Summary
Dieser Artikel zeigt die Verwendung von Laser-Doppler-Flowmetrie, um die Fähigkeit der zerebralen Zirkulation zu bewerten, ihren Blutfluss während der Senkung des arteriellen Blutdrucks autoregulieren.
Abstract
Bei der Untersuchung der mechanismen des Körpers zur Regulierung des zerebralen Blutflusses kann eine relative Messung des mikrozirkulierenden Blutflusses mit Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF) erreicht werden. Dieses Papier zeigt eine geschlossene Schädelpräparation, die es ermöglicht, den zerebralen Blutfluss zu beurteilen, ohne in den Schädel einzudringen oder eine Kammer oder ein Zerebralpeinzusungsfenster zu installieren. Zur Bewertung der autoregulatorischen Mechanismen kann ein Modell der kontrollierten Blutdrucksenkung durch abgestufte Blutungen verwendet werden, während gleichzeitig LDF eingesetzt wird. Dies ermöglicht die Echtzeit-Tracking der relativen Veränderungen des Blutflusses als Reaktion auf die Verringerung des arteriellen Blutdrucks durch die Entnahme des zirkulierenden Blutvolumens erzeugt. Dieses Paradigma ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung der autoregulation des zerebralen Blutflusses bei der Senkung des arteriellen Blutdrucks und ist mit geringfügigen Änderungen im Protokoll auch als experimentelles Modell des hämorrhagischen Schocks wertvoll. Zusätzlich zur Bewertung autoregulierender Reaktionen kann LDF verwendet werden, um den kortikalen Blutfluss zu überwachen, wenn metabolische, myogene, endotheliale, humorale oder neuronale Mechanismen untersucht werden, die den zerebralen Blutfluss und die Auswirkungen verschiedener experimenteller Interventionen und pathologische Bedingungen bei der zerebralen Durchblutung.
Introduction
Autoregulatorische Mechanismen in der zerebralen Zirkulation spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der normalen Funktion im Gehirn. Die Autoregulation des zerebralen Blutflusses wird durch mehrere Faktoren beeinflusst, einschließlich Herzfrequenz, Blutgeschwindigkeit, Perfusionsdruck, Durchmesser der Hirnwiderstandsarterien und der Mikrozirkulationsresistenz, die alle eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der gesamten zerebralen Blutflusskonstante im Gehirn über den physiologischen Bereich des systemischen Blutdrucks spielen. Wenn der arterielle Druck zunimmt, verengen diese Mechanismen Arteriolen und Widerstandsarterien, um gefährliche Erhöhungen des intrakraniellen Drucks zu verhindern. Wenn der arterielle Blutdruck abnimmt, werden die Arteriolen durch lokale Kontrollmechanismen zur Aufrechterhaltung der Gewebeperfusion und o2-Abgabe dedukumen. Verschiedene pathologische Erkrankungen wie Hyperkapnie, traumatische oder globale hypoxische Hirnverletzungen und diabetische Mikroangiopathie1,2,3,4,5,6 können die Fähigkeit des Gehirns stören, seinen Blutfluss autoregulieren. Zum Beispiel verschiebt chronische Hypertonie den effektiven Autoregulierungsbereich in Richtung höherer Drücke7,8,9, und eine hohe Salzdiät (HS) stört nicht nur die normale Endothel-abhängige Dilatation in der zerebralen Mikrozirkulation10, sondern beeinträchtigt auch die Fähigkeit der autoregulatorischen Mechanismen in der zerebralen Zirkulation, die Gewebedurchblutung zu erweitern und aufrechtzuerhalten, wenn der arterielle Druck reduziert wird11. Die zerebrale Autoregulation ist auch bei Salzempfindlichen Ratten in Dahl beeinträchtigt, wenn sie mit einer HS-Diät gefüttert werden12.
Bei der Verringerung des arteriellen Drucks gibt die Dilatation der Hirnwiderstandsarterien und Arteriolen zunächst den zerebralen Blutfluss zurück, um die Werte trotz des reduzierten Durchblutungsdrucks zu kontrollieren. Da der arterielle Druck weiter reduziert wird, bleibt der zerebrale Blutfluss im unteren Druck konstant (Plateauphase der autoregulierenden Reaktion), bis die Gefäße nicht mehr erweitern können, um den Blutfluss im unteren Druck aufrechtzuerhalten. Der niedrigste Druck, bei dem ein Organ den normalen Blutfluss aufrechterhalten kann, wird als untere Grenze der Autoregulation (LLA) bezeichnet. Bei Drücken unterhalb der LLA nimmt der zerebrale Blutfluss signifikant ab von ruhewerten und nimmt linear mit jeder Verringerung des arteriellen Perfusionsdrucks13,14ab. Eine Aufwärtsverschiebung in der LLA, wie bei Bluthochdruck7,8,9beobachtet, kann das Risiko und die Schwere der ischämischen Verletzung unter Bedingungen erhöhen, in denen der arterielle Perfusionsdruck reduziert wird (z. B. Myokardinfarkt, ischämischer Schlaganfall oder Kreislaufschock).
LDF hat sich als äußerst wertvoller Ansatz zur Bewertung des Blutflusses in der Mikrozirkulation unter einer Vielzahl von Umständen erwiesen, einschließlich der Autoregulation des Blutflusses im Zerebralparesekreislauf11,14,15. Zusätzlich zur Bewertung autoregulierender Reaktionen kann LDF verwendet werden, um den kortikalen Blutfluss bei der Untersuchung metabolischer, myogener, endothelialer, humoraler oder neuronaler Mechanismen zu überwachen, die den zerebralen Blutfluss und die Auswirkungen verschiedener experimenteller Eingriffe und pathologischer Bedingungen auf den zerebralen Blutfluss10,16,17,18,19,20,21regulieren.
LDF misst die Verschiebung des reflektierten Laserlichts als Reaktion auf die Anzahl und Geschwindigkeit sich bewegender Teilchen - in diesem Fall rote Blutkörperchen (RBC). Für Studien zur zerebralen vaskulären Autoregulation wird der arterielle Blutdruck entweder durch die Infusion eines alpha-adrenergen Agonisten verändert, um den arteriellen Druck zu erhöhen (weil die zerebrale Zirkulation selbst unempfindlich gegenüber alpha-adrenergen Vasokonstriktoragonisten ist)12,15 oder durch kontrollierte Blutvolumenentnahme zur Verringerung des arteriellen Drucks11,14. In der vorliegenden Studie wird LDF verwendet, um die Auswirkungen von abgestuften Senkungen des Blutdrucks auf die zerebrale Autoregulation bei einer gesunden Ratte zu demonstrieren. Obwohl offene und geschlossene Schädelmethoden in der Literatur22,23,24,25beschrieben wurden, zeigt das vorliegende Papier eine geschlossene Schädelpräparation, die es ermöglicht, den zerebralen Blutfluss zu bewerten, ohne in den Schädel einzudringen oder eine Kammer oder ein Hirnfenster zu installieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigte alle in diesem Papier beschriebenen Protokolle, und alle Verfahren entsprechen dem National Institutes of Health (NIH) Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) Vorschriften.
1. Versuchstiere und Aufnahmevorbereitung
- Verwenden Sie 8-12 Wochen alte männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 250–300 g. Für diese Experimente füttern Ratten eine Standarddiät bestehend aus 0,4% NaCl, 200 g/kg Casein, 3 g/kg DL-Methionin, 497,77 g/kg Saccharose, 150 g/kg Maisstärke, 50 g/kg Maisöl, 50 g/kg Zellulose, 2 g/kg Cholinbitartrat, 35 g/kg Mineralmischung und 10 g/kg Vitaminmischung.
- Zeichnen Sie arterielle Blutdruck- und LDF-Messungen mit Datenerfassungssoftware oder einer vergleichbaren Aufzeichnungsmethode auf.
- Befestigen Sie den arteriellen Druckwandler an einem Kanal des Aufnahmesystems und die LDF-Sonde an den anderen Kanal des Aufnahmesystems.
- Kalibrieren Sie vor der Messung die Laser-Doppler-Sonde, um einen Motilitätsstandard zu setzen und sicherzustellen, dass das Laser-Doppler-Durchflussmesser eine konstante Leistung liefert.
- Bereiten Sie zusätzliche Ausrüstung für die vorbereitende Operation und für das Experiment vor: ein Sezieren des Mikroskops, ein Nagetier-Beatmungsgerät, ein Endgezeiten-CO2-Monitor, ein stereotaxic-Instrument zur Befestigung des Kopfes der Ratte in Position und ein Mikromanipulator, um die LDF-Sonde über der pialen Mikrozirkulation zu lokalisieren und in einer stabilen Position zu halten.
2. Chirurgische Präparation
- Wiegen Sie die Ratte und beanten das Tier in einer Induktionskammer mit 3,5% Isofluran und 30%O2 Ergänzung.
- Entfernen Sie das Tier aus der Induktionskammer und ersetzen Sie eine Anästhetikummaske, die 1,5–3% Isofluran liefert, durch eine 30%O2-Ergänzung.
- Legen Sie die Ratte auf eine zirkulierende Wasserdecke, die bei 37 °C gehalten wird, und überprüfen Sie die Reflexe mit einer Zehenzange, um sicherzustellen, dass es einen Entzugsreflex gibt. Tragen Sie sterile ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf, um Hornhautaustrocknung zu verhindern.
- Rasieren Sie die Spitze des Schädels, ventralen Halsbereich, und Femoral Dreiecke. Entfernen Sie lose Haare aus diesen Bereichen und reinigen Sie mit Reiben Alkohol.
- Legen Sie die Ratte in eine Supine-Position auf einem Heizkissen mit einer zirkulierenden Warmwasserpumpe, um die Körpertemperatur des Tieres bei 37 °C zu halten und sie vorübergehend mit medizinischem Klebeband am Pad zu befestigen.
- Installieren Sie eine Luftröhrenkanüle (PE240 Polyethylenrohre) durch einen ventralen Schnitt im Hals, wie an anderer Stelle beschrieben26.
- Befestigen Sie die Luftröhrenkanüle an einem Endgezeiten-CO2-Monitor und dem Beatmungsgerät, das 2,5–3,0 % Isofluran (je nach Größe des Tieres) und eine 30% O2-Inhalationsergänzung liefert. Stellen Sie sicher, dass die Atemfrequenz, die Inspiratorzeit und das Minutenbeatmungsvolumen eingestellt und überwacht werden, um während des gesamten Experiments ein abgelaufenes Gezeiten-CO2 von ca. 35 mmHg zu gewährleisten.
HINWEIS: Dies wird in der Regel mit einer Atemfrequenz von ca. 48–60 Atemzügen/min, einem Gezeitenvolumen von 1,70–2,30 ml und einer Inspirationszeit von 0,50–0,60 s für eine 250–300 g Ratte erreicht. - Füllen Sie zwei PE50-Polyethylenkanülen mit 1 U/ml Heparin in isotonischer NaCl-Lösung, um Gerinnung zu verhindern und die Durchgängigkeit der Katheter aufrechtzuerhalten. Nach dem Befüllen das offene Ende jeder Kanüle mit einer chirurgischen Schere abschrägen, um das Einführen in die Arterie zu erleichtern.
- Kanülieren Sie die rechte und linke Femoralarterien, wie an anderer Stelle beschrieben27, um eine kontinuierliche Überwachung des arteriellen Drucks in einem Katheter und Blutentnahme aus dem anderen Katheter zu ermöglichen.
- Nachdem Sie die Arterien unter einem Sezierendes Mikroskop sorgfältig vom umgebenden Gewebe getrennt haben, legen Sie das distale Ende der Arterie auf und legen Sie zwei zusätzliche Nähte um die mittleren und proximalen Enden der Arterie, ohne die Knoten zu straffen.
- Verwenden Sie die proximale Naht als Hebeligatur, um Blutungen aus der Arterie nach dem Einschnitt zur Kanüleneinfügung zu verhindern (Schritt 2.11).
- Legen Sie einen V-förmigen Draht aus einer Büroklammer unter der Arterie ein, um das Gefäß zu verschließen, bis die Kanüle gesichert ist.
- Unter einem Sezieren Mikroskop machen einen kleinen Schnitt in der Oberschenkelarterie in der Nähe der distalen Ligation mit Vannas Schere. Setzen Sie das abgeschrägte Ende der Kanüle in den Schnitt ein und bringen Sie es in die Oberschenkelarterie. Ziehen Sie den Knoten an der mittleren Ligatur an, um die Kanüle an Ort und Stelle zu sichern, damit sie nicht durch arteriellen Druck entfernt wird, wenn die Hebeligatur oder Büroklammer entfernt wird.
- Nachdem die mittlere Ligatur angezogen wurde, lassen Sie die Spannung auf der Hebeligatur los und/oder entfernen Sie die Büroklammer, und ziehen Sie die proximale Ligatur an.
- Schließen Sie den Schnitt mit feinen Nähten (3:0 Seide) oder einem chirurgischen Grundnahrungsmittel. Alternativ legen Sie eine feuchte Gaze über die Einschnittstelle, abhängig von der Größe des Einschnitts.
3. Schädelverdünnung für LDF-Messungen
- Unmittelbar nachdem die Kanülen an Ort und Stelle sind, stellen Sie das Tier in eine Sternposition und sichern Sie den Kopf in einem stereotaxic Gerät, wobei Sie darauf achten, die Katheter oder Trachealröhren nicht zu lösen.
- Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen elliptischen Schnitt in der Haut zu machen, der den Schädel bedeckt. Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um jegliches Bindegewebe zu entfernen, um sicherzustellen, dass der Schädel sauber und trocken ist. Legen Sie ein kleines längs esliertes und gerolltes Stück Tissuepapier um den Schnitt auf der Kopfhaut, um Blutungen zu stoppen.
- Verwenden Sie unter dem Sezierendes Mikroskop ein Dremel-Werkzeug oder einen Zahnbohrer mit einem 2,15 mm Bohrer, um eine kleine Knochenfläche (je nach Größe der Ratte ca. 0,5–1 cm) im parietalen Bereich über dem linken oder rechten somatosensorischen Kortex zu verdünnen.
VORSICHT: Dünnen Sie den Knochen langsam und vorsichtig, um ein Eindringen in den Schädel zu vermeiden. Während dieses Schritts sollte eine saline Lösung großzügig angewendet werden, um eine Überhitzung des Gebiets zu verhindern. - Sobald der Schädel ausgedünnt wurde und der Bereich ein rosa Aussehen hat und/oder Blutgefäße visualisiert werden, decken Sie den Bereich mit Mineralöl ab und verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Laser-Dopplersonde über der exponierten zerebralen Mikrozirkulation zu positionieren, so dass die Spitze der Sonde nur die Spitze des Mineralölpools berührt (Abbildung 1).
HINWEIS: Es ist wichtig, LDF-Messungen in einem Bereich durchzuführen, in dem es keine äußeren Vibrationen gibt, die die Laser-Doppler-Messungen stören würden, und dass die Sonde während des gesamten Experiments sicher über demselben Zielbereich fixiert ist.
4. Beurteilung der zerebralen vaskulären Autoregulation
- Sobald die LDF-Sonde in Position ist, lassen Sie eine 30–45 min Ausgeglichenheit vor Beginn des Experiments zu. Messen Sie nach der Ausgleichsperiode den mittleren arteriellen Druck (MAP) und den zerebralen Laserblutfluss (LCBF) alle 30 s für 2 min und durchschnittlich die Werte, um die Ausgangswerte für den Blutdruck vor der Blutung und LCBF zu erhalten.
- Um die zerebrale vaskuläre Autoregulation als Reaktion auf arterielle Druckreduktion zu bewerten, messen Sie die LCBF und MAP nach aufeinanderfolgenden Entnahmen von 1,5 ml Blut aus der Femoralarterie11. Um das Katheterpatent zu halten, stellen Sie sicher, dass nach jeder Blutentnahme ein Volumen von Heparinlösung (100 U/ml in isotonischer Saline) in etwa gleich dem Kathetervolumen infundiert wird.
ANMERKUNG: Bei der Infundierung der Heparin-Lösung zur Aufrechterhaltung der Katheterdurchgängigkeit ist es wichtig, das Volumen der Heparin-Lösung so nah wie möglich an das Volumen des Katheters anzugleichen, um zu verhindern, dass das Tier zu viel Heparin erhält, was zu unerwünschten Blutungen. - Nach jedem Blutvolumenentzug kann die Ratte 2 min ausdemieren, danach werden MAP und LCBF alle 30 s für 2 min aufgezeichnet. Wiederholen Sie die Blutvolumenentnahmen, bis das Tier einen MAP von ca. 20 mmHg erreicht.
- Bestimmen Sie den effektiven Autoregulierungsbereich, indem Sie den Blutdruckbereich vom prähemorrhage MAP bis zur LLA (Schritte 4.5 und 5.3, unten) ermitteln.
- Bestimmen Sie die LLA, indem Sie den niedrigsten Druck ermitteln, bei dem LCBF nach der Entnahme des Blutvolumens immer noch innerhalb von 20 % des Kontrollwerts vor Blutungen zurückkehrt, wie zuvor beschrieben11,28 oder indem Sie den Schnittpunkt der Regressionslinien identifizieren, der während der Plateauphase der Autoregulation und unterhalb der LLA ermittelt wurde, wo LCBF mit jeder aufeinanderfolgenden Blutentnahme abnimmt (Schritt 5.3, unten).
HINWEIS: Die Kriterien für die Definition des LLA- und Autoregulierungsplateaus können zwischen Laboratorien (z. B. Takada et al.28 vs. Jones et al.29) sowie Verfahren zur Senkung des arteriellen Blutdrucks (z. B. Entnahme eines bestimmten Blutvolumens vs. kontrollierter Blutungen, um bestimmte arterielle Druckwerte zu erreichen)variieren 11. - Am Ende des Experiments, euthanisieren Sie das Tier durch die Schaffung eines bilateralen Pneumothorax unter einer chirurgischen Ebene der Anästhesie, wie von der IACUC genehmigt.
- LDF-Werte, die nach der Einschläferne des Tieres im Gewebe erhalten werden, liefern den Null-Basis-Fließwert für den Versuchsaufbau.
5. Statistische Analyse
- Führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch, um die Korrelation zwischen den LDF-Werten und dem entsprechenden arteriellen Druck zu bewerten. Verwenden Sie die Basis-LDF-Werte, die nach der Einschläferne des Tieres ermittelt wurden, um sicherzustellen, dass kein unspezifisches LDF-Signal vorhanden ist, das die gemessenen Durchflussraten beeinflusst.
- Berechnen Sie die LLA anhand des Schnittpunkts zwischen den Regressionslinien oberhalb und unterhalb des Autoregulierungsplateaus. Um die LLA mit dieser Methode zu berechnen, kombinieren Sie die beiden Regressionsgleichungen und lösen Sie die resultierende Gleichung für arteriellen Druck.
- Wenn Sie verschiedene experimentelle Gruppen vergleichen, verwenden Sie die lineare Regressionsanalyse, um die Neigungen des LDF vs. arteriellen Druckverhältnisses oberhalb und unterhalb der LLA für jedes Tier zu berechnen und sie als Mittelwert für die Tiere in dieser experimentellen Gruppe zusammenzufassen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbildung 2 fasst die Ergebnisse von Experimenten zusammen, die an 10 männlichen Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt wurden, die standardlaborierte Chow gefüttert wurden. In diesen Experimenten wurde der mittlere LCBF nach den ersten drei Blutvolumenentnahmen innerhalb von 20 % des Prämorhage-Wertes gehalten, bis der mittlere arterielle Druck die LLA erreichte. Nachfolgende Blutvolumenentnahmen bei Drücken unterhalb der LLA führten zu einer progressiven Reduktion von LCBF, was zeigte, dass die zerebrale Zirkulation nicht mehr in der Lage war, ein ausreichendes Gehalt an Vasodilatation zu erzeugen, um den zerebralen Blutfluss konstant bei den niedrigeren Perfusionsdrücken aufrechtzuerhalten.
Abbildung 3 fasst die Beziehung zwischen mittlerem arteriellen Druck und LCBF in der Plateauphase (MAP >65 mmHg) und der Dekompensatorischen Phase (MAP <65 mmHg) der CBF-Autoregulation zusammen. Bei Drücken an oder über der LLA gab es keine signifikante Korrelation zwischen LCBF und arteriellem Druck (r2 = 0,0246; p = 0,3534), was zeigt, dass der LCBF unabhängig vom arteriellen Druck im Plateaubereich der autoregulierenden Kurve war. Unterhalb der LLA hatte die LCBF/arterielle Druckbeziehung eine negative Neigung und LCBF war signifikant mit dem arteriellen Druck korreliert (r2 = 0,7907; p = 8,7 x 10-25).
Abbildung 1: Platzierung der Laser-Dopplersonde über den ausgedünnten Schädel einer anästhesierten Ratte. Ratte in stereotaxic Apparat mit einer LDF-Sonde über einem ausgedünnten Bereich des Schädels positioniert und an Ort und Stelle mit einem Mikromanipulator gehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Autoregulation des zerebralen Blutflusses als Reaktion auf Blutungs-induzierte Senkung des arteriellen Blutdrucks. Zusammengefasste Beziehung zwischen Blutvolumenentzug und (A) mittlerer arterieller Druck (MAP) und (B) Laser zerebralen Blutfluss (LCBF) bei Ratten gefüttert eine Standard-Diät und zog sequenzielle Blutvolumenentnahmen. Daten, die als Mittelwert für n = 6–10 nach jeder Blutvolumenentnahme angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beziehung zwischen dem mittleren arteriellen Druck und dem zerebralen Laserblutfluss. In der Plateauphase der autoregulierenden Reaktion (n = 37 Beobachtungen) und in der dekompensatorischen Phase der Reaktion (n = 70 Beobachtungen) werden Beziehungen gezeigt, in denen der arterielle Druck unter die LLA fiel (ca. 65 mmHg). LCBF war in der Dekompensatorische Phase der Autoregulation stark mit MAP korreliert (r2 = 0,7907; p = 8,7 x 10-25), aber nicht während der Plateauphase der Autoregulation (r2 = 0,0246; p = 0,3534). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Auswertung von Gewebe-Blutflussreaktionen mit Laser Doppler-Flowmetrie (LDF). Wie oben erwähnt, ist das LDF-Signal proportional zur Anzahl und Geschwindigkeit der sich bewegenden Teilchen, in diesem Fall RBC, in der Mikrozirkulation. LDF-Messungen in verschiedenen Organen korrelieren gut mit dem Vollorgan-Blutfluss, der mit etablierten Methoden wie elektromagnetischen Durchflussmessern und radioaktiven Mikrosphären30 bewertet wird, und stimmen im Allgemeinen mit Studien überein, die die Regulierung des aktiven Tons in kanülierten Arterienpräparaten10,31,32,33,34 und in situ Mikrozirkulationspräparate35,36.
Eine Überlegung bei der Durchführung von Studien zur zerebralen Autoregulation und möglicherweise Autoregulation in anderen Gefäßbetten ist die mögliche Wirkung der Anästhesie auf autoregulierende Reaktionen. Obwohl die zerebrale Autoregulation in der aktuellen Studie und in einer früheren Studie unserer Gruppe11 vorhanden war und mit den bekannten Auswirkungen einer HS-Diät auf die Vasodilatator-Antworten der Hirnwiderstandsarterien31,32,37übereinstimmte. , die Rattenpialarteriolen35 und die in situ Arteriolen des Hamsterbackenbeutels36, Isoflurananästhesie hat eine starke Vasodilatatorwirkung38 und verursacht herzkarle Unterdrückung 39. Isoflurane hat auch berichtet, einen Verlust der zerebralen vaskulären Autoregulation bei Mäusenverursachen 40,41, so dass einige Forscher Alpha-Chloralose-Anästhesie entweder allein41 oder in Kombination mit Urethan42 verwendet haben, um zerebrale Autoregulation stattdessen zu studieren.
Die Anzahl und Geschwindigkeit von RBC variiert innerhalb eines Mikrozirkulatorbettes, zwischen Individuen und innerhalb eines einzelnen Subjekts im Laufe der Zeit. Somit liefert LDF keinen absoluten Wert des Blutflusses innerhalb eines Organs oder seiner Mikrozirkulation, zwischen verschiedenen Organen oder in verschiedenen Regionen der Mikrozirkulation. Daher ist es wichtig, die LDF-Sonde fest zu sichern, damit sie in der gleichen Position bleibt und während des gesamten Experiments keiner Vibration ausgesetzt ist. Um Veränderungen im zerebralen Blutfluss genau zu beurteilen, wird der Kopf der Ratte in einem stereotaxic-Instrument positioniert und die LDF-Sonde wird in einem Mikromanipulator über einem ausgedünnten Bereich des Schädels gehalten, um Bewegungsartefakte zu verhindern und die Position der Sonde relativ zu dem untersuchten Bereich zu erhalten (Abbildung 1). Jede Bewegung der Sonde weg von ihrem ursprünglichen Standort erzeugt ein Signal, das durch den Blutfluss in einem anderen Bereich des Gewebes bestimmt wird, was Vergleiche behindert. Obwohl LDF keine Messung des absoluten Blutflusses liefert, ist es bei sachgemäßer Leistung immer noch ein bequemer und wertvoller Ansatz, um die Regulierung des Blutflusses auf der Ebene des gesamten Gefäßbettes30zu bewerten, und die Größe der relativen Erhöhungen oder Abnahmen des LDF-Flusses im Verhältnis zu einem Kontrollwert kann statistisch verglichen werden.
Autoregulation des zerebralen Blutflusses. Die zerebrale Zirkulation kann normalerweise große Veränderungen des arteriellen Blutdrucks tolerieren, die eine Vasokonstriktion verursachen, wenn der arterielle Druck erhöht wird, und die Vasodilatation, wenn der arterielle Druck durch autoregulierende Mechanismen reduziert wird. Diese Mechanismen sind von entscheidender Bedeutung, um gefährliche Erhöhungen des intrakraniellen Drucks bei steigendem systemischen Blutdruck zu verhindern und eine ausreichende Gewebedurchblutung und Sauerstoffversorgung aufrechtzuerhalten, wenn der arterielle Druck abnimmt. Die vorliegenden Experimente konzentrierten sich auf die Fähigkeit der autoregulatorischen Mechanismen, den zerebralen Blutfluss konstant zu halten, da der arterielle Druck reduziert wird (und nicht die Fähigkeit der zerebralen Zirkulation, einen konstanten Blutfluss aufrechtzuerhalten, da MAP erhöht ist), obwohl LDF sehr wertvoll ist und auch für letztere Studien ausgiebig verwendet wird. Eine weitere wertvolle Anwendung dieses experimentellen Designs ist die Untersuchung des mikrovaskulären Blutflusses während der Blutung und in verschiedenen Formen des Kreislaufschocks43,44,45,46.
Die Automatische Regulation von LCBF während der Blutungs-induzierten Reduktion des arteriellen Drucks wird durch einen Vergleich des LDF-Flusses und der 2 min gemessenen MAP-Messung von 2 min nach jeder Blutentnahme mit der unmittelbar vor der Blutvolumenentnahme gemessenen Präblutungskontrolle MAP und LCBF bewertet. An diesem Punkt werden die autoregulatorischen Mechanismen gehandelt haben, um die Mikrovaskulatur zu erweitern, um den Blutfluss bei einem niedrigeren Perfusionsdruck aufrechtzuerhalten. Die LLA wird als niedrigsteMAP identifiziert, in der Autoregulierungsmechanismen trotz der Verringerung des Durchblutungsdrucks den Blutfluss wiederherstellen können. Bei arteriellen Drücken unterhalb der LLA haben die Autoregulierungsmechanismen ihre Grenzen erreicht und können die zerebrale Vaskulatur nicht mehr ausreichend erweitern, um eine weitere Verringerung des zerebralen Blutflusses zu verhindern. Nach der Bestandenkeit der LLA gibt es eine signifikante und progressive Reduktion des LCBF vom Präblutungswert nach jedem Blutentzug, um den neuen Druck zu erreichen11. Die Wirksamkeit der zerebralen vaskulären Autoregulation als Reaktion auf die Senkung des arteriellen Blutdrucks wird bewertet, indem die Steigung des LCBF mit der arteriellen Druckbeziehung vor und nach der LLA und der Breite der Plateauphase der Autoregulation verglichen wird, definiert als der arterielle Druckbereich zwischen Präblutungs-MAP und LLA. Eine aktuelle Studie zur Bewertung der Wirkung einer HS-Diät auf die zerebrale Autoregulation11 ergab beispielsweise, dass der zerebrale Blutfluss bei Ratten, die mit einer salzarmen (LS; 0,4% NaCl)-Diät gefüttert wurden, bei anhaltender Verringerung des arteriellen Drucks auf Werte von bis zu 40–50 mmHg konstant gehalten wurde. Dieser Befund steht im Einklang mit früheren Schätzungen der LLA bei gesunden Ratten16,47. Jedoch, die Plateau-Phase der zerebralen Blutfluss Autoregulation in normotensive Sprague-Dawley Ratten gefüttert kurzfristig (3 Tage) und chronisch (4 Wochen) hohes Salz (HS; 4% NaCl) Diät nahm schrittweise mit sukzessiven Verringerungen des arteriellen Drucks, zeigt, dass HS-Diät beseitigt die Plateauphase der Blutflussregulation, die normalerweise in gesunden normotensiven Ratten vorhanden ist und beeinträchtigt die Fähigkeit der zerebralen Durchblutung, Gewebeperfusion im Angesicht der Verringerung des Blutdrucks11zu halten. Die Feststellung, dass die Autoregulation des zerebralen Blutflusses als Reaktion auf den reduzierten Blutdruck bei Ratten, die mit einer HS-Diät gefüttert werden, beeinträchtigt wird, stimmt mit den Ergebnissen von Studien überein, die zeigen, dass die Zunahme des Speisesalzes die Entspannung der Resistenzarterien31,32,33,34,37 und Arterioles35,36 von normotensiven Ratten und Hamstern beeinträchtigt.
Neben wertvollen Erkenntnissen über die Fähigkeit der Mikrozirkulation, ihren Blutfluss autoregulieren zu können, können LDF-Messungen in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, die eine dynamische Schätzung der Durchblutungskontrolle liefern, die mit herkömmlichen Methoden wie Mikrosphären und elektromagnetischen Durchflusssonden nicht verfügbar ist. Beispielsweise sind LDF-Messungen äußerst wertvoll bei der Bewertung der Reaktion der Mikrozirkulation auf vasoaktive Reize wie ACh-Infusion und Verabreichung anderer vasoaktiver Wirkstoffe31,32,33,34,37, erhöhte arterielle pCO210, Hypoxie17,48, neurovaskuläre Kopplung als Reaktion auf sensorische Reize21,49, funktionelle Hyperämie im Gehirn20, und Bewertung der Gewebereaktionen auf hämorrhagischen blutdrucksenkenden Stress und verschiedene Arten von Kreislaufschock43,44,45,46.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich aufrichtig bei Kaleigh Kozak, Megan Stumpf und Jack Bullis für ihre hervorragende Unterstützung bei der Fertigstellung dieser Studie und der Vorbereitung des Manuskripts. Grant-Unterstützung: NIH #R01-HL128242, #R21-OD018309 und #R21-OD024781.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 braided black silk suture | Midwest Vet | 193.73000.2 | |
| Arterial Pressure Transducer | Merit Medical | 041516504A | |
| Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ & BIOPAC system) | DATAQ Instruments | ||
| Blood Pressure Display Unit | Stoelting | 50115 | |
| Circulating warm water pump | Gaymar Industries | T-pump | |
| End-tidal CO2 monitor | Stoelting | Capstar-100 | |
| Heparin Sodium | Midwest Vet | 191.46720.3 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Laser Doppler Flow Meter | Perimed | PeriFlux 5000 LDPM | |
| Laser Doppler Refill Motility Standard | Perimed | PF1001 | |
| Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula) | VWR | 63018-828 | |
| Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters) | VWR | 63019-048 | |
| Rodent Ventilator | Cwe/Stoelting | SAR-830/P | |
| Saline | Midwest Vet | 193.74504.3 | |
| Sprague-Dawley Outbred Rats | Variable | N/A | Rats were ordered from various companies |
| Standard Rat Chow | Dyets, Inc. | 113755 | |
| Stereotaxic Instrument | Cwe/Stoelting | Clasic Lab Standard |
References
- Aso, Y., Inukai, T., Takemura, Y. Evaluation of microangiopathy of the skin in patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus by laser Doppler flowmetry; microvasodilatory responses to beraprost sodium. Diabetes Research and Clinical Practice. 36, 19-26 (1997).
- Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Jr The consequences of traumatic brain injury on cerebral blood flow and autoregulation: a review. Clinical and Experimental Hypertension. 21, 299-332 (1999).
- Grunwald, J. E., DuPont, J., Riva, C. E. Retinal haemodynamics in patients with early diabetes mellitus. British Journal of Ophthalmology. 80, 327-331 (1996).
- Mankovsky, B. N., Piolot, R., Mankovsky, O. L., Ziegler, D. Impairment of cerebral autoregulation in diabetic patients with cardiovascular autonomic neuropathy and orthostatic hypotension. Diabetic Medicine. 20, 119-126 (2003).
- Symon, L., Held, K., Dorsch, N. W. A study of regional autoregulation in the cerebral circulation to increased perfusion pressure in normocapnia and hypercapnia. Stroke. 4, 139-147 (1973).
- Taccone, F. S., et al. Cerebral autoregulation is influenced by carbon dioxide levels in patients with septic shock. Neurocritical Care. 12, 35-42 (2010).
- Barry, D. I., et al. Cerebral blood flow in rats with renal and spontaneous hypertension: resetting of the lower limit of autoregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 2, 347-353 (1982).
- Faraci, F. M., Baumbach, G. L., Heistad, D. D. Cerebral circulation: humoral regulation and effects of chronic hypertension. Journal of the American Society of Nephrology. 1, 53-57 (1990).
- Strandgaard, S. Autoregulation of cerebral blood flow in hypertensive patients. The modifying influence of prolonged antihypertensive treatment on the tolerance to acute, drug-induced hypotension. Circulation. 53, 720-727 (1976).
- McEwen, S. T., Schmidt, J. R., Somberg, L., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Time-course and mechanisms of restored vascular relaxation by reduced salt intake and angiotensin II infusion in rats fed a high-salt diet. Microcirculation. 16, 220-234 (2009).
- Allen, L. A., et al. High salt diet impairs cerebral blood flow regulation via salt-induced angiotensin II suppression. Microcirculation. , e12518 (2018).
- Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
- Greene, N. H., Lee, L. A. Modern and Evolving Understanding of Cerebral Perfusion and Autoregulation. Advances in Anesthesia. 30, 97-129 (2012).
- Merzeau, S., Preckel, M. P., Fromy, B., Leftheriotis, G., Saumet, J. L. Differences between cerebral and cerebellar autoregulation during progressive hypotension in rats. Neuroscience Letters. 280, 103-106 (2000).
- Zagorac, D., Yamaura, K., Zhang, C., Roman, R. J., Harder, D. R. The effect of superoxide anion on autoregulation of cerebral blood flow. Stroke. 36, 2589-2594 (2005).
- Hudetz, A. G., Lee, J. G., Smith, J. J., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Effects of volatile anesthetics on cerebrocortical laser Doppler flow: hyperemia, autoregulation, carbon dioxide response, flow oscillations, and role of nitric oxide. Advances in Pharmacology. 31, 577-593 (1994).
- Hudetz, A. G., Shen, H., Kampine, J. P. Nitric oxide from neuronal NOS plays critical role in cerebral capillary flow response to hypoxia. American Journal of Physiology. 274, H982-H989 (1998).
- Okamoto, H., Hudetz, A. G., Roman, R. J., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Neuronal NOS-derived NO plays permissive role in cerebral blood flow response to hypercapnia. American Journal of Physiology. 272, H559-H566 (1997).
- Okamoto, H., Roman, R. J., Kampine, J. P., Hudetz, A. G. Endotoxin augments cerebral hyperemic response to halothane by inducing nitric oxide synthase and cyclooxygenase. Anesthesia and Analgesia. 91, 896-903 (2000).
- Schulte, M. L., Hudetz, A. G. Functional hyperemic response in the rat visual cortex under halothane anesthesia. Neuroscience Letters. 394, 63-68 (2006).
- Schulte, M. L., Li, S. J., Hyde, J. S., Hudetz, A. G. Digit tapping model of functional activation in the rat somatosensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 157, 48-53 (2006).
- Alkayed, N. J., et al. Inhibition of brain P-450 arachidonic acid epoxygenase decreases baseline cerebral blood flow. American Journal of Physiology. 271, H1541-H1546 (1996).
- Alonso-Galicia, M., Hudetz, A. G., Shen, H., Harder, D. R., Roman, R. J. Contribution of 20-HETE to vasodilator actions of nitric oxide in the cerebral microcirculation. Stroke. 30, 2727-2734 (1999).
- Kurosawa, M., Messlinger, K., Pawlak, M., Schmidt, R. F. Increase of meningeal blood flow after electrical stimulation of rat dura mater encephali: mediation by calcitonin gene-related peptide. British Journal of Pharmacology. 114, 1397-1402 (1995).
- Mayhan, W. G., Faraci, F. M., Heistad, D. D. Impairment of endothelium-dependent responses of cerebral arterioles in chronic hypertension. American Journal of Physiology. 253, H1435-H1440 (1987).
- Ghali, M. G. Z. Microsurgical technique for tracheostomy in the rat. MethodsX. 5, 61-67 (2018).
- Ghali, M. G. Z. Microsurgical technique for femoral vascular access in the rat. MethodsX. 4, 498-507 (2017).
- Takada, J., et al. Valsartan improves the lower limit of cerebral autoregulation in rats. Hypertension Research. 29, 621-626 (2006).
- Jones, S. C., Radinsky, C. R., Furlan, A. J., Chyatte, D., Perez-Trepichio, A. D. Cortical NOS inhibition raises the lower limit of cerebral blood flow-arterial pressure autoregulation. American Journal of Physiology. 276, H1253-H1262 (1999).
- Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. Journal of Applied Physiology (1985). 61, 666-672 (1986).
- Durand, M. J., Raffai, G., Weinberg, B. D., Lombard, J. H. Angiotensin-(1-7) and low-dose angiotensin II infusion reverse salt-induced endothelial dysfunction via different mechanisms in rat middle cerebral arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299, H1024-H1033 (2010).
- Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284, H1124-H1133 (2003).
- Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 278, H500-H506 (2000).
- Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 280, H2196-H2202 (2001).
- Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Loss of endothelium and receptor-mediated dilation in pial arterioles of rats fed a short-term high salt diet. Hypertension. 33, 686-688 (1999).
- Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvascular Research. 89, 134-145 (2013).
- McEwen, S. T., Balus, S. F., Durand, M. J., Lombard, J. H. Angiotensin II maintains cerebral vascular relaxation via EGF receptor transactivation and ERK1/2. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297, H1296-H1303 (2009).
- Jensen, N. F., Todd, M. M., Kramer, D. J., Leonard, P. A., Warner, D. S. A comparison of the vasodilating effects of halothane and isoflurane on the isolated rabbit basilar artery with and without intact endothelium. Anesthesiology. 76, 624-634 (1992).
- Avram, M. J., et al. Isoflurane alters the recirculatory pharmacokinetics of physiologic markers. Anesthesiology. 92, 1757-1768 (2000).
- Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Experimental Brain Research. 207, 249-258 (2010).
- Ayata, C., et al. Pronounced hypoperfusion during spreading depression in mouse cortex. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 1172-1182 (2004).
- Niwa, K., et al. Cerebrovascular autoregulation is profoundly impaired in mice overexpressing amyloid precursor protein. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283, H315-H323 (2002).
- Carreira, S., et al. Diaphragmatic Function Is Preserved during Severe Hemorrhagic Shock in the Rat. Anesthesiology. 120, 425-435 (2014).
- Kerby, J. D., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock with HBOC-201 in the setting of traumatic brain injury. Shock. 27, 652-656 (2007).
- Krejci, V., et al. Continuous measurements of microcirculatory blood flow in gastrointestinal organs during acute haemorrhage. British Journal of Anaesthesia. 84, 468-475 (2000).
- Rosengarte, B., Hecht, M., Wolff, S., Kaps, M. Autoregulative function in the brain in an endotoxic rat shock model. Inflammation Research. 57, 542-546 (2008).
- Rozet, I., et al. Cerebral autoregulation and CO2 reactivity in anterior and posterior cerebral circulation during sevoflurane anesthesia. Anesthesia and Analgesia. 102, 560-564 (2006).
- Hudetz, A. G., Biswal, B. B., Feher, G., Kampine, J. P. Effects of hypoxia and hypercapnia on capillary flow velocity in the rat cerebral cortex. Microvascular Research. 54, 35-42 (1997).
- Shi, Y., et al. Interaction of mechanisms involving epoxyeicosatrienoic acids, adenosine receptors, and metabotropic glutamate receptors in neurovascular coupling in rat whisker barrel cortex. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28, 111-125 (2008).
