT. Para ilustrar la diferencia entre los liposomas almacenados correctamente y secos, en la Figura 2Cse muestra una imagen de la misma muestra antes y después de secar la cámara.
Después de haber garantizado una calidad de imagen óptima, la intensidad integrada para cada liposoma en los dos canales de imagen se puede extraer siguiendo los pasos de la sección 5 de este protocolo. Al hacerlo, se creará una lista de valores de intensidad únicos, lo que nos permitirá calcular la relación de intensidad para cada liposoma individual. La inhomogeneidad compositiva se evalúa a partir de histogramas de relación de intensidad, que normalmente revelan una distribución gaussiana alrededor de un valor de relación media(Figura 3A). Observe que si se observan desviaciones fuertes de una distribución gaussiana(Figura 3B),indica un problema de sensibilidad de detección para al menos uno de los canales de imagen, lo que sugiere que se ha excluido un subconjunto de liposomas que muestran una señal más débil. Esto podría deberse tanto al límite de detección del sistema de imágenes, o excluyendo liposomas en el análisis de datos (por ejemplo, al aplicar un determinado umbral mínimo; véase el paso 5.7).
El cálculo del valor DI descrito en los pasos 5.11-5.13 del protocolo proporcionará una medida cuantitativa de la inhomogeneidad compositiva entre los liposomas individuales de la preparación. Para el sistema liposomal estudiado aquí, DI a 0,23 a 0,01 (Figura 3C). Este valor se puede utilizar para comparar sistemáticamente cómo las diferentes propiedades de liposomas o métodos de preparación afectan a la inhomogeneidad compositiva. Para conceptualizar el significado del valor DI, nos referimos a la distribución normal mostrada por el histograma de relación de intensidad, lo que significa que obedecerán la regla empírica 68-95-99.7. Esta regla describe el porcentaje de una población que se encuentra dentro de una, dos y tres desviaciones estándar alrededor del valor medio. Para el valor de DI de 0,23 a 0,01 que se encuentra aquí, significa que el 32% de los liposomas en la población tendrán una relación de intensidad que difiere en más del 23% de la relación molar media del conjunto(Figura 3D).
Para el experimento de control que los mismos liposomas antes y después de reenfocar (sección 4.6), se realiza el mismo análisis de datos y trazado de resultados que para el experimento real. Esto permite cuantificar la incertidumbre experimental del valor DI, que se encontró que eraincertidumbre DI de 0,10 a 0,01 (Figura 3E). Aunque el valor deincertidumbre DI dependerá del sistema de imágenes empleado, se encontró que las configuraciones de microscopio confocal dan lugar consistentemente a valores deincertidumbre DI de alrededor de 0.105,6. El valor DI de DI a 0,23 a 0,01 que se encuentra para el sistema liposomal aquí es más del doble de la incertidumbre experimental, lo que sugiere la presencia de una inhomogeneidad compositiva significativa entre los liposomas individuales de la preparación.
Realizar el experimento de calibración de tamaño descrito en la sección 6 permitirá transformar los valores de intensidad de liposomas arbitrarios en diámetros físicos en nanómetros. El método ha sido validado contra otras técnicas de imagen25 como la microscopía electrónica criogénica, que tiene la capacidad de resolver ópticamente los liposomas del tamaño de un nanómetro, aunque con un rendimiento mucho menor. Imagen de la muestra de control utilizando exactamente la misma configuración de microscopio que se utiliza para los experimentos reales, ahora es posible correlacionar la intensidad de liposomas media con el diámetro de liposoma medio determinado por DLS(Figura 4A). El siguiente paso es representar la distribución de intensidad liposoma, que se basa en las restricciones físicas contra la creación de liposomas extremadamente pequeños, normalmente mostrará una distribución normal de registro(Figura 4B). Si la distribución no está bien descrita por una distribución normal de registro (más a menudo debido a liposomas faltantes con valores de baja intensidad) significa que una parte de la población de liposomas fue excluida ya sea debido a una baja sensibilidad de detección de microscopio o parámetros demasiado estrictos durante el análisis de datos(Figura 4C). Es importante detectar y abordar estas cuestiones para garantizar una interpretación imparcial de los datos. A continuación, los valores de intensidad para cada liposoma individual en la Figura 4B se pueden convertir en diámetros reales utilizando el factor de corrección determinado en la Figura 4A (Figura 4D). Después de determinar el tamaño de cada liposoma, el DI en función del diámetro ahora se puede investigar trazando la relación de intensidad frente al diámetro de cada liposoma individual(Figura 4E). Esta estructura de datos similar a un embudo corrobora los hallazgos anteriores de que el valor DI aumenta cuando el tamaño del liposomas disminuye6. Es importante destacar que el aumento simétrico en la propagación de las relaciones de intensidad alrededor de un valor medio sugiere que no hay ninguna variación sistemática dependiente del tamaño en la composición media de los liposomas.
Figura 1: El ensayo de un solo liposoma. (A) Los liposomas están formulados con un contenido equimolar de los lípidos etiquetados fluorescentemente DOPE-Atto488 y DOPE-Atto655 e inmovilizados en una superficie de BSA utilizando un enlace biotina/streptavidina. (B) Los liposomas inmovilizados se utilizan mediante un microscopio confocal, lo que permite la detección de las intensidades de fluorescencia a partir de los liposomas individuales. Barras de escala a 8 m. (C) Zoom del área verde en (B) representado como trazado de intensidad de superficie para dos liposomas adyacentes que muestran la señal fluorescente invertida entre los dos canales, ilustrando el concepto de inhomogeneidad compositiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Optimización y escollos. (A) La parte superior izquierda muestra 29 liposomas inmovilizados en un marco de 50 ám x 50 m. Estos son demasiado pocos liposomas por trama para explotar la posibilidad de investigación de alto rendimiento de la inhomogeneidad liposoma. La parte superior derecha muestra 123 liposomas por fotograma. Esta es una densidad subóptima, pero se puede utilizar si se adquieren muchas imágenes. La parte inferior izquierda muestra 300-400 liposomas por fotograma. Esto es óptimo para el protocolo descrito aquí. La parte inferior derecha muestra más de 1.500 liposomas por cuadro, que es demasiados para distinguir liposomas individuales. Existe un alto riesgo de que un solo punto sea realmente dos liposomas inmovilizados dentro del mismo punto limitado de difracción. (B) Si la cámara no se coloca correctamente en el soporte de la muestra, será imposible poner todo el campo de visión en el enfoque adecuado. En la micrografía izquierda, la placa se inclina alrededor del eje transversal, lo que da lugar a que la esquina inferior izquierda esté desenfocada. En la micrografía derecha la placa se inclina alrededor del eje longitudinal, dando lugar a una inclinación más pesada. Tanto la esquina inferior izquierda como la superior derecha están desenfocadas. (C) Si la toma de imágenes durante largos períodos de tiempo o a temperaturas elevadas, el tampón podría evaporarse, lo que provocará el secado de la cámara. Ilustramos este escenario aquí mediante imágenes de liposomas antes y después de que la cámara se dejara secar durante 3 minutos, y luego se rehumó añadiendo un nuevo tampón a la cámara. Los liposomas resultantes son más grandes, borrosos, tienen menor intensidad de fluorescencia y parecen extenderse en la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Histogramas de relación de intensidad para cuantificar la inhomogeneidad compositiva liposoma. (A) La relación de intensidad de la fluorescencia DOPE-Atto488 y DOPE-Atto655 para cada liposoma individual trazado como histograma. (B) Una distribución gaussiana truncada que ilustra un posible problema de sensibilidad, ya sea durante la toma de imágenes o en el paso de tratamiento de datos. (C) El ajuste del histograma de intensidad con una función gaussiana permite extraer la media y la desviación estándar utilizadas para calcular el valor DI. (D) Un valor DI de 0,23 se puede traducir al 32% de la población que difiere en más del 23% de la relación molar media del conjunto. (E) Controlar la creación de imágenes del experimento los mismos liposomas antes y después de reenfocar y luego realizar el mismo procedimiento de tratamiento de datos que para el experimento real. Esto permite determinar el error experimental para la cuantificación DI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Convertir la intensidad del liposomas en diámetro físico en nm. (A) Histograma de intensidad de los liposomas de calibración extruidos de 50 nm en comparación con los datos DLS para determinar el factor de calibración. (B) Un histograma del valor IntSqrt de los liposomas experimentales normalmente produce una distribución log-normal debido a las restricciones físicas contra la creación de liposomas muy pequeños. (C) Un histograma de valor IntSqrt no normal indica problemas con la sensibilidad de detección o que se excluyeron pequeños liposomas durante el tratamiento de datos. (D) Las intensidades de liposomas en (B) se convierten en diámetros de liposomas reales utilizando el factor de corrección. (E) La relación de intensidad de cada liposoma trazado en función del diámetro de los liposomas ahora se puede mostrar permitiendo la investigación de la inhomogeneidad compositiva en función del tamaño de los liposomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Es importante tener en cuenta que si bien describimos en detalle cómo el ensayo de liposomas individuales se puede utilizar para estudiar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales, la plataforma es muy versátil. Como se ha mostrado y discutido anteriormente en la introducción, el protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar aspectos de la fusión membrana-membrana, interacciones proteína-membrana o caracterización portadora de fármacos liposomal. Para cualquier pregunta científica que se aborde, el poder del ensayo de un solo liposomas radica en la capacidad de detectar los componentes individuales del conjunto y, por lo tanto, tener una lectura cuantitativa, no sesgada por los efectos de promediación del conjunto.
El ensayo de un solo liposoma es óptimo para las modalidades de imagen superficial, como la reflexión interna total o el microscopio confocal, donde el seccionamiento de dirección Z puede eliminar la fluorescencia de fondo no deseada de la solución por encima de la capa liposoma. Sin embargo, este aspecto es más importante para los estudios en los que compuestos etiquetados fluorescentemente, como péptidos, proteínas u otros liposomas, se agregan a la solución y permanecen allí durante la toma de imágenes. Por ejemplo, si el ensayo se utiliza en el formato descrito en detalle aquí, donde los colorantes fluorescentes están restringidos a los liposomas inmovilizados, el ensayo podría, en principio, realizarse utilizando microscopios de campo ancho más ampliamente disponibles, proporcionando la detección sistema es lo suficientemente sensible.
A priori no hay limitaciones con respecto al método utilizado para preparar los liposomas utilizados en el ensayo. Aquí describimos en detalle el uso de una técnica de liofilización. Sin embargo, previamente se han empleado técnicas de rehidratación de lípidos a base de cloroformo o a base de etanol para fabricar liposomas utilizados en el ensayo5,6. Un parámetro crítico es la inclusión de una fracción de minuto de lípidos biotinylados en la mezcla de lípidos para asegurar la inmovilización (0,05 mol% recomendado). Otro elemento necesario es incluir una pequeña cantidad de lípidos etiquetados fluorescentemente. En general, la cantidad de lípido-teñido añadido debe mantenerse tan bajo como sea posible para evitar efectos de enfriamiento y para evitar que el lípido-teñido de alterar significativamente las propiedades fisicoquímicas del liposoma. El límite inferior de la cantidad de tinte lipídico se establece por la concentración, donde la variación estocástica en el número de tintes lipídicos individuales por liposoma se vuelve significativa en comparación con la cantidad media de colorantes lipídicos (ver Larsen et al.6 para una discusión en profundidad). Ir por debajo de este límite introducirá grandes incertidumbres en las intensidades extraídas. Por último, la cantidad de tinte lipídico debe ser lo suficientemente alta para la detección precisa de los liposomas individuales con una buena relación señal-ruido. Si bien este criterio, por supuesto, depende en gran medida del sistema de imágenes, encontramos que las concentraciones de tinte lipídico entre 0,05 y 0,5 mol% funcionan bien en la gran mayoría de los casos.
Para elegir qué tinte lipídico incluir en el liposoma, el primer requisito previo es que las propiedades de excitación y emisión coincidan con las capacidades de iluminación y detección del sistema de imágenes. En segundo lugar, para aumentar la sensibilidad y precisión del método recomendamos utilizar colorantes con altos rendimientos cuánticos y fotoestabilidad, y previamente hemos utilizado con éxito colorantes con diferentes longitudes de onda de excitación6,11. Se debe tener cuidado al elegir anclajes de lípidos con propiedades fisicoquímicas similares para garantizar que la partición de lípidos no conduce a una alta inhomogeneidad artificial. Por ejemplo, para este protocolo, hemos anclado ambos fluoróforos usando DOPE, mientras que tener un fluoróforo en DOPE y otro en DPPE podría conducir a heterogeneidades de distribución de fluoróforos no relacionadas con la inhomogeneidad inherente en la población liposoma. Especialmente para las imágenes de doble color es importante elegir tintes con espectros estrechos de excitación y emisión y la superposición espectral más pequeña posible para evitar el sangrado significativo, la conversación cruzada y la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre los tintes y los canales. Para evitar artefactos relacionados con la variación en el entorno de fluoróforos, preferimos trabajar con distees, que han demostrado experimentalmente mostrar una propensión a la interacción de membrana extremadamente baja según lo determinado por Hughes et al.26. Por último, si una composición específica de lípidos liposoma no es un requisito duro para el diseño experimental, puede ser beneficioso incluir hasta 10 mol% de lípidos cargados negativamente para asegurar que los liposomas individuales se repelen entre sí y se inmovilicen eficientemente como liposomas individuales12.
Una ventaja del ensayo de un solo liposoma es el pequeño volumen experimental, que puede reducir en gran medida la cantidad de compuestos caros o raros utilizados por experimento. Aquí describimos el uso de cámaras estándar y disponibles comercialmente con un volumen experimental entre 150–300 l. Sin embargo, se pueden utilizar cámaras de microscopio hechas a medida que pueden reducir el volumen a un rango de 50-80 l. Además, el consumo de liposomas es muy bajo, con una concentración final de alrededor de 2 m de lípidototal total.
Una desventaja del ensayo de un solo liposomas es que es difícil controlar la concentración de lípidos en la cámara debido a las variaciones en las tendencias de inmovilización descritas anteriormente. Además, con respecto a la aplicación del ensayo para el estudio de las interacciones membrana-proteína, es difícil determinar la concentración o el número de proteínas unidas directamente a partir de la intensidad de la fluorescencia.
Cuando se utilizan los liposomas en el ensayo como sistemas de modelos de membrana (por ejemplo, para estudiar la interacción de la membrana de compuestos fluorescentes, péptidos o proteínas) es importante asegurar una baja unión no específica a los componentes proteicos que facilita la Inmovilización. Si este no es el caso, se puede detectar una señal de fondo alta que podría impedir la detección de la unión específica a los liposomas. Si se detecta un fondo no específico alto, previamente hemos reducido con éxito el fondo cambiando de estreptavidina a Neutravidin o avidina.
Realizar una sola detección de liposoma utilizando otras técnicas como la citometría de flujo podría ofrecer potencialmente un mayor rendimiento de detección en comparación con el ensayo basado en microscopio. Sin embargo, dado que los citómetros de flujo están optimizados para estudiar muestras mucho más grandes y brillantes como las células, el sistema de detección de la mayoría no es lo suficientemente sensible como para detectar la fluorescencia relativamente débil de un liposoma individual. Así que mientras se está desarrollando una citometría de flujo nueva y más sensible, el ensayo basado en microscopio según el microscopio ofrece la mejor solución para dilucidar inhomogeneidades liposoma cuando se realiza de manera eficiente y monitorizar miles de liposomas por experimento.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Consejo Danés de Investigaciones Independientes [número de subvención 5054-00165B].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
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