Summary
المقدمة هنا هو بروتوكول للكشف عن الإنتاج الضام (MET) فخ خارج الخلية في ثقافة الخلايا الحية باستخدام المجهر وتلطيخ فلوري. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لدراسة محدده علامات البروتين التقي بتلطيخ المناعي.
Abstract
تم تحديد الإفراج عن الفخاخ خارج الخلية (ETs) من العدلات باعتبارها عاملا مساهما في تطوير الامراض المتعلقة بالتهاب مزمن. العدلات ETs (الناموسيات) تتكون من شبكه من الحمض النووي ، والبروتينات هيستون ، والبروتينات الحبيبية المختلفة (اي ، الميلوكسيداز ، اللدائن ، و كاتيبسين G). الخلايا المناعية الأخرى ، بما في ذلك الضامة ، ويمكن أيضا ان تنتج ETs ؛ ومع ذلك ، إلى اي مدي يحدث هذا في الجسم الآخر وما إذا كانت الفخاخ خارج الخلية الضامة (ميتس) تلعب دورا في أليات المرضية لم يتم فحصها بالتفصيل. لفهم أفضل دور ميتس في الامراض التهابيه ، تم تطوير بروتوكول لتصور الإفراج عن التقي من الضامة البشرية الاوليه في المختبر ، والتي يمكن أيضا ان تستغل في التجارب المناعية. وهذا يسمح بمزيد من توصيف هذه الهياكل ومقارنتها مع ETs الصادرة من العدلات. الضامة البشرية المشتقة من الخلايا (HMDM) تنتج ميتس عند التعرض لمحفزات التهابيه مختلفه بعد التمايز إلى النمط الظاهري M1 الموالية للالتهابات. ويمكن تصور الإفراج عن ميتس عن طريق المجهر باستخدام الأخضر الفلورسنت وصمه عار الحمض النووي التي يتم تعريضها للخطر الخلايا الحية (علي سبيل المثال ، SYTOX الخضراء). استخدام الضامة الابتدائية المعزولة الطازجة ، مثل HMDM ، هو مفيد في النمذجة في الظواهر التهابيه الجسم التي هي ذات الصلة للتطبيقات السريرية المحتملة. ويمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لدراسة الإفراج عن الخلايا البشرية الاحاديه الخلية (علي سبيل المثال ، thp-1) بعد التمايز في الضامة مع خلات ميريستات phorbol أو غيرها من خطوط الخلايا الضامة (علي سبيل المثال ، الضامة murine-مثل الخلايا J774A).
Introduction
تم تحديد الإفراج عن ETs من العدلات لأول مره كاستجابة مناعية فطريه الناجمة عن العدوى البكتيرية1. وهي تتكون من العمود الفقري الحمض النووي التي ترتبط البروتينات الحبيبية المختلفة مع خصائص مضاده للبكتيريا ، بما في ذلك اللدائن العدلات و myeloperoxidase2. الدور الرئيسي لل العدلات (الناموسيات) هو للقبض علي مسببات الامراض وتسهيل القضاء عليها3. ومع ذلك ، بالاضافه إلى دور وقائي من ETs في الدفاع المناعي ، وقد اكتشف عدد متزايد من الدراسات أيضا دورا في الامراض المرضية ، وخاصه خلال تطوير امراض يحركها التهاب (اي التهاب المفاصل الروماتويدي تصلب الشرايين4). ويمكن تشغيل الإفراج عن ETs من قبل مختلف السايتوكينات الموالية للالتهابات بما في ذلك انترلوكين 8 (آيل-8) وعامل نخر الورم الفا (tnfα)5،6، وتراكم المترجمة من ets يمكن ان تزيد من تلف الانسجه واستحضار استجابه الموالية للالتهابات7. علي سبيل المثال, وقد تورطت ETs كما لعب دورا سببيه في تطوير تصلب الشرايين8, تعزيز تخثر9, وتوقع مخاطر القلب والاوعيه الدموية10.
ومن المسلم به الآن انه بالاضافه إلى العدلات, الخلايا المناعية الأخرى (اي, الخلايا البدينة, الحمضات, والضامة) يمكن أيضا الإفراج عن ETs علي التعرض للتحفيز الميكروبية أو الموالية للالتهابات11,12. قد يكون هذا مهما بشكل خاص في حاله الضامة ، بالنظر إلى دورها الرئيسي في تطوير وتنظيم وحل الامراض التهابيه المزمنة. ولذلك ، من المهم الحصول علي فهم أكبر للعلاقة المحتملة بين الإفراج عن ET من الضامة والامراض المرتبطة بالتهاب التنمية. وقد أظهرت الدراسات الاخيره وجود ميتس والشباك في لويحات تصلب الشرايين البشرية سليمه ونظمت الجلطات13. المثل, وقد تورط ميتس في القيادة أصابه الكلي من خلال تنظيم الاستجابات التهابيه14. ومع ذلك ، وعلي النقيض من العدلات ، وهناك بيانات محدوده عن أليات تشكيل اجتمع من الضامة. الدراسات الاخيره باستخدام نماذج الإنسان في المختبر من تشكيل اجتمع تظهر بعض الاختلافات في مسارات المشاركة في كل نوع الخلية (اي ، فيما يتعلق بعدم وجود هيستون سيترولينيشن مع الضامة)6. ومع ذلك ، فقد أظهرت بعض ان الإفراج عن NET يمكن ان يحدث أيضا في غياب هيستون سيترولينيشن15.
الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير طريقه بسيطه ومباشره لتقييم الإفراج عن الوفاء في نموذج الضامة ذات الصلة سريريا. وهناك عدد من مختلف في المختبر نماذج الخلايا الضامة التي تم استخدامها لدراسة ميتس (اي THP-1 خط خليه الخلايا الاحاديه الإنسان ومختلف خطوط الخلايا الضامة murine)16. هناك بعض القيود المرتبطة بهذه النماذج. علي سبيل المثال ، التمايز من الخلايا الاحاديه thp-1 إلى الضامة عاده ما يتطلب خطوه فتيله ، مثل أضافه خلات phorbol ميريستات (نقدا) ، الذي ينشط نفسه البروتين كيناز C (pkc)-المسارات التابعة. ومن المعروف هذه العملية لتشغيل ET الإصدار4 والنتائج في القاعدية منخفضه التقي الإفراج من خلايا thp-1. وقد أبرزت دراسات أخرى بعض الاختلافات في النشاط البيولوجي والاستجابات التهابيه التي شنتها الضامة في الجسم الحيوي مقارنه مع الخلايا المعالجة بالنقد العامل THP-117.
المثل ، فان السلوك والاستجابات التهابيه من مختلف خطوط الخلايا الضامة murine لا تمثل تماما طيف الاستجابة من الضامة البشرية الاوليه18. ولذلك ، لغرض التحقيق في تكوين الضامة ET في البيئة السريرية ، ويعتقد ان الضامة البشرية الاوليه المشتقة (HMDMs) نموذج أكثر ملاءمة بدلا من الخلايا الاحاديه أو murine الضامة مثل خطوط الخلية.
وقد ثبت ET الإفراج عن HMDMs M1 الاستقطاب التالية التعرض لهذه الخلايا لعدد من المحفزات التهابيه المختلفة ، بما في ذلك الأحماض المؤكسدة المشتقة الميلوكسيداز (الحسين) ، ونقدا ، TNFα ، و IL-86. وصف هنا هو بروتوكول لاستقطاب HMDMs إلى النمط الظاهري M1 وتصور الإفراج عن اللاحقة التقي عند التعرض لهذه المحفزات التهابيه. وتستخدم هذه النقد كحافز للإفراج عن الاجتماعات لتسهيل مقارنات الدراسات السابقة التي استخدمت العدلات. الأهم من ذلك ، يتم استخدام الهوكي ، آيل-8 ، و TNFα أيضا لتحفيز الإفراج عن الوفاء ، والتي يعتقد انها أفضل نماذج من البيئة التهابيه في الجسم الفيفو. الطريقة المجهرية لتصور الإفراج عن ET ينطوي تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية في ثقافات الخلايا الحية باستخدام الأخضر SYTOX ، وهو الفلورية الخضراء الفلورسنت وصمه عار التي تم تطبيقها بنجاح في الدراسات العدلات السابقة. وتسمح هذه الطريقة بالتقييم السريع والنوعي للإصدار ET ، ولكنها ليست مناسبه كطريقه قائمه بذاتها للقياس الكمي لمدي الإفراج عن ET. وينبغي استخدام المنهجية البديلة إذا اقتضى الأمر القياس الكمي لمقارنه مدي الإفراج عن البيانات التعريفية الناتجة عن ظروف أو تدخلات علاجيه مختلفه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم عزل HMDM من المستحضرات البشرية معطف بافي المقدمة من بنك الدم مع موافقه الأخلاق من منطقه سيدني الصحية المحلية.
1. الثقافة HMDM
- عزل الخلايا الاحاديه من الاستعدادات معطف بافي أعدت من الدم المحيطي من المتبرعين البشرية الصحية باستخدام استعداد تجاريا المتاحة لعزل الخلايا الليمفاوية ، تليها التيار الطرد المركزي المضادة لل19، 20-الآن
- تاكيد وجود الخلايا الاحاديه عن طريق الخلايا الخلوية وتلطيخ مع تعديل Giemsa وصمه عار لتوصيف الخلايا الاحاديه19.
- تحت ظروف معقمه ، وضبط كثافة الخلايا الاحاديه إلى 1 × 106 خليه/مل باستخدام rpmi-1640 وسائل الاعلام دون المصل. أضافه 1 مل من هذا التعليق الخلية إلى كل بئر من 12 لوحه ثقافة الانسجه جيدا. الثقافة في حاضنه الخلية في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 لمده 2 ساعة لتعزيز التزام بلوحه ثقافة الانسجه.
- في ظروف معقمه ، قم بازاله الوسائط الخلوية واستبدلها بوسائل الاعلام الثقافية الكاملة RPMI-1640 التي تحتوي علي 10% (v/v) المصل البشري المجمع و 20 ملم L-الجلوتامين.
- ثقافة الخلايا في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية لمده 8 أيام ، وتغيير وسائل الاعلام كل يوم 2.
2. استقطاب HMDM
- في ظل ظروف معقمه ، واعداد وسائل الاعلام فتيله M1 عن طريق أضافه γ مضاد للفيروسات (ifnγ ؛ 20 نانوغرام/مل) و عديد السكاريد (lps ؛ 1 ميكروغرام/مل) إلى الاعلام الثقافة rpmi-1640 كامله. اعداد وسائل الاعلام فتيله M2 عن طريق أضافه انترلوكين 4 (IL-4 ؛ 20 نانوغرام/مل) إلى وسائل الاعلام الثقافة rpmi-1640 كامله.
- في ظروف معقمه ، يستنشق وسائل الاعلام من الآبار لوحه ثقافة الانسجه التي تحتوي علي HMDM ، التي تم المصنفة ومثقف كما هو موضح في القسم 1.
- غسل بعناية الآبار التي تحتوي علي الخلايا 3x مع العقيمة التلفزيونية (ما قبل الإحماء إلى 37 درجه مئوية) ، وذلك باستخدام 1 مل قسامات من تلفزيوني.
- أضف 1 مل من الوسائط الفتيلة M1 أو M2 إلى كل المحتويات الجيدة التي تحتوي علي HMDM (أيهما مناسب للتجربة).
- احتضان الخلايا ل 48 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية.
3. تحفيز HMDM للحث علي الإفراج عن الوفاء
- في ظروف معقمه ، واعداد وسائل الاعلام الثقافة التي تحتوي علي محفزات مختلفه من الإفراج التقي (أيهما المناسب للتجربة) لكامل RPMI-1640 وسائل الاعلام: نقدا (25 نانومتر) ، الإنسان المؤتلف TNFα (25 نانوغرام/مل) ، أو الإنسان المؤتلف IL-8 (50 ng/mL ).
- بالنسبة للتجارب التي أجريت مع تحفيز الهوكي ، أعد الهوكي (200 μM) في HBSS (قبل التسخين إلى 37 درجه مئوية) ، قبل الاضافه إلى الخلايا مباشره. تاكد من عدم اعداد الوحدة في الوسائط الكاملة للخلايا.
ملاحظه: يتم تحديد تركيز الحل المخزون من الهراء عن طريق قياس امتصاص الاشعه فوق البنفسجية من المحلول عند 292 nm ودرجه الحموضة = 116 واستخدام معامل الانقراض من 350 M-1سم-121. - بعد الاستقطاب العلاج الموصوفة في القسم 2 ، يستنشق وسائل الاعلام الخلية من كل بئر ويغسل بعناية الخلايا 3x مع 1 مل قسامات اما: العقيمة تلفزيوني (لنقدا ، tnfα و IL-8) أو hbss (ل الحسين) ، التي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجه مئوية.
- لاجراء تجارب مع النقد الخاص ، TNFα ، أو آيل-8: أضافه 1 مل من وسائل الاعلام الكاملة التي تحتوي علي النقد الخاص ، TNFα ، أو آيل-8 بعد أزاله التلفزيونية في خطوه الغسيل النهائي.
- للتجارب مع TNFα ، احتضان الخلايا ل 6 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية. لاجراء تجارب مع قوه النقد الخاصة و IL-8 ، احتضان الخلايا ل 24 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية.
-
لاجراء تجارب مع السيد الحسين ، أضف 1 مل من الهوكي في HBSS بعد أزاله HBSS في خطوه الغسيل النهائية. ثم ، احتضان الخلايا لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية.
- يستنشق بعناية الخلية ماده طافي ويغسل الخلايا 3x مع 1 مل قسامات من hbss كما هو موضح في الخطوة 3.3.
- بعد أزاله HBSS من خطوه الغسيل النهائية ، أضف 1 مل من الوسائط الثقافية RPMI-1640 الكاملة. ثم ، احتضان الخلايا ل 24 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية.
4. التصور من اجتمع في ثقافة خليه حيه
- اعداد الصبغة الخضراء SYTOX في HBSS بتركيز 40 μM.
- في نهاية العلاجات الموصوفة في القسم 3 للحث علي الإفراج عن MET ، أضافه مباشره 25 μL من 40 μM من الصبغة لكل المحتوية جيدا HMDM.
- احتضان الخلايا في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 5 دقائق في الظلام.
- وضع HMDM في الآبار ثقافة الانسجه علي مرحله المجهر من المجهر الفلورسنت المقلوب للتصوير.
-
إجراءات المجهر
- قم بتشغيل مصدر الضوء الفلوري واسع الطيف ، ومصدر الضوء الساطع ، والمجهر المقلوب المثبت بكاميرا رقميه ملونه عاليه الدقة (انظر جدول المواد).
- تدوير عجله فلتر إلى موقف "عدد 2" للفلوري الأخضر (الاثاره = 504 نانومتر ، الانبعاثات = 523 nm) للتصوير من العينات الملونة الخضراء الواردة داخل الآبار ثقافة الانسجه.
- باستخدام الهدف 5x ، والتركيز علي الصورة مع التركيز الخشن ، ثم المقابض التركيز الدقيق علي المجهر ، حتى تظهر الصورة حاده ، واضحة ، وتركز عندما ينظر اليها من خلال العدسة المجهر.
- التبديل المجهر إلى وضع الكاميرا.
- بدء تشغيل البرامج المقترنة.
- حدد علامة التبويب التقاط علي البرنامج.
- انقر علي زر التشغيل لمعاينه الصورة وضبط مقبض التركيز الدقيق علي المجهر حتى تظهر الصورة حاده وواضحة ومركزه في نافذه معاينه البرنامج.
- انقر فوق الزر التقاط .
ملاحظه: سيتم عرض الصورة الملتقطة تلقائيا في البرامج المصاحبة. - ضمن البرنامج ، انقر فوق ملف | حفظ كنوع ملف الصورة المطلوبة.
- علي المجهر ، تدوير عجله التصفية إلى موقف "عدد 5" للتصوير برايت وكرر الخطوات 4.5.2-4.5.9 للحصول علي صوره المقابلة برايت.
- كرر الخطوات 4.5.2 – 4.5.10 حسب الضرورة للحصول علي الصورة اللاحقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر صور برارفيلد التي تظهر التغيرات المورفولوجية لل HMDM استجابه لمحفزات لتمايز الخلايا في الشكل 1. وأظهرت الضامة M1 الاستقطاب من التجارب مع HMDM يتعرض لifnγ و LPS شكل خليه ممدود والمغزل ، كما هو مبين من الأسهم السوداء في الشكل 1 (اللوحة الوسطي). النسبة للمقارنة ، فان شكل الضامة M2 الاستقطاب بعد التعرض لل HMDM إلى IL-4 ل 48 h كانت عاده مستديرة ومسطحه ، كما هو مبين من الأسهم السوداء في الشكل 1 (لوحه اليمين المتطرف).
تم تصور قدره الأنماط الظاهرية HMDM المتمايزة للإفراج عن ميتس من خلال التصوير الحي للخلايا الخلوية مع SYTOX الأخضر ، كما هو مبين في الشكل 2. يظهر الشكل 2A بيانات التحكم التي تم الحصول عليها من كل نمط ظاهري لكل hmdm تم احتضانه لمده 24 ساعة في غياب اي محفزات مواليه للالتهابات. في هذه الحالة ، كان هناك تلطيخ الخضراء محدوده جدا ، كما كان متوقعا ، نظرا للخلية التي تهدد طبيعة هذا وصمه عار. وأظهرت الشكل 2B تلطيخ ايجابيه لل ميتس ، الناتجة عن التعرض لل M1 HMDMs إلى الحسين ، ونقدا ، آيل-8 ، أو TNFα. ويشار إلى ميتس من قبل السهام البيضاء ، كما هو مبين الشرائط الخضراء ، والناجمة عن خيوط الحمض النووي خارج الخلية. مع الحسين ، بالاضافه إلى تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية ، كان هناك بعض تلطيخ الخضراء واضحة في الخلايا. ولوحظ أيضا هذا تلطيخ الخلوية إلى حد ما مع المحفزات الأخرى ، ويعتقد ان تعكس فقدان سلامه الغشاء الناجمة عن موت الخلايا المستقلة ET نتيجة لظروف العلاج.
ويبين الشكل 2 باء أيضا التجارب المناظرة التي أجريت مع HMDMs M2 ، التي تعرضت ل IL-4. في هذه الحالة ، لم يكن هناك إطلاق الحمض النووي من الخلايا ، كما هو مبين من قبل عدم وجود خيوط/الشرائط من الحمض النووي خارج الخلية. علي الرغم من ذلك ، كان هناك بعض امتصاص الخلوية من صبغه الفلورسنت الخضراء مع الهوكي و TNFα. ولأغراض المقارنة ، يبين الشكل 3 البيانات التمثيلية التي تشير إلى الإفراج عن العقد من الضامة thp-1 المعرضة ل TNFα (50 Ng/mL) لمده 4 ساعات. في هذه الحالة ، تجدر الاشاره إلى انه تم استخدام السكان غير المستقطبة من الخلايا ، وتم التفريق بين البويضات THP-1 إلى الضامة عن طريق المعالجة المسبقة مع نقدا (50 ng/mL ل 72 h) كما هو موضح سابقا22.
الشكل 1: التغيرات المورفولوجية لل HMDMs المستقطبة بصوره مختلفه. الصور التمثيلية برايت من HMDMs غير متمايزة ومتمايزة (ن ≥ 5). تم استزراع HMDMs مع وسائل الاعلام الكاملة التي تحتوي علي المصل البشري و الجلوتامين لمده 8 أيام قبل فتيله إلى M1 أو M2 النمط الظاهري عند التعرض ل IFNγ و LPS أو IL-4 ، علي التوالي ، ل 48 h. شريط مقياس = 200 μm. الأسهم تشير إلى أمثله من الخلايا التي تظهر الخصائص المورفولوجية من M1 أو M2 HMDMs. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ميتس التي تنتجها M1 HMDMs بعد الشعوذة ، ونقدا ، آيل-8 ، وتحفيز TNFα. الصور التمثيلية لل SYTOX الأخضر الملون HMDMs من (ا) غير محفزه M1 و M2 hmdms حضن لمده 24 ساعة في غياب اي محفزات التهابيه كانت تستخدم كعنصر تحكم ، مما يدل علي عدم وجود الإفراج عن الوفاء. (B) تم التعامل مع HMDMs M1 و M2 مع 1) الهراء (200 μM ، 15 دقيقه) ، ونقدا (25 نانومتر) ، أو آيل-8 (50 Ng/ml) مع حضانة لمده 24 ساعة أو 2) TNFα (25 نانوغرام/مل) مع الحضانة ل 6 ح للحث علي الإفراج عن الوفاء. وقد تم تصور ميتس من خلال أضافه الأخضر SYTOX ، كما هو مبين من قبل السهام البيضاء في اللوحة العليا من M1 HMDMs. لم يشاهد اي ميتس في التجارب المناظرة مع HMDMs M2. وتمثل البيانات تكرار الآبار الثقافية من n ≥ 3 المتبرعين الفردية. شريط مقياس = 500 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ميتس التي تنتجها غير المستقطبة THP-1 الضامة بعد التحفيز TNFα. الصور التمثيلية لل SYTOX الأخضر الملون TNP-1 الضامة ، والتي كانت متمايزة قبل العلاج مع النقد الخاص (50 ng/mL ل 72 h) قبل مزيد من الحضانة لمده 4 ساعات في غياب أو وجود TNFα (50 ng/mL) للحث علي الإفراج التقي. تم تصور ميتس بالاضافه إلى الأخضر SYTOX. البيانات هي ممثله لتكرار الآبار الثقافة من n ≥ 3 التجارب. شريط مقياس = 100 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجيل والتصور من تشكيل اجتمع باستخدام M1 المتمايزة HMDMs يمثل نموذج جديد في المختبر التي قد تكون مفيده للتحقيق في الدور المرضي المحتملة لهذه الهياكل الضامة ، وخاصه تحت التهابات مزمنة الظروف. ويوفر بروتوكولا قويا لتحفيز الضامة البشرية الاوليه للإفراج عن ميتس ، والتي يمكن أيضا ان تستخدم في الدراسات ذات الصلة مع البويضات البشرية أو خطوط الخلايا الضامة murine. ان التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول لتحفيز تكوين الاجتماعات من قبل HMDM يعتمد علي ثقافة الخلايا الدقيقة والتعامل معها للحفاظ علي سلامه الخلايا الجيدة. وهذا سيزيد من مدي ونوعيه ميتس لاحظت. لتوفير تغذيه أفضل للخلايا ، يجب ان تحتوي وسائط RPMI المستخدمة للمحافظة علي مصل الدم البشري ، بدلا من مصل الأبقار الجنيني ، وكذلك ال-الجلوتامين. وينبغي استخدام كل حل الأسهم من هذه الوسائط RPMI كامله في غضون 1 أسبوع. التخزين الصحيح للوسائط مهم أيضا. يجب تخزين وسائل الاعلام في 4 درجه مئوية في غياب الضوء.
الاضافه إلى ذلك ، من المهم ان نلاحظ بانتظام ورصد شكل والمورفولوجية من الخلايا عن طريق المجهر اثناء الخياطة من HMDM. اي تغييرات غير طبيعيه أو غير متوقعه في شكل الخلية التي لوحظت قبل أضافه IFNγ و LPS أو IL-4 (لاستقطاب الضامة) قد تشير إلى انخفاض في معدل بقاء الخلية. وينبغي ان تكون المنتسبين HMDM ولا تتكاثر. من المهم ، لذلك ، لرصد الخلايا لأي تغييرات في المورفولوجية ، وكثافة الخلايا ، أو فقدان التزام خلال فتره الثقافة 8 أيام العادية. ويشير الانخفاض الكبير في كثافة الخلايا خلال اليومين الأولين بعد العزلة إلى ان القدرة الناتجة عن ذلك قد لا تكون قابله للاستمرار بما فيه الكفاية للتجارب اللاحقة. ومن القيود المفروضة علي استخدام الخلايا البشرية الاوليه الاختلاف بين المانحين ، الأمر الذي يمكن ان يؤثر بشكل ملحوظ علي مدي الإفراج عن البيانات. الاضافه إلى ذلك ، فان نوعيه الاستعدادات معطف بافي وردت لعزل الخلايا الاحاديه يمكن ان تختلف. ومن المهم تكرار التجارب مع ثلاثه علي الأقل من الجهات المانحة المنفردة لضمان ان تكون البيانات ممثله لعدد أكبر من سكان الزنزانات.
من المهم ان نلاحظ ان البروتوكول الموصوف لتمايز HMDM قد تم تحسينه للخلايا المعزولة عن الاستعدادات البشرية لمعطف بافي من خلال الشطف الحالي ، مما يؤدي إلى اعداد البويضات الاحاديه عاليه النقاء. التحقق من صحة الاستقطاب العلاجات (لتاكيد النمط الظاهري) عن طريق تدفق الخلوي وتقييم التعبير عن علامة M1 CD86 وعلامة M2 CD206 تم تنفيذها سابقا باستخدام هذا الاعداد من HMDM6. ومن الجدير بالتقدير ان طريقه العزل هذه قد لا تكون متاحه علي نطاق واسع ، وان أساليب العزل البديلة (اي فرز الخرزة المغنطيسية) قد تكون أفضل. إذا تم استخدام مصدر بديل للخلايا الاحاديه أو بروتوكولات عزل مختلفه ، فانه ينصح باجراء تجارب اضافيه لقياس التدفق الخلوي للتحقق من صحة تغيير النمط الظاهري ، وقد تكون هناك حاجه إلى بعض التحسين الأمثل لظروف العلاج لتحفيز الإصدار MET.
للصور مضان الأمثل ، ينبغي تعديل وقت التعرض بعناية والاحتفاظ بها قصيرة قدر الإمكان لتجنب الخلفية فلوري وتلطيخ التحف من لوحات الثقافة البلاستيكية ، التي لديها الطلاء ملتصقة. من المهم ان تاخذ صور متعددة من كل الخلايا التي تحتوي علي جيدا. فمن المفيد إذا كانت العينات اعمي قبل تحليل المجهر مضان. بالاضافه إلى تلطيخ خيوط خارج الخلية من الحمض النووي ، وهناك أيضا أدله علي امتصاص الخلوية من SYTOX الخضراء. ويعتقد ان هذا يعكس خسارة في سلامه الغشاء ، والتي قد تكون بسبب الإفراج عنه ، ويمكن ان تكشف أيضا عن مسارات بديله لموت الخلايا (انظر أيضا أدناه). وهذا يسلط الضوء علي اهميه اجراء تجارب اضافيه لتحديد كميه البيانات الصادرة وزيادة توصيفها.
ويلزم اجراء المزيد من التحليل لاجراء مقارنه كميه لمدي الإفراج عن الأشخاص المشمولين بالعقد في ظروف معالجه مختلفه أو عقب تدخلات مختلفه لتعديل الإفراج عن الاجتماع. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق اجراء تحليل qPCR من الحمض النووي والدنا الميتوكوندريا الموجودة في الخلايا الفائقة ، كما هو موضح سابقا6. وعاده ما يتم الجمع بين هذه الطريقة مع اللاكتات نازعات الإفراج عن الاختبارات للسيطرة علي الخلية تحلل لا علاقة لها الإفراج عن6. ويمكن أيضا ان يتم تحديد كميه التلطيخ الأخضر SYTOX من قبل قارئ لوحه مضان بعد العلاج DNase لهضم جزئيا ميتس والإفراج عنهم من لوحات الثقافة. وقد استخدمت هذه المنهجية علي نطاق واسع في الاعمال السابقة مع الشباك العدلات1,2,23.
التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول تتعلق بتوفير فرص لمزيد من توصيف ميتس باستخدام مناعي. سيكون من الممكن التحقيق في تكوين البروتين من ميتس باستخدام هذا النهج مع الأجسام المضادة المستهدفة (اي ضد citrullinated histones أو MPO) للحصول علي مزيد من التبصر في ادوار هذه الهياكل في العينات البيولوجية أكثر تعقيدا. ستكون هذه التجارب أيضا مهمة لتسليط مزيد من الضوء علي ترسيم الإفراج عن الميت بعد اشكال أخرى من موت الخلايا ، مثل الحمم البركانية15. ومن الجدير بالذكر انه في تجربتنا ، ميتس من الضامة لا تلتزم لوحات بقوة مثل الشباك من العدلات ، والتي يمكن ان تجعل تحليل مناعي أكثر تحديا. ومع ذلك ، فان البيانات من هذه التجارب ستكون ذات فائده ، نظرا لحقيقة ان الضامة غالبا ما تلعب دورا مهيمنا في الامراض التهابيه المزمنة. ويعتبر المزيد من توصيف هذه الهياكل أمرا بالغ الاهميه لتقييم أدوارها في الجسم الحيوي ، الذي لم يؤد حتى الآن الا إلى حد محدود16. ويعتقد ان الطريقة الموصوفة باستخدام HMDM لتحقيق هذا الغرض قد تكون أكثر اهميه سريريا بالمقارنة مع غيرها من المصادر التي تستمد منها خط الخلايا الضامة. علي الرغم من ان هذه الخطوط الخلوية قد يكون لها فائده في توفير نموذج أكثر استقرارا لتوصيف الوفاء مع احتمالات اقل لاختلاف المانحين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه الأثر الدائم (IPAP201601422) ومنحه المشروع الطبي الحيوي لمؤسسه نوفو نورديسك (NNF17OC0028990). كما يعترف باستلام الجائزة الاستراليه للدراسات العليا من جامعه سيدني. ونود ان نشكر السيد بات بيسساراكسيت والسيدة مورغان جونز علي المساعدة في العزلة الاحاديه وثقافة الانسجه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
