Summary
Aquí se presenta un protocolo para detectar la producción de trampaextracelular de macrófagos (MET) en el cultivo de células vivas mediante microscopía y tinción de fluorescencia. Este protocolo se puede ampliar aún más para examinar marcadores específicos de proteína MET mediante la tinción de inmunofluorescencia.
Abstract
La liberación de trampas extracelulares (ET) por neutrófilos se ha identificado como un factor que contribuye al desarrollo de enfermedades relacionadas con la inflamación crónica. Las ET de neutrófilos (NET) consisten en una malla de ADN, proteínas de histona y varias proteínas de gránulos (es decir, mieloperoxidasa, elastasa y catepsina G). Otras células inmunitarias, incluidos los macrófagos, también pueden producir ETs; sin embargo, en qué medida esto ocurre in vivo y si las trampas extracelulares de macrófagos (MET) desempeñan un papel en los mecanismos patológicos no se han examinado en detalle. Para comprender mejor el papel de los MET en las patologías inflamatorias, se desarrolló un protocolo para visualizar la liberación de MET de los macrófagos humanos primarios in vitro, que también se puede explotar en experimentos de inmunofluorescencia. Esto permite una mayor caracterización de estas estructuras y su comparación con los ET liberados de neutrófilos. Los macrófagos derivados de monocitos humanos (HMDM) producen MET al exponerse a diferentes estímulos inflamatorios después de la diferenciación al fenotipo proinflamatorio M1. La liberación de METs se puede visualizar mediante microscopía utilizando una mancha de ácido nucleico fluorescente verde que está impermeant a las células vivas (por ejemplo, SYTOX verde). El uso de macrófagos primarios recién aislados, como el MMDM, es ventajoso en el modelado de eventos inflamatorios in vivo que son relevantes para posibles aplicaciones clínicas. Este protocolo también se puede utilizar para estudiar la liberación de MET de las líneas celulares de monocitos humanos (por ejemplo, THP-1) después de la diferenciación en macrófagos con acetato de mirista phorbol u otras líneas celulares de macrófagos (por ejemplo, las células J774A.1 similares a los macrófagos murinos).
Introduction
La liberación de ETs de neutrófilos se identificó por primera vez como una respuesta inmune innata desencadenada por una infección bacteriana1. Consisten en una columna vertebral del ADN a la que se unen varias proteínas de gránulos con propiedades antibacterianas, incluyendo la aslastasa de neutrófilos y mieloperoxidasa2. El papel principal de las ET de neutrófilos (NET) es capturar patógenos y facilitar su eliminación3. Sin embargo, además del papel protector de las ET en la defensa inmunitaria, un número cada vez mayor de estudios también han descubierto un papel en la patogénesis de la enfermedad, particularmente durante el desarrollo de enfermedades impulsadas por la inflamación (es decir, artritis reumatoide y aterosclerosis4). La liberación de ETs puede ser desencadenada por varias citoquinas proinflamatorias incluyendo interleucina 8 (IL-8) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF)5,6, y la acumulación localizada de ETs puede aumentar el daño tisular y evocar una respuesta proinflamatoria7. Por ejemplo, las ET se han implicado como un papel causal en el desarrollo de la aterosclerosis8,promoviendo la trombosis9, y prediciendo el riesgo cardiovascular10.
Ahora se reconoce que, además de los neutrófilos, otras células inmunitarias (es decir, células de mástil, eosinófilos y macrófagos) también pueden liberar ET en la exposición a la estimulación microbiana o proinflamatoria11,12. Esto puede ser particularmente significativo en el caso de los macrófagos, teniendo en cuenta su papel clave en el desarrollo, la regulación y la resolución de enfermedades inflamatorias crónicas. Por lo tanto, es importante obtener una mayor comprensión de la relación potencial entre la liberación ET de los macrófagos y el desarrollo de enfermedades relacionadas con la inflamación. Estudios recientes han demostrado la presencia de MET y NETs en placas ateroscleróticas humanas intactas y trombos organizados13. Del mismo modo, los MET se han implicado en la conducción de lesiones renales a través de la regulación de las respuestas inflamatorias14. Sin embargo, a diferencia de los neutrófilos, hay datos limitados sobre los mecanismos de formación de MET a partir de macrófagos. Estudios recientes que utilizan modelos in vitro humanos de formación MET muestran algunas diferencias en las vías involucradas en cada tipo de célula (es decir, con respecto a la ausencia de citrulinación histona con macrófagos)6. Sin embargo, algunos han demostrado que la versión NET también puede ocurrir en ausencia de histona citrullination15.
El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método simple y directo para evaluar la liberación de MET en un modelo de macrófagos clínicamente relevante. Hay una serie de diferentes modelos de células de macrófagos in vitro que se han utilizado para estudiar los MET (es decir, la línea celular de monocitos humanos THP-1 y varias líneas celulares de macrófagos murinos)16. Hay algunas limitaciones asociadas con estos modelos. Por ejemplo, la diferenciación de los monocitos THP-1 a los macrófagos generalmente requiere un paso de cebado, como la adición de acetato de mirista phorbol (PMA), que a su vez activa las vías dependientes de la proteína quinasa C (PKC). Este proceso es conocido por desencadenar la liberación de ET4 y da como resultado una liberación basal baja de MET de las células THP-1. Otros estudios han puesto de relieve algunas diferencias en la bioactividad y las respuestas inflamatorias montadas por los macrófagos in vivo en comparación con las células THP-1 tratadas con PMA17.
Del mismo modo, el comportamiento y las respuestas inflamatorias de diferentes líneas celulares similares a macrófagos murinos no representan completamente el espectro de respuesta de los macrófagos humanos primarios18. Por lo tanto, con el fin de investigar la formación de ET de macrófagos en el entorno clínico, se cree que los macrófagos derivados de monocitos humanos primarios (HMM) son un modelo más relevante en lugar de líneas celulares monocíticas o similares a la murina.
La liberación de ET de los HMMAM polarizados M1 se ha demostrado después de la exposición de estas células a una serie de diferentes estímulos inflamatorios, incluyendo el ácido hipocloroso oxidante derivado de mieloperoxidasa (HOCl), PMA, TNF, e IL-86. Aquí se describe un protocolo para polarizar los HMMAM al fenotipo M1 y visualizar la posterior liberación de MET tras la exposición a estos estímulos inflamatorios. PMA se utiliza como un estímulo de la liberación de MET para facilitar las comparaciones con estudios anteriores que han utilizado neutrófilos. Es importante destacar que HOCl, IL-8 y TNF también se utilizan para estimular la liberación de MET, que se cree que son mejores modelos del ambiente inflamatorio in vivo. El método microscópico para la visualización de la liberación de ET consiste en tinchar el ADN extracelular en cultivos de células vivas utilizando SYTOX green, una mancha de ácido nucleico verde fluorescente impermeable que se ha aplicado con éxito en estudios anteriores de neutrófilos. Este método permite una evaluación rápida y cualitativa de la versión ET, pero no es apropiado como método independiente para la cuantificación de la extensión de liberación ET. Se debe utilizar una metodología alternativa si se requiere cuantificación para comparar el alcance de la liberación de ET resultante de diferentes condiciones o intervenciones de tratamiento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los HMDM fueron aislados de los preparados de capa buffy humana suministradas por el banco de sangre con la aprobación ética del Distrito de Salud Local de Sídney.
1. Cultura HMDM
- Aislar a los monocitos de las preparaciones de capa buffy preparadas a partir de la sangre periférica de donantes humanos sanos utilizando una preparación disponible comercialmente para aislar linfocitos, seguida de la elutriación centrífuga centrífuga contracorriente19, 20.
- Confirmar la presencia de monocitos mediante el cytospinning y la tinción con la mancha de Giemsa modificada para la caracterización de monocitos19.
- En condiciones estériles, ajuste la densidad de los monocitos a 1 x 106 células/ml utilizando medios RPMI-1640 sin suero. Añadir 1 ml de esta suspensión celular a cada pocal de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos. Cultivo en una incubadora celular a 37oC en presencia de 5%CO2 durante 2 h para promover la adherencia a la placa de cultivo tisular.
- En condiciones estériles, retire los medios celulares y sustitúyalos por medios de cultivo RPMI-1640 completos que contengan 10% (v/v) de suero humano agrupado y 20 mM de L-glutamina.
- Cultivo de las células a 37 oC en presencia de 5% co2 en una incubadora de células durante 8 días, cambiando el medio cada 2 días.
2. Polarización del MMDM
- En condiciones estériles, prepare los medios de cebado M1 añadiendo interferón (IFN; 20 ng/ml) y lipopolisacárido (LPS; 1 g/mL) a los medios de cultivo RPMI-1640 completos. Prepare los medios de cebado M2 añadiendo interleucina 4 (IL-4; 20 ng/mL) a los medios de cultivo RPMI-1640 completos.
- En condiciones estériles, aspirar medios de los pozos de la placa de cultivo de tejido que contienen el MMDM, que han sido sembrados y cultivados como se describe en la sección 1.
- Lavar cuidadosamente los pozos que contienen las células 3x con PBS estéril (precalentado a 37 oC), utilizando 1 mL alícuotas de PBS.
- Agregue 1 ml de los medios de cebado M1 o M2 a cada pocil que contenga el MMDM (lo que sea apropiado para el experimento).
- Incubar las células durante 48 h a 37 oC en presencia de 5% deCO2 en una incubadora de células.
3. Estimulación del MMDM para inducir la liberación de MET
- En condiciones estériles, prepare los medios de cultivo que contengan diferentes estimuladores de liberación MET (lo que sea apropiado para el experimento) a los medios RPMI-1640 completos: PMA (25 nM), TNF recombinante humano (25 ng/ml), o IL-8 recombinante humano (50 ng/ml) ).
- Para los experimentos con estimulación HOCl, prepare HOCl (200 m) en HBSS (precalentado a 37 oC), inmediatamente antes de la adición a las células. Asegúrese de que el HOCl no esté preparado en medios celulares completos.
NOTA: La concentración de la solución en stock de HOCl se cuantifica midiendo la absorbancia UV de la solución a 292 nm y el pH 116 y utilizando un coeficiente de extinción de 350 M-1cm-121. - Después del tratamiento de polarización descrito en la sección 2, aspirar los medios celulares de cada pocayés y lavar cuidadosamente las células 3 veces con alícuotas de 1 ml de: PBS estéril (para PMA, TNF e IL-8) o HBSS (para HOCl), que han sido precalentadas a 37 oC.
- Para experimentos con PMA, TNF o IL-8: agregue 1 ml del medio completo que contiene PMA, TNF o IL-8 después de quitar el PBS en el paso de lavado final.
- Para los experimentos con TNF, incubar las células durante 6 h a 37 oC en presencia de 5% de CO2 en una incubadora de células. Para experimentos con PMA e IL-8, incubar las células durante 24 h a 37 oC en presencia de 5% deCO2 en una incubadora de células.
-
Para experimentos con HOCl, agregue 1 ml de HOCl en HBSS después de retirar el HBSS en el paso final de lavado. Luego, incubar las células durante 15 min a 37 oC en presencia de 5% co2 en una incubadora de células.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante celular y lavar las células 3 veces con 1 ml de alícuotas de HBSS como se describe en el paso 3.3.
- Después de retirar el HBSS del paso de lavado final, agregue 1 ml de medios de cultivo RPMI-1640 completos. Luego, incubar las células durante 24 h a 37 oC en presencia de 5% deCO2 en una incubadora de células.
4. Visualización de MET en la cultura celular en vivo
- Preparar el tinte verde SYTOX en HBSS a una concentración de 40 m.
- Al final de los tratamientos descritos en la sección 3 para inducir la liberación del MET, agregue directamente 25 ml de 40 oM del tinte a cada pocal que contenga HMDM.
- Incubar células a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos en la oscuridad.
- Coloque el MMDM en pozos de cultivo de tejidos en la etapa del microscopio de un microscopio fluorescente invertido para la toma de imágenes.
-
Procedimientos del microscopio
- Encienda una fuente de luz fluorescente de amplio espectro, una fuente de luz de campo brillante y un microscopio invertido instalados con una cámara digital a color de alta resolución (consulte Tabla de materiales).
- Gire la rueda del filtro a la posición del "número 2" para la fluorescencia verde (excitación de 504 nm, emisión a 523 nm) para la toma de imágenes de las muestras teñidas verdes contenidas en los pozos de cultivo de tejido.
- Usando el objetivo 5x, enfoque la imagen con el enfoque grueso, luego las perillas de enfoque fino en el microscopio, hasta que la imagen aparezca nítida, clara y enfocada cuando se ve a través del ocular del microscopio.
- Cambie el microscopio al modo de cámara.
- Inicie el software asociado.
- Seleccione la pestaña Capturar en el software.
- Haga clic en el botón Reproducir para obtener una vista previa de la imagen y ajustar la perilla de enfoque fino en el microscopio hasta que la imagen aparezca nítida, clara y enfocada en la ventana de vista previa del software.
- Haga clic en el botón Capturar.
NOTA: La imagen capturada se mostrará automáticamente en el software que lo acompaña. - Dentro del software, haga clic en Archivo . Guardar como el tipo de archivo de imagen necesario.
- En el microscopio, gire la rueda del filtro a la posición "número 5" para la imagen de campo brillante y repita los pasos 4.5.2–4.5.9 para obtener la imagen de campo brillante correspondiente.
- Repita los pasos 4.5.2–4.5.10 según sea necesario para la adquisición posterior de la imagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las imágenes de Brightfield que muestran los cambios morfológicos de la MMDM en respuesta a los estímulos para la diferenciación celular se muestran en la Figura 1. Los macrófagos polarizados M1 de experimentos con HMDM expuestos a IFN y LPS mostraron una forma celular alargada y similar al husillo, como lo indican las flechas negras de la Figura 1 (panel medio). A modo de comparación, la morfología de los macrófagos polarizados M2 después de la exposición de HMDM a IL-4 durante 48 h eran típicamente redondas y planas, como indican las flechas negras en la Figura 1 (panel derecho lejano).
La capacidad de los fenotipos HMDM diferenciados para liberar MET se visualizó mediante imágenes de fluorescencia de células vivas con sYTOX verde, como se presenta en la Figura 2. La Figura 2A muestra los datos de control obtenidos de cada fenotipo HMDM incubado durante 24 h en ausencia de estímulos proinflamatorios. En este caso, había una tinción verde muy limitada, como se esperaba, dada la naturaleza impermeant celular de esta mancha. La Figura 2B mostró tinción positiva para los MET, como resultado de la exposición de los HHM M1 a HOCl, PMA, IL-8 o TNF. Los MET están indicados por las flechas blancas, mostradas como rayas verdes, resultantes de las hebras de ADN extracelular. Con HOCl, además de manchar ADN extracelular, había algunas manchas verdes aparentes en las células. Esta tinción celular también se observó en cierta medida con los otros estímulos y se cree que refleja la pérdida de integridad de la membrana resultante de la muerte celular independiente de ET como resultado de las condiciones del tratamiento.
La Figura 2B también muestra los experimentos correspondientes realizados con HMDM M2, que fueron expuestos a IL-4. En este caso, no hubo liberación de ADN de las células, como lo indica la ausencia de las hebras / rayas de ADN extracelular; sin embargo, hubo cierta absorción celular de tinte fluorescente verde con el HOCl y el TNF. A efectos comparativos, la Figura 3 muestra datos representativos que indican la liberación de MET de los macrófagos THP-1 expuestos a TNF (50 ng/ml) durante 4 h. En este caso, cabe señalar que se utilizó una población no polarizada de células, y los monocitos THP-1 se diferenciaron a macrófagos por pretratamiento con PMA (50 ng/ml para 72 h) como se describió anteriormente22.
Figura 1: Cambios morfológicos de hmMAM polarizados diferencialmente. Imágenes representativas de zonas de brillo de HHM no diferenciados y diferenciados (n.o 5). Los HMMAM se cultivaron con medios completos que contenían suero humano y glutamina durante 8 días antes de cebar el fenotipo M1 o M2 al exponerse a IFN y LPS o IL-4, respectivamente, durante 48 h. Barra de escala de 200 m. Las flechas indican ejemplos de celdas que muestran características morfológicas de los HHM M1 o M2. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: METs producidos por HMDM M1 después de la estimulación HOCl, PMA, IL-8 y TNF. Como control se utilizaron imágenes representativas de HmDM sin manchas verdes de (A) HmDMS M1 y M2 no estimulados incubados durante 24 horas en ausencia de estímulos inflamatorios, lo que demuestra la ausencia de liberación del MET. (B) Los HMM M1 y M2 fueron tratados con 1) HOCl (200 m, 15 min), PMA (25 nM) o IL-8 (50 ng/ml) con incubación para 24 h o 2) TNF (25 ng/ml) con incubación durante 6 h para inducir la liberación del MET. Los MET fueron visualizados por la adición de SYTOX verde, como lo indican las flechas blancas en el panel superior de los HmDM M1. No se ha visto METS en los experimentos correspondientes con HMDMMMMMS M2. Barra de escala a 500 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: MET producidos por macrófagos THP-1 no polarizados después de la estimulación TNF. Imágenes representativas de macrófagos TNP-1 teñidos de verde SYTOX, que se diferenciaron por pretratamiento con PMA (50 ng/ml durante 72 h) antes de una mayor incubación durante 4 h en ausencia o presencia de TNF (50 ng/ml) para inducir la liberación del MET. Los MET se visualizaron mediante la adición de SYTOX green. Los datos son representativos de los pozos de cultivo de réplica de n 3 experimentos. Barra de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La generación y visualización de la formación met utilizando HMMam diferenciados M1 representa un nuevo modelo in vitro que puede ser útil para investigar el papel patológico potencial de estas estructuras de macrófagos, particularmente bajo inflamatoriocrónico Condiciones. Proporciona un protocolo robusto para la estimulación de macrófagos humanos primarios para liberar MET, que también se puede utilizar en estudios relacionados con monocitos humanos o líneas celulares de macrófagos murinos. La implementación exitosa de este protocolo para la estimulación de la formación de MET por HMDM depende del cultivo y manejo celular cuidadoso para mantener una buena viabilidad celular. Esto aumentará el alcance y la calidad de los MET observados. Para proporcionar una mejor nutrición celular, los medios RPMI utilizados para mantener el HMDM deben contener suero humano, en lugar de suero bovino fetal, así como L-glutamina. Cada solución de stock de este medio RPMI completo debe utilizarse en un plazo de 1 semana. El almacenamiento correcto de los medios también es importante. El soporte debe almacenarse a 4 oC en ausencia de luz.
Además, es importante observar y monitorear regularmente la forma y morfología de las células mediante microscopía durante el cultivo de HMDM. Cualquier cambio anormal o inesperado en la forma celular observado antes de la adición de IFN y LPS o IL-4 (para polarizar los macrófagos) puede indicar una reducción en la tasa de supervivencia celular. El MMDM debe ser adherente y no proliferar. Por lo tanto, es importante monitorear las células en busca de cualquier cambio en la morfología, densidad celular o pérdida de adherencia durante el período normal de cultivo de 8 días. Una disminución dramática de la densidad celular durante los primeros 2 días después del aislamiento sugiere que los HMMam resultantes pueden no ser lo suficientemente viables para experimentos posteriores. Una limitación del uso de células humanas primarias es la variación entre los donantes, que puede influir notablemente en el alcance de la liberación de MET. Además, la calidad de las preparaciones de la capa de color amarindo recibidas para el aislamiento de los monocitos puede variar. Es importante repetir los experimentos con al menos tres donantes celulares individuales para asegurarse de que los datos sean representativos de las poblaciones más grandes de células.
Es importante tener en cuenta que el protocolo descrito para la diferenciación de HMDM se ha optimizado para células aisladas de preparaciones de capa buffy humanas por elutriación contracorriente, lo que resulta en una preparación de monocitos de alta pureza. Validación de los tratamientos de polarización (para confirmar el fenotipo) por citometría de flujo y evaluación de la expresión del marcador M1 CD86 y m2 marcador CD206 se han realizado previamente utilizando esta preparación de HMDM6. Se aprecia que este método de aislamiento puede no ser ampliamente accesible, y que los métodos de aislamiento alternativos (es decir, clasificación de perlas magnéticas) pueden ser preferibles. Si se utiliza una fuente alternativa de monocitos o diferentes protocolos de aislamiento, se recomiendan experimentos de citometría de flujo adicionales para validar el cambio de fenotipo, y puede ser necesaria alguna optimización de las condiciones de tratamiento para estimular la liberación de MET.
Para obtener imágenes óptimas de fluorescencia, el tiempo de exposición debe ajustarse cuidadosamente y mantenerse lo más corto posible para evitar la fluorescencia de fondo y los artefactos de tinción de las placas de cultivo de plástico, que tienen recubrimientos adherentes. Es importante tomar varias imágenes de cada pozo que contiene células. Es ventajoso si las muestras están cegadas antes del análisis de microscopía de fluorescencia. Además de manchar las hebras extracelulares de ADN, también hay evidencia para la ingesta celular de SYTOX green. Esto se cree que refleja una pérdida en la integridad de la membrana, que puede ser debido a la liberación de MET, y también puede revelar vías alternativas de la muerte celular (ver también a continuación). Esto pone de relieve la importancia de realizar experimentos adicionales para cuantificar y caracterizar aún más la versión de MET.
Para una comparación cuantitativa del alcance de la liberación del MET en diferentes condiciones de tratamiento o después de diferentes intervenciones para modular la liberación del MET, se requiere un análisis adicional. Esto se puede lograr mediante la realización de análisis qPCR de ADN nuclear y mitocondrial presente en los sobrenatantes celulares, como se describió anteriormente6. Este método se combina generalmente con ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa para controlar la lisis celular no relacionada con la liberación6de MET. La tinción verde SYTOX también puede ser cuantificada por un lector de placas de fluorescencia después del tratamiento dNase para digerir parcialmente los MET y liberarlos de las placas de cultivo. Esta metodología se ha utilizado ampliamente en trabajos anteriores con nT de neutrófilos1,2,23.
Las futuras aplicaciones de este protocolo se refieren a proporcionar oportunidades para una mayor caracterización de los MET utilizando inmunohistoquímica. Será posible sondear la composición proteica de los MET utilizando este enfoque con anticuerpos dirigidos (es decir, contra histonas citrulinasos o MPO) para obtener información adicional sobre las funciones de estas estructuras en muestras biológicas más complejas. Estos experimentos también serán importantes para arrojar más luz sobre la delineación de la liberación del MET después de otras formas de muerte celular, como la piroptosis15. Vale la pena señalar que en nuestra experiencia, los MET de los macrófagos no se adhieren a las placas tan fuertemente como los NET de los neutrófilos, lo que puede hacer que el análisis de inmunohistoquímica sea más difícil. Sin embargo, los datos de estos experimentos serán de interés, dado que los macrófagos a menudo desempeñan un papel dominante en las enfermedades inflamatorias crónicas. Una mayor caracterización de estas estructuras es fundamental para evaluar sus funciones in vivo, que hasta ahora sólo se ha realizado en una medida limitada16. Se cree que el método descrito utilizando HMDM para lograr este propósito puede ser más clínicamente relevante en comparación con otras fuentes de macrófagos derivados de líneas celulares inmortalizadas; sin embargo, estas líneas celulares pueden tener utilidad para proporcionar un modelo más estable para la caracterización del MET con menos potencial para la variación del donante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una Beca Perpetua IMPACT (IPAP201601422) y la Beca de Proyecto Biomédico de la Fundación Novo Nordisk (NNF17OC0028990). YZ también reconoce la recepción de un Premio de Posgrado Australiano de la Universidad de Sídney. Nos gustaría dar las gracias al Sr. Pat Pisansarakit y a la Sra. Morgan Jones por la asistencia en el aislamiento de monocitos y el cultivo de tejidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
