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Immunology and Infection

विट्रो उत्तेजना और विक्षेत मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज में extracellular ट्रैप रिलीज के दृश्य

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60541

Summary

यहाँ प्रस्तुत माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट धुंधला का उपयोग कर लाइव सेल संस्कृति में मैक्रोफेज एक्स्ट्रासेल्यूलर ट्रैप (एमईटी) उत्पादन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल है। इस प्रोटोकॉल आगे इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा विशिष्ट एमईटी प्रोटीन मार्करों की जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Abstract

न्यूट्रोफिल द्वारा एक्स्ट्रासेल्यूलर ट्रैप (ईटी) की रिहाई को पुरानी सूजन से संबंधित बीमारियों के विकास में एक योगदान कारक के रूप में पहचाना गया है। न्यूट्रोफिल ईटीएस (एनटीएस) डीएनए, हिस्टोन प्रोटीन, और विभिन्न ग्रेन्यूल प्रोटीन (यानी, माइलोपेरॉक्सिड्स, इलैस्टेस, और कैथेप्सिन जी) की एक जाल से मिलकर बनता है। मैक्रोफेज सहित अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी ETs का उत्पादन कर सकती हैं; तथापि, विवो में यह किस सीमा तक होता है और क्या मैक्रोफेज बाह्यकोशिक ीय जाल (एमईटीएस) रोग तंत्र में भूमिका निभाता है, इसकी विस्तार से जांच नहीं की गई है। भड़काऊ रोगों में एमईटी की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए, इन विट्रो में प्राथमिक मानव मैक्रोफेज से एमईटी रिलीज को विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, जिसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों में भी शोषण किया जा सकता है। यह इन संरचनाओं की आगे की विशेषता और न्यूट्रोफिल से जारी ईटी की तुलना की अनुमति देता है। मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एचएमडीएम) एम 1 समर्थक भड़काऊ फीनोटाइप के भेदभाव के बाद विभिन्न भड़काऊ उत्तेजनाओं के संपर्क में एमईटी का उत्पादन करता है। METs की रिहाई एक हरे फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग है कि कोशिकाओं को जीने के लिए impermeant है का उपयोग कर माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है (उदा. SYTOX हरे). एचएमडीएम जैसे हौसले से अलग प्राथमिक मैक्रोफेज का उपयोग, विवो सूजन की घटनाओं में मॉडलिंग में फायदेमंद है जो संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए प्रासंगिक हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग मानव मोनोसाइट सेल लाइनों (जैसे, THP-1) से एमईटी रिलीज का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, जो फोरबोल माइरिस्टेट एसीटेट या अन्य मैक्रोफेज सेल लाइनों (जैसे, murine मैक्रोफेज-जैसे J774A.1 कोशिकाओं) के साथ मैक्रोफेज में भेदभाव के बाद किया जा सकता है।

Introduction

न्यूट्रोफिल से ईटी की रिहाई की पहचान सबसे पहले जीवाणु संक्रमण1के कारण होने वाली एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में की गई थी . इनमें डीएनए की रीढ़ की हड्डी होती है जिसमें एंटी-बैक्टीरियल गुणों वाले विभिन्न कण प्रोटीन बंधे होते हैं, जिनमें न्यूट्रोफिल इलैस्टेज और माइलोपेरॉक्सिडस2शामिल हैं। न्यूट्रोफिल ईटीएस (एनआईटी) की प्राथमिक भूमिका रोगजनकों को पकड़ना और उनके उन्मूलन को सुगम बनाना3है। हालांकि, प्रतिरक्षा रक्षा में ईटीएस की सुरक्षात्मक भूमिका के अलावा, अध्ययनों की बढ़ती संख्या ने रोग रोगजनन में एक भूमिका की भी खोज की है, विशेष रूप से सूजन-चालित रोगों के विकास के दौरान (यानी, रूमेटोइड गठिया और ऐथेरोस्क्लेरोसिस4) ईटीएस की रिहाई interleukin 8 (आईएल-8) और ट्यूमर नेक्रोसिस कारक अल्फा (TNF ] )5,6,और ईटीएस के स्थानीयकृत संचय ऊतक क्षति को बढ़ाने और एक आह्वान सहित विभिन्न समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया7| उदाहरण के लिए, ईटी को एथेरोस्क्लेरोसिस8के विकास में एक कारण भूमिका निभाने , थ्रोम्बिसिस9को बढ़ावा देने और हृदय जोखिम10की भविष्यवाणी के रूप में फंसाया गया है .

अब यह मान्यता प्राप्त है कि न्यूट्रोफिल के अलावा, अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं (यानी, मस्तूल कोशिकाओं, eosinophils, और मैक्रोफेज) भी माइक्रोबियल या समर्थक भड़काऊ उत्तेजना के संपर्क में ETs जारी कर सकते हैं11,12. यह मैक्रोफेज के मामले में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है, विकास, विनियमन, और पुरानी भड़काऊ रोगों के समाधान में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका पर विचार. इसलिए, मैक्रोफेज और सूजन से संबंधित रोग विकास से एट रिलीज के बीच संभावित संबंधों की अधिक से अधिक समझ हासिल करना महत्वपूर्ण है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एमईटीएस और एनईटीएस की उपस्थिति में मानव एथेरोस्क्लेरोटिक प्लेक और संगठित थ्रोम्बी13में शामिल हैं . इसी तरह, एमईटीएस को सूजन प्रतिक्रियाओं के विनियमन के माध्यम से गुर्दे की चोट को चलाने में फंसाया गयाहै। तथापि, न्यूट्रोफिल के विपरीत, मैक्रोफेज से एमईटी निर्माण के तंत्र पर सीमित आंकड़े हैं। एमईटी गठन के मानव इन विट्रो मॉडल का उपयोग कर के हाल के अध्ययन प्रत्येक सेल प्रकार में शामिल रास्ते में कुछ मतभेद दिखा (यानी, मैक्रोफेज के साथ histone citrullination के अभाव के बारे में)6. हालांकि, कुछ ने दिखाया है कि नेट रिलीज भी histone citrullination15की अनुपस्थिति में हो सकता है.

इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक मैक्रोफेज मॉडल में एमईटी रिलीज का आकलन करने के लिए एक सरल और प्रत्यक्ष विधि प्रदान करना है। इन विट्रो मैक्रोफेज सेल मॉडलों में कई अलग-अलग हैं जिनका उपयोग एमईटीएस (अर्थात, THP-1 मानव मोनोसाइट सेल लाइन और विभिन्न murine मैक्रोफेज सेल लाइनों)16का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इन मॉडलों के साथ संबद्ध कुछ सीमाएँ हैं. उदाहरण के लिए, thp-1 monocytes के मैक्रोफेज के लिए भेदभाव आमतौर पर एक प्राइमिंग कदम की आवश्यकता है, इस तरह के phorbol myristate एसीटेट (पीएमए) के अलावा के रूप में, जो अपने आप में प्रोटीन kinase सी (PKC) पर निर्भर रास्ते सक्रिय करता है. इस प्रक्रिया को एट रिलीज4 ट्रिगर और THP-1 कोशिकाओं से एक कम बेसल MET रिलीज में परिणाम के लिए जाना जाता है. अन्य अध्ययनों में पीएमए द्वारा उपचारित टीएचपी-1 कोशिकाओं17की तुलना में विवो में मैक्रोफेज द्वारा शुरू की गई जैव सक्रियता और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में कुछ अंतर ों पर प्रकाश डाला गया है।

इसी प्रकार, विभिन्न मौरीन मैक्रोफेज जैसे सेल लाइनों के व्यवहार और भड़काऊ प्रतिक्रियाएं प्राथमिक मानव मैक्रोफेज18के अनुक्रिया स्पेक्ट्रम को पूरी तरह से प्रदर्शित नहीं करती हैं। इसलिए, नैदानिक सेटिंग में मैक्रोफेज एट गठन की जांच के प्रयोजन के लिए, प्राथमिक मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एचएमडीएम) को मोनोसाइटिक या मौरीन मैक्रोफेज जैसे सेल लाइनों के बजाय अधिक प्रासंगिक मॉडल माना जाता है।

एम 1 polarized HMDMs से एट रिलीज विभिन्न भड़काऊ उत्तेजनाओं की एक संख्या के लिए इन कोशिकाओं के प्रदर्शन के बाद प्रदर्शन किया गया है, myeloperoxidase व्युत्पन्न ऑक्सीडेंट hypochlorous एसिड (HOCl), PMA, TNF, और आईएल-86सहित . यहाँ वर्णित M1 phenotype करने के लिए HMDMs polarize और इन भड़काऊ उत्तेजनाओं के संपर्क में बाद में एमईटी रिलीज कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल है. पीएमए का उपयोग एमईटी रिलीज के एक प्रोत्साहन के रूप में किया जाता है ताकि पिछले अध्ययनों की तुलना की जा सके, जिनमें न्यूट्रोफिल का उपयोग किया गया है। महत्वपूर्ण बात, HOCl, आईएल -8, और TNF - भी एमईटी रिलीज, जो vivo में भड़काऊ वातावरण के बेहतर मॉडल माना जाता है को प्रोत्साहित करने के लिए उपयोग किया जाता है. एट रिलीज के दृश्य के लिए सूक्ष्म विधि SYTOX हरे रंग का उपयोग कर रहते सेल संस्कृतियों में extracellular डीएनए धुंधला शामिल है, एक अपारगम्य फ्लोरोसेंट हरी न्यूक्लिक एसिड दाग है कि सफलतापूर्वक पिछले न्यूट्रोफिल अध्ययन में लागू किया गया है. इस विधि एट रिलीज के तेजी से और गुणात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह एट रिलीज हद तक के परिमाणीकरण के लिए एक खड़े अकेले विधि के रूप में उपयुक्त नहीं है. वैकल्पिक पद्धति का उपयोग किया जाना चाहिए यदि विभिन्न उपचार स्थितियों या हस्तक्षेपों से उत्पन्न एट रिलीज की सीमा की तुलना करने के लिए परिमाणीकरण की आवश्यकता है।

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Protocol

HMDM सिडनी स्थानीय स्वास्थ्य जिले से नैतिकता के अनुमोदन के साथ रक्त बैंक द्वारा आपूर्ति की मानव buffy कोट तैयारी से अलग थे.

1. एचएमडीएम संस्कृति

  1. लिम्फोसाइटों को अलग करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तैयारी का उपयोग करके स्वस्थ मानव दाताओं के परिधीय रक्त से तैयार की गई शौकीन कोट की तैयारी से मोनोसाइट्स को अलग करें, इसके बाद प्रतिधारा केन्द्रापसारक एलुट्रेशन19, 20|
  2. साइटोस्पिनिंग द्वारा मोनोसाइट्स की उपस्थिति की पुष्टि करें और मोनोसाइट विशेषता19के लिए संशोधित Giemsa दाग के साथ धुंधला .
  3. बाँझ शर्तों के तहत, सीरम के बिना RPMI-1640 मीडिया का उपयोग कर 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल करने के लिए monocytes के घनत्व को समायोजित करें। एक 12 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए इस सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें. ऊतक संस्कृति प्लेट के पालन को बढ़ावा देने के लिए 2 एच के लिए 5% सीओ2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल इनक्यूबेटर में संस्कृति।
  4. बाँझ शर्तों के तहत, सेल मीडिया को हटाने और 10% (v/v) जमा मानव सीरम और 20 एम एल-ग्लूटामाइन युक्त पूर्ण RPMI-1640 संस्कृति मीडिया के साथ बदलें।
  5. 8 दिनों के लिए एक सेल इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को संस्कृति, हर 2 दिन मीडिया बदल रहा है।

2. एचएमडीएम का ध्रुवीकरण

  1. बाँझ शर्तों के तहत, पूर्ण RPMI-1640 संस्कृति मीडिया को इंटरफेरोन (IFN]; 20 एनजी/एमएल) और lipopolysaccharide (LPS; 1 g/mL) जोड़कर एम 1 प्राइमिंग मीडिया तैयार करें। पूरा RPMI-1640 संस्कृति मीडिया के लिए interleukin 4 (IL-4; 20 ng/mL) जोड़कर M2 प्राइमिंग मीडिया तैयार करें।
  2. बाँझ शर्तों के तहत, ऊतक संस्कृति प्लेट कुओं से aspirate मीडिया कि HMDM, जो बीज और सुसंस्कृत किया गया है के रूप में अनुभाग 1 में वर्णित होते हैं.
  3. ध्यान से बाँझ पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं युक्त कुओं धोने (पूर्व 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म), पीबीएस के 1 एमएल alicuots का उपयोग कर.
  4. HMDM (जो भी प्रयोग के लिए उपयुक्त है) युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए या तो M1 या M2 प्राइमिंग मीडिया के 1 एमएल जोड़ें.
  5. कोशिका इनक्यूबेटर में 5% ब्व्2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 ज के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

3. एचएमडीएम की उत्तेजना एमईटी रिलीज प्रेरित करने के लिए

  1. बाँझ शर्तों के तहत, पूरा RPMI-1640 मीडिया के लिए (जो भी प्रयोग के लिए उपयुक्त है) MET रिलीज के विभिन्न stimulators युक्त संस्कृति मीडिया तैयार: PMA (25 एनएम), मानव रिकॉमबिनेंट TNF (25 ng/mL), या मानव पुनः संयोजक आईएल-8 (50 एनजी / ).
  2. HOCl उत्तेजना के साथ प्रयोगों के लिए, HBSS में HOCl (200 डिग्री सेल्सियस) तैयार (पूर्व 37 डिग्री सेल्सियस के लिए), तुरंत कोशिकाओं के अलावा से पहले. सुनिश्चित करें कि HOCl पूरा सेल मीडिया में तैयार नहीं है.
    नोट: एचओसीएल के स्टॉक विलयन की सांद्रता 292 दउ तथा चह 116 पर तथा 350 उ-1बउ-121के विलुप्त होने गुणांक का उपयोग करके विलयन के यूवी अवशोषण को मापने के द्वारा परिमाणित की जाती है।
  3. धारा 2 में वर्णित ध्रुवीकरण उपचार के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से सेल मीडिया aspirate और ध्यान से या तो के 1 एमएल alicots के साथ 3x कोशिकाओं को धोने: बाँझ पीबीएस (पीएमए के लिए, TNF$ और आईएल-8) या HBSS (HOCl के लिए), जो पहले से किया गया है 37 डिग्री सेल्सियस के लिए.
  4. अंतिम वाशिंग चरण में PBS निकालने के बाद PMA, TNF$, या IL-8 वाले पूर्ण मीडिया का 1 एमएल जोड़ें.
  5. टीएनएफजेड के साथ प्रयोगों के लिए, कोशिका इनक्यूबेटर में 5% ब्व्2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 h के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। पीएमए और आईएल-8 के साथ प्रयोगों के लिए, सेल इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. HOCl के साथ प्रयोगों के लिए, अंतिम धोने के चरण में HBSS को हटाने के बाद HBSS में HOCl के 1 एमएल जोड़ें. फिर, कोशिका इनक्यूबेटर में 5% ब्व्2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    1. सावधानी से सेल supernatant aspirate और चरण 3.3 में वर्णित के रूप में HBSSS के 1 एमएल alicots के साथ कोशिकाओं 3x धो लो.
    2. अंतिम धोने कदम से HBSS हटाने के बाद, पूरा RPMI-1640 संस्कृति मीडिया के 1 एमएल जोड़ें. फिर, कोशिका इनक्यूबेटर में 5% ब्व्2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 ज के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

4. लाइव सेल संस्कृति में एमईटी का दृश्य

  1. एचबीएसएस में 40 डिग्री सेल्सियस की सांद्रता पर SYTOX हरे रंग की तैयारी करें।
  2. MET रिलीज प्रेरित करने के लिए धारा 3 में वर्णित उपचार के अंत में, सीधे प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त HMDM करने के लिए डाई के 40 डिग्री ग्राम के 25 $L जोड़ें.
  3. कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट कोशिकाओं (आरटी) अंधेरे में 5 मिनट के लिए।
  4. इमेजिंग के लिए एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के माइक्रोस्कोप चरण पर ऊतक संस्कृति कुओं में HMDM रखें.
  5. माइक्रोस्कोप प्रक्रियाओं
    1. एक व्यापक स्पेक्ट्रम फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत, brightfield प्रकाश स्रोत, और एक उच्च संकल्प रंग डिजिटल कैमरा के साथ स्थापित उल्टे माइक्रोस्कोप चालू करें (सामग्री की तालिकादेखें).
    2. ऊतक संस्कृति कुओं के भीतर निहित हरे रंग के दाग नमूनों की इमेजिंग के लिए हरी फ्लोरोसेंट (उत्तेजना - 504 एनएम, उत्सर्जन ] 523 एनएम) के लिए "संख्या 2" स्थिति के लिए फिल्टर व्हील घुमाएँ।
    3. 5x उद्देश्य का उपयोग करना, मोटे ध्यान के साथ छवि ध्यान केंद्रित है, तो माइक्रोस्कोप पर ठीक ध्यान knobs, जब तक छवि तेज, स्पष्ट दिखाई देता है, और ध्यान केंद्रित जब माइक्रोस्कोप eyepiece के माध्यम से देखा.
    4. माइक्रोस्कोप को कैमरा मोड में स्विच करें.
    5. संबद्ध सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें।
    6. सॉफ़्टवेयर पर कैप्चर टैब का चयन करें.
    7. छवि पूर्वावलोकन और छवि तेज, स्पष्ट दिखाई देता है, और सॉफ्टवेयर पूर्वावलोकन विंडो में ध्यान केंद्रित जब तक माइक्रोस्कोप पर ठीक ध्यान घुंडी समायोजित करने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करें।
    8. कैप्चर बटन क्लिक करें.
      नोट: पर कब्जा कर लिया छवि स्वचालित रूप से साथ सॉफ्टवेयर में प्रदर्शित किया जाएगा.
    9. सॉफ़्टवेयर के भीतर, फ़ाइल क्लिक करें | आवश्यक छवि फ़ाइल प्रकार के रूप में सहेजें.
    10. माइक्रोस्कोप पर, brightfield इमेजिंग के लिए "संख्या 5" स्थिति के लिए फिल्टर पहिया बारी बारी से और इसी brightfield छवि प्राप्त करने के लिए चरण 4.5.2-4.5.9 दोहराएँ.
    11. बाद में छवि अधिग्रहण के लिए आवश्यक के रूप में 4.5.2-4.5.10 चरणों को दोहराएँ.

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Representative Results

सेल विभेदन के लिए उत्तेजनाओं के प्रत्युत्तर में एचएमडीएम के रूपात्मक परिवर्तनदर्शियों को दर्शानेवाली ब्राइटफील्ड छवियां चित्र 1 में दर्शाए गए हैं। HMDM के साथ प्रयोगों से M1 polarized मैक्रोफेज IFN$ और एलपीएस के संपर्क में एक लम्बी और धुरी की तरह सेल आकार दिखाया, के रूप में चित्रा 1 (मध्य पैनल) में काले तीर द्वारा संकेत दिया. तुलना के लिए, 48 एच के लिए आईएल-4 के लिए HMDM के जोखिम के बाद M2 polarized मैक्रोफेज की आकृति विज्ञान आम तौर पर गोल और फ्लैट थे, के रूप में चित्र 1 में काले तीर द्वारा संकेत दिया (दूर सही पैनल).

एमईटीएस को मुक्त करने के लिए विभेदित एचएमडीएम फीनोटाइप्स की क्षमता को लाइव सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा SYTOX हरे रंग के साथ कल्पना की गई थी, जैसा कि चित्र 2में प्रस्तुत किया गया था। चित्र 2क प्रत्येक HMDM फीनोटाइप से प्राप्त नियंत्रण डेटा को किसी भी समर्थक भड़काऊ उत्तेजनाओं के अभाव में 24 h के लिए इनक्यूबेट किया गया दिखाता है। इस मामले में, वहाँ बहुत सीमित हरे रंग का धुंधला था, के रूप में उम्मीद थी, इस दाग के सेल impermeant प्रकृति को देखते हुए. चित्र ाााल2बी में एम 1 एचएमडीएम के एचओसीएल, पीएमए, आईएल-8 या टीएनएफ के प्रदर्शन के परिणामस्वरूप एम 1 एचएमडीएम के प्रदर्शन के कारण एमईटीएस के लिए सकारात्मक दाग दिखाई दिया। METs सफेद तीर द्वारा संकेत दिया जाता है, हरी धारियाँ के रूप में दिखाया गया है, extracellular डीएनए की किस्में से जिसके परिणामस्वरूप. HOCl के साथ, दाग extracellular डीएनए के अलावा, वहाँ कुछ हरी कोशिकाओं में स्पष्ट धुंधला था. यह सेलुलर धुंधला भी अन्य उत्तेजनाओं के साथ कुछ हद तक मनाया गया था और उपचार की स्थिति का एक परिणाम के रूप में एट स्वतंत्र कोशिका मृत्यु से उत्पन्न झिल्ली अखंडता के नुकसान को प्रतिबिंबित करने के लिए माना जाता है.

चित्र 2ख एम 2 एचएमडीएम के साथ किए गए संगत प्रयोगों को भी दर्शाता है, जो आईएल-4 के संपर्क में थे। इस मामले में, कोशिकाओं से डीएनए की कोई रिहाई नहीं थी, जैसा कि अतिरिक्त कोशिकीय डीएनए के किस्में/स्ट्रेक की अनुपस्थिति द्वारा दर्शाया गया है; हालांकि, वहाँ HOCl और TNF के साथ हरी फ्लोरोसेंट डाई के कुछ सेलुलर तेज था. तुलनात्मक प्रयोजनों के लिए चित्र 3 प्रतिनिधि आंकड़ों को दर्शाता है कि टीएचपी-1 मैक्रोफेज से टीएचएफ (50 एनजी/एमएल) को 4 एच के लिए उजागर किया गया है। इस मामले में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कोशिकाओं की एक गैर polarized आबादी का इस्तेमाल किया गया था, और THP-1 monocytes PMAके साथ पूर्व उपचार द्वारा मैक्रोफेज के लिए विभेदित किया गया (50 एनजी /

Figure 1
चित्र 1: अंतरित ध्रुवित HMDMs के Morphological परिवर्तन. गैर-अलग और विभेदित HMDMs से प्रतिनिधि brightfield छवियों (एन $5). HMDMs मानव सीरम और glutamine युक्त पूरा मीडिया के साथ सुसंस्कृत थे 8 दिनों के लिए M1 या M2 phenotype IFN के लिए जोखिम पर प्राइमिंग से पहले और एलपीएस या आईएल -4, क्रमशः, के लिए 48 ज. स्केल बार $ 200m. तीर M1 या M2 HMDMs के रूपात्मक विशेषताओं को दर्शाने वाले कक्षों के उदाहरण दर्शाते हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एचओसीएल, पीएमए, आईएल-8 और टीएनएफ जेड उत्तेजना के बाद एम 1 एचएमडीएमएस द्वारा उत्पादित एमईटीएस। SYTOX हरी दाग HMDMs के प्रतिनिधि छवियों से(A) गैर उत्तेजित M1 और M2 HMDMs किसी भी भड़काऊ उत्तेजनाओं के अभाव में 24 एच के लिए incubated नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया, एमईटी रिलीज की अनुपस्थिति का प्रदर्शन. (बी) एम 1 और एम 2 एचएमडीएम का इलाज 1 एचओसीएल (200 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट), पीएमए (25 एनएम), या आईएल-8 (50 एनजी/एमएल) के साथ 24 ज या 2 के लिए ऊष्मायन के साथ किया गया था) टीएनएफजेड (25 एनजी/ METs SYTOX हरे रंग के अलावा द्वारा कल्पना की गई, के रूप में M1 HMDMs से ऊपरी पैनल में सफेद तीर द्वारा संकेत दिया. M2 HMDMs. डेटा n $ 3 व्यक्तिगत दाताओं से संस्कृति कुओं को दोहराने के प्रतिनिधि हैं के साथ इसी प्रयोगों में कोई METS देखा गया. स्केल बार $ 500 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: टीएनएफ की उत्तेजना के बाद गैर-ध्रुवित टीएचपी-1 मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित एमईटीएस। SYTOX हरे रंग की दाग TNP-1 मैक्रोफेज के प्रतिनिधि छवियों, जो पीएमए के साथ पूर्व उपचार द्वारा विभेदित किया गया (50 एनजी /एमएल 72 एच के लिए) के लिए आगे ऊष्मायन से पहले 4 एच के लिए अनुपस्थिति या TNF की उपस्थिति में (50 ng/mL) एमईटी रिलीज प्रेरित करने के लिए. METs SYTOX हरे रंग के अलावा द्वारा कल्पना की गई. डेटा n से संस्कृति कुओं को दोहराने के प्रतिनिधि हैं - 3 प्रयोगों. स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एम 1 विभेदित HMDMs का उपयोग कर MET गठन की पीढ़ी और दृश्य इन मैक्रो मॉडल है कि इन मैक्रोफेज संरचनाओं की संभावित रोग भूमिका की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है में एक नया इन विट्रो मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है, विशेष रूप से पुरानी सूजन के तहत शर्तों. यह एमईटीएस को जारी करने के लिए प्राथमिक मानव मैक्रोफेज की उत्तेजना के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जिसे मानव मोनोसाइट या मोरीन मैक्रोफेज सेल लाइनों के साथ संबंधित अध्ययनों में भी उपयोग किया जा सकता है। HMDM द्वारा एमईटी गठन की उत्तेजना के लिए इस प्रोटोकॉल के सफल कार्यान्वयन सावधान सेल संस्कृति पर निर्भर है और अच्छी सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए हैंडलिंग. इससे मनाया जाने वाला एमईटीएस की सीमा और गुणवत्ता में वृद्धि होगी। बेहतर सेल पोषण प्रदान करने के लिए, RPMI मीडिया HMDM बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया मानव सीरम शामिल करना चाहिए, बजाय भ्रूण गोजातीय सीरम, साथ ही एल-ग्लूटामाइन. इस पूर्ण RPMI मीडिया के प्रत्येक स्टॉक समाधान 1 सप्ताह के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए. मीडिया का सही भंडारण भी महत्वपूर्ण है. प्रकाश के अभाव में मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाना चाहिए।

इसके अलावा, एचएमडीएम की रचना के दौरान माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं के आकार और आकारिकी का नियमित रूप से निरीक्षण और निगरानी करना महत्वपूर्ण है। कोशिका आकार में कोई भी असामान्य या अप्रत्याशित परिवर्तन आईएफएन जेड और एलपीएस या आईएल-4 (मैक्रोफेज का ध्रुवीकरण करने के लिए) के अलावा से पहले मनाया गया सेल जीवित रहने की दर में कमी का संकेत हो सकता है। HMDM का पालन किया जाना चाहिए और बढ़ नहीं है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है, आकारिकी में किसी भी परिवर्तन के लिए कोशिकाओं की निगरानी करने के लिए, सेल घनत्व, या सामान्य 8 दिन संस्कृति अवधि के दौरान पालन की हानि. पहले 2 दिनों के दौरान सेल घनत्व में एक नाटकीय कमी के बाद अलगाव पता चलता है कि जिसके परिणामस्वरूप HMDMs बाद के प्रयोगों के लिए पर्याप्त रूप से व्यवहार्य नहीं हो सकता है. प्राथमिक मानव कोशिकाओं का उपयोग करने की एक सीमा दाताओं के बीच भिन्नता है, जो स्पष्ट रूप से एमईटी रिलीज की सीमा को प्रभावित कर सकते हैं. इसके अलावा, monocytes के अलगाव के लिए प्राप्त buffy कोट तैयारी की गुणवत्ता भिन्न हो सकते हैं. यह सुनिश्चित करने के लिए कि डेटा कोशिकाओं की बड़ी आबादी के प्रतिनिधि हैं कम से कम तीन अलग-अलग सेल दाताओं के साथ प्रयोगों को दोहराने के लिए महत्वपूर्ण है.

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि HMDM भेदभाव के लिए वर्णित प्रोटोकॉल countercurrent elutriation द्वारा मानव buffy कोट तैयारी से अलग कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है, जो एक उच्च शुद्धता monocyte तैयारी में परिणाम है. ध्रुवण उपचार का सत्यापन (फीनोटाइप की पुष्टि करने के लिए) प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा और M1 मार्कर CD86 और M2 मार्कर CD206 की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन पहले HMDM6की इस तैयारी का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है. यह इस अलगाव विधि व्यापक रूप से सुलभ नहीं किया जा सकता है कि सराहना की है, और है कि वैकल्पिक अलगाव तरीकों (यानी, चुंबकीय मनका छँटाई) बेहतर हो सकता है. मोनोसाइट्स या अलग अलगाव प्रोटोकॉल के एक वैकल्पिक स्रोत का उपयोग किया जाता है, तो phenotype परिवर्तन को मान्य करने के लिए अतिरिक्त प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोगों की सिफारिश कर रहे हैं, और एमईटी रिलीज को प्रोत्साहित करने के लिए उपचार की स्थिति के कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

इष्टतम फ्लोरोसेंट छवियों के लिए, जोखिम समय ध्यान से समायोजित किया जाना चाहिए और पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट और प्लास्टिक संस्कृति प्लेटों, जो अनुयायी कोटिंग्स है से धुंधला कलाकृतियों से बचने के लिए संभव के रूप में कम के रूप में रखा. यह प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं से कई छवियों को लेने के लिए महत्वपूर्ण है. यह फायदेमंद है अगर नमूने फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विश्लेषण से पहले अंधा कर रहे हैं. डीएनए के extracellular किस्में धुंधला करने के अलावा, वहाँ भी SYTOX हरे रंग की सेलुलर तेज के लिए सबूत है. यह झिल्ली अखंडता में एक नुकसान को प्रतिबिंबित करने के लिए माना जाता है, जो एमईटी रिलीज की वजह से हो सकता है, और यह भी सेल मौत के वैकल्पिक रास्ते प्रकट कर सकते हैं (नीचे भी देखें). यह अतिरिक्त प्रयोगों के प्रदर्शन के महत्व पर प्रकाश डाला गया मात्रा और आगे MET रिलीज की विशेषता.

विभिन्न उपचार स्थितियों के तहत एमईटी रिलीज की सीमा की मात्रात्मक तुलना के लिए या एमईटी रिलीज को मॉड्युलेट करने के लिए विभिन्न हस्तक्षेपों का पालन करना, आगे विश्लेषण की आवश्यकता है। यह कोशिका supernatants में मौजूद परमाणु और mitochondrial डीएनए के QPCR विश्लेषण प्रदर्शन करके प्राप्त किया जा सकता है, जैसा कि पहले6वर्णित . इस विधि को आमतौर पर लैक्टेट डिहाइड्रोजेनेज रिलीज परसे गए के साथ मिलाया जाता है ताकि एमईटी रिलीज6से संबंधित सेल lysis को नियंत्रित किया जा सके . SYTOX हरी धुंधला भी आंशिक रूप से METs पचाने और उन्हें संस्कृति प्लेटों से मुक्त करने के लिए DNase उपचार के बाद एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इस पद्धति का प्रयोग न्यूट्रोफिल नेट 1 ,2,23के साथ पिछले कार्य में व्यापक रूप से किया गया है .

इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोग इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके एमईटीएस की आगे की विशेषता के लिए अवसर प्रदान करने से संबंधित हैं। यह अधिक जटिल जैविक नमूनों में इन संरचनाओं की भूमिकाओं में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए लक्षित एंटीबॉडी के साथ इस दृष्टिकोण का उपयोग कर METs के प्रोटीन संरचना की जांच करने के लिए संभव हो जाएगा (यानी, citrullinated histones या MPO के खिलाफ)। ये प्रयोग कोशिका मृत्यु के अन्य रूपों जैसे पाइरोप्तकोसिस15के बाद एमईटी रिलीज के चित्रण पर अधिक प्रकाश डालने के लिए भी महत्वपूर्ण होंगे। यह ध्यान देने योग्य बात है कि हमारे अनुभव में, मैक्रोफेज से एमईटीएस न्यूट्रोफिल से एनआईटी के रूप में दृढ़ता से प्लेटों का पालन नहीं करते हैं, जो इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण को अधिक चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं। फिर भी, इन प्रयोगों से डेटा ब्याज की होगी, तथ्य यह है कि मैक्रोफेज अक्सर पुरानी भड़काऊ रोगों में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं. इन संरचनाओं की आगे की विशेषता विवो में उनकी भूमिकाओं का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है, जो अब तक केवल16सीमित सीमा तक की गई है. ऐसा माना जाता है कि इस उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए HMDM का उपयोग करने वाली वर्णित विधि अन्य अमरीकृत सेल लाइन व्युत्पन्न मैक्रोफेज स्रोतों की तुलना में अधिक नैदानिक रूप से प्रासंगिक हो सकती है; हालांकि, इन सेल लाइनों दाता भिन्नता के लिए कम क्षमता के साथ एमईटी लक्षणीकरण के लिए एक और अधिक स्थिर मॉडल प्रदान करने में उपयोगिता हो सकती है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम एक स्थायी प्रभाव अनुदान (IPAP201601422) और नोवो Nordisk फाउंडेशन जैव चिकित्सा परियोजना अनुदान (NNF17OC0028990) द्वारा समर्थित किया गया था. वाईजेड भी सिडनी विश्वविद्यालय से एक ऑस्ट्रेलियाई स्नातकोत्तर पुरस्कार की प्राप्ति स्वीकार करता है. हम मोनोसाइट अलगाव और ऊतक संस्कृति के साथ सहायता के लिए श्री पैट Pisansarakit और सुश्री मॉर्गन जोन्स शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
120Q broad spectrum fluorescent light source EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) Sigma-Aldrich CLS3336 For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) Polysciences Inc. 24606 Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS) Thermo-Fisher 14025050 For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl) Sigma-Aldrich 320331 For MET stimulation
Interferon gamma Thermo-Fisher PMC4031 For M1 priming
Interleukin 4 Integrated Sciences rhil-4 For M2 priming
Interleukin 8 Miltenyl Biotec 130-093-943 For MET stimulation
L-Glutamine Sigma-Aldrich 59202C Added to culture media
Lipopolysaccharide Integrated Sciences tlrl-eblps For M1 priming
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS 1114544 For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D5652 For washing steps
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R8758 For cell culture
SYTOX green Life Technologies S7020 For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source Olympus, Tokyo, Japan x-cite series
Tumor necrosis factor alpha Lonza 300-01A-50 For MET stimulation

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References

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Zhang, Y., Rayner, B. S., Jensen,More

Zhang, Y., Rayner, B. S., Jensen, M., Hawkins, C. L. In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (153), e60541, doi:10.3791/60541 (2019).

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