Summary
Apresentado aqui é um protocolo para detectar a produção de armadilha extracelular de macrófagos (MET) na cultura celular ao vivo usando microscopia e mancha de fluorescência. Este protocolo pode ser estendido para examinar marcadores específicos da proteína met por coloração de imunofluorescência.
Abstract
A liberação de armadilhas extracelulares (ETs) por neutrófilos tem sido identificada como um fator contribuinte para o desenvolvimento de doenças relacionadas à inflamação crônica. ETs neutrófilos (NETs) consistem em uma malha de DNA, proteínas histona e várias proteínas de grânulo (ou seja, mieloperoxidase, elastase e cateterasina G). Outras células imunes, incluindo macrófagos, também podem produzir ETs; no entanto, até que ponto isso ocorre in vivo e se as armadilhas extracelulares de macrófagos (METs) desempenham um papel nos mecanismos patológicos não foi examinada em detalhes. Para entender melhor o papel dos METs em patologias inflamatórias, um protocolo foi desenvolvido para visualizar a liberação met de macrófagos humanos primários in vitro, que também pode ser explorado em experimentos de imunofluorescência. Isso permite uma maior caracterização dessas estruturas e sua comparação com ETs liberados de neutrófilos. Macrófagos derivados de monócito santem (HMDM) produzem METs após a exposição a diferentes estímulos inflamatórios após a diferenciação do fenótipo pró-inflamatório M1. A liberação de METs pode ser visualizada por microscopia usando uma mancha de ácido nucleico fluorescente verde que é imperdestina às células vivas (por exemplo, verde SYTOX). O uso de macrófagos primários recém-isolados, como o HMDM, é vantajoso na modelagem de eventos inflamatórios in vivo que são relevantes para potenciais aplicações clínicas. Este protocolo também pode ser usado para estudar a liberação met de linhas celulares monócitos humanos (por exemplo, THP-1) após a diferenciação em macrófagos com acetato phorbol myristate ou outras linhas celulares de macrófagos (por exemplo, as células J774A.1 murine macrófagos).
Introduction
A liberação de ETs de neutrófilos foi identificada pela primeira vez como uma resposta imune inata desencadeada pela infecção bacteriana1. Eles consistem em uma espinha dorsal de DNA para que várias proteínas de grânulo com propriedades antibacterianas estão ligadas, incluindo elastase neutrófilo e mieloperoxidase2. O principal papel dos ETs neutrófilos (NETs) é capturar patógenos e facilitar a sua eliminação3. No entanto, além do papel protetor dos ETs na defesa imunológica, um número crescente de estudos também descobriu um papel na patogênese da doença, particularmente durante o desenvolvimento de doenças transmitidas por inflamação (ou seja, artrite reumatóide e aterosclerose4). A liberação de ETs pode ser desencadeada por várias citocinas pró-inflamatórias, incluindo interleucina 8 (IL-8) e fator de necrose tumoral alfa (TNFα)5,6, e o acúmulo localizado de ETs pode aumentar os danos nos tecidos e evocar um resposta pró-inflamatória7. Por exemplo, os ETs têm sido implicados como desempenhando um papel causal no desenvolvimento da aterosclerose8,promovendo a trombose9,e prevendo o risco cardiovascular10.
Agora é reconhecido que, além de neutrófilos, outras células imunes (ou seja, células de mastro, eosinófilos e macrófagos) também podem liberar ETs na exposição à estimulação microbiana ou pró-inflamatória11,12. Isso pode ser particularmente significativo no caso dos macrófagos, considerando seu papel fundamental no desenvolvimento, regulação e resolução de doenças inflamatórias crônicas. Portanto, é importante obter uma maior compreensão da relação potencial entre a liberação de ET de macrófagos e desenvolvimento de doenças relacionadas à inflamação. Estudos recentes têm mostrado a presença de METs e NETs em placas ateroscleróticas humanas intactas etrombo13organizado. Da mesma forma, mets têm sido implicados na condução de lesões renais através da regulação de respostas inflamatórias14. No entanto, em contraste com os neutrófilos, existem dados limitados sobre os mecanismos de formação met de macrófagos. Estudos recentes usando modelos in vitro humanos de formação MET mostram algumas diferenças nas vias envolvidas em cada tipo de célula (ou seja, em relação à ausência de citrulização histona com macrófagos)6. No entanto, alguns mostraram que a liberação net também pode ocorrer na ausência de histona ciitrullination15.
O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método simples e direto para avaliar a liberação do MET em um modelo de macrófago clinicamente relevante. Existem uma série de diferentes modelos de células de macrófagos in vitro que têm sido usados para estudar METs (ou seja, a linha de células monócito humana THP-1 e várias linhas de células demacrófagosmurine) 16 . Existem algumas limitações associadas a esses modelos. Por exemplo, a diferenciação de monócitos THP-1 para macrófagos geralmente requer um passo de preparação, como a adição de acetato phorbol myristate (PMA), que por si só ativa proteína kinase C (PKC) vias dependentes. Este processo é conhecido por desencadear a liberação de ET4 e resulta em uma liberação baixo basal MET de células THP-1. Outros estudos destacaram algumas diferenças na bioatividade e respostas inflamatórias montadas por macrófagos in vivo em comparação com as células THP-1 tratadas com PMA17.
Da mesma forma, o comportamento e as respostas inflamatórias de diferentes linhas celulares semelhantes a macrófagos de urina não representam completamente o espectro de resposta dos macrófagos humanos primários18. Portanto, com a finalidade de investigar a formação de ET de macrófagos no ambiente clínico, acredita-se que os macrófagos humanos primários derivados de monócito (HMDMs) sejam um modelo mais relevante do que linhas celulares monocíticas ou murina semelhantes a macrófagos.
A liberação de ET de HMDMs polarizados M1 foi demonstrada após a exposição dessas células a uma série de diferentes estímulos inflamatórios, incluindo o ácido ocorrecloloso oxidante derivado da mieloperoxidase (HOCl), PMA, TNFα e IL-86. Descrito aqui é um protocolo para polarizar HMDMs ao fenótipo M1 e visualizar a liberação met subseqüente após a exposição a esses estímulos inflamatórios. Pma é usado como um estímulo de liberação MET para facilitar comparações com estudos anteriores que usaram neutrófilos. Importante, HOCl, IL-8, e TNFα são usados igualmente para estimular a liberação MET, que são acreditadas para ser melhores modelos do ambiente inflamatório in vivo. O método microscópico para visualização da liberação de ET envolve a coloração do DNA extracelular em culturas de células vivas usando o verde SYTOX, uma mancha de ácido nucleico verde fluorescente impermeável que tem sido aplicada com sucesso em estudos anteriores de neutrófilos. Este método permite uma avaliação rápida e qualitativa da liberação de ET, mas não é apropriado como um método autônomo para a quantificação da extensão de liberação de ET. Metodologia alternativa deve ser usada se a quantificação for necessária para comparar a extensão da liberação de ET resultante de diferentes condições ou intervenções de tratamento.
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Protocol
O HMDM foi isolado das preparações humanas do revestimento do buffy fornecidas pelo banco de sangue com aprovação das éticas do distrito de saúde local de Sydney.
1. Hmdm Cultura
- Isolar os monócitos de preparações de casaco sinuoso preparado a partir do sangue periférico de doadores humanos saudáveis usando uma preparação comercialmente disponível para isolar linfócitos, seguido por elutriação centrífuga contracorrente19, 20.
- Confirme a presença de monócitos por citofidiae e coloração com mancha de Giemsa modificada para caracterização de monócito19.
- Em condições estéreis, ajuste a densidade de monócitos para 1 x 106 células/mL usando mídia RPMI-1640 sem soro. Adicione 1 mL desta suspensão celular para cada poço de uma placa de cultura de tecido 12 poço. Cultura em uma incubadora celular a 37 °C na presença de 5% de CO2 para 2 h para promover a adesão à placa de cultura de tecidos.
- Em condições estéreis, remova a mídia celular e substitua por mídia cultural RPMI-1640 completa contendo 10% (v/v) soro humano agrupado e 20 mM L-glutamina.
- Cultura as células a 37 °C na presença de 5% DE CO2 em uma incubadora de células por 8 dias, mudando a mídia a cada 2 dias.
2. Polarização de HMDM
- Em condições estéreis, prepare a mídia m1 priming adicionando interferon γ (IFNγ; 20 ng/mL) e lipopolissaccharide (LPS; 1 μg/mL) para a completa RPMI-1640 mídia cultural. Prepare a mídia m2 priming adicionando interleucina 4 (IL-4; 20 ng/mL) para a mídia completa da cultura RPMI-1640.
- condições estéreis, os meios de comunicação das placas de cultura de tecidos que contêm o HMDM, que foram semeados e cultivados como descrito na seção 1.
- Lave cuidadosamente os poços que contêm as células 3x com PBS estéril (pré-aquecido a 37 °C), usando 1 mL alíquotas de PBS.
- Adicione 1 mL da m1 ou m2 priming mídia para cada poço contendo o HMDM (o que for apropriado para o experimento).
- Incubar as células por 48 h a 37 °C na presença de 5% de CO2 em uma incubadora celular.
3. Estimulação de HMDM para induzir a liberação MET
- Em condições estéreis, prepare os meios de cultura contendo diferentes estimuladores de liberação MET (o que for apropriado para o experimento) para a mídia Completa RPMI-1640: PMA (25 nM), tnfα recombinante humano (25 ng/mL), ou recombinante humano IL-8 (50 ng/mL ).
- Para experimentos com estimulação hocl, prepare HOCl (200 μM) em HBSS (pré-aquecido a 37 °C), imediatamente antes da adição às células. Certifique-se de que o HOCl não esteja preparado em completa mídia celular.
Nota: A concentração da solução de estoque de HOCl é quantificada medindo a absorção UV da solução em 292 nm e pH = 116 e usando um coeficiente de extinção de 350 M-1cm-121. - Após o tratamento de polarização descrito na seção 2, aspirar a mídia celular de cada poço e lavar cuidadosamente as células 3x com 1 mL alíquotas de qualquer um: PBS estéril (para PMA, TNFα e IL-8) ou HBSS (para HOCl), que foram pré-aquecidos a 37 °C.
- Para experimentos com PMA, TNFα ou IL-8: adicione 1 mL da mídia completa contendo PMA, TNFα ou IL-8 após a remoção do PBS na etapa final de lavagem.
- Para experimentos com TNFα, incubar as células para 6 h a 37 °C na presença de 5% CO2 em uma incubadora celular. Para experimentos com PMA e IL-8, incubar as células por 24 h a 37 °C na presença de 5% de CO2 em uma incubadora celular.
-
Para experimentos com HOCl, adicione 1 mL de HOCl em HBSS após a remoção do HBSS na etapa final de lavagem. Em seguida, incubar as células por 15 min a 37 °C na presença de 5% de CO2 em uma incubadora celular.
- Cuidadosamente aspirar o supernatant célula e lavar as células 3x com 1 mL alíquotas de HBSS como descrito no passo 3.3.
- Após a remoção do HBSS da etapa final da lavagem, adicione 1 mL de meios completos da cultura RPMI-1640. Em seguida, incubar as células por 24 h a 37 °C na presença de 5% de CO2 em uma incubadora celular.
4. Visualização do MET na Cultura de Células Ao Vivo
- Prepare o tinmodo verde SYTOX em HBSS a uma concentração de 40 μM.
- No final dos tratamentos descritos na seção 3 para induzir a liberação do MET, adicionar diretamente 25 μL de 40 μM do tinuino a cada poço contendo HMDM.
- Incubate células à temperatura ambiente (RT) para 5 min no escuro.
- Coloque o HMDM em poços de cultura de tecidos no estágio do microscópio de um microscópio fluorescente invertido para imagens.
-
Procedimentos de microscópio
- Ligue uma fonte de luz fluorescente de amplo espectro, fonte de luz de campo brilhante e microscópio invertido instalado com uma câmera digital colorida de alta resolução (veja Tabela de Materiais).
- Gire a roda de filtro para a posição "número 2" para fluorescência verde (excitação = 504 nm, emissão = 523 nm) para imagens das amostras manchadas de verde contidas nos poços de cultura de tecido.
- Usando o objetivo 5x, concentre a imagem com o foco grosseiro, em seguida, os botões de foco fino no microscópio, até que a imagem pareça nítida, clara e focada quando vista através da ocular do microscópio.
- Mude o microscópio para o modo da câmera.
- Iniciar o software associado.
- Selecione a guia Capture no software.
- Clique no botão Play para visualizar a imagem e ajustar o botão de foco fino no microscópio até que a imagem pareça nítida, clara e focada na janela de visualização do software.
- Clique no botão captura.
Nota: A imagem capturada será exibida automaticamente no software que o acompanha. - Dentro do software, clique em Arquivo | Economize como o tipo de arquivo de imagem necessário.
- No microscópio, gire a roda de filtro para a posição "número 5" para imagens de campo brilhante e repita os passos 4,5,2-4,5,9 para obter a imagem de campo brilhante correspondente.
- Repita os passos 4.5.2-4.5.10 como necessário para a aquisição de imagem subseqüente.
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Representative Results
Imagens de Brightfield mostrando as mudanças morfológicas do HMDM em resposta a estímulos para diferenciação celular são mostradas na Figura 1. M1 polarizado macrófagos de experimentos com HMDM expostos a IFNγ e LPS mostrou uma forma de célula alongada e fuso- como, como indicado pelas setas pretas na Figura 1 (painel médio). Para comparação, a morfologia dos macrófagos polarizados M2 após a exposição de HMDM a IL-4 para 48 h era tipicamente redonda e lisa, como indicado pelas setas pretas na figura 1 (painel direito distante).
A capacidade de fenótipos de HMDM diferenciados para liberar METs foi visualizada por imagens de fluorescência de células vivas com verde SYTOX, conforme apresentado na Figura 2. A Figura 2A mostra os dados de controle obtidos de cada fenótipo hmdm incubado por 24 h na ausência de quaisquer estímulos pró-inflamatórios. Neste caso, havia uma coloração verde muito limitada, como era esperado, dado a natureza impermeant da pilha desta mancha. A figura 2B mostrou a coloração positiva para METs, resultando da exposição de HMDMs M1 a HOCl, a PMA, a IL-8, ou a TNFα. Os METs são indicados pelas setas brancas, mostradas como estrias verdes, resultantes das cadeias de DNA extracelular. Com HOCl, além de manchar o DNA extracelular, havia alguma coloração verde aparente nas células. Esta coloração celular também foi observada em certa medida com os outros estímulos e acredita-se refletir a perda de integridade da membrana resultante da morte celular independente do ET como resultado das condições de tratamento.
A Figura 2B também mostra os experimentos correspondentes realizados com HMDMs M2, que foram expostos ao IL-4. Neste caso, não houve liberação de DNA das células, como indicado pela ausência das cadeias/estrias de DNA extracelular; no entanto, houve alguma captação celular de corante fluorescente verde com o HOCl e TNFα. Para fins comparativos, a Figura 3 mostra dados representativos indicando a liberação do MET dos macrófagos THP-1 expostos ao TNFα (50 ng/mL) por 4 h. Neste caso, note-se que uma população não polarizada de células foi utilizada, e os monócitos THP-1 foram diferenciados aos macrófagos por pré-tratamento com PMA (50 ng/mL por 72 h), conforme descrito anteriormente22.
Figura 1: Mudanças morfológicas de HMDMs diferencialpolarizados. Imagens representativas de campos brilhantes de HMDMs não diferenciados e diferenciados (n ≥5). Os HMDMs foram cultivados com meios completos contendo soro humano e glutamina por 8 dias antes de se prepararem para o fenótipo M1 ou M2 após a exposição a IFNγ e LPS ou IL-4, respectivamente, para 48 h. Barra de escala = 200 μm. As setas indicam exemplos de células que mostram características morfológicas de HmDMs M1 ou M2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: METs produzidos por M1 HMDMs após a estimulação HOCl, PMA, IL-8 e TNFα. Imagens representativas de HMDMs manchados de verde SYTOX de(A)M1 e M2 HMDMs não estimulados incubados por 24 h na ausência de quaisquer estímulos inflamatórios foram usados como controle, demonstrando a ausência de liberação do MET. (B) M1 e M2 HMDMs foram tratados com 1) HOCl (200 μM, 15 min), PMA (25 nM), ou IL-8 (50 ng/mL) com incubação para 24 h ou 2) TNFα (25 ng/mL) com incubação para 6 h para induzir a liberação met. Os METs foram visualizados pela adição de sytox verde, como indicado por setas brancas no painel superior de M1 HMDMs. Nenhum METS foi visto nos experimentos correspondentes com HMDMs M2. Os dados são representativos de replicar poços culturais de n ≥3 doadores individuais. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: METs produzidos por macrófagos THP-1 não polarizados após a estimulação tnfα. Imagens representativas dos macrófagos TNP-1 manchados de verde sYTOX, que foram diferenciados por pré-tratamento com PMA (50 ng/mL por 72 h) antes de mais incubação de 4 h na ausência ou presença de TNFα (50 ng/mL) para induzir a liberação do MET. Os METs foram visualizados pela adição de sytox verde. Os dados são representativos dos poços de cultura de replicar de experimentos n ≥ 3. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
A geração e visualização da formação MET utilizando HmDMs diferenciados de M1 representa um novo modelo in vitro que pode ser útil para investigar o potencial papel patológico dessas estruturas de macrófagos, particularmente inflamatória crônica Condições. Ele fornece um protocolo robusto para a estimulação de macrófagos humanos primários para liberar METs, que também podem ser utilizados em estudos relacionados com monocyte humano ou linhas de células macrófagos de urina. A implementação bem-sucedida deste protocolo para a estimulação da formação met por HMDM depende de uma cultura cuidadosa celular e manuseio para manter a boa viabilidade celular. Isso aumentará a extensão e a qualidade dos METs observados. Para fornecer uma melhor nutrição celular, a mídia RPMI usada para manter o HMDM deve conter soro humano, em vez de soro bovino fetal, bem como l-glutamina. Cada solução de ações dessa mídia RPMI completa deve ser usada dentro de 1 semana. O armazenamento correto dos meios é igualmente importante. Os meios de comunicação devem ser armazenados a 4 °C na ausência de luz.
Além disso, é importante observar e monitorar regularmente a forma e a morfologia das células por microscopia durante o cultivo de HMDM. Quaisquer alterações anormais ou inesperadas na forma celular observadas antes da adição de IFNγ e LPS ou IL-4 (para polarizar os macrófagos) podem indicar uma redução na taxa de sobrevivência celular. Hmdm deve ser adepto e não proliferar. É importante, portanto, monitorar as células para quaisquer alterações na morfologia, densidade celular ou perda de adesão durante o período normal de cultura de 8 dias. Uma diminuição dramática na densidade celular durante os primeiros 2 dias após o isolamento sugere que os HMDMs resultantes podem não ser suficientemente viáveis para experimentos subsequentes. Uma limitação do uso de células humanas primárias é a variação entre os doadores, o que pode influenciar significativamente a extensão da liberação do MET. Além disso, a qualidade dos preparativos de casaco buffy recebidos para o isolamento de monócitos pode variar. É importante repetir experimentos com pelo menos três doadores de células individuais para garantir que os dados sejam representativos de populações maiores de células.
É importante notar que o protocolo descrito para a diferenciação hmdm foi otimizado para células isoladas de preparações de casaco sinuoso humano por elutriação contracorrente, o que resulta em uma preparação de alta pureza monocyte. A validação dos tratamentos de polarização (para confirmar o fenótipo) por citometria de fluxo e avaliação da expressão do marcador M1 CD86 e m2 marcador CD206 foram realizadas anteriormente usando esta preparação de HMDM6. É apreciado que este método de isolamento pode não ser amplamente acessível, e que os métodos alternativos de isolamento (ou seja, a classificação de contas magnéticas) podem ser preferíveis. Se uma fonte alternativa de monócitos ou protocolos de isolamento diferentes for usada, experimentos adicionais de citometria de fluxo para validar a alteração do fenótipo são recomendados, e alguma otimização das condições de tratamento para estimular a liberação do MET pode ser necessária.
Para imagens ideais de fluorescência, o tempo de exposição deve ser cuidadosamente ajustado e mantido o mais curto possível para evitar a fluorescência de fundo e artefatos de coloração das placas de cultura de plástico, que têm revestimentos adeptos. É importante tirar várias imagens de cada célula bem contendo. É vantajoso se as amostras são cegadas antes da análise da microscopia da fluorescência. Além de manchar cadeias extracelulares de DNA, há também evidências para a captação celular de verde SYTOX. Isto é acreditado para refletir uma perda na integridade da membrana, que pode ser por causa da liberação met, e também pode revelar caminhos alternativos de morte celular (veja também abaixo). Isso destaca a importância de realizar experimentos adicionais para quantificar e caracterizar ainda mais a liberação do MET.
Para uma comparação quantitativa da extensão da liberação do MET em diferentes condições de tratamento ou após diferentes intervenções para modular a liberação do MET, é necessária uma análise mais aprofundada. Isso pode ser alcançado através da realização de análise qPCR de DNA nuclear e mitocondrial presente nos supernatants celulares, como descrito anteriormente6. Este método é geralmente combinado com ensaios de liberação de dehidrogenase lactato para controlar a lise celular não relacionada à liberação MET6. A coloração verde SYTOX também pode ser quantificada por um leitor de placas de fluorescência após o tratamento de DNase para digerir parcialmente os METs e liberá-los de placas de cultura. Esta metodologia tem sido amplamente utilizada em trabalhos anteriores com NETs neutantes1,2,23.
As futuras aplicações deste protocolo referem-se a proporcionar oportunidades para uma maior caracterização dos METs utilizando imunohistoquímica. Será possível sondar a composição proteica de METs usando essa abordagem com anticorpos direcionados (ou seja, contra histonas citrullinadas ou MPO) para obter uma visão adicional sobre os papéis dessas estruturas em amostras biológicas mais complexas. Esses experimentos também serão importantes para lançar mais luz sobre a delimitação da liberação do MET após outras formas de morte celular, como a piroptose15. Vale a pena notar que, em nossa experiência, mets de macrófagos não aderem às placas tão fortemente como NETs de neutrófilos, o que pode tornar a análise imunohistoquímica mais desafiadora. No entanto, os dados desses experimentos serão de interesse, dado o fato de que os macrófagos muitas vezes desempenham um papel dominante em doenças inflamatórias crônicas. Uma caracterização mais adicional destas estruturas é crítica avaliar seus papéis in vivo, que tem sido executado até agora somente a uma extensão limitada16. Acredita-se que o método descrito usando HMDM para atingir esse objetivo pode ser mais relevante clinicamente em comparação com outras fontes de macrófagos imortalizadas da linha de células derivadas; embora, essas linhas celulares podem ter utilidade em fornecer um modelo mais estável para a caracterização MET com menos potencial para variação de doadores.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) e novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ também reconhece o recebimento de um Prêmio de Pós-Graduação Australiana da Universidade de Sydney. Gostaríamos de agradecer ao Sr. Pat Pisansarakit e à Sra. Morgan Jones pela ajuda com o isolamento monócito e a cultura dos tecidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
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