Summary
Hier is een protocol voor het opsporen van macrofaag extracellulaire trap (met) productie in levende celcultuur met behulp van microscopie en fluorescentie kleuring. Dit protocol kan verder worden uitgebreid om specifieke MET eiwit markers te onderzoeken door immunofluorescentie kleuring.
Abstract
De afgifte van extracellulaire vallen (ETs) door neutrofielen is geïdentificeerd als een factor die bijdraagt aan de ontwikkeling van ziekten die verband houden met chronische ontstekingen. Neutrofiele ETS (netten) bestaan uit een Maas van DNA, Histon-eiwitten en diverse korrel proteïnen (d.w.z. myeloperoxidase, elastase en door G). Andere immuuncellen, waaronder macrofagen, kunnen ook ETs produceren; in hoeverre dit in vivo gebeurt en of macrofaag extracellulaire vallen (METs) een rol spelen bij pathologische mechanismen, is niet in detail onderzocht. Om de rol van METs in inflammatoire pathologieën beter te begrijpen, werd een protocol ontwikkeld voor het visualiseren van de introductie van primaire menselijke macrofagen in vitro, die ook kunnen worden misbruikt bij immunofluorescentie experimenten. Dit maakt verdere karakterisering van deze structuren en hun vergelijking met ETs vrijgegeven uit neutrofielen. Humane monocyte-afgeleide macrofagen (HMDM) produceren METs bij blootstelling aan verschillende ontstekings stimuli na differentiatie aan het M1 pro-inflammatoire fenotype. De vrijgave van de METs kan worden gevisualiseerd door microscopie met behulp van een groen fluorescerende nucleïnezuur vlek die ongevoelig is voor levende cellen (bijv. SYTOX groen). Het gebruik van vers geïsoleerde primaire macrofagen, zoals HMDM, is voordelig bij het modelleren in vivo ontstekings gebeurtenissen die relevant zijn voor potentiële klinische toepassingen. Dit protocol kan ook worden gebruikt om te studeren met vrijlating van humane monocyt cellijnen (bv, thp-1) na differentiatie in macrofagen met forbol myristaat acetaat of andere macrofaag cellijnen (bijv. de Murine macrofaag-achtige J774A. 1 cellen).
Introduction
De afgifte van ETs uit neutrofielen werd voor het eerst geïdentificeerd als een aangeboren immuunrespons veroorzaakt door bacteriële infectie1. Ze bestaan uit een DNA-ruggengraat waaraan verschillende korrel eiwitten met antibacteriële eigenschappen gebonden zijn, waaronder neutrofiele elastase en myeloperoxidase2. De primaire rol van neutrofiele ETs (netten) is het opvangen van pathogenen en het vergemakkelijken van hun eliminatie3. Echter, naast de beschermende rol van ETs in immuun verdediging, een toenemend aantal studies hebben ook een rol in de ziekte-pathogenese ontdekt, vooral tijdens de ontwikkeling van ontsteking-gedreven ziekten (dat wil zeggen, reumatoïde artritis en atherosclerose4). De afgifte van ETS kan worden geactiveerd door verschillende pro-inflammatoire cytokines, met inbegrip van Interleukine 8 (Il-8) en tumor necrose factor alpha (tnfα)5,6, en de gelokaliseerde accumulatie van ETS kan weefselschade te verhogen en roepen een pro-inflammatoire respons7. Bijvoorbeeld, ETs zijn betrokken als het spelen van een causale rol in de ontwikkeling van atherosclerose8, bevordering van trombose9, en het voorspellen van cardiovasculaire risico10.
Het wordt nu erkend dat naast neutrofielen ook andere immuuncellen (d.w.z. mestcellen, eosinofielen en macrofagen) ETS kunnen vrijgeven voor blootstelling aan de microbiële of pro-inflammatoire stimulatie11,12. Dit kan bijzonder belangrijk zijn in het geval van macrofagen, gezien hun cruciale rol in de ontwikkeling, regulering en oplossing van chronische ontstekingsziekten. Daarom is het belangrijk om een beter begrip te krijgen van de potentiële relatie tussen ET-vrijlating van macrofagen en ontsteking-gerelateerde ziekte ontwikkeling. Recente studies hebben aangetoond dat de aanwezigheid van Mets en netten in intact menselijke atherosclerotische plaques en georganiseerde trombi13. Evenzo zijn METs betrokken bij het besturen van nierschade door de regulering van ontstekingsreacties14. Echter, in tegenstelling tot neutrofielen, er zijn beperkte gegevens over de mechanismen van MET vorming van macrofagen. Recente studies met behulp van humane in vitro modellen van MET formatie vertonen enkele verschillen in de trajecten die betrokken zijn bij elk celtype (d.w.z. met betrekking tot de afwezigheid van Histon-Citrullinatie met macrofagen)6. Echter, sommige hebben aangetoond dat netto vrijlating kan ook optreden in de afwezigheid van Histon-Citrullinatie15.
Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige en directe methode te bieden om MET vrijgave te beoordelen in een klinisch relevant macrofaag model. Er zijn een aantal verschillende in vitro macrofaag celmodellen die zijn gebruikt om Mets te bestuderen (d.w.z. de thp-1 humane monocyt cellijn en verschillende muriene macrofaag cellijnen)16. Er zijn enkele beperkingen in verband met deze modellen. Bijvoorbeeld, de differentiatie van thp-1 monocyten aan macrofagen meestal vereist een priming stap, zoals de toevoeging van forbol myristaat acetaat (PMA), die zelf activeert proteïne kinase C (PKC)-afhankelijke trajecten. Dit proces is bekend om te activeren ET release4 en resulteert in een lage basale met release van thp-1 cellen. Andere studies hebben gewezen op enkele verschillen in bioactiviteit en ontstekingsreacties die in vivo door macrofagen zijn aangebracht in vergelijking met PMA-behandelde THP-1-cellen17.
Evenzo, het gedrag en inflammatoire reacties van verschillende muriene macrophage-achtige cellijnen niet volledig vertegenwoordigen de respons spectrum van primaire menselijke macrofagen18. Daarom worden met het oog op het onderzoeken van macrofaag et-vorming in de klinische setting, primaire humane monocyte-afgeleide macrofagen (hmdm's) verondersteld een relevanter model te zijn in plaats van monocytische of muriene macrofaag-achtige cellijnen.
ET vrijlating van M1 gepolariseerde HMDMs is aangetoond na blootstelling van deze cellen aan een aantal verschillende ontstekings stimuli, waaronder het myeloperoxidase-afgeleide oxidant hypochloreuze zuur (HOCl), PMA, TNFα en IL-86. Hier beschreven is een protocol voor het polariseren van HMDMs op de M1 fenotype en visualiseer de daaropvolgende ONTMOETTE release bij blootstelling aan deze ontstekings stimuli. PMA wordt gebruikt als een stimulans van de release om vergelijkingen te maken met eerdere onderzoeken die neutrofielen hebben gebruikt. Belangrijker, HOCl, IL-8, en TNFα worden ook gebruikt om te stimuleren MET release, die worden verondersteld te zijn betere modellen van de ontstekings omgeving in vivo. De microscopische methode voor visualisatie van ET-release impliceert het extracellulair DNA in levende celculturen met behulp van SYTOX Green, een ondoorlatende fluorescerende groene nucleïnezuur vlek die met succes is toegepast in eerdere neutrofiele onderzoeken. Deze methode maakt een snelle en kwalitatieve beoordeling van de ET-release mogelijk, maar is niet geschikt als een stand-alone methode voor de kwantificering van ET-vrijgave omvang. Er moet een alternatieve methode worden gebruikt als kwantificering nodig is om de mate van ET-afgifte te vergelijken die voortvloeit uit verschillende behandelings condities of interventies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De HMDM waren geïsoleerd van menselijke Buffy vacht preparaten geleverd door de bloedbank met ethische goedkeuring van de Sydney Local Health district.
1. HMDM-cultuur
- Isoleer de monocyten van Buffy coat preparaten bereid uit het perifere bloed van gezonde menselijke donoren met behulp van een in de handel verkrijgbare bereiding om lymfocyten te isoleren, gevolgd door tegenstroom centrifugale elutriation19, 20.
- Bevestig de aanwezigheid van monocyten door cytospinning en kleuring met gemodificeerde Giemsa vlek voor monocyt karakterisatie19.
- Pas onder steriele omstandigheden de dichtheid van monocyten aan 1 x 106 cellen/ml met behulp van rpmi-1640 media zonder serum. Voeg 1 mL van deze celsuspensie toe aan elk goed van een 12-goed-weefselkweek plaat. Cultuur in een cel incubator bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 voor 2 uur ter bevordering van de hechting op de weefselkweek plaat.
- Verwijder onder steriele omstandigheden de celmedia en vervang deze door complete RPMI-1640 kweekmedia met 10% (v/v) gepoolde menselijke serum en 20 mM L-glutamine.
- Kweek de cellen bij 37 °C in de aanwezigheid van 5% CO2 in een celincubator gedurende 8 dagen, waarbij de media elke 2 dagen worden gewijzigd.
2. polarisatie van HMDM
- Bereid onder steriele omstandigheden de M1-priming media voor door toevoeging van interferon γ (IFNγ; 20 ng/mL) en lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL) aan de volledige RPMI-1640-kweekmedia. Bereid de m2 priming media door interleukine 4 (IL-4; 20 ng/mL) toe te voegen aan de complete RPMI-1640 kweekmedia.
- Onder steriele omstandigheden, aspiraat media uit de weefselcultuur plaat putten die de hmdm bevatten, die zijn geseerd en gekweekt zoals beschreven in punt 1.
- Was zorgvuldig de putten met de cellen 3x met steriele PBS (voorverwarmd tot 37 °C), met 1 mL aliquots van PBS.
- Voeg 1 mL van de primingmedia M1 of m2 toe aan elk goed dat de HMDM bevat (afhankelijk van wat voor het experiment het geval is).
- Incuberen de cellen voor 48 uur bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 in een celincubator.
3. stimulatie van HMDM voor het opwekken van MET release
- Bereid onder steriele omstandigheden de kweekmedia met verschillende stimulatoren van MET afgifte (afhankelijk van wat het experiment geschikt is) uit voor de volledige RPMI-1640-media: PMA (25 nM), humaan recombinant TNFα (25 ng/mL) of humane recombinant IL-8 (50 ng/mL ).
- Voor experimenten met HOCl-stimulatie, bereid HOCl (200 μM) in HBSS (voorverwarmd tot 37 °C), onmiddellijk voor de toevoeging aan de cellen. Zorg ervoor dat de HOCl niet in volledige celmedia is voorbereid.
Opmerking: De concentratie van de stamoplossing van HOCl wordt gekwantificeerd door meting van de UV-extinctie van de oplossing bij 292 nm en pH = 116 en met een extinctiecoëfficiënt van 350 M-1cm-121. - Na de polarisatie behandeling beschreven in rubriek 2, aspireren de celmedia van elk goed en was zorgvuldig de cellen 3x met 1 mL aliquots van ofwel: steriel PBS (voor PMA, TNFα en IL-8) of HBSS (voor HOCl), die vooraf zijn opgewarmd tot 37 °C.
- Voor experimenten met PMA, TNFα of IL-8: Voeg 1 mL van de volledige media met PMA, TNFα of IL-8 toe na het verwijderen van de PBS in de laatste wasstap.
- Voor experimenten met TNFα, incuberen de cellen gedurende 6 uur bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 in een celincubator. Voor experimenten met PMA en IL-8, incuberen de cellen 24 uur bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 in een celincubator.
-
Voor experimenten met HOCl, voeg 1 mL HOCl in HBSS toe na het verwijderen van de HBSS in de laatste wasstap. Vervolgens incuberen de cellen 15 min bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 in een cel incubator.
- Aspiraat de cel supernatant zorgvuldig en was de cellen 3x met 1 ml aliquots van HBSS zoals beschreven in stap 3,3.
- Na het verwijderen van de HBSS van de laatste Wash stap, voeg 1 mL complete RPMI-1640 kweekmedia toe. Vervolgens incuberen de cellen 24 uur bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 in een cel incubator.
4. visualisatie van MET in levende celcultuur
- Bereid SYTOX groene kleurstof in HBSS met een concentratie van 40 μM.
- Aan het einde van de behandelingen beschreven in rubriek 3 voor het induceren van MET afgifte, voeg direct 25 μL van 40 μM van de kleurstof toe aan elke put met HMDM.
- Inincuberen cellen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min in het donker.
- Plaats de HMDM in weefselkweek putten op de Microscoop fase van een omgekeerde fluorescerende Microscoop voorbeeld vorming.
-
Microscoop procedures
- Schakel een breedspectrum fluorescerende lichtbron, brightfield-lichtbron en omgekeerde Microscoop in, geïnstalleerd met een digitale camera met hoge resolutie (Zie tabel met materialen).
- Draai het filter wiel naar de "nummer 2"-positie voor groene fluorescentie (excitatie = 504 nm, emissie = 523 nm) voor de beeldvorming van de groen gebeitste monsters die zich in de weefselkweek putten bevinden.
- Met behulp van de 5x doelstelling, focus het beeld met de grove focus, dan de fijne focus knoppen op de Microscoop, totdat het beeld lijkt scherp, helder, en gefocust wanneer bekeken door de Microscoop oculair.
- Zet de Microscoop in de cameramodus.
- Start de bijbehorende software.
- Selecteer het tabblad vastleggen op de software.
- Klik op de knop afspelen om een voorvertoning van de afbeelding te bekijken en pas de fijne focus knop op de Microscoop aan totdat het beeld scherp, helder en gefocust is in het voorbeeldvenster van de software.
- Klik op de knop vastleggen .
Opmerking: De vastgelegde afbeelding wordt automatisch weergegeven in de bijbehorende software. - Klik in de software op bestand | Opslaan als het vereiste afbeeldingsbestandstype.
- Draai op de Microscoop het filter wiel naar de positie "nummer 5" voor brightfield Imaging en herhaal stap 4.5.2 – 4.5.9 om de corresponderende brightfield-afbeelding te verkrijgen.
- Herhaal de stappen 4.5.2 – 4.5.10 indien nodig voor latere beeld verwerving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brightfield-afbeeldingen met de morfologische veranderingen van HMDM in reactie op stimuli voor celdifferentiatie worden weergegeven in Figuur 1. M1 gepolariseerde macrofagen uit experimenten met HMDM blootgesteld aan IFNγ en LPS vertoonden een langwerpige en spil achtige celvorm, zoals aangegeven door de zwarte pijlen in Figuur 1 (middelste paneel). Ter vergelijking, de morfologie van de m2 gepolariseerde macrofagen na blootstelling van HMDM aan IL-4 voor 48 h waren meestal rond en plat, zoals aangegeven door de zwarte pijlen in Figuur 1 (uiterste rechter paneel).
Het vermogen van gedifferentieerde HMDM-fenotypes om METs vrij te geven werd gevisualiseerd door Live-celfluorescentie beelden met SYTOX Green, zoals weergegeven in Figuur 2. Figuur 2a toont de controlegegevens die zijn verkregen van elk hmdm-fenotype dat gedurende 24 uur wordt geïnineerd bij afwezigheid van pro-inflammatoire stimuli. In dit geval was er zeer beperkte groene kleuring, zoals werd verwacht, gezien de cel imperbetekende aard van deze vlek. Figuur 2b toonde positieve kleuring voor Mets, als gevolg van de blootstelling van M1 HMDMs aan HOCL, PMA, Il-8 of TNFα. De METs worden aangegeven door de witte pijlen, weergegeven als groene strepen, als gevolg van de strengen van extracellulair DNA. Met HOCl, naast het kleurende extracellulaire DNA, was er enkele groene kleuring zichtbaar in de cellen. Deze cellulaire kleuring werd ook waargenomen tot op zekere hoogte met de andere stimuli en wordt verondersteld te reflecteren verlies van membraan integriteit als gevolg van ET-onafhankelijke celdood als gevolg van de behandelings condities.
Figuur 2b toont ook de corresponderende experimenten uitgevoerd met m2 HMDMs, die werden blootgesteld aan Il-4. In dit geval was er geen afgifte van DNA uit de cellen, zoals aangegeven door de afwezigheid van de strengen/strepen van extracellulair DNA; Hoewel, er was een cellulaire opname van groene fluorescerende kleurstof met de HOCl en TNFα. Voor vergelijkende doeleinden toont Figuur 3 representatieve gegevens die voldoen aan de release van thp-1 macrofagen die is blootgesteld aan TNFα (50 ng/ml) gedurende 4 uur. In dit geval moet worden opgemerkt dat een niet-gepolariseerde populatie van cellen werd gebruikt, en de THP-1-monocyten werden gedifferentieerd naar macrofagen door voor behandeling met PMA (50 ng/mL voor 72 h) zoals eerder beschreven22.
Figuur 1: morfologische veranderingen van differentiaal gepolariseerde Hmdm's. Representatieve brightfield-beelden van niet-gedifferentieerde en gedifferentieerde Hmdm's (n ≥ 5). Hmdm's werden gekweekt met volledige media met humaan serum en glutamine gedurende 8 dagen vóór de priming aan de M1 of m2 fenotype bij blootstelling aan IFNγ en LPS of IL-4, respectievelijk, voor 48 h. schaalbalk = 200 μm. Pijlen duiden op voorbeelden van cellen met morfologische kenmerken van M1 of m2 HMDMs. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Mets geproduceerd door M1 HMDMs na HOCl-, PMA-, Il-8-en TNFα-stimulatie. Representatieve beelden van SYTOX groen gekleurd HMDMs van (a) niet-gestimuleerde M1 en m2 hmdms geïnineerd voor 24 h bij afwezigheid van ontstekings stimuli werden gebruikt als de controle, waaruit blijkt dat de afwezigheid van met release. (B) M1 en m2 HMDMs werden behandeld met 1) hocl (200 μM, 15 min), PMA (25 nm) of Il-8 (50 ng/ml) met incubatie gedurende 24 h of 2) TNFα (25 ng/ml) met incubatie gedurende 6 uur voor het opwekken van een ontmoette release. METs werden gevisualiseerd door de toevoeging van SYTOX Green, zoals aangegeven door witte pijlen in het bovenste paneel van M1 HMDMs. Geen METS werden gezien in de bijbehorende experimenten met m2 HMDMs. gegevens zijn representatief voor replicaatcultuurbronnen van n ≥ 3 individuele donoren. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Mets geproduceerd door niet-gepolariseerde THP-1 macrofagen na TNFα-stimulatie. Representatieve beelden van SYTOX groen-gekleurd TNP-1 macrofagen, die werden gedifferentieerd door voor behandeling met PMA (50 ng/mL voor 72 h) vóór verdere incubatie gedurende 4 h bij afwezigheid of aanwezigheid van TNFα (50 ng/mL) voor het opwekken van MET vrijlating. METs werden gevisualiseerd door toevoeging van SYTOX Green. Gegevens zijn representatief voor replicaatkweek putten uit n ≥ 3 experimenten. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De generatie en visualisatie van met vorming met M1 gedifferentieerde Hmdm's vertegenwoordigt een nieuw in vitro model dat nuttig kan zijn voor het onderzoeken van de potentiële pathologische rol van deze macrofaag structuren, met name onder chronische inflammatoire Voorwaarden. Het biedt een robuust protocol voor het stimuleren van primaire menselijke macrofagen om METs vrij te geven, die ook kunnen worden gebruikt in gerelateerde studies met humane monocyt of muriene macrofaag cellijnen. De succesvolle implementatie van dit protocol voor het stimuleren van MET vorming door HMDM is afhankelijk van zorgvuldige celcultuur en behandeling om een goede levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Dit zal de mate en kwaliteit van de waargenomen METs verhogen. Om betere Celvoeding te bieden, moeten de RPMI-media die worden gebruikt om de HMDM te handhaven, humaan serum bevatten, in plaats van foetaal runderserum en L-glutamine. Elke voorraadoplossing van deze volledige RPMI-media moet binnen 1 week worden gebruikt. De juiste opslag van de media is ook belangrijk. De media moeten bij afwezigheid van licht bij 4 °C worden bewaard.
Daarnaast is het belangrijk om regelmatig de vorm en morfologie van de cellen te observeren en te bewaken door microscopie tijdens het kweken van HMDM. Abnormale of onverwachte veranderingen in de celvorm die vóór de toevoeging van IFNγ en LPS of IL-4 zijn waargenomen (om de macrofagen te polariseren) kunnen duiden op een verlaging van de overlevings snelheid van de cel. HMDM moet worden aanhandig en niet vermenigvuldigen. Het is daarom belangrijk om de cellen te controleren op veranderingen in de morfologie, celdichtheid of verlies van hechting tijdens de normale cultuur periode van 8 dagen. Een dramatische afname van de celdichtheid tijdens de eerste 2 dagen na isolatie suggereert dat de resulterende Hmdm's mogelijk niet voldoende levensvatbaar zijn voor latere experimenten. Een beperking van het gebruik van primaire menselijke cellen is de variatie tussen donoren, die de omvang van de versie van MET release aanzienlijk kan beïnvloeden. Bovendien kan de kwaliteit van de Buffy vacht preparaten ontvangen voor de isolatie van monocyten variëren. Het is belangrijk om experimenten te herhalen met ten minste drie individuele celdonoren om ervoor te zorgen dat gegevens representatief zijn voor grotere populaties cellen.
Het is belangrijk op te merken dat het protocol beschreven voor HMDM differentiatie is geoptimaliseerd voor cellen geïsoleerd van menselijke Buffy vacht preparaten door tegenstroom elutriation, wat resulteert in een hoge zuiverheid monocyt voorbereiding. Validatie van de polarisatie behandelingen (om fenotype te bevestigen) door Flowcytometrie en beoordeling van de expressie van M1 marker CD86 en m2 marker CD206 zijn eerder uitgevoerd met behulp van deze voorbereiding van HMDM6. Het is duidelijk dat deze isolatiemethode niet breed toegankelijk kan zijn en dat alternatieve isolatie methoden (d.w.z. magnetische kraal sortering) de voorkeur kunnen hebben. Als er een alternatieve bron van monocyten of verschillende isolatie protocollen wordt gebruikt, worden extra Flowcytometrie-experimenten aanbevolen om fenotype verandering te valideren, en sommige optimalisatie van de behandelings condities om MET release te stimuleren, kunnen nodig zijn.
Voor optimale fluorescentie beelden dient de blootstellingstijd zorgvuldig te worden aangepast en zo kort mogelijk te worden gehouden om achtergrond fluorescentie en kleurings artefacten van de kunststof kweek platen te vermijden, die een aanhandig coating hebben. Het is belangrijk om meerdere afbeeldingen van elk goed met cellen te nemen. Het is voordelig als de monsters worden verblind vóór de fluorescentiemicroscopie analyse. Naast het kleurende extracellulaire strengen van DNA, er is ook bewijs voor de cellulaire opname van SYTOX groen. Dit wordt verondersteld te reflecteren een verlies in membraan integriteit, die kan worden veroorzaakt door de release, en het kan ook onthullen alternatieve trajecten van celdood (Zie ook hieronder). Dit benadrukt het belang van het uitvoeren van extra experimenten om te kwantificeren en verder karakteriseren MET release.
Voor een kwantitatieve vergelijking van de omvang van de introductie onder verschillende behandelings condities of na verschillende ingrepen om MET vrijgave te moduleren, is nadere analyse vereist. Dit kan worden bereikt door het uitvoeren van qPCR-analyse van nucleair en mitochondriaal DNA aanwezig in de celsupernatants, zoals eerder beschreven6. Deze methode wordt meestal gecombineerd met lactaat dehydrogenase-vrijgave testen om te controleren op celllysis die geen verband houdt met release6. De SYTOX groene kleuring kan ook worden gekwantificeerd door een fluorescentie plaat lezer na behandeling met DNase om de METs gedeeltelijk te verteren en los te maken van kweek platen. Deze methodologie is intensief gebruikt in eerdere werkzaamheden met neutrofielen netten1,2,23.
De toekomstige toepassingen van dit protocol hebben betrekking op het bieden van mogelijkheden voor verdere karakterisering van METs met behulp van immunohistochemie. Het zal mogelijk zijn om de eiwit samenstelling van Mets te toetsen met behulp van deze aanpak met gerichte antilichamen (d.w.z. tegen gecitrullineerde histonen of MPO) om extra inzicht te krijgen in de rollen van deze structuren in complexere biologische monsters. Deze experimenten zullen ook belangrijk zijn voor het vergieten van meer licht op de afbakening van MET vrijlating na andere vormen van celdood, zoals pyroptosis15. Het is vermeldenswaard dat in onze ervaring, METs van macrofagen niet hechten aan de platen zo sterk als netten van neutrofielen, die immunohistochemie analyse uitdagender kan maken. Niettemin zullen de gegevens van deze experimenten van belang zijn, gezien het feit dat macrofagen vaak een dominante rol spelen bij chronische ontstekingsziekten. Verdere karakterisering van deze structuren is van cruciaal belang voor het beoordelen van hun rol in vivo, die tot nu toe slechts in beperkte mate is uitgevoerd16. Er wordt aangenomen dat de beschreven methode met behulp van HMDM om dit doel te bereiken kan meer klinisch relevant in vergelijking met andere vereeuwigd cellijn afgeleide macrofaag bronnen; Hoewel, deze cellijnen kunnen nut hebben in het verstrekken van een stabieler model voor met karakterisering met minder potentieel voor donor variatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) en Novo Nordisk Foundation Biomedical project Grant (NNF17OC0028990). YZ erkent ook de ontvangst van een Australische postdoctorale onderscheiding aan de Universiteit van Sydney. We willen de heer Pat en mevrouw Morgan Jones bedanken voor de hulp bij de monocyt-isolatie en weefselkweek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
