Summary
Presenteras här är ett protokoll för att upptäcka makrofag extracellulära Trap (Met) produktion i levande cellkultur med hjälp av mikroskopi och fluorescens färgning. Detta protokoll kan utökas ytterligare för att undersöka specifika MET-proteinmarkörer genom färgning av immunofluorescensteknik.
Abstract
Frisläppandet av extracellulära fällor (ETs) av neutrofiler har identifierats som en bidragande faktor till utvecklingen av sjukdomar relaterade till kronisk inflammation. Neutrofila eter (NETs) består av ett nät av DNA, histonproteiner, och olika granule proteiner (dvs., myeloperoxidas, elastase, och cathepsin G). Andra immunceller, inklusive makrofager, kan också producera ETs; men i vilken utsträckning detta sker in vivo och om makrofagextracellulära fällor (METs) spelar en roll i patologiska mekanismer har inte undersökts i detalj. För att bättre förstå den roll som METs i inflammatoriska sjukdomar, ett protokoll utvecklades för att visualisera MET release från primära mänskliga makrofager in vitro, som också kan utnyttjas i immunofluorescensexperiment. Detta möjliggör ytterligare karakterisering av dessa strukturer och deras jämförelse med ETs frigörs från neutrofiler. Humana monocyte-härledda makrofager (HMDM) producerar METs vid exponering för olika inflammatoriska stimuli efter differentiering till M1 pro-inflammatorisk fenotyp. Frisättningen av METs kan visualiseras genom mikroskopi med hjälp av en grön fluorescerande nukleinsyrafotsfläck som är okänsliggjort för levande celler (t. ex. SYTOX Green). Användning av nyligen isolerade primära makrofager, såsom HMDM, är fördelaktigt vid modellering in vivo inflammatoriska händelser som är relevanta för potentiella kliniska tillämpningar. Detta protokoll kan också användas för att studera met release från Human monocyt cellinjer (t. ex., THP-1) efter differentiering till makrofager med phorbol myristate acetat eller andra makrofagcellinjer (t. ex., den murina makrofage-liknande J774A. 1 celler).
Introduction
Frisläppandet av ETs från neutrofiler identifierades först som ett medfödda immunsvar utlöst av bakteriell infektion1. De består av en DNA-ryggrad som olika granule proteiner med anti-bakteriella egenskaper är bundna, inklusive neutrofila elastase och myeloperoxidas2. Den primära rollen för neutrofila (NETs) är att fånga patogener och underlätta deras eliminering3. Men förutom den skyddande roll ETs i immunförsvaret, ett ökande antal studier har också upptäckt en roll i sjukdomens patogenes, särskilt under utvecklingen av inflammations drivna sjukdomar (dvs., reumatoid artrit och åderförkalkning4). Frisläppandet av ETS kan utlösas av olika pro-inflammatoriska cytokiner inklusive interleukin 8 (Il-8) och tumörnekrosfaktor alfa (TNFα)5,6, och den lokaliserade ansamling av ETS kan öka vävnadsskada och framkalla en Pro-inflammatoriskt svar7. Till exempel, ETs har varit inblandade som spelar en kausala roll i utvecklingen av åderförkalkning8, främja trombos9, och förutsäga kardiovaskulär risk10.
Det är nu erkänt att förutom neutrofiler, andra immunceller (dvs mastceller, eosinofiler, och makrofager) kan också släppa ETS på exponering för den mikrobiella eller pro-inflammatorisk stimulering11,12. Detta kan vara särskilt betydelsefullt när det gäller makrofager, med tanke på deras centrala roll i utvecklingen, regleringen och lösningen av kroniska inflammatoriska sjukdomar. Därför är det viktigt att få en större förståelse för den potentiella relationen mellan ET release från makrofager och inflammation-relaterade sjukdomsutveckling. Nyligen genomförda studier har visat närvaron av METs och nät i intakt mänskliga aterosklerotiska plack och organiserade Trombi13. På samma sätt har METs varit inblandade i att köra njurskada genom regleringen av inflammatoriska svar14. Men i motsats till neutrofiler, det finns begränsade data om mekanismerna för MET formation från makrofager. Nyligen genomförda studier med humana in vitro-modeller av met formation visar några skillnader i de vägar som ingår i varje celltyp (dvs., om avsaknaden av Histon citrullination med makrofager)6. Emellertid, vissa har visat att netto frisättning kan också förekomma i avsaknad av Histon citrullination15.
Det övergripande målet med detta protokoll är att ge en enkel och direkt metod för att bedöma MET release i en kliniskt relevant makrofagmodell. Det finns ett antal olika in vitro-makrofagceller modeller som har använts för att studera Mets (dvs, den THP-1 Human monocyt cellinjer och olika murin makrofage cellinjer)16. Det finns vissa begränsningar i samband med dessa modeller. Till exempel, differentiering av THP-1 monocyter till makrofager kräver vanligtvis en priming steg, såsom tillsats av phorbol myristate acetat (PMA), som själv aktiverar proteinkinas C (PKC)-beroende vägar. Denna process är känd för att utlösa ET release4 och resulterar i en låg basal met release från THP-1 celler. Andra studier har belyst vissa skillnader i bioaktivitet och inflammatoriska reaktioner monterade av makrofager in vivo jämfört med PMA-behandlade THP-1-celler17.
På samma sätt representerar beteendet och inflammatoriska reaktioner av olika murina makrofage-liknande cellinjer inte helt svaret spektrum av primära mänskliga makrofager18. Därför, i syfte att utreda makrofaget bildas i den kliniska inställningen, primära humana monocyte-härledda makrofager (HMDMs) tros vara en mer relevant modell snarare än monocytiska eller murina makrofage-liknande cellinjer.
ET release från M1 polariserade HMDMs har visats efter exponering av dessa celler till ett antal olika inflammatoriska stimuli, inklusive myeloperoxidas-derived antioxidant hypoklorös syra (HOCl), PMA, TNFα, och IL-86. Beskrivs här är ett protokoll för att polarisera HMDMs till M1 fenotyp och visualisera efterföljande MET release vid exponering för dessa inflammatoriska stimuli. PMA används som en stimulans av MET release för att underlätta jämförelser med tidigare studier som har använt neutrofiler. Viktigt, HOCl, IL-8, och TNFα används också för att stimulera MET release, som tros vara bättre modeller av den inflammatoriska miljön in vivo. Den mikroskopiska metoden för visualisering av ET release innebär färgning av extracellulära DNA i levande cellkulturer med hjälp av SYTOX Green, en ogenomtränglig fluorescerande grön nukleinsyra fläck som har framgångsrikt tillämpats i tidigare neutrofila studier. Denna metod möjliggör snabb och kvalitativ bedömning av ET-frisättning, men det är inte lämpligt som en fristående metod för kvantifiering av ET-frigöringsgrad. Alternativa metoder bör användas om kvantifieringen krävs för att jämföra omfattningen av ET-frisättningen till följd av olika behandlings villkor eller interventioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den HMDM isolerades från Human Buffy Coat preparat som tillhandahålls av Blodbanken med etik godkännande från Sydney Local Health District.
1. HMDM kultur
- Isolera monocyterna från Buffy Coat preparat som framställts av perifert blod av friska humana givare med hjälp av en kommersiellt tillgänglig beredning för att isolera lymfocyter, följt av motströms centrifugalelutriation19, 20.
- Bekräfta närvaron av monocyter genom cytospinning och färgning med modifierad Giemsa fläcken för monocyt karakterisering19.
- Under sterila förhållanden, justera tätheten av monocyter till 1 x 106 celler/ml med hjälp av RPMI-1640 media utan serum. Tillsätt 1 mL av denna cellsuspension till varje brunn av en 12 väl vävnadsodling plattan. Kultur i en cellinkubator vid 37 ° c i närvaro av 5% CO2 för 2 h för att främja anslutning till vävnadsodling plattan.
- Under sterila förhållanden, ta bort cellmedia och Ersätt med kompletta RPMI-1640 odlingsmedier som innehåller 10% (v/v) poolat humant serum och 20 mM L-glutamin.
- Odla cellerna vid 37 ° c i närvaro av 5% CO2 i en cell inkubator för 8 dagar, ändra Media varje 2 dagar.
2. polarisering av HMDM
- Förbered M1-grundmaterialet under sterila förhållanden genom att tillsätta interferon γ (IFNγ; 20 ng/mL) och lipopolysackarid (LPS; 1 μg/mL) till det kompletta kultur mediet RPMI-1640. Förbered m2 priming Media genom att lägga interleukin 4 (IL-4; 20 ng/mL) till den kompletta RPMI-1640 kultur media.
- Under sterila förhållanden, aspirera medier från vävnads odlingsplattan brunnar som innehåller HMDM, som har seedade och odlade enligt beskrivningen i avsnitt 1.
- Tvätta noggrant de brunnar som innehåller cellerna 3x med steril PBS (förvärmt till 37 ° c) med 1 mL alikvoter av PBS.
- Tillsätt 1 mL av antingen M1-eller m2-priming-mediet till varje brunn som innehåller HMDM (beroende på vilket som är lämpligt för experimentet).
- Inkubera cellerna för 48 h vid 37 ° c i närvaro av 5% CO2 i en cellinkubator.
3. stimulering av HMDM för att inducera MET release
- Under sterila förhållanden, förbereda kultur medier som innehåller olika stimulatorer av MET release (beroende på vilket som är lämpligt för experimentet) till den kompletta RPMI-1640 media: PMA (25 nM), humant rekombinant TNFα (25 ng/mL), eller humant rekombinant IL-8 (50 ng/mL ).
- För experiment med HOCl stimulering, Förbered HOCl (200 μM) i HBSS (förvärmt till 37 ° c), omedelbart före tillsats till cellerna. Se till att HOCl inte är beredd i kompletta cellmedia.
Anmärkning: Koncentrationen av stamlösningen av HOCl kvantifieras genom mätning av lösningens UV-absorbans vid 292 nm och pH = 116 och med hjälp av en utrotningskoefficient på 350 M-1cm-121. - Efter den polarisering behandling som beskrivs i avsnitt 2, aspirera cellmedia från varje brunn och noggrant tvätta cellerna 3x med 1 mL alikvoter av antingen: steril PBS (för PMA, TNFα och IL-8) eller HBSS (för HOCl), som har förvärmts till 37 ° c.
- För experiment med PMA, TNFα eller IL-8: Tillsätt 1 mL av hela mediet innehållande PMA, TNFα eller IL-8 efter borttagning av PBS i det slutliga tvättsteget.
- För experiment med TNFα, inkubera cellerna i 6 h vid 37 ° c i närvaro av 5% CO2 i en cellinkubator. För experiment med PMA och IL-8, inkubera cellerna för 24 h vid 37 ° c i närvaro av 5% CO2 i en cellinkubator.
-
För experiment med HOCl, tillsätt 1 mL HOCl i HBSS efter att ha avlägsnat HBSS i det slutliga tvättsteget. Sedan, inkubera cellerna i 15 min vid 37 ° c i närvaro av 5% CO2 i en cell inkubator.
- Försiktigt aspirera cellen supernatanten och tvätta cellerna 3x med 1 mL alikvoter av HBSS som beskrivs i steg 3,3.
- Efter att ha avlägsnat HBSS från det sista TVÄTTNINGSSTEGET, tillsätt 1 mL komplett RPMI-1640 odlingsmedium. Sedan, inkubera cellerna för 24 h vid 37 ° c i närvaro av 5% CO2 i en cell inkubator.
4. visualisering av MET i levande cell kultur
- Bered SYTOX Green Dye i HBSS vid en koncentration av 40 μM.
- I slutet av behandlingar som beskrivs i avsnitt 3 för inducera MET release, tillsätt direkt 25 μL av 40 μM av färgämnet till varje brunn som innehåller HMDM.
- Inkubera celler i rumstemperatur (RT) i 5 minuter i mörker.
- Placera HMDM i vävnadsodling brunnar på mikroskopet skede av en inverterad fluorescerande Mikroskop för avbildning.
-
Mikroskop förfaranden
- Slå på en fluorescerande ljuskälla med bredspektrum, ljuskälla brightfield och inverterat Mikroskop som installeras med en digitalkamera med hög upplösning (se tabell över material).
- Vrid filter hjulet till positionen "nummer 2" för grön fluorescens (excitation = 504 nm, emission = 523 nm) för avbildning av de gröna färgade proverna som finns i vävnads kulturbrunnarna.
- Med hjälp av 5x mål, fokusera bilden med grov fokus, sedan den fina fokus rattar på mikroskopet, tills bilden visas skarp, tydlig och fokuserad när de ses genom mikroskopet okular.
- Växla mikroskopet till kameraläge.
- Starta den tillhörande programvaran.
- Välj den Capture fliken på programvaran.
- Klicka på uppspelnings knappen för att förhandsgranska bilden och justera fin fokus ratten på mikroskopet tills bilden visas skarp, tydlig och fokuserad i fönstret programvara förhandsgranskning.
- Klicka på Capture -knappen.
Anmärkning: Den tagna bilden visas automatiskt i den medföljande programvaran. - I programvaran klickar du på Arkiv | Spara som önskad bild fils typ.
- På mikroskopet roterar du filter hjulet till positionen "Number 5" för brightfield Imaging och upprepar steg 4.5.2 – 4.5.9 för att erhålla motsvarande brightfield-bild.
- Upprepa stegen 4.5.2 – 4.5.10 vid behov för efterföljande Bildinsamling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brightfield-bilder som visar de morfologiska förändringarna av HMDM som svar på stimuli för celldifferentiering visas i figur 1. M1 polariserade makrofager från experiment med HMDM som exponerats för IFNγ och LPS visade en långsträckt och spindelliknande cell form, vilket indikeras av de svarta pilarna i figur 1 (Mittenpanelen). För jämförelse, morfologin av m2 polariserade makrofager efter exponering av HMDM till IL-4 för 48 h var typiskt runda och platta, vilket indikeras av de svarta pilarna i figur 1 (längst till höger panel).
Möjligheten för differentierade HMDM-fenotyper att frigöra METs visualiserades genom levande cellfluorescensavbildning med SYTOX Green, som presenteras i figur 2. Figur 2A visar de kontrolldata som erhållits från varje hmdm-fenotyp som inkuberats för 24 timmar i avsaknad av proinflammatoriska stimuli. I detta fall, det var mycket begränsad grönfärgning, som väntat, med tanke på cellen impermenterade arten av denna fläck. Figur 2b visade positiv färgning för Mets, till följd av exponeringen av M1 HMDMs till HOCl, PMA, Il-8 eller TNFα. METs indikeras av de vita pilarna, som visas som gröna ränder, till följd av strängarna av extracellulära DNA. Med HOCl, förutom färgning extracellulära DNA, det fanns några gröna färgning uppenbar i cellerna. Denna cellulär färgning observerades också till viss del med de andra stimuli och tros återspegla förlust av membran integritet till följd av ET-oberoende celldöd som ett resultat av behandlings villkoren.
Figur 2b visar också motsvarande experiment utförda med m2 HMDMs, som EXPONERADES för Il-4. I detta fall fanns det ingen frisättning av DNA från cellerna, vilket indikeras av avsaknaden av strängarna/strimmor av extracellulära DNA; men, det fanns vissa cellulära upptag av grönt fluorescerande färgämne med HOCl och TNFα. I jämförelsesyfte visar figur 3 representativa data som indikerar att de släpps ut från THP-1-makrofagerna som exponerats för TNFα (50 ng/ml) under 4 timmar. I detta fall bör det noteras att en icke-polariserad population av celler användes, och THP-1 monocyter differentierades till makrofager genom förbehandling med PMA (50 ng/mL för 72 h) som beskrivs tidigare22.
Figur 1: morfologiska förändringar av Differentiellt polariserade HMDMs. Representativa brightfield-bilder från icke-differentierade och differentierade HMDMs (n ≥ 5). HMDMs var odlade med kompletta medier som innehåller humant serum och glutamin i 8 dagar före grundning till M1 eller m2 fenotyp vid exponering för IFNγ och LPS eller IL-4, respektive, för 48 h. Scale bar = 200 μm. Pilar indikerar exempel på celler som uppvisar morfologiska egenskaper hos HMDMs M1 eller m2. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mets producerade av M1 HMDMs efter stimulering av HOCl, PMA, Il-8 och TNFα. Representativa bilder av SYTOX gröna färgade HMDMs från (a) icke-stimulerade Hmdms M1 och m2 inkuberades för 24 h i avsaknad av några inflammatoriska stimuli användes som kontroll, visar frånvaron av met release. (B) HMDMs M1 och m2 behandlades med 1) hocl (200 μm, 15 min), PMA (25 nm) eller Il-8 (50 ng/ml) med inkubering för 24 h eller 2) TNFα (25 ng/ml) med inkubering för 6 h för att INDUCERA met release. METs visualiserades genom tillsats av SYTOX Green, vilket indikeras av vita pilar i den övre panelen från M1 HMDMs. Inga METS sågs i motsvarande experiment med m2 HMDMs. data är representativa för replikationskulturbrunnar från n ≥ 3 enskilda givare. Skalstapel = 500 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mets som produceras av icke-polariserade THP-1 makrofager efter TNFα-stimulering. Representativa bilder av SYTOX grön-färgade TNP-1 makrofager, som differentierades genom förbehandling med PMA (50 ng/mL för 72 h) innan ytterligare inkubering för 4 h i frånvaro eller förekomst av TNFα (50 ng/mL) för att inducera MET release. METs visualiserades genom tillsats av SYTOX Green. Data är representativa för replikationskulturbrunnar från n ≥ 3 experiment. Skalstapel = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering och visualisering av MET formation med hjälp av M1 differentierade HMDMs representerar en ny in vitro-modell som kan vara användbara för att undersöka den potentiella patologiska roll dessa makrofagstrukturer, särskilt under kroniska inflammatoriska Villkor. Det ger ett robust protokoll för stimulering av primära mänskliga makrofager att frigöra METs, som också kan utnyttjas i relaterade studier med Human monocyt eller murin makrofage cellinjer. Det framgångsrika genomförandet av detta protokoll för stimulering av MET formation av HMDM är beroende av noggrann cellkultur och hantering för att bibehålla god cell lönsamhet. Detta kommer att öka omfattningen och kvaliteten på de observerade METs. För att ge bättre cell Nutrition, den RPMI Media används för att upprätthålla HMDM bör innehålla humant serum, snarare än fetalt Nötkreaturserum, samt L-glutamin. Varje stamlösning av denna kompletta RPMI Media bör användas inom 1 vecka. Korrekt lagring av media är också viktigt. Mediet ska förvaras vid 4 ° c i avsaknad av ljus.
Dessutom är det viktigt att regelbundet iaktta och övervaka cellernas form och morfologi genom mikroskopi under odling av HMDM. Eventuella onormala eller oväntade förändringar i cell formen som observerats före tillsats av IFNγ och LPS eller IL-4 (för att polarisera makrofager) kan tyda på en minskning av cellernas överlevnadsgrad. HMDM bör vara anhängare och inte förgöra. Det är därför viktigt att övervaka cellerna för eventuella förändringar i morfologi, celltäthet, eller förlust av följsamhet under den normala 8 dagars kultur period. En dramatisk minskning av CELLTÄTHETEN under de första 2 dagarna efter isoleringen tyder på att de resulterande HMDMs inte kan vara tillräckligt lönsamma för efterföljande experiment. En begränsning av användning av primära mänskliga celler är variationen mellan givare, som markant kan påverka omfattningen av MET release. Dessutom kan kvaliteten på de Buffy Coat preparat som mottagits för isolering av monocyter variera. Det är viktigt att upprepa experiment med minst tre enskilda cellgivare för att säkerställa att data är representativa för större populationer av celler.
Det är viktigt att notera att det protokoll som beskrivs för HMDM differentiering har optimerats för celler isolerade från humant Buffy Coat preparat genom kontraktuella elutriation, vilket resulterar i en hög renhet monocyt beredning. Validering av polarisation behandlingar (för att bekräfta fenotyp) med flödescytometri och bedömning av uttrycket av M1 markör CD86 och m2 markör CD206 har utförts tidigare med hjälp av denna beredning av HMDM6. Det uppskattas att denna isoleringsmetod inte kan vara allmänt tillgänglig, och att alternativa isoleringsmetoder (dvs. magnetisk pärla sortering) kan vara att föredra. Om en alternativ källa av monocyter eller olika isolerings protokoll används, ytterligare flödescytometri experiment för att validera fenotyp förändring rekommenderas, och vissa optimering av behandling villkor för att stimulera MET release kan krävas.
För optimala fluorescensbilder bör exponeringstiden noggrant justeras och hållas så kort som möjligt för att undvika bakgrundfluorescens och infärgnings artefakter från plast odlings plattorna, som har anhängare av beläggningar. Det är viktigt att ta flera bilder från varje brunn som innehåller celler. Det är fördelaktigt om proverna är blindade före fluorescensmikroskopi analys. Förutom färgning extracellulära strängar av DNA, det finns också belägg för cellulära upptag av SYTOX grön. Detta tros återspegla en förlust i membranet integritet, som kan vara på grund av MET release, och det kan också avslöja alternativa vägar av celldöd (se även nedan). Detta belyser vikten av att utföra ytterligare experiment för att kvantifiera och ytterligare karakterisera MET release.
För en kvantitativ jämförelse av omfattningen av MET release under olika behandlingsförhållanden eller efter olika ingrepp för att modulera MET release, krävs ytterligare analys. Detta kan åstadkommas genom att utföra qPCR analys av nukleära och mitokondriella DNA som finns i cellen supernatants, som beskrivits tidigare6. Denna metod kombineras vanligtvis med laktatdehydrogenas release-analyser för att kontrollera för cell lysis orelaterat till MET release6. Den SYTOX grönfärgning kan också kvantifieras genom en fluorescens plattan läsare efter DNase behandling att delvis smälta METs och släppa dem från odlings plattorna. Denna metod har använts flitigt i tidigare arbete med neutrofila nät1,2,23.
De framtida tillämpningarna av detta protokoll avser att ge möjligheter till ytterligare karakterisering av METs med hjälp av immunohistokemi. Det kommer att vara möjligt att söka protein sammansättningen av Mets med hjälp av denna metod med riktade antikroppar (dvs. mot citrullinerade histoner eller MPO) för att få ytterligare insikt i rollerna för dessa strukturer i mer komplexa biologiska prover. Dessa experiment kommer också att vara viktiga för att kasta mer ljus över avgränsningen av MET release efter andra former av celldöd, såsom pyroptos15. Det är värt att notera att i vår erfarenhet, METs från makrofager inte hålla sig till plattorna lika starkt som nät från neutrofiler, vilket kan göra immunohistokemi analys mer utmanande. Data från dessa experiment kommer dock att vara av intresse, med tanke på att makrofager ofta spelar en dominerande roll vid kroniska inflammatoriska sjukdomar. Ytterligare karakterisering av dessa strukturer är avgörande för att bedöma deras roller in vivo, som hittills endast har utförts i begränsad utsträckning16. Man tror att den beskrivna metoden att använda HMDM för att uppnå detta syfte kan vara mer kliniskt relevant i jämförelse med andra förevigade cellinhärledda makrofagkällor; även om dessa cellinjer kan ha nytta av att ge en stabilare modell för MET karakterisering med mindre potential för givaren variation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) och Novo Nordisk Foundation Biomedicinskt projekt Grant (NNF17OC0028990). YZ erkänner också mottagandet av en australisk doktorand utmärkelse från University of Sydney. Vi skulle vilja tacka Mr Pat pisansarakit och MS Morgan Jones för hjälp med monocyt isolering och vävnad kultur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
