Summary
Bu protokol lipozomların imalatını ve bunların bir yüzeyüzerinde nasıl hareketsiz hale getirilebildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak büyük bir paralel şekilde tek tek nasıl görüntülenebileceğini açıklar. Bu, popülasyonun tek lipozomları arasındaki boyutun ve bileşimsel homojenliğin nicelikselleştirilmesine olanak sağlar.
Abstract
Membran model sistemleri veya ilaç dağıtım taşıyıcıları olarak lipozomların çoğunun toplu okuma tekniklerine dayandığını ve böylece özünde topluluğun tüm lipozomlarının aynı olduğunu varsayar. Ancak, tek parçacık düzeyinde lipozomları gözlemleyebilen yeni deneysel platformlar, bireysel lipozomlarda protein-membran etkileşimleri veya ilaç taşıyıcı özellikleri üzerinde son derece gelişmiş ve kantitatif çalışmalar yapılmasını mümkün kılabilir, böylece topluluk ortalama gelen hataları kaçınarak. Burada floresan bazlı mikroskopi testini kullanarak tek lipozomların hazırlanması, saptandırılmasını ve analiz ini sağlayan ve bu tür tek parçacık ölçümlerini kolaylaştıran bir protokol sıyoruz. Kurulum büyük bir paralel şekilde bireysel lipozomların görüntülenmesi için izin verir ve intra-örnek boyutu ve bileşimsel inhomojenlikleri ortaya çıkarmak için kullanılır. Ayrıca, protokol tek lipozom düzeyinde lipozomlar çalışma avantajları açıklar, test sınırlamaları, ve diğer araştırma soruları çalışmak için değiştirerek dikkat edilmesi gereken önemli özellikleri.
Introduction
Lipozomlar hem temel hem de uygulamalı araştırmalarda yoğun olarak kullanılan küresel fosfolipid bazlı veziküllerdir. Onlar mükemmel membran model sistemleri olarak işlev, onların fizyokimyasal özellikleri kolayca lipozom oluşturan lipid bileşenleri değiştirerek manipüle edilebilir çünkü1,2. Ayrıca, lipozomlar gelişmiş farmakokinetiği ve farmakodinamik yanı sıra yüksek biyouyumluluksunan,en çok kullanılan ilaç dağıtım nanocarrier sistemi oluşturmaktadır 3 .
Uzun yıllar boyunca, lipozomlar öncelikle toplu teknikler kullanılarak incelenmiştir, sadece topluluk ortalama okuma değerlerine erişim veren. Bu topluluk taki tüm lipozomlar aynı olduğunu varsaymak için bu çalışmaların çoğunluğu yol açmıştır. Ancak, bu tür topluluk ortalaması değerleri yalnızca temel veri kümesi ortalama değer etrafında eşit olarak dağıtılırsa doğrudur, ancak veri kümesi örneğin birden çok bağımsız popülasyon içeriyorsa yanlış ve önyargılı bir sonucu temsil edebilir. Ayrıca, topluluk tüm nüfusu temsil etmek anlamına geldiğini varsayarak lipozomlar arasında inhomogeneity içinde barındırılan bilgileri göz ardı edebilirsiniz. Sadece son zamanlarda tek lipozomlar araştırmak mümkün kantitatif tahliller ortaya çıktı, lipozom boyutu da dahil olmak üzere önemli fizyochemical özellikleri ile ilgili bireysel lipozomlar arasında büyük inhomojeniteler ortaya ortaya çıktı4, lipid bileşimi5,6, ve kapsülleme verimliliği 7 , tek lipozom lar çalışma önemini vurgulayan7.
Lipozom özellikleri topluluk ortalama önyargı sonuçları gösterilmiştir bir araştırma alanı lipozom boyutuna bağlı protein-membranetkileşimleri8 ,9çalışıyor . Geleneksel olarak, bu tür süreçleri inceleyen araştırmacılar farklı gözenek boyutları9filtreler aracılığıyla ekstrüzyon tarafından farklı topluluk ortalama çapları ile lipozomlar hazırlanması için sınırlı olmuştur. Ancak, tek lipozom ların çapıtek lipozomların tek lipozom larının çıkarılması büyük popülasyon örtüşmelerini ortaya çıkarmıştır, lipozomlar 100 nm ve 200 nm filtreleri kullanarak ekstrüzyon ile% 70'e kadar kendi boyut dağılımı4çakışma gösteren . Bu ciddi lipozom boyutuna bağlı protein-membran etkileşimleri10toplu ölçümler önyargı olabilir. Tek lipozom testini kullanarak membran-protein etkileşim imasını gerçekleştiren araştırmacılar, bunun yerine numunenin içindeki boyut-polidispersitlikten yararlanarak, her bir deneyde çok çeşitli lipozom çaplarını incelemelerine olanak sağlayarak, membran eğriliği ve bileşiminin membranlara protein alımını nasıl etkileyebileceğine dair yeni keşifler kolaylaştırıyorlar4,11,12. Tek lipozom tahlilleri uygulama enstrümantal kanıtlamıştır başka bir alan protein aracılı membran füzyon mekanistik çalışmalarda13,14. Bu tür kinetik ölçümler için, bireysel füzyon olaylarını inceleme yeteneği, füzyon sürecinin deneysel senkronizasyonuna olan ihtiyacı hafifleterek, toplu topluluk ölçümlerinde yapılan spatiotemporal ortalamada kaybolacak yeni mekanistik anlayışlara olanak sağladı. Ayrıca, tek lipozomlar bir membran iskele olarak kullanılmıştır, bireysel proteinlerin ölçümü sağlayan ve transmembran protein yapısal dinamiği yeni bilgi sunan15,16. Ayrıca, bu tür proteolipozom tabanlı kurulumlar mümkün bireysel transmembran taşıyıcılar17 ve gözenek oluşturan protein kompleksleri18 fonksiyonu yanı sıra biyoaktif membran geçirimli peptidlermekanizmasının incelenmesi mümkün kı. Tek lipozomlar da 10-19 L hacimlerinde enzimatik reaksiyonlar için oda olarak hizmet veren yüzey immobilize tek lipozomlar ile yumuşak madde nanofluidics olarak kullanılmıştır, en az ürün tüketimi ile tarama tahlillerinin hacmi ve karmaşıklığını artırarak20.
Son zamanlarda, tek lipozom tahlilleri daha önce önceden haber verilmemiş bir ayrıntı düzeyinde ilaç dağıtım lipozomları karakterize etmek için kullanılmıştır. Araştırmacılar bireysel lipozomların yüzeyine bağlı polimer miktarı önemli inhomogeneities ölçmek başardık21. Tek lipozom tahlilleri de karmaşık ortamda ilaç teslim lipozomölçümleri izin, kan plazması gibi, lipozomlar ile lipozom lar aracılığıyla lipozom yüzeyine demirlemiş elemanların dissosiyasasyona duyarlı olabilir ortaya22. Genel olarak, tek lipozom tahlillerinin çok yönlülüğü ve kullanışlılığı, bu kurulumların ele alınması için kullanılan çok çeşitli sorunlarla kanıtlanmıştır ve metodolojinin geliştirilmeye ve yeni bilimsel alanlarda kullanılmaya devam edeceğini öngörüyoruz.
Burada, tek tek lipozomların yüksek iş lenme şeklinde incelenmesini sağlayan floresan mikroskopesi bazlı tek lipozom testini tanımlıyoruz (Şekil 1). Yöntemi göstermek için, bir topluluk içinde bireysel lipozomlar arasındaki boyut ve kompozisyon yamajenliğini ölçmek için kullanırız. Titre, pasif cam yüzeyüzerinde hareketsiz hale getirilen tek lipozomların floresan mikroskop görüntülemesini kullanır. Biz ilk uygun floresan lipozom etiketleme ve immobilizasyon sağlayan lipozom üretim sürecinde kritik adımları açıklar. Daha sonra, uygun lipozom yüzey yoğunluklarını sağlamak için prosedürü ana hatlarıyla özetlemeden önce lipozom immobilizasyonkolaylaştırmak için gerekli yüzey hazırlığı açıklar. Yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için önemli olan mikroskopi parametrelerini tartışıyoruz ve basit veri analizinin nasıl yapılacağını, lipozom boyutunun ve bileşimsel homojenliğin çıkarılmasına izin verilebildiğini anlatıyoruz. Bu genel protokol, ilgilenen araştırmacının kendi özel araştırma ilgi alanı için daha fazla araştırma yapmak için daha fazla araştırma yapması için iyi bir temel oluşturmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lipozom Hazırlığı
NOT: Kısaca, lipozomların hazırlanması genellikle üç önemli adımı içerir: 1) istenilen lipid bileşimikuru lipid filmlerin hazırlanması; 2) lipozom oluşumu için lipidlerin rehidrasyon; ve 3) lipozom popülasyonunun boyutunu ve lamellaritesini kontrol eder.
- Lipidler tartmak ve tert-butanol onları eritin:su (9:1) cam şişelerde.
- Popc çözünme (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin; MW = 760 g/mol) ila 50 mM.
- Kolesterolü (MW = 387 g/mol) 25 mM'ye çözün.
- DOPE-Atto488 çözün (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamine-Atto488; MW = 1,316 g/mol) ila 0,1 mM.
- DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamine-Atto655; MW = 1.368 g/mol) ila 0,1 mM.
- Çözün DSPE-PEG2000-biotin (1,2-distearyl-sn-glycero-3-fosfattanolamine-N-[biotinyl(polietilen glikol)-2000]; MW = 3.017 g/mol) ila 0.1 mM.
NOT: Lipitleri 55 °C'ye ısıtın ve lipidlerin tamamen çözünmesini sağlamak için manyetik karıştırma kullanın. Alternatif olarak, bir sonication banyo kullanın. Kullanılmayan lipid stokları -20 °C'de birkaç ay saklanabilir.
- Adım 1.1'de hazırlanan lipid stoklarını POPC:KOLESTEROL:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotin 68.95:30:0.5:0.0.05 molar oranına karıştırın, 138 μL POPC, 120 μL kolesterol, 500 μL her floresan etiketli lipid ve 50 μL DSPE-PEG-biotin taze cam şişe.
NOT: Kesin lipozom bileşimi, belirli bir ilgi sorununa değinmek için kolayca değiştirilebilir. Daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın. - Cam şişenin kapağını gevşetin ve şişeyi sıvı nitrojenle dondurun.
- Bir gecede donmuş lipid karışımını lyophilize.
- Kuru lipidlere 200 mM D-sorbitol tampon (sorbitol tampon) 1 mL ekleyin.
- Karışımı 45 °C'ye ısıtın ve en az 1 saat boyunca manyetik karıştırmaya maruz kınayın.
NOT: Tampon, ele alınmakta olan belirli soruyu (örneğin, membran-protein etkileşimlerini incelemek için fizyolojik koşullar veya ilaç dağıtım lipozomlarını incelemek için klinik olarak onaylanmış belirli bir tampon) yansıtmalıdır. Ancak, çalışma için belirli bir tampon gerekli değilse, lipozomların multilamellaritesini azaltmak için rehidrasyon için iyonsuz bir tampon uygulanabilir. - Sıvı nitrojen şişe daldırma tarafından lipid süspansiyon dondurun ve süspansiyon tamamen dondurulana kadar bekleyin.
- Dondurulmuş süspansiyonu 55 °C'de bir ısıtma banyosuna batırın, karışım tamamen eriyene kadar.
- Lipozom süspansiyontoplam 11 dondurma/çözülme döngüsüne maruz kalana kadar 1.7 ve 1.8 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Tekrarlanan donma/çözülme döngüleri lipozom multilamellarity azaltmak için göstermiştir23, hangi tek lipozom tsay doğruluğu için çok önemlidir, multilamellar lipozomlar lipozomların floresan yoğunluğu karşı lipozom boyutu çarpık olacak gibi. Çok lamellerite genellikle doğal olarak düşük formülasyonda fazla% 0.5 PEGylated lipid dahil (bu tür yaygın ilaç teslimatı için lipozomlarda yapılan gibi)24. - Bir mini ekstrüzyon kiti kullanarak 800 nm polikarbonat filtre ile lipozom süspansiyon bir kez extrude. Ekstrüzyon kitinin montajı için üreticinin yönergelerini izleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Lipozomları bir gecede 4 °C'de saklayın.
2. Görüntüleme Odasının Yüzey Hazırlığı
- 10 mM HEPES (4-(2-hidroksitil)-1-piperazineeesulfonik asit) 95 mM NaCl tampon (HEPES tampon) içinde büyükbaş serum albumin (BSA; 1 mg/mL), BSA-biotin (1 mg/mL) ve streptavidin (0.025 mg/mL) hazırlayın.
NOT: Lipozomal patlamayı önlemek için rehidrasyon için kullanılan sorbitol tamponu ve yüzey hazırlığında kullanılan HEPES tamponu izotonik olmalıdır. Bu nedenle denemeden önce arabelleklerin ozmolarite kontrol etmek için tavsiye edilir. - 1.200 μL BSA ve 120 μL BSA-biotin'i karıştırın ve mikroskopi için 8 kuyuluk slaytında her kuyuya 300 μL karışımı ekleyin.
NOT: Burada cam alt ile ticari olarak kullanılabilir 8 kuyu mikroskop slayt kullanın (Malzeme Tablosubakınız), ancak protokol kolayca özelleştirilmiş mikroskop odalarına adapte edilebilir. - Kaydırağı oda sıcaklığında (RT) 20 dakika kuluçkaya yatırın.
- 300 μL HEPES tamponu ile kaydırağı 8x yıkayın.
NOT: Kuyuları tamponolmadan birkaç saniyeden fazla bırakmamaya dikkat edin, çünkü yüzeyin kuruması kuyuya zarar verir. Ayrıca, bu da ona zarar verecek gibi pipet ucu ile yüzey çizik için dikkatli olun. Böylece, bir kuyudan tampon aspirating zaman, kenardan veya köşeden yapın. - RT'de 10 dakika boyunca 250 μL streptavidin ve inkübatör ekleyin.
- Adım 2.4'te açıklanan 8 yıkıntıyı tekrarlayın.
- Mikroskop kaydıraği her kuyuda 300 μL sorbitol tamponile 4 °C'de saklayın. Çözücünün buharlaşması yüzeye zarar verir, bu nedenle mikroskop kaydırasını petri kabına koyun ve hazırlanan slayt hemen kullanılmadığı sürece parafilmle kapatın.
3. Lipozom Immobilizasyon
- Sorbitol tampon yaklaşık 20 μM toplam lipid lipozom süspansiyon seyreltin. Bölüm 1'deki işlem yaklaşık 10 mM toplam lipid lipozom süspansiyon uver.
- Kılavuz olarak cam/tampon arabiriminden gelen artırılmış lazer yansıma sinyalini kullanarak kaydırağı mikroskoba yerleştirin ve odanın yüzeyine odaklanın.
- 300 μL taze HEPES tampon ile hazneyi 4x yıkayın.
- Mikrosantrifüj tüpüne seyreltilmiş lipozom stokunun (20 μM toplam lipid) 10 μL'sini ekleyin.
- Hazneden 100 μL tampon alın, adım 3.4'te hazırlanan mikrosantrifüj tüpüne ekleyin, düzgün ceretler karıştırın ve 110 μL'yi tekrar odaya koyun.
- Numuneyi mikroskop altına alın ve lipozom florofordan gelen sinyali algılayabilen ve yüzeyde hareketsiz hale getirilen lipozomları gözlemleyebilen ilkel bir mikroskop ayarı kullanın.
- Aynı anda tek tek lipozomları girintisi ve yüksek iş yapma ölçümlerini kolaylaştıracak kadar yoğun olacak kadar seyrek olan lipozom yüzey yoğunluğunu hedefleyin. Tipik olarak 50 μm x 50 μm görüş alanı kullanılarak, çerçeve başına 300−400 lipozom en uygun uyrmuşolur(Şekil 2). Bu genellikle 5−10 dk içinde elde edilebilir.
NOT: Görüş alanında sadece hızlı hareket eden floresan parçacıklar tespit edilirse, immobilizasyon süreci için kritik olan bileşenlerden herhangi birinin yokluğu veya çok düşük konsantrasyonu (BSA-biotin, streptavidin, DOPE-PEG-biotin) neden olabilir. Herhangi bir lipozom tespit edilirse ya düşük lipozom konsantrasyonu, floresan tespiti için uygun olmayan ayarlar veya cam yüzeyinde olmayan bir odak düzlemi ile potansiyel görüntüleme ile ilgili olabilir. - Uygun bir lipozom yüzey yoğunluğuna ulaşıldıktan sonra, 200 μL HEPES tamponu ile 3x hazneyi yıkayın.
NOT: Immobilizasyon kinetiğinin de boyut ve şarj gibi lipozom özelliklerine bağlı olduğunu ve bu nedenle her zaman her lipozom formülasyonu için optimize edilmesi gerektiğini unutmayın.
4. Görüntü Edinme
NOT: Bu bölüm, deneyi gerçekleştiren araştırmacının kullanabileceği mikroskop sistemine çok bağlıdır. Böylece, görüntülemenin nasıl gerçekleştirileceğine ilişkin genel kurallar açıklanacaktır. Ancak, tam ayarlar ve bunların nasıl uygulanacağı farklı mikroskop kurulumları arasında değişir. Örneğin, bazı sistemler istenilen herhangi bir emisyon filtresi birleşimini seçmeye izin verirken, diğer mikroskoplar belirli, önceden ayarlanmış filtrelerle donatılmıştır.
- Tek lipozomları görüntülemek için mikroskobu ayarlayın. En iyi görüntü kalitesi ve sonraki veri analizi sağlamak için yüksek gri tonlama çözünürlüğü ve tek tek lipozomların aşırı örneklemesine olanak tanıyan bir piksel şeması kullanın. 50 μm x 50 μm alan için 16 ve en az 1.024 x 1.024 piksel biraz derinlik önerilir. Varsa, gürültüyü azaltmak için satır ortalaması yararlı bir şekilde uygulanabilir (örn. hat başına 3 tarama).
- Hem önemli olmayan kare-karartama ve arka plandan bireysel lipozomları açıkça ayırt edecek kadar güçlü sinyal sağlayan bir uyarma lazer gücü seçin. En uygun ayar, florofor kombinasyonunun yanı sıra kullanılan spesifik mikroskoba da bağlıdır. Bu önyargı yoğunluğu niceleme olacak gibi dedektörleri, doymuş olmadığından emin olun.
- Lipozomlarda hem DOPE-Atto488 hem de DOPE-Atto655 floroporlarının görüntülenmesi birden fazla kanalın görüntülenmesi gerektirir. Böylece, çapraz uyarma önlemek için her kanal sırayla görüntülenmiş olduğundan emin olun. Örneğin, ilk olarak 488 nm'de heyecan verici bir görüntü ve 495−560 nm'de emisyon okuma. Bundan sonra, 633 nm heyecan verici ama sadece 660−710 nm emisyon okuma başka bir görüntü almak. Özellikleri mikroskop sistemine (örn. hangi lazerler ve filtreler) bağlıdır.
- Yüzeyin farklı alanlarını kapsadığından emin olun, numunenin en az 10 görüntüsünü elde ederek en az 3.000 bireysel lipozom görüntülenin. Yüzey yoğunluğu 300 lipozom/çerçeveden daha düşükse, daha fazla görüntü edinin. Her yeni görüntü için mikroskobu yeniden odakladığından emin olun.
NOT: İki kanallı görüntüleme için, farklı floresan kanallarındaki aynı lipozomlarla görüntü çiftleri veri analizi sırasında kolayca tanımlanabilmesi için görüntü dosyalarını adlandırdığından emin olun. - Bileşimsel homojenlik ölçümü ile ilgili deneysel belirsizliği ölçmek için, lipozomların yeniden odaklama öncesi ve sonrasında aynı alanı görüntüleyin (bkz. Şekil 3 ve metindeki açıklama).
- Görüntüleri mikroskop yazılımından .tiff dosyaları olarak dışa aktarın. Aynı lipozomların iki kanalını tek tek dışa aktarın.
5. Veri Analizi
NOT: Özel olarak geliştirilen otomatik 2D Gaussian montaj rutinleri daha önce istihdam edilmiştir6,11,12. Ancak, yöntemin uygulanabilirliğini artırmak için tüm laboratuvarlarda kolayca uygulanabilen bir veri analizi süreci tanımlanmıştır.
- Aynı görüntüleme alanındaki iki farklı floresan kanalının karşılık gelen .tiff görüntülerini FIJI (FIJI Sadece ImageJ) yazılımına yükleyin.
- Resim menüsünde Renk'iseçin ve iki kanalın birbileşimini oluşturmak için Kanalı Birleştir işlevini kullanın.
- İki farklı kanalda görüntülenen lipozomların iyi bir kolokalizasyon gösterip göstermediğini veya görünür sürüklenme olup olmadığını gözlemleyin.
NOT: İki floresan kanalı (iki kanaldaki sinyal arasında sistematik ve eşit X-Y ofset olarak kabul edilir) arasında sürüklenme durumunda, çerçevelerden biri FIJI'nin Resim menüsündeki Transform > Translate işlevi kullanılarak çevrilebilir. Ancak, bu tür görüntü manipülasyonu ile dikkat edilmelidir. Bu nedenle lipozomları görüntülerken mümkün olduğunca sürüklenmekten kaçınmak önerilir. - ComDet eklentisinin (v.0.3.6.1 veya daha yeni) yüklü olduğundan emin olun veya bunu Eklentiler menüsünde yapın.
- Eklentiler menüsüne giderek ve ComDet v.0.3.6.1 > Detect Particles'üseçerek parçacıkları algılamak için ComDet eklentisini açın.
- ComDet'te, her iki Kanaldaki Parçacıkları Tek tek seçtiğinizden emin olun. Yaklaşık Parçacık Boyutunabenzer Eş lokalize Noktalar Arasındaki Maksimum Mesafeyi ayarlayın. Genellikle, burada açıklanan ayarlar için 4 piksel uygundur.
- Sinyal-gürültü oranı, düşük miktarda floresan ile bile loş parçacıkların algılanmasına olanak sağlayacaktır. ComDet'te, her iki kanaldaki Algılama Hassasiyetini Çok Dim Parçacıklara (SNR = 3)ayarlayarak bu oranı 3 olarak ayarlayın.
NOT: Bu SNR değeri genellikle uygun olsa da, daha yükseğe ayarlamak gerekebilir (örneğin, lipozom olarak tanımlanabilecek ve yanlış pozitif sonuçlara yol açabilecek çok fazla görüntü gürültüsü varsa). - Oktuşuna basmadan önce, Her Iki Kanaldaki Kolocalrizasyon ve Çizim Algılanan Parçacıkları Hesapla'ya sahip kutuların kontrol edildiğinden emin olun.
- Analizi çalıştırdıktan sonra, Sonuçlar ve Özet içeren iki açılır pencere gösterecektir. Ortak yerelleştirme verilerini (parçacık koordinatları ve algılanan her parçacığın tümleşik yoğunluğu) içeren veri tablosu sonuçlarını,.txt dosyası olarak kaydedip yazılıma aktararak tercih edilen bir veri işleme yazılımına dışa aktarın.
- Her lipozom veri setine yalnızca bir kez dahil olduğundan ve hem kanal1/channel2 hem de channel2/channel1 oranına dahil olmadığından emin olun. Böylece, verileri filtreleyin, böylece yalnızca Abs_frame = 1 adım 5.11'de çizilir.
NOT: Kolocalized = 1seçilerek, görüntülerdeki gürültüden kaynaklanan yanlış pozitif ler analizden çıkarılabilir. Ancak, mevcut iki floresan bileşenden sadece birine sahip lipozomlar da analizin dışında tutularak önemli veri noktaları analizden çıkarılacaktır. - Algılanan her lipozom için Yoğunluk Oranını içeren verilerle sütunun bir histogramını çizin.
- İncelenen lipozomal sistemin bileşimsel homojenlik derecesi yoğunluk oranı dağılımının genişliği ile temsil edilir. Homojenliği ölçmek için, gauss fonksiyonu ile yoğunluk oranı histogram uygun ve ortalama ayıklamak (μ) ve standart sapma (sigma). Temsilci Sonuçları bölümüne bakın.
- Homojenlik derecesi (DI) için bir değer artık DI = sigma / μ olarak tanımlanan varyasyon katsayısı kullanılarak hesaplanabilir.
6. Lipozom Boyut Kalibrasyonu
- Lipozom stoğunun bir kısmını alın ve adım 1.10'da açıklandığı gibi 50 nm polikarbonat filtreile 21 x ekstrüzyonu edin.
- Mikrosantrifüj tüpünde 800 μL sorbitol tamponuna lipozom süspansiyonun 10 μL'sini ekleyerek lipozomları seyreltin.
- Seyreltilmiş lipozom numunesini polipropilen tek kullanımlık bir cuvette aktarın.
- Dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanarak boyutu ölçün. Lipozom süspansiyonun boyutunu ve çok dağılımlılığını ölçmek için en az üç bağımsız çalıştırma gerçekleştirin.
NOT: Gerekirse, ölçüm için daha konsantre lipozom süspansiyon kullanın. Lipozomların boyutunu ölçmek için DLS'ye (örneğin nanopartikül izleme analizi) alternatifler de uygulanabilir. Bu tür parçacık boyutu belirlemenasıl yürütülmesi için bir açıklama bu protokolün kapsamı dışındadır. - 4.1 ve 4.2 adımlarında tanımlandığı gibi tam olarak aynı deneysel ayarları kullanarak mikroskop üzerindeki kalibrasyon lipozomlarını görüntüleyin.
- Kalibrasyon görüntülerindeki her kalibrasyon lipozomu için entegre yoğunluğu ayıklayın: 5.1−5.10 adımlarında açıklandığı gibi lipozom floresan yoğunlukları içeren filtrelenmiş sonuç sayfasını ayıklayın. Sonuç tablosundan "IntegratedInt" sütunundan ayıklayın.
- Membranında etiketlenmiş bir lipozonun toplam entegre yoğunluğu lipozomun yüzey alanı ile orantılı olduğundan ve böylece çapının karesi ile orantılı olduğundan, floresan yoğunluğunun kare kök yoğunluğu histogramını kalibrasyon lipozomlar.
- 6.7 adımda üretilen entegre histogramı günlük normal dağılımla takın ve kalibrasyon lipozomlarının ortalama floresan yoğunluğunu ayıklayın.
- Kare kök yoğunluğu (IntSqrt)ve lipozom boyutu arasındaki ilişkiyi belirlemek için, ortalama lipozom çapı (Dia) Kullanarak düzeltme faktörü (C) Hesaplamak DLS ölçümleri elde edilen sayı ile tartılır: Dia = C x IntSqrt C = Dia / IntSqrteşdeğerdir .
- Bileşimsel homojenlik deneyindeki lipozomlar için IntSqrt değerlerini hesaplayın ve düzeltme faktörüyle çarparak bunları çaplara dönüştürün.
- Bileşimsel homojenlik lipozomlar için çapın bir fonksiyonu olarak yoğunluk oranı değerini çizin, böylece yaklaşık 50 nm−800 nm'den yayılan lipozom popülasyonu için lipozom büyüklüğünün bir fonksiyonu olarak homojenliği elde edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan protokolü n ardından, tek lipozomların büyük bir paralel şekilde görüntülenebilmektedir (Şekil 1). Lipozomların başarılı yüzey immobilizasyonu, lipozom çözeltisinin hazneye eklenmesiyle hemen belirgin olmalıdır (protokolde 3.6 adım) çünkü görüntüde kırınım sınırlı yoğunluk noktaları görünmelidir(Şekil 1B ve Şekil 1C).
İyi istatistikler elde etmek ve tsurcun yüksek iş verme yeteneklerini kullanmak için binlerce lipozom görüntülenmelidir. Bunu makul sayıda görüntüde yapabilmek için, kare başına 300−400 lipozom yoğunluğuna ulaşmak için yeterli lipozomların hareketsiz hale getirilmesi tavsiye edilir, çünkü bu durum örnek başına görüntü sayısını ~10'a düşürecek ve böylece elde edilmesi ve analiz edilmesi gereken görüntü sayısını sınırlandıracaktır. Daha düşük bir yoğunluk veri analizini daha zaman alıcı hale getirirken, daha yüksek bir yoğunluk görüntü analizi yazılımının tek lipozomları ayırt etmesini zorlaştırabilir. 300−400 lipozomların neye benzeyiş yaptığına dair görsel bir izlenim elde etmek için Şekil 2A'yabakınız. Ancak, bazı uygulamalariçin (örneğin, BSA yüzeyine güçlü bir arka plan bağlanması eğilimi gösteren bir proteinle membran-protein etkileşimleri) sağ üstteki Şekil 2A'da olduğu gibi biraz daha düşük bir yoğunluk kullanılması tavsiye edilir.
Bazen, görüntü elde ederken şekil 2B'degösterildiği gibi, tüm görüş alanını uygun odakta elde etmek zordur. Bu tür sorunlar, numune plakasının eğimli olduğunu gösterebilir ve bu da plakanın mikroskoptaki numune tutucuya düzgün bir şekilde yerleştirilmememesinden kaynaklanabilir. Ayrıca, lipozomlar büyük ve bulanık görünüyorsa, odadaki tampon buharlaşmış ve yüzey kurumuş olabilir. Uzun süregörüntüleme yaparken veya RT'den daha yüksek sıcaklıklarda ölçüm yaparken bu hususu göz önünde bulundurmak özellikle önemlidir. Düzgün bir şekilde depolanan ve kurutulmuş lipozomlar arasındaki farkı göstermek için, aynı numunenin kurutulmadan önceki ve kuruduktan sonraki görüntüsü Şekil 2C'degösterilmiştir.
Optimum görüntü kalitesini sağladıktan sonra, iki görüntüleme kanalındaki her lipozom için entegre yoğunluk, bu protokolün 5. Bunu yapmak, bize her bir lipozom için yoğunluk oranını hesaplamak için izin benzersiz yoğunluk değerlerinin bir listesini oluşturacaktır. Bileşimsel homojenlik yoğunluk oranı histogramlarından değerlendirilir ve tipik olarak ortalama oran değeri etrafında Gauss dağılımı ortaya çıkar(Şekil 3A). Gaussdağılımından güçlü sapmalar gözlenirse(Şekil 3B),görüntüleme kanallarından en az biri için bir algılama duyarlılığı sorunu olduğunu gösterir ve daha zayıf bir sinyal gösteren lipozomalt kümesinin dışlandığını düşündürmektedir. Bunun nedeni hem görüntüleme sisteminin algılama limitinden, hem de veri analizindeki lipozomların hariç alınmasından kaynaklanıyor olabilir (örneğin, belirli bir minimum eşik uygulanırken; bkz. adım 5.7).
Protokoldeki 5.11−5.13 adımlarında açıklandığı gibi DI değerinin hesaplanması, preparatın bireysel lipozomları arasındaki bileşimsel homojenliğin nicel bir ölçüsünü sağlayacaktır. Burada incelenen lipozomal sistem için DI = 0.23 ± 0.01 (Şekil 3C). Bu değer, değişken lipozom özelliklerinin veya hazırlama yöntemlerinin bileşimsel homojenliği nasıl etkilediğini sistematik olarak karşılaştırmak için kullanılabilir. DI değerinin anlamını kavramsallaştırmak için histogramın yoğunluk oranının gösterdiği normal dağılıma atıfta bulunuruz, yani ampirik 68-95-99.7 kuralına uyacaklar. Bu kural, ortalama değer etrafında bir, iki ve üç standart sapmalar içinde düşen bir popülasyon yüzdesini açıklar. Burada bulunan 0,23 ± 0,01 DI değeri için, popülasyondaki lipozomların %32'sinin topluluğun ortalama azı hebisi oranından %23'ten fazla bir yoğunluk oranına sahip olacağı anlamına gelir(Şekil 3D).
Yeniden odaklamadan önce ve sonra aynı lipozomları (bölüm 4.6) gösteren kontrol deneyi için, gerçek deneyle aynı veri analizi ve sonuç çizimi gerçekleştirilir. Bunu yapmak,DI belirsizliği = 0,10 ± 0,01(Şekil 3E)olduğu tespit edilen DI değerinin deneysel belirsizliğinin ölçülmesine olanak sağlar. DIbelirsizlik değeri istihdam görüntüleme sistemine bağlı olmasına rağmen, bu konfokal mikroskop kurulumları sürekli 0,105,6civarında DIbelirsizlik değerlerine yol açtı bulundu. Burada lipozomal sistem için bulunan DI = 0.23 ± 0.01 di değeri, preparatın bireysel lipozomları arasında anlamlı bileşimsel homojenlik varlığını düşündüren deneysel belirsizliğin iki katından fazladır.
Bölüm 6'da açıklanan boyut kalibrasyon deneyinin yapılması, rasgele lipozom yoğunluk değerlerinin nanometrelerde fiziksel çaplara dönüştürülmesini sağlayacaktır. Yöntem, çok daha düşük iş elde edilmesine rağmen nanometre boyutundaki lipozomları optik olarak çözebilen kriyojenik elektron mikroskobu gibi25 adet diğer görüntüleme tekniklerine karşı doğrulanmıştır. Kontrol örneğinin gerçek deneylerde kullanılan mikroskop ayarlarını kullanarak görüntülenmesi, ortalama lipozom yoğunluğunu DLS tarafından belirlenen ortalama lipozom çapı ile ilişkilendirmek artık mümkündür(Şekil 4A). Bir sonraki adım, son derece küçük lipozomlar oluşturmaya karşı fiziksel kısıtlamalara dayalı lipozom yoğunluğu dağılımı, tipik bir günlük normal dağılım görüntüler (Şekil 4B)tasvir etmektir. Dağılım bir günlük normal dağılımı ile iyi tanımlanmamışsa (çoğu zaman düşük yoğunlukdeğerlerine sahip eksik lipozomlar nedeniyle) lipozom popülasyonunun bir kısmının düşük mikroskop algılama hassasiyeti veya veri analizi sırasında aşırı katı parametreler nedeniyle dışlandığı anlamına gelir (Şekil 4C). Tarafsız veri yorumlanmasını sağlamak için bu sorunları yakalamak ve ele almak önemlidir. Daha sonra Şekil 4B'deki her bir lipozomun yoğunluk değerleri Şekil 4A 'da belirlenen düzeltme faktörü kullanılarak gerçek çaplara dönüştürülebilir (Şekil 4D). Her lipozomun boyutu belirlendikten sonra, çapın bir fonksiyonu olarak DI artık her bir lipozom için yoğunluk oranına karşı çap çizilerek incelenebilir(Şekil 4E). Bu huni benzeri veri yapısı, lipozom boyutu6azaldığında DI değerinin arttığına dair önceki bulguları doğrular. Daha da önemlisi, yoğunluk oranlarının ortalama bir değer etrafında yayılmasındaki simetrik artış, lipozomların ortalama bileşiminde sistematik boyuta bağlı bir varyasyon olmadığını göstermektedir.
Şekil 1: Tek lipozom töz. (A) Lipozomlar floresan olarak etiketlenmiş dope-Atto488 ve DOPE-Atto655 lipidlerinin equimolar içeriği ile formüle edilir ve biotin/streptavidin bağlantısı kullanılarak BSA yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. (B) Hareketsiz lipozomlar konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenerek tek lipozomlardan kaynaklanan floresan yoğunluklarının saptanmasına olanak sağlar. Ölçek çubukları = 8 μm. (C)(B)içinde yeşil alanın yakınlaştırılması, iki kanal arasında ters floresan sinyali gösteren iki bitişik lipozomiçin yüzey yoğunluğu çizimi olarak gösterilmiş ve kompozisyonsal homojenlik kavramını gösterilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Optimizasyon ve tuzaklar. (A) Sol üstte 50 μm x 50 m karede hareketsiz 29 lipozom bulunur. Bunlar çerçeve başına çok az lipozomlilik lipozom inhomojenite yüksek iş itme araştırma olasılığı yararlanmak için vardır. Sağ üstte kare başına 123 lipozom görülüyor. Bu bir suboptimal yoğunluk, ancak birçok görüntü elde edilirse kullanılabilir. Sol altta kare başına 300−400 lipozom gösterilmektedir. Bu, burada açıklanan protokol için en uygun uyrumdur. Sağ altta kare başına 1.500'den fazla lipozom gösteriliyor, bu da tek tek lipozomları ayırt edemeyecek kadar fazla. Tek bir nokta aslında aynı kırınım sınırlı nokta içinde hareketsiz iki lipozom lar olacak yüksek bir risk vardır. (B) Hazne numune tutucuya düzgün yerleştirilmezse, tüm görüş alanını uygun bir şekilde odaklamak imkansız olacaktır. Sol mikrografta plaka, çapraz eksen etrafında eğilerek sol alt köşeyin odak dışında kalmasına neden oluyor. Doğru mikrografta plaka uzunlamasına eksen etrafında eğilerek daha ağır bir eğime yol açar. Hem sol alt hem de sağ üst köşe odak dışındadır. (C) Eğer uzun süre görüntüleme veya yüksek sıcaklıklarda tampon buharlaşabilir, bu da odanın kuruması ile. Biz önce ve sonra oda 3 dakika kurumaya bırakıldı ve daha sonra odaya taze tampon ekleyerek rewetted önce ve sonra lipozomlar görüntüleme ile bu senaryoyu resimli. Ortaya çıkan lipozomlar daha büyük, bulanık, daha düşük floresan yoğunluğuna sahip, ve plaka üzerinde yayılmış gibi görünüyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Lipozom bileşimsel inhomojenitenin ölçülmesi için yoğunluk oranı histogramları. (A) Her bir lipozom için DOPE-Atto488 ve DOPE-Atto655 floresan yoğunluk oranı bir histogram olarak çizilmiştir. (B) Görüntüleme sırasında veya veri işleme aşamasında potansiyel bir duyarlılık sorununu gösteren kesilmiş gaussian dağılımı. (C) Yoğunluk histogramını Gauss fonksiyonuna uydurmak, DI değerini hesaplamak için kullanılan ortalama ve standart sapmanın ayıklanmasımümkün olur. (D) 0,23 DI değeri, topluluğun ortalama azı azı oranının %23'ünden fazla bir oranda farklı olan nüfusun %32'sine çevrilebilir. (E) Yeniden odaklamadan önce ve sonra aynı lipozomları görüntüleme yi kontrol etmek ve gerçek deneyle aynı veri işleme prosedürünü gerçekleştirmek. Bu, DI nicelleştirme için deneysel hatanın belirlenmesini sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Lipozom yoğunluğunun nm'deki fiziksel çapa dönüştürülmesi. (A) Kalibrasyon faktörünü belirlemek için DLS verileri ile karşılaştırıldığında 50 nm ekstrüde kalibrasyon lipozomlarının yoğunluk histogramı. (B) Deneysel lipozomlardan intSqrt değerinin histogramı genellikle çok küçük lipozomlar oluşturmaya karşı fiziksel kısıtlamalar nedeniyle bir log-normal dağılım verir. (C) Günlük olmayan bir intSqrt değeri histogram ı tespit duyarlılığı ile ilgili sorunları gösterir ya da veri tedavisi sırasında küçük lipozomlar dışlanır. (D) (B)lipozom yoğunlukları düzeltme faktörü kullanılarak gerçek lipozom çaplarına dönüştürülür. (E) Lipozom çapının bir fonksiyonu olarak çizilen her lipozomun yoğunluk oranı artık lipozom boyutunun bir fonksiyonu olarak bileşimsel homojenliğin araştırılmasına olanak sağlayacak şekilde görüntülenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek lipozom ların tek lipozomlar arasındaki bileşimsel homojenliği incelemek için nasıl kullanılabileceğini ayrıntılı olarak açıklarken, platformun çok yönlü olduğunu belirtmek önemlidir. Daha önce gösterildiği ve giriş tartışılan gibi, protokol kolayca membran-membran füzyon yönlerini incelemek için adapte edilebilir, protein-membran etkileşimleri, veya lipozomal ilaç taşıyıcı karakterizasyonu. Ele alınması gereken herhangi bir bilimsel soru için, tek lipozom test gücü topluluğun bireysel bileşenlerini tespit etmek ve böylece bir nicel okuma sahip yeteneği yatıyor, topluluk ortalama etkileri tarafından önyargılı değil.
Tek lipozom doğrama, z-yönlü kesitin lipozom tabakasının üzerindeki çözeltiden istenmeyen arka plan floresansını ortadan kaldırabileceği toplam iç yansıma veya konfokal mikroskop gibi yüzey görüntüleme yöntemleri için en uygun yöntemdir. Ancak bu husus, peptidler, proteinler veya diğer lipozomlar gibi floresan etiketli bileşiklerin çözeltiye eklendiği ve görüntüleme sırasında orada kaldığı çalışmalar için en önemli unsurdur. Örneğin, flüoresan boyaların hareketsiz lipozomlarla sınırlı olduğu burada ayrıntılı olarak açıklanan biçimde ele geçide kullanılırsa, titreşme prensipte daha geniş alan mikroskopları kullanılarak yapılabilir ve bu da tespiti sağlar. sistem yeterince hassastır.
A priori, sataşmada kullanılan lipozomları hazırlamak için kullanılan yöntemle ilgili herhangi bir sınırlama yoktur. Burada bir dondurma-kurutma tekniğinin kullanımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ancak, daha önce kloroform bazlı lipid rehidrasyon veya etanol enjeksiyon tabanlı teknikler test lipozomlar imalatiçin istihdam edilmiştir5,6. Kritik bir parametre immobilizasyon sağlamak için lipid karışımı biyotinylated lipidlerin bir dakika fraksiyonu dahil (0.05% önerilir). Başka bir gerekli unsur floresan lipid etiketli küçük bir miktar dahil etmektir. Genel olarak, eklenen lipid boya miktarı hem söndürme etkilerini önlemek ve lipozom un fizyokimyasal özelliklerini önemli ölçüde değiştiren lipid-boya önlemek için mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır. Lipid boyası miktarının alt sınırı, lipozom başına tek tek lipid boyalarının sayısındaki stokastik varyasyonun ortalama lipid-boya miktarına göre anlamlı hale geldiği konsantrasyona göre belirlenir (ayrıntılı bir tartışma için Bkz. Larsen ve ark.6). Bu sınırın altına inme, çıkarılan yoğunluklarda büyük belirsizliklere neden olacaktır. Son olarak, lipid boya miktarı iyi bir sinyal-gürültü oranı ile tek lipozomların doğru tespiti için yeterince yüksek olması gerekir. Bu kriter elbette görüntüleme sistemine bağlı olmakla birlikte, olguların büyük çoğunluğunda lipid boya konsantrasyonlarının %0.05 ile 0.5 mol arasında iyi çalıştığını bulduk.
Lipozomda hangi lipid boyasının yer alacağı na ilişkin ilk ön koşul, uyarma ve emisyon özelliklerinin görüntüleme sisteminin aydınlatma ve algılama yetenekleriyle eşleşmesidir. İkinci olarak, hem yüksek kuantum verimleri hem de fotostabilite ile boyalar kullanmanızı tavsiye ettiğimiz yöntemin hassasiyetini ve doğruluğunu artırmak için, daha önce farklı uyarma dalgaboylarında6,11boyaları başarıyla kullandık. Lipid bölümlemeyapay yüksek homojenlik yol açmaz sağlamak için benzer fizyokimyasal özelliklere sahip lipid çapa seçiminde dikkat edilmelidir. Örneğin, bu protokol için, her iki floroforu DAPE kullanarak demirledik, DOPE'da bir florofor ve DPPE'de başka bir florofor dağılımı heterojenitesine yol açabilirken lipozom popülasyondaki doğal homojenlik ile ilişkili olmayan heteroorofordağılımı. Özellikle çift renkli görüntüleme için, boyalar ve kanallar arasında önemli ölçüde kanama, çapraz konuşma ve floresan rezonans enerji transferini (FRET) önlemek için dar uyarma ve emisyon spektrumları ve mümkün olduğunca en küçük spektral çakışma ile boyalar seçmek önemlidir. Florofor ortamındaki değişimle ilgili eserlerden kaçınmak için, Hughes ve ark.26tarafından belirlenen son derece düşük membran etkileşim eğilimini göstermek için deneysel olarak kanıtlanmış boyalarla çalışmayı tercih ediyoruz. Son olarak, belirli bir lipozom lipid bileşimi deneysel tasarım için zor bir gereklilik değilse, bireysel lipozomlar birbirlerini püskürtmek ve verimli bir şekilde tek lipozomlar 12 olarak immobilize sağlamak için negatif yüklü lipidlerin% 10 mol kadar dahil etmek yararlı olabilir12.
Tek lipozom doğrama bir avantajı büyük ölçüde deney başına kullanılan pahalı veya nadir bileşiklerin miktarını azaltabilir küçük deneysel hacimvardır. Burada 150-300 μL arasında deneysel hacmi ile standart ve ticari olarak kullanılabilir odaların kullanımını açıklıyoruz. Ancak, hacmi 50-80 μL aralığına düşürebilen özel yapım mikroskop odaları kullanılabilir. Ayrıca, lipozom tüketimi çok düşüktür, 2 μM toplam lipid etrafında son konsantrasyonu ile.
Tek lipozom analizinin bir dezavantajı, yukarıda açıklanan immobilizasyon eğilimlerindeki farklılıklar nedeniyle odadaki lipid konsantrasyonunun kontrol edilmesinin zor olmasıdır. Ayrıca, membran-protein etkileşimleri incelenmesi için titreşme uygulanması ile ilgili olarak, doğrudan floresan yoğunluğubağlı proteinlerin konsantrasyonu veya sayısını belirlemek zordur.
Membran model sistemleri olarak tsaydaki lipozomları kullanırken (örneğin, floresan bileşiklerin, peptidlerin veya proteinlerin membran etkileşimini incelemek için) Immobilizasyon. Bu durumda, lipozomlar için özel bağlama algılamasını engelleyebilir yüksek arka plan sinyali algılanabilir. Yüksek non-spesifik arka plan tespit edilirse biz daha önce başarılı neutravidin veya avidin streptavidin değiştirerek arka plan azalttı.
Akış sitometrisi gibi diğer teknikleri kullanarak tek lipozom tespiti yapmak, mikroskop bazlı teste kıyasla daha yüksek bir algılama işakışı sunabilir. Ancak, akış sitometreler hücreler gibi çok daha büyük ve parlak örnekleri incelemek için optimize edilmiş göz önüne alındığında, en algılama sistemi bireysel bir lipozom nispeten zayıf floresan tespit etmek için yeterince hassas değildir. Bu nedenle, yeni ve daha hassas akış sitometrisi geliştirilirken, mikroskop bazlı test, verimli bir şekilde yapıldığında lipozom yetmezliklerini açıklamak ve deney başına binlerce lipozomun izlenmesi için en iyi çözümü sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma Danimarka Bağımsız Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir [hibe numarası 5054-00165B].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
