Summary
הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לזהות מלכודת מקרופאג מסחטות (MET) ייצור בתרבות התא החי באמצעות מיקרוסקופ וכתמים פלואורסצנטית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עוד יותר כדי לבחון סמנים מסוימים של החלבון נפגשו על-ידי כתמים immunofluorescence.
Abstract
שחרורו של מלכודות מסחטות (ETs) על ידי נויטרופילים זוהה כגורם תורם להתפתחות של מחלות הקשורות לדלקת כרונית. נויטרופילים מורכב מרשת של DNA, חלבונים היסטון, וחלבונים שונים של הגרניט (כלומר, myeloperoxidase, elastase, ו-צנתור G). תאים חיסוניים אחרים, כולל מקרופאגים, יכולים גם לייצר ETs; עם זאת, עד כמה זה קורה בvivo והאם מקרופאג מלכודות לחילוץ (מטס) לשחק תפקיד במנגנונים פתולוגיים לא נבדק בפרוטרוט. כדי להבין טוב יותר את התפקיד של גרורות בפתווגיות דלקתיות, פרוטוקול פותחה לצורך ויזואליזציה שחרור MET מקרופאגים האנושי העיקרי בתוך מבחנה, אשר ניתן גם לנצל בניסויים immunofluorescence. זה מאפשר אפיון נוסף של המבנים האלה ואת ההשוואה שלהם ETs שוחרר מ נויטרופילים. מקרופאגים של האדם מונוציט הנגזר (HMDM) לייצר גרורות בעת חשיפה גירויים דלקתיים שונים בעקבות בידול ל-M1 pro-הפנוטיפים דלקתיים. שחרורו של מטס יכול להיות מדמיין על ידי מיקרוסקופ באמצעות כתם ירוק הגרעין חומצה פלואורסצנטי כי הוא מיועד לחיות תאים (g., בדיקת רעלים ירוק). השימוש של מקרופאגים ראשוניים מבודדים, כגון HMDM, הוא יתרון במידול באירועים דלקתיים vivo הרלוונטיים יישומים קליניים פוטנציאליים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד שחרור MET מתוך קווי מונוציט האדם התאים (למשל, THP-1) בעקבות בידול לתוך מקרופאגים עם האצטטים myristate מקרופאג או אחרים תא קווי (g., מקרופאג murine כמו J774A. 1 תאים).
Introduction
שחרורו של ETs מ נויטרופילים זוהה לראשונה כתגובה חיסונית מולדת המופעל על ידי זיהום חיידקי1. הם מורכבים השדרה DNA אשר שונים חלבונים הגרניט עם תכונות אנטי בקטריאלי מאוגדים, כולל נויטרופילים elastase ו myeloperoxidase2. התפקיד העיקרי של נויטרופילים (רשתות) היא ללכוד פתוגנים ולהקל על חיסול שלהם3. עם זאת, בנוסף לתפקיד המגן של ETs בהגנה החיסונית, מספר גדל והולך של מחקרים גילו גם תפקיד בפתוגנזה מחלה, במיוחד במהלך התפתחות של מחלות מונחה דלקות (כלומר, דלקת מפרקים שגרונית ו טרשת עורקים4). שחרורו של ETs יכול להיות מופעלות על ידי ציטוקינים pro-דלקתיות שונים כולל אינטרלויקין 8 (IL-8) ו נמק גורם הגידול אלפא (tnfα)5,6, ואת הצטברות מקומי של ETs יכול להגביר את הנזק לרקמות ולעורר תגובה הפרו דלקתית7. לדוגמה, ETs היו מעורבים כמו לשחק תפקיד סיבתי בפיתוח טרשת עורקים8, קידום פקקת9, וחיזוי הסיכון וכלי דם10.
עכשיו הוא מוכר כי בנוסף נויטרופילים, תאים חיסוניים אחרים (כלומר, התורן תאים, אאוזיפרלס, ו מקרופאגים) יכול גם לשחרר את האור על חשיפה לחיידקים או גירוי פרו-דלקתי11,12. זה עשוי להיות משמעותי במיוחד במקרה של מקרופאגים, בהתחשב תפקיד המפתח שלהם בפיתוח, רגולציה, והרזולוציה של מחלות דלקתיות כרוניות. לכן, חשוב להשיג הבנה גדולה יותר של הקשר הפוטנציאלי בין שחרור ET מקרופאגים ופיתוח דלקת מחלות הקשורות. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו נוכחות של מטס ורשתות בפלאק טרשת עורקים אנושיים שלמים ומאורגנים בתרובי13. באופן דומה, המטס היו מעורבים בנהיגה פציעה בכליות באמצעות התקנה של תגובות דלקתיות14. עם זאת, בניגוד נויטרופילים, יש נתונים מוגבלים על מנגנוני היווצרות MET מקרופאגים. מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות האדם מודלים מחוץ לתחום של היווצרות MET להראות כמה הבדלים המסלולים המעורבים בכל סוג תא (כלומר, לגבי העדר הציטרין של היסטון עם מקרופאגים)6. עם זאת, חלק הראו כי מהדורת NET יכול להתרחש גם בהעדר האוקירורולציה15.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה פשוטה וישירה להערכת שחרור MET במודל מקרופאג רלוונטי קלינית. ישנם מספר שונים של מודלים מקרופאג cell מחוץ לתחום ששימשו לחקר מטס (כלומר, קו התאים האנושי THP-1 מונוציט וקווי התאים השונים murine מקרופאג)16. ישנן מספר מגבלות המשויכות למודלים אלה. לדוגמה, הבידול של THP-1 מונוציטים מקרופאגים בדרך כלל דורש צעד לקרקע, כגון תוספת של מיבריא אצטט myristate (PMA), אשר עצמו מפעיל את החלבון קינאז C (PKC) התלויים שבילים. תהליך זה ידוע להפעיל את שחרור ET4 ותוצאות שחרור בסיס נמוך הבזמ thp-1 תאים. מחקרים אחרים הדגישו כמה הבדלים ביו פעילות ותגובות דלקתיות רכוב על ידי מקרופאגים ב vivo לעומת PMA מטופלים THP-1 תאים17.
באופן דומה, את ההתנהגות ואת התגובות דלקתיות של קווי מורטין מקרופאג שונים כמו הקווים אינם מייצגים לחלוטין את ספקטרום התגובה של מקרופאגים האדם העיקרי18. לכן, לצורך חקירת היווצרות מקרופאג ET בהגדרה הקלינית, מקרופאגים (HMDMs) של האדם הראשי הנגזר הנחשב להיות מודל רלוונטי יותר מאשר קווי תאים מקרופאג כמו monocytic או murine.
שחרור ET מ-M1 מקוטב HMDMs הוכח לאחר החשיפה של תאים אלה למספר גירויים דלקתיים שונים, כולל myeloperoxidase הנגזר חומצה היפוכלורית חמצון (HOCl), PMA, TNFα, ו-IL-86. מתוארים כאן הוא פרוטוקול כדי להקטאת HMDMs ל-M1 פניטיפ ולדמיין שחרור MET לאחר מכן בחשיפה לגירויים דלקתיים אלה. PMA משמש גירוי של שחרור MET כדי להקל על השוואות למחקרים קודמים אשר השתמשו נויטרופילים. וחשוב מכך, HOCl, IL-8 ו-TNFα משמשים גם כדי לעורר שחרור MET, אשר האמינו להיות מודלים טובים יותר של הסביבה דלקתית ב vivo. השיטה המיקרוסקופית להדמיה של מהדורת ET כרוכה בצביעת ה-DNA של החילוץ בתרביות תאים חיים באמצעות שימוש ברעלים בירוק, הכתם הירוק של פלורסנט בלתי מורגש בצבע חומצות גרעין שהוחלו בהצלחה במחקרים הקודמים של נויטרופילים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה ואיכותית של שחרור ET, אך אינה מתאימה כשיטה עצמאית לכמת של מידת שחרור ET. יש להשתמש במתודולוגיה חלופית אם הכמת נדרש כדי להשוות את היקף שחרור ET כתוצאה מתנאי טיפול שונים או התערבויות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ה-HMDM היו מבודדים מההכנות של מעיל הבאפי האנושי המסופק על ידי בנק הדם עם אישור מוסר מאזור הבריאות המקומי של סידני.
1. התרבות החMDM
- לבודד את המונציטים מן ההכנות מעיל באפי הכין דם היקפי של תורמים אנושיים בריאים באמצעות הכנה מסחרית זמין כדי לבודד לימפוציטים, ואחריו משחררות הנוכחית של הזרם הצנטריפוגלי19, . עשריםדולר
- לאשר את הנוכחות של מונוציטים על ידי ציטוטווייה וצביעת עם כתם Giemsa שונה לאפיון מונוציט19.
- תחת תנאים סטריליים, להתאים את צפיפות של מונוציטים ל 1 x 106 תאים/mL באמצעות RPMI-1640 מדיה ללא נסיוב. להוסיף 1 מ ל של תא זה השעיה לכל באר של 12 היטב העור הרקמה לוחית. תרבות בחממה תא ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO2 עבור 2 h כדי לקדם את הדבקות לצלחת תרבות רקמה.
- תחת תנאים סטריליים, להסיר את מדיית התא ולהחליף עם השלמת RPMI-1640 התקשורת התרבותית המכילה 10% (v/v) במאגר סרום אנושי 20 מ"מ L-גלוטמין.
- תרבות התאים ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO2 בחממה תא במשך 8 ימים, שינוי התקשורת כל יומיים.
2. פולריזציה של הmdm
- תחת התנאים סטרילי, להכין את המדיה לקרקע M1 על ידי הוספת אינטרפרון γ (IFNγ; 20 ng/mL) ו ליפופוליד (LPS; 1 μg/mL) לתקשורת מלאה RPMI-1640 תרבות. הכן את מדיית הקרקע M2 על-ידי הוספת אינטרלויקין 4 (IL-4; 20 ng/mL) לRPMI המלאה-1640 תרבות.
- בתנאים סטריליים, מכילים מדיה מבארות בארות העור המכילות את החברה המכילה את ה-HMDM, אשר שופרה ומתורבת כמתואר בסעיף 1.
- שטוף בזהירות את הבארות המכילות את התאים 3x עם ה-PBS סטרילי (מחומם מראש עד 37 ° c), באמצעות 1 mL-הבליטים של PBS.
- הוסף 1 מ ל של מדיית הטרמה של M1 או M2 לכל מדיה המכילה את ה-HMDM (המתאים לניסוי).
- דגירה את התאים עבור 48 h ב 37 ° צ' בנוכחות של 5% CO2 ב אינקובטור תא.
3. גירוי של הMDM כדי לגרום לשחרור MET
- בתנאים סטריליים, להכין את מדיית התרבות המכילה המעוררים שונים של שחרור MET (המתאים לניסוי) לRPMI מלאה-1640 מדיה: PMA (25 ננומטר), רקומביננטי האדם TNFα (25 ng/mL), או האדם רקומביננטי IL-8 (50 ng/mL ).
- לניסויים עם גירוי HOCl, להכין HOCl (200 μM) ב HBSS (טרום מחומם ל 37 ° c), מיד לפני התוספת לתאים. ודא כי HOCl אינו מוכן במדיית תאים מוחלטת.
הערה: הריכוז של פתרון המניה של HOCl הוא כימות על ידי מדידת ספיגת UV של הפתרון ב 292 ננומטר ו-pH = 116 ובאמצעות מקדם הכחדה של 350 M-1ס"מ-121. - לאחר הטיפול הפולריזציה המתואר בסעיף 2, מטפי את מדיית התא מכל הבאר ולשטוף בזהירות את התאים 3x עם 1 mL מקבל ה, או: PBS סטרילי (עבור PMA, TNFα ו-IL-8) או HBSS (עבור HOCl), אשר כבר טרום מחומם 37 ° c.
- לניסויים עם PMA, TNFα, או IL-8: להוסיף 1 מ ל של המדיה המלאה המכילה PMA, TNFα, או IL-8 לאחר הסרת PBS בשלב הכביסה הסופי.
- לניסויים עם TNFα, דגירה את התאים עבור 6 h ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO2 בחממה תא. לניסויים עם PMA ו-IL-8, דגירה את התאים 24 שעות ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO2 בחממה תא.
-
לניסויים עם HOCl, להוסיף 1 מ ל של HOCl ב HBSS לאחר הסרת HBSS בשלב הכביסה הסופי. לאחר מכן, דגירה את התאים עבור 15 דקות ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO2 ב אינקובטור תא.
- בזהירות לטפי את הטלפון supernatant ולשטוף את התאים 3x עם 1 mL משובטים של HBSS כפי שמתואר בשלב 3.3.
- לאחר הסרת HBSS משלב השטיפה הסופי, להוסיף 1 מ ל של RPMI-1640 המלא התקשורת התרבות. לאחר מכן, דגירה את התאים 24 שעות ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO2 בחממה תא.
4. הדמיה של מפגש בתרבות התאים החיים
- הכינו בדיקת רעלים לצבע ירוק HBSS בריכוז של 40 μM.
- בסוף הטיפולים שתוארו בסעיף 3 כדי לגרום לשחרר MET, ישירות להוסיף 25 μL של 40 μM של הצבע לכל היטב המכילים HMDM.
- התאים הדגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות בחושך.
- הציבו את ה-HMDM בבארות של תרבות הרקמה על במת המיקרוסקופ של מיקרוסקופ פלורסנט הפוך להדמיה.
-
נוהלי מיקרוסקופ
- הפעל מקור אור פלורסנט רחב טווח, ברייטסורס מקור אור, ומיקרוסקופ הפוך מותקן עם מצלמה דיגיטלית צבעונית ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים).
- סובב את גלגל הסינון לתנוחת "מספר 2" עבור הזריחה הירוקה (עירור = 504 nm, פליטה = 523 nm) לדימות של הדגימות המוכתמת הירוקות הכלולות בתוך בארות תרבות הרקמה.
- באמצעות המטרה 5x, למקד את התמונה עם המוקד גס, ואז ידיות מיקוד עדין על המיקרוסקופ, עד התמונה נראה חד, ברור, וממוקד כאשר מתבוננים דרך העין מיקרוסקופ.
- העבר את המיקרוסקופ למצב המצלמה.
- הפעל את התוכנה המשויכת.
- בחר בלשונית הלכידה בתוכנה.
- לחצו על הלחצן ' הפעל ' לתצוגה מקדימה של התמונה והתאימו את כפתור המיקוד העדין במיקרוסקופ עד שהתמונה תיראה חדה, ברורה וממוקדת בחלון התצוגה המקדימה של התוכנה.
- לחץ על לחצן הלכידה .
הערה: התמונה שנלכדה תוצג באופן אוטומטי בתוכנה הנלווית. - בתוך התוכנה, לחץ על קובץ | שמור כסוג קובץ התמונה הדרוש.
- על המיקרוסקופ, לסובב את גלגל הסינון אל המיקום "מספר 5" עבור הדמיה ברייטפילד ולחזור על שלבים 4.5.2 – 4.5.9 כדי להשיג את התמונה המקבילה ברייטפילד.
- חזור על השלבים 4.5.2 – 4.5.10 לפי הצורך עבור רכישת תמונות עוקבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ברייטפילד תמונות המציגות את השינויים הורפולוגיים של HMDM בתגובה לגירויים של בידול התא מוצגים באיור 1. מקרופאגים מקוטבי M1 מניסויים עם HMDM חשופים ל-IFNγ ו-LPS הראו צורה מוארך ובעלת צורת ציר, כפי שמצוין על-ידי החיצים השחורים באיור 1 (הלוח האמצעי). לצורך השוואה, המבנה של מקרופאגים מקוטב M2 לאחר החשיפה של HMDM ל-IL-4 עבור 48 h היו בדרך כלל עגול ושטוח, כפי שמצוין על ידי החיצים השחורים באיור 1 (הפאנל הימני הרחוק).
היכולת של הבדיל HMDM פנוטיפים כדי לשחרר את מטס היה דמיינו על ידי הדמיה של תאים לחיות האור עם בדיקת רעלים בירוק, כפי שהוצג באיור 2. איור 2A מציג את נתוני הפקד שהתקבלו מכל הפנוו של hmdm במשך 24 שעות בהיעדר גירויים פרו-דלקתיים. במקרה זה, היה מוגבל מאוד ירוק כתמים, כפי שהיה צפוי, בהתחשב באופי התאים המשמעות של הכתם הזה. איור 2B הראה כתמים חיוביים עבור מטס, כתוצאה מחשיפה של M1 HMDMs ל HOCL, PMA, IL-8, או TNFα. המטס מצוינים על ידי החצים הלבנים, המוצגים כפסים ירוקים, כתוצאה מגדילי ה-DNA של החילוץ. עם HOCl, בנוסף לצביעת מסחטות DNA, היה כמה כתמים ירוקים לכאורה בתאים. זה מכתים הסלולר נצפתה גם במידה מסוימת עם גירויים אחרים והוא האמין לשקף אובדן של שלמות הממברנה וכתוצאה מכך מוות תא לא תלוי כתוצאה מתנאי הטיפול.
איור 2B מציג גם את הניסויים המתאימים שבוצעו עם M2 HMDMs, אשר נחשפו IL-4. במקרה זה, לא היה שחרור של ה-DNA מן התאים, כפי שצוין על ידי העדר קווצות/פסים של ה-DNA לחילוץ; למרות, היה קצת קליטה תאית של צבע פלורסנט ירוק עם HOCl ו TNFα. למטרות השוואתי, איור 3 מציג נתונים מייצגים המציינים MET שחרור thp-1 מקרופאגים חשופים TNFα (50 Ng/mL) עבור 4 h. במקרה זה, יש לציין כי אוכלוסייה לא מקוטב של תאים שימש, ואת THP-1 מונוציטים היו מובחנים מקרופאגים על ידי טרום טיפול עם PMA (50 ng/mL עבור 72 h) כמתואר בעבר22.
איור 1: שינויים מורפולוגיים בעלי הסדר המימדי הדיפרנציאלי. נציג תמונות ברייטפילד מתוך HMDMs לא מובלים ומובחנים (n ≥ 5). HMDMs היו מתורבתים עם מדיה מלאה המכילים סרום אנושי ו גלוטמין במשך 8 ימים לפני הטרמה M1 או M2 הפנוטיפ על החשיפה IFNγ ו LPS או IL-4, בהתאמה, עבור 48 h. סרגל סרגל = 200 μm. חיצים מציינים דוגמאות של תאים המציגים מאפיינים מורפולוגיים של המערכת HMDMs M1 או M2. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מטס המיוצר על ידי M1 HMDMs בעקבות HOCl, PMA, IL-8, ו-TNFα גירוי. תמונות מייצגות של SYTOX דיקת רעלים ירוקה ויטראז ' מ (A) לא מגורה M1 ו M2 HMDMs מודטת עבור 24 שעות בהעדר גירויים דלקתיים שימשו כפקד, הוכחת העדר שחרור MET. (ב) M1 ו-M2 HMDMs טופלו עם 1) hocl (200 μm, 15 דקות), pma (25 ננומטר), או IL-8 (50 Ng/ml) עם דגירה עבור 24 h או 2) TNFα (25 Ng/ml) עם דגירה עבור 6 h כדי לגרום לשחרר MET. מטס היו מדמיינו בתוספת של בדיקת רעלים ירוקה, כפי שמצוין על ידי חיצים לבנים בפאנל העליון מ-M1 HMDMs. הגרורות לא נראו בניסויים המתאימים עם M2 HMDMs. Data מייצגים שכפול בארות התרבות מ n ≥ 3 תורמים בודדים. סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: המטס המיוצרים על ידי מקרופאגים לא מקוטב 1 בעקבות גירוי TNFα. תמונות מייצגות של SYTOX דיקת רעלים ירוקה מוכתם TNP-1 מקרופאגים, אשר הובלו על ידי טרום טיפול עם PMA (50 ng/mL עבור 72 h) לפני דגירה נוספת עבור 4 h בהעדר או נוכחות של TNFα (50 ng/mL) כדי לגרום לשחרר MET. המטס היו מדמיינו בתוספת. של בדיקת רעלים ירוקה נתונים מייצגים של שכפול בארות התרבות מניסויים n ≥ 3. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדור וההדמיה של היווצרות MET באמצעות M1 הבדיל HMDMs מייצג חדש במודל מבחנה שעשוי להועיל לחקירת התפקיד הפתולוגי הפוטנציאלי של מבנים מקרופאג אלה, במיוחד תחת דלקתי כרונית תנאים. הוא מספק פרוטוקול חזק לגירוי של מקרופאגים אנושיים הראשי כדי לשחרר את המטס, אשר יכול גם להיות מנוצל במחקרים קשורים עם מונוציט אנושי או מורטין מקרופאג התאים קווי. היישום המוצלח של פרוטוקול זה לגירוי היווצרות של חברת HMDM תלוי בתרבות התא הזהיר ובטיפול ביכולת לשמור על יכולת תאים טובה. זה יגדיל את המידה ואת האיכות של המטס שנצפו. כדי לספק הזנה טובה יותר של תאים, מדיית ה-RPMI המשמשת לשמירה על ה-HMDM צריכה להכיל נסיוב אנושי, במקום נסיוב העוברי, כמו גם L-גלוטמין. כל פתרון מניות של מדיה RPMI מלאה זו צריך להיות בשימוש בתוך 1 שבוע. גם האחסון הנכון של המדיה חשוב. התקשורת צריכה להיות מאוחסנת ב -4 ° c בהיעדר אור.
כמו-כן, חשוב להתבונן ולנטר בקביעות את הצורה והמבנה של התאים באמצעות מיקרוסקופ במהלך התהליך של ה-HMDM. כל שינויים חריגים או בלתי צפויים בצורת התא נצפתה לפני התוספת של IFNγ ו-LPS או IL-4 (כדי לצמצם את מקרופאגים) עשוי להצביע על ירידה בשיעור הישרדות התא. HMDM צריך להיות חסיד ולא להתרבות. לכן חשוב לעקוב אחר התאים עבור כל שינוי במבנה, צפיפות התא או אובדן דבקות במהלך תקופת התרבות הרגילה של 8 ימים. ירידה דרמטית בצפיפות התא במהלך הראשון 2 ימים לאחר בידוד מציע כי HMDMs המתקבל לא יכול להיות מספיק בר קיימא עבור ניסויים הבאים. הגבלה של שימוש בתאי האדם העיקריים היא הווריאציה בין התורמים, שיכולה להשפיע במידה ניכרת על מידת השחרור של הפגישה. בנוסף, איכות ההכנות של מעילים באפי שהתקבלו עבור בידוד של מונוציטים יכול להשתנות. חשוב לחזור על ניסויים עם לפחות שלושה תורמים סלולריים בודדים כדי להבטיח כי הנתונים הם נציגים של אוכלוסיות גדולות יותר של תאים.
חשוב לציין כי הפרוטוקול המתואר עבור הבידול HMDM כבר ממוטב עבור תאים מבודדים מתוך ההכנות של מעילים באפי האדם על ידי הססרות הנוכחית, אשר מביא הכנה בעלת טוהר גבוהה. אימות של הטיפולים הפולריזציה (כדי לאשר פנוטיפ) על ידי הזרמת cy, הערכה של הביטוי של M1 סמן CD86 ו M2 סמן CD206 בוצעו בעבר באמצעות הכנת זה של HMDM6. מעריכים כי שיטת בידוד זו אינה נגישה באופן נרחב, ושיטות בידוד חלופיות (כלומר, מיון חרוזים מגנטי) עשויות להיות עדיפות. אם נעשה שימוש במקור חלופי של מונוציטים או בפרוטוקולי בידוד שונים, ניתן להשתמש בניסויים אחרים של cy, בנוסף לאימות פנוטיפ, ומיטוב של תנאי הטיפול לעירור שחרור הפגישה עשוי להידרש.
עבור תמונות פלואורסצנטית אופטימלית, זמן חשיפה צריך להיות מותאם בקפידה ושמרו קצר ככל האפשר כדי להימנע מפני זריחה וצביעת חפצים מלוחות התרבות פלסטיק, אשר יש ציפויים חסיד. חשוב לצלם מספר תמונות מכל התאים המכילים היטב. זה יתרון אם הדגימות עיוורות. לפני ניתוח מיקרוסקופ הזריחה בנוסף לצביעת קווצות מסחטות של דנ א, יש גם ראיות לספיגה התאית של בדיקת רעלים ירוקה. זה נחשב לשקף אובדן של שלמות הממברנה, אשר עשוי להיות בגלל שחרור MET, וזה יכול גם לחשוף מסלולים חלופיים של מוות תאים (ראה גם להלן). זה מדגיש את החשיבות של ביצוע ניסויים נוספים לכמת ולאפיין עוד שחרור MET.
עבור השוואה כמותית של מידת שחרור MET בתנאי טיפול שונים או בעקבות התערבויות שונות כדי לווסת את שחרור MET, נדרש ניתוח נוסף. זה יכול להיות מושגת על ידי ביצוע ניתוח qPCR של ה-DNA גרעינית ומיטוכונדריאלי הנוכחי של סופר, כמתואר בעבר6. שיטה זו משולב בדרך כלל עם שחרור לקטט דהידרוגנאז לשחרר שליטה על הליזה תאים שאינם קשורים MET שחרור6. מכתים בדיקת רעלים ירוק יכול גם להיות כימות על ידי קורא צלחת הקרינה לאחר טיפול DNase לעכל חלקית את המטס ולשחרר אותם מלוחות התרבות. מתודולוגיה זו שימש באופן נרחב בעבודה הקודמת עם הרשתות נויטרופילים1,2,23.
היישומים העתידיים של פרוטוקול זה מתייחסים למתן הזדמנויות לאפיון נוסף של מטס באמצעות אימונוהיסטוכימיה. ניתן יהיה לחקור את הרכב החלבון של מטס באמצעות גישה זו עם נוגדנים ממוקדות (כלומר, נגד האבנים הצירולפות או MPO) כדי לקבל תובנה נוספת לתוך התפקידים של מבנים אלה בדגימות ביולוגיות מורכבות יותר. ניסויים אלה יהיו גם חשובים לשפוך יותר אור על התיחום של שחרור MET בעקבות צורות אחרות של מוות תאים, כגון פירופסיס15. ראוי לציין כי בניסיון שלנו, מטס מ מקרופאגים לא לדבוק ללוחות בחוזקה כמו רשתות מ נויטרופילים, אשר יכול להפוך ניתוח אימונוהיסטוכימיה מאתגרת יותר. עם זאת, הנתונים מניסויים אלה יהיה עניין, בהתחשב העובדה כי מקרופאגים לעתים קרובות לשחק תפקיד דומיננטי במחלות דלקתיות כרונית. אפיון נוסף של מבנים אלה הוא חיוני כדי להעריך את תפקידם בvivo, אשר עד כה בוצעה רק במידה מוגבלת16. הוא האמין כי השיטה המתוארת באמצעות HMDM כדי להשיג מטרה זו עשויה להיות רלוונטית יותר קלינית לעומת מקורות אחרים הנגזרים ממקרופאג קו. למרות שקווי תאים אלה עשויים להיות שירות במתן מודל יציב יותר לאפיון MET עם פוטנציאל פחות לווריאציית התורמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענק השפעה תמידי (IPAP201601422) ו נובו Nordisk קרן מענק פרויקט ביו-רפואי (NNF17OC0028990). YZ גם מודה בקבלת פרס לתואר שני אוסטרלי מאוניברסיטת סידני. אנחנו רוצים להודות למר פט פיסארו ולגב מורגן ג'ונס לסיוע בבידוד ובתרבות הרקמה המונבציט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
