Summary
Burada mikroskopve floresan boyama kullanarak canlı hücre kültüründe makrofaj ekstrasellüler tuzak (MET) üretimini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, immünoresans boyama ile spesifik MET protein belirteçlerini incelemek için daha da genişletilebilir.
Abstract
Nötrofiller tarafından hücre dışı tuzakların (ET) salınımı kronik inflamasyona bağlı hastalıkların gelişimine katkıda bulunan bir faktör olarak tanımlanmıştır. Nötrofil ET'ler (NETs) DNA, histon proteinleri ve çeşitli granül proteinlerinden (yani miyeloperoksidaz, elastaz ve kathepsin G) oluşur. Makrofajlar da dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücreleri, aynı zamanda ET üretebilir; ancak, bunun ne ölçüde meydana geldiği ve makrofaj hücre dışı tuzakların (METs) patolojik mekanizmalarda rol oynayıp oynamadığı ayrıntılı olarak incelenmemiştir. Met'lerin inflamatuar patolojilerde rolünü daha iyi anlamak için, immünoresans deneylerinde de yararlanılabilen primer insan makrofajlarından MET salınımını in vitro olarak görselleştirmek için bir protokol geliştirilmiştir. Bu, bu yapıların daha fazla karakterizasyonuna ve nötrofillerden salınan ED'lerle karşılaştırılmasına olanak sağlar. İnsan monosit kaynaklı makrofajlar (HMDM), M1 pro-inflamatuar fenotipten farklılaşmasını takiben farklı inflamatuar uyaranlara maruz kalındığında MET üretirler. MET salınımı canlı hücreler (örneğin, SYTOX yeşili) için imperkast olan yeşil floresan nükleik asit lekesi kullanılarak mikroskopi ile görselleştirilebilir. HMDM gibi yeni izole edilmiş primer makrofajların kullanımı, potansiyel klinik uygulamalarla ilgili in vivo inflamatuar olayların modelalınmasında avantajlıdır. Bu protokol aynı zamanda insan monosit hücre hatlarından MET salınımını incelemek için de kullanılabilir (örn. THP-1) phorbol myristate asetat veya diğer makrofaj hücre hatları (örn. rürin makrofaj benzeri J774A.1 hücreleri) ile makrofajlara farklılaşmayı takiben.
Introduction
Nötrofillerden edinen ET salınımı ilk olarak bakteriyel enfeksiyon tarafından tetiklenen doğuştan gelen bir immün yanıt olarak tanımlanmıştır1. Nötrofil elastaz ve miyeloperoksidaz2gibi anti-bakteriyel özelliklere sahip çeşitli granül proteinlerin bağlı olduğu bir DNA omurgası oluşur. Nötrofil ETs birincil rolü (NETs) patojenleri yakalamak ve bunların ortadan kaldırılması kolaylaştırmaktır 3. Bununla birlikte, immün savunmada ET'lerin koruyucu rolüne ek olarak, özellikle inflamasyona dayalı hastalıkların (örneğin romatoid artrit ve ateroskleroz4). ET salınımı interlökin 8 (IL-8) ve tümör nekroz faktörü alfa (TNFα)5,6dahil olmak üzere çeşitli pro-inflamatuar sitokinler tarafından tetiklenebilir ve ET'lerin lokalize birikimi doku hasarı artırabilir ve bir uyandırmak pro-inflamatuar yanıt7. Örneğin, ET'ler ateroskleroz gelişiminde nedensel bir rol oynadığı için karıştığı edilmiştir8, tromboz teşvik9, ve kardiyovasküler risk tahmin10.
Şimdi nötrofiller ek olarak, diğer bağışıklık hücreleri (yani, mast hücreleri, eozinofiller, ve makrofajlar) ayrıca mikrobiyal veya pro-inflamatuar stimülasyon 11 ,12maruz kalma ET'ler serbest bırakabilirsiniz kabul edilmektedir. Bu durum, kronik inflamatuar hastalıkların gelişiminde, düzenlenmesinde ve çözümünde kilit rol oynadıkları göz önünde bulundurularak makrofajlar açısından özellikle önemli olabilir. Bu nedenle, makrofajlar et sürümü ve inflamasyona bağlı hastalık gelişimi arasındaki potansiyel ilişki daha iyi anlaşılması önemlidir. Son çalışmalar sağlam insan aterosklerotik plaklar ve organize trombüs13METs ve NETs varlığını göstermiştir. Benzer şekilde, METs inflamatuar yanıtların düzenlenmesi ile böbrek hasarı sürüş karıştığı edilmiştir14. Ancak nötrofillerin aksine makrofajlardan MET oluşumu mekanizmaları hakkında sınırlı veri vardır. MET oluşumuinsan in vitro modellerini kullanarak yapılan son çalışmalar, her hücre tipinde yer alan yollarda bazı farklılıklar göstermektedir (yani, makrofajlarla histon sitrullination yokluğu ile ilgili)6. Ancak, bazı NET sürümü de histon sitrullination yokluğunda oluşabilir göstermiştir15.
Bu protokolün genel amacı, MET salınımını klinik olarak ilgili bir makrofaj modelinde değerlendirmek için basit ve doğrudan bir yöntem sağlamaktır. MET'leri incelemek için kullanılan farklı in vitro makrofaj hücre modelleri vardır (yani, THP-1 insan monosit hücre hattı ve çeşitli murine makrofaj hücre hatları)16. Bu modeller ile ilişkili bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, THP-1 monositlerinin makrofajlara farklılaşması genellikle protein kinaz C (PKC) bağımlı yolları aktive eden phorbol myristate asetat (PMA) eklenmesi gibi bir astar adım gerektirir. Bu işlem ET salınımıtetiklediği bilinmektedir 4 ve THP-1 hücrelerinden düşük bazal MET sürümü ile sonuçlanır. Diğer çalışmalar pma tedavi THP-1 hücreleri17ile karşılaştırıldığında in vivo makrofajlar tarafından monte biyoaktivite ve inflamatuar yanıtları bazı farklılıklar vurgulamıştır.
Benzer şekilde, farklı murine makrofaj benzeri hücre hatlarının davranışı ve inflamatuar yanıtları tamamen birincil insan makrofajlarının yanıt spektrumu temsil etmez18. Bu nedenle, klinik ortamda makrofaj ET oluşumunu araştırmak amacıyla, birincil insan monosit kaynaklı makrofajlar (HMDM) monositik veya murine makrofaj benzeri hücre hatları yerine daha alakalı bir model olduğuna inanılmaktadır.
M1 polarize HMDM et sürümü farklı inflamatuar uyaranların bir dizi bu hücrelerin maruz kalma sonrasında gösterilmiştir, miyeloperoksidaz türetilmiş oksidan hipokloröz asit de dahil olmak üzere (HOCl), PMA, TNFα, ve IL-86. Burada açıklanan M1 fenotip HMDMs polarize etmek ve bu inflamatuar uyaranlara maruz kalma üzerine sonraki MET sürümü görselleştirmek için bir protokoldür. PMA nötrofil kullanmış önceki çalışmalara karşılaştırmaları kolaylaştırmak için MET sürümü bir uyarıcı olarak kullanılır. Daha da önemlisi, HOCl, IL-8, ve TNFα da MET salınımını uyarmak için kullanılır, hangi in vivo inflamatuar ortamın daha iyi modelleri olduğuna inanılmaktadır. ET salınımını görselleştirme için mikroskobik yöntem, önceki nötrofil çalışmalarında başarıyla uygulanmış bir geçirimsiz floresan yeşil nükleik asit lekesi olan SYTOX yeşili kullanılarak canlı hücre kültürlerinde hücre dışı DNA'nın boyanmasını içerir. Bu yöntem ET salınımının hızlı ve nitel olarak değerlendirilmesine olanak sağlar, ancak ET salınım kapsamının nicelleştirilmesi için tek başına bir yöntem olarak uygun değildir. Farklı tedavi koşullarından veya müdahalelerden kaynaklanan ET salınımının kapsamını karşılaştırmak için niceleme gerekiyorsa alternatif metodoloji kullanılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HMDM, Sydney Yerel Sağlık Bölgesi'nin etik onayı ile kan bankası tarafından sağlanan insan buffy ceket preparatlarından izole edildi.
1. HMDM Kültürü
- Lenfositleri izole etmek için ticari olarak kullanılabilir bir hazırlık kullanarak sağlıklı insan donörlerin periferik kan hazırlanan buffy kat preparatları monositler izole, karşı akım santrifüj elutriation takip19, 20. yıl.
- Monosit karakterizasyonu için modifiye Giemsa lekesi ile sitospinning ve boyama ile monositvarlığını onaylayın19.
- Steril koşullarda, serumsuz RPMI-1640 ortam ını kullanarak monosityoğunluğunu 1 x 106 hücre/mL olarak ayarlayın. 12 kuyu doku kültürü plaka her kuyuya bu hücre süspansiyon 1 mL ekleyin. Doku kültürü plakasına bağlılığı teşvik etmek için %5 CO2 ila 2 saat içinde 37 °C'de bir hücre kuluçka makinesinde kültür.
- Steril koşullar altında, hücre ortamını çıkarın ve %10 (v/v) havuzlu insan serumu ve 20 mM L-glutamin içeren komple RPMI-1640 kültür ortamı ile değiştirin.
- Bir hücre kuluçka makinesinde %5 CO2 varlığında 37 °C'deki hücreleri 8 gün boyunca kültürlendirerek, 2 günde bir ortam değiştirin.
2. HMDM'nin Kutuplaşması
- Steril koşullar altında, RPMI-1640 kültür ortamının tamamına interferon γ (IFNγ; 20 ng/mL) ve lipopolisakkarit (LPS; 1 μg/mL) ekleyerek M1 astar ortamını hazırlayın. Komple RPMI-1640 kültür ortamına interlökin 4 (IL-4; 20 ng/mL) ekleyerek M2 astar ortamını hazırlayın.
- Steril koşullar altında, bölüm 1'de açıklandığı gibi tohumlanmış ve kültürlü hmdm içeren doku kültürü plaka kuyularından aspire ortamı.
- Hücreleri içeren kuyuları steril PBS (önceden 37 °C'ye Önceden ısıtılmış) ile 1 mL aliquots PBS kullanarak dikkatlice yıkayın.
- HMDM içeren her kuyuya (deneme için uygun olan) M1 veya M2 astar lı ortamdan 1 mL ekleyin.
- Hücreleri 37 °C'de 48 saat boyunca bir hücre kuluçka makinesinde %5 CO2 varlığında kuluçkaya yatırın.
3. MET Salınımını sağlamak için HMDM'nin uyarılması
- Steril koşullar altında, MET salınımının farklı uyarıcılarını içeren kültür ortamını (deney için uygun olan) tam RPMI-1640 ortama hazırlayın: PMA (25 nM), insan rekombinantTTNFα (25 ng/mL) veya insan rekombinant IL-8 (50 ng/mL ).
- HOCl stimülasyon deneyleri için, hücrelere ilave edilmeden hemen önce HBSS'de (önceden 37 °C'ye ısınmış) HOCl (200 μM) hazırlayın. HOCl'un tam hücre li ortamiçinde hazırlanmadığından emin olun.
NOT: HOCl stok çözeltisinin konsantrasyonu çözeltinin UV emmesinin 292 nm ve pH = 116'da ölçülmesi ve 350 M-1cm-121'likbir tükenme katsayısı kullanılarak ölçülür. - Bölüm 2'de açıklanan polarizasyon tedavisinden sonra, hücre ortamını her kuyudan aspire edin ve hücreleri 3x'i 1 mL aliquots ile dikkatlice yıkayın: steril PBS (PMA, TNFα ve IL-8 için) veya HBSS (HOCl için), önceden ısıtılmış olan 37 °C'ye kadar ısıtın.
- PMA, TNFα veya IL-8 ile yapılan deneyler için: Son yıkama adımında PBS'yi çıkardıktan sonra PMA, TNFα veya IL-8 içeren tüm ortamlardan 1 mL ekleyin.
- TNFα ile yapılan deneyler için, hücreleri 37 °C'de 6 saat kuluçkaya yatırın ve hücre kuvözde %5 CO2 bulunur. PMA ve IL-8 ile yapılan deneylerde, hücreleri 37 °C'de 24 saat boyunca bir hücre kuluçka makinesinde %5 CO2 varlığında kuluçkaya yatırın.
-
HOCl ile yapılan deneyler için, son yıkama adımında HBSS'yi çıkardıktan sonra HBSS'ye 1 mL HOCl ekleyin. Daha sonra, bir hücre kuluçka makinesinde %5 CO2 varlığında hücreleri 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücre supernatant'ı dikkatlice aspire edin ve 3.3 adımda açıklandığı gibi hücreleri 1 mL HBSS ile 3x yıkayın.
- HBSS'yi son yıkama adımından çıkardıktan sonra 1 mL tam RPMI-1640 kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, bir hücre kuluçka makinesinde %5 CO2 varlığında hücreleri 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
4. Canlı Hücre Kültüründe MET'nin Görselleştirilmesi
- HBSS'de 40 μM konsantrasyonda SYTOX yeşil boya hazırlayın.
- MET salınımını sağlamak için bölüm 3'te açıklanan tedavilerin sonunda, hmdm içeren her kuyuya doğrudan 25 μL 40 μM boya ekleyin.
- Karanlıkta 5 dakika oda sıcaklığında (RT) hücreleri kuluçka.
- HMDM'yi doku kültürü kuyularına, görüntüleme için ters floresan mikroskobun mikroskop aşamasına yerleştirin.
-
Mikroskop prosedürleri
- Geniş spektrumlu floresan ışık kaynağını, parlak alan ışık kaynağını ve yüksek çözünürlüklü renkli dijital fotoğraf makinesiyle yüklü ters mikroskobu açın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Filtre tekerleğini, doku kültürü kuyularında bulunan yeşil lekeli örneklerin görüntülenmesi için yeşil floresan (uyarma = 504 nm, emisyon = 523 nm) için "2 numara" konumuna döndürün.
- 5x hedefini kullanarak, görüntüyü kaba odakla odaklayın, ardından mikroskopüzerinde ince odaklama topuzları, görüntü mikroskop merceğinde nivesal, net ve odaklanmış görünene kadar.
- Mikroskobu kamera moduna geçirin.
- İlişkili yazılımı başlatın.
- Yazılımdaki Yakalama sekmesini seçin.
- Görüntüyü önizlemek için Oynat düğmesini tıklatın ve görüntü net, net ve yazılım önizleme penceresinde odaklanana kadar mikroskoptaki ince odak düğmesini ayarlayın.
- Yakala düğmesini tıklatın.
NOT: Yakalanan görüntü otomatik olarak eşlik eden yazılımda görüntülenir. - Yazılım içinde Dosya | Gerekli görüntü dosyası türü olarak kaydedin.
- Mikroskopta, filtre tekerleğini brightfield görüntüleme için "5 numara" konumuna döndürün ve ilgili brightfield görüntüsünü elde etmek için 4.5.2-4.5.9 adımlarını tekrarlayın.
- Sonraki görüntü edinimi için gerekli olan 4.5.2-4.5.10 adımlarını tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre farklılaşması için uyaranlara yanıt olarak HMDM'nin morfolojik değişikliklerini gösteren brightfield görüntüleri Şekil 1'degösterilmiştir. IFNγ ve LPS'ye maruz kalan HMDM ile yapılan deneylerdeki M1 polarize makrofajlar, Şekil 1'deki (orta panel) siyah oklarda gösterildiği gibi uzamış ve mil benzeri bir hücre şekli gösterdi. Karşılaştırma için, HMDM'nin 48 saat il-4'e maruz kalmasından sonra M2 polarize makrofajların morfolojisi şekil 1'deki (en sağ daki panel) siyah oklarda belirtildiği gibi tipik olarak yuvarlak ve.
Farklılaştırılmış HMDM fenotiplerinin MET salgılayabilme yeteneği Şekil 2'desunulduğu gibi, SYTOX yeşili ile canlı hücre floresan görüntülemesi ile görselleştirildi. Şekil 2A, pro-inflamatuar uyaranların yokluğunda 24 saat kuluçkaya yatırılamış her HMDM fenotipten elde edilen kontrol verilerini göstermektedir. Bu durumda, bu lekenin hücre imperkast doğası göz önüne alındığında, beklendiği gibi, çok sınırlı yeşil boyama vardı. Şekil 2B, M1 HMDM'lerin HOCl, PMA, IL-8 veya TNFα'ya maruz kalmasından kaynaklanan metler için pozitif boyama gösterdi. MET'ler, hücre dışı DNA iplikçiklerinden kaynaklanan yeşil çizgiler olarak gösterilen beyaz oklarla gösterilir. HOCl ile, ekstrasellüler DNA boyama ek olarak, bazı yeşil boyama hücreleri belirgin oldu. Bu hücresel lekelenme de diğer uyaranlarla bir dereceye kadar gözlendi ve tedavi koşulları nın bir sonucu olarak ET-bağımsız hücre ölümü sonucu membran bütünlüğünün kaybını yansıttığına inanılmaktadır.
Şekil 2B ayrıca IL-4'e maruz kalan M2 HMDM'lerle yapılan ilgili deneyleri de göstermektedir. Bu durumda, hücre dışı DNA iplikçiklerinin/çizgilerin yokluğunda belirtildiği gibi, hücrelerden DNA salınımı yoktu; rağmen, HOCl ve TNFα ile yeşil floresan boya bazı hücresel alımı vardı. Karşılaştırmalı amaçlar için Şekil 3, 4 saat boyunca TNFα'ya (50 ng/mL) maruz kalan THP-1 makrofajlarından MET salınımı gösteren temsili verileri gösterir. Bu durumda, polarize olmayan hücre popülasyonunun kullanıldığı ve THP-1 monositlerinin daha önce22kez açıklandığı gibi PMA (72 saat için 50 ng/mL) ile ön tedavi ile makrofajlara farklılaştırıldığı unutulmamalıdır.
Şekil 1: Diferansiyel polarize HMDM'lerin morfolojik değişiklikleri. Farklılaşmamış ve farklılaştırılmış HMDM'lerden (n ≥5) gelen temsili brightfield görüntüleri. HMDM'ler, ifnγ ve LPS veya IL-4'e maruz kaldıktan sonra M1 veya M2 fenotipine girmeden önce 8 gün boyunca insan serumu ve glutamin içeren komple ortamla, sırasıyla 48 saat ölçek çubuğu = 200 μm için kültürlendi. Oklar M1 veya M2 HMDM'lerin morfolojik özelliklerini gösteren hücre örneklerini gösterir.
Şekil 2: HOCl, PMA, IL-8 ve TNFα stimülasyonu ndan sonra M1 HMDM'ler tarafından üretilen MET'ler. SYTOX yeşil lekeli HMDM temsili görüntüler (A) Non-uyarılmış M1 ve M2 HMDMs herhangi bir inflamatuar uyaranların yokluğunda 24 saat için kuluçkaya yatırıldı, MET serbest yokluğu gösteren kontrol olarak kullanılmıştır. (B) M1 ve M2 HMDM'ler 1) HOCl (200 μM, 15 dk), PMA (25 nM) veya IL-8 (50 ng/mL) 24 veya 2) TNFα (25 ng/mL) kuluçka ile tedavi edildi ve MET salınımına neden olmak için 6 saat kuluçka süresi verildi. MET'ler, M1 HMDM'lerin üst panelindeki beyaz oklarla gösterildiği gibi SYTOX yeşilinin eklenmesiyle görselleştirildi. M2 HMDM ile ilgili deneylerde METS görülmedi. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: TNFα stimülasyonu ndan sonra polarize olmayan THP-1 makrofajları tarafından üretilen METler. SYTOX yeşil lekeli TNP-1 makrofajlarının temsili görüntüleri, MET salınımını sağlamak için TNFα'nın yokluğunda veya varlığında 4 saat daha fazla kuluçkadan önce PMA (72 saat için 50 ng/mL) ile ön tedavi ile ayırt edildi. MET'ler SYTOX yeşili ilave edilerek görselleştirildi. Veriler, n ≥ 3 deneylerinden elde edilen kültür kuyularını temsil eder. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
M1 diferansiye HMDM'ler kullanılarak MET oluşumunun oluşturulması ve görselleştirilmesi, özellikle kronik inflamatuar altında, bu makrofaj yapıların potansiyel patolojik rolünü araştırmak için yararlı olabilecek yeni bir in vitro modeli temsil eder Koşul -ları. Aynı zamanda insan monosit veya murine makrofaj hücre hatları ile ilgili çalışmalarda kullanılabilir METs serbest bırakmak için birincil insan makrofajların uyarılması için sağlam bir protokol sağlar. HMDM tarafından MET oluşumunun uyarılması için bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, iyi hücre canlılığını korumak için dikkatli hücre kültürüne ve işlemebağlıdır. Bu, gözlenen MET'lerin kapsamını ve kalitesini artıracaktır. Daha iyi hücre beslenmesi sağlamak için, HMDM korumak için kullanılan RPMI medya insan serumu içermelidir, yerine fetal sığır serum, yanı sıra L-glutamin. Bu komple RPMI ortamının her stok çözümü 1 hafta içinde kullanılmalıdır. Ortamın doğru depolanması da önemlidir. Ortam ışık yokluğunda 4 °C'de saklanmalıdır.
Buna ek olarak, HMDM'nin kültürlenmesi sırasında hücrelerin şekil ve morfolojisinin mikroskopi ile düzenli olarak izlenmesi ve izlenmesi önemlidir. IFNγ ve LPS veya IL-4 (makrofajları polarize etmek için) eklenmesinden önce gözlenen hücre şeklindeki anormal veya beklenmeyen değişiklikler hücre sağkalım hızında bir azalmaya işaret edebilir. HMDM bağlı olmalı ve çoğalmamalıdır. Bu nedenle, normal 8 günlük kültür döneminde morfoloji, hücre yoğunluğu veya yapışma kaybı herhangi bir değişiklik için hücreleri izlemek için önemlidir. İzolasyon sonrası ilk 2 gün boyunca hücre yoğunluğunda belirgin bir düşüş, ortaya çıkan HMDM'lerin sonraki deneyler için yeterince uygun olmayabileceğini düşündürmektedir. Birincil insan hücrelerini kullanmanın bir sınırlama sıcağa donörler arasındaki varyasyondur, bu da MET salınımının kapsamını belirgin bir şekilde etkileyebilir. Buna ek olarak, monositlerin izolasyonu için alınan buffy kat preparatlarının kalitesi değişebilir. Verilerin daha büyük hücre popülasyonlarını temsil etmesini sağlamak için en az üç hücre bağışçısıyla yapılan deneyleri yinelemek önemlidir.
HMDM farklılaşması için açıklanan protokolün, insan buffy kat preparatlarından izole edilmiş hücreler için, yüksek saflıkta monosit hazırlanmasıyla sonuçlanan karşıakım elutriation ile optimize edildiğini belirtmek önemlidir. Akım sitometrisi ile polarizasyon tedavilerinin doğrulanması (fenotipi doğrulamak için) ve M1 marker CD86 ve M2 marker CD206'nın ekspresyonunun değerlendirilmesi daha önce HMDM6'nınbu hazırlığı kullanılarak yapılmıştır. Bu izolasyon yönteminin yaygın olarak erişilebilir olmaması ve alternatif izolasyon yöntemlerinin (yani manyetik boncuk sıralama) tercih edilebildiği takdir edilmektedir. Alternatif bir monosit kaynağı veya farklı izolasyon protokolleri kullanılırsa, fenotip değişimini doğrulamak için ek akış sitometri deneyleri önerilir ve MET salınımını uyarmak için tedavi koşullarının bazı optimizasyonu gerekebilir.
Optimum floresan görüntüler için, pozlama süresi dikkatle ayarlanmalı ve yapışkan kaplamalara sahip plastik kültür plakalarından arka plan floresan ve boyama eserlerini önlemek için mümkün olduğunca kısa tutulmalıdır. Her iyi içeren hücrelerden birden fazla görüntü almak önemlidir. Floresan mikroskopi analizinden önce numunelerin kör olması avantajlıdır. DNA'nın hücre dışı iplikçiklerini boyamanın yanı sıra, SYTOX yeşilinin hücresel alımına dair kanıtlar da vardır. Bu membran bütünlüğü nde bir kaybı yansıttığına inanılmaktadır, MET salınımı nedeniyle olabilir, ve aynı zamanda hücre ölümü alternatif yolları ortaya çıkarabilir (ayrıca aşağıya bakınız). Bu, MET salınımını ölçmek ve daha fazla karakterize etmek için ek denemeler yapmanın önemini vurgular.
Farklı tedavi koşullarında veya MET salınımını modüle etmek için farklı müdahaleleri takiben MET salınımının kapsamının nicel bir karşılaştırması için daha fazla analiz gereklidir. Bu hücre supernatants mevcut nükleer ve mitokondriyal DNA qPCR analizi yaparak elde edilebilir, daha önce açıklandığı gibi6. Bu yöntem genellikle MET serbest6ile ilgisi olmayan hücre lisisi için kontrol etmek için laktat dehidrogenaz salınımı tahlilleri ile birleştirilir. SYTOX yeşil boyama da kısmen METs sindirmek ve kültür plakaları onları serbest bırakmak için DNase tedavisi aşağıdaki bir floresan levha okuyucu tarafından ölçülebilir. Bu metodoloji nötrofil NETs1,2,23ile önceki çalışmalarda yaygın olarak kullanılmıştır.
Bu protokolün gelecekteki uygulamaları immünohistokimya kullanarak MET'lerin daha fazla karakterizasyonu için fırsatlar sağlamak la ilgilidir. Daha karmaşık biyolojik örneklerde bu yapıların rolleri hakkında ek bilgi edinmek için metlerin protein bileşimini hedeflenen antikorlarla (örneğin, citrullinated histones veya MPO'ya karşı) kullanarak araştırmak mümkün olacaktır. Bu deneyler aynı zamanda piroptoz15gibi hücre ölümü diğer formları aşağıdaki MET salınımının açıklaması üzerinde daha fazla ışık dökülmesi için önemli olacaktır. Deneyimlerimizde makrofajlardan gelen MET'lerin, nötrofillerden gelen NET'ler kadar güçlü bir şekilde plakalara uymadığı ve bu da immünohistokimya analizini daha zorlu hale getirebileceği ne kadar güçlü bir şekilde yer alamayacağıdır. Yine de, makrofajların kronik inflamatuar hastalıklarda baskın bir rol oynadığı göz önüne alındığında, bu deneylerden elde edilen veriler ilgi çekici olacaktır. Bu yapıların daha fazla karakterizasyonu şimdiye kadar sadece sınırlı bir ölçüde yapılmıştır vivo, rollerini değerlendirmek için önemlidir16. Bu amaca ulaşmak için HMDM'yi kullanan tanımlanan yöntemin, diğer ölümsüzleştirilmiş hücre hattı kaynaklı makrofaj kaynaklarına kıyasla klinik olarak daha uygun olabileceğine inanılmaktadır; rağmen, bu hücre hatları donör varyasyonu için daha az potansiyele sahip MET karakterizasyonu için daha kararlı bir model sağlamada yarar olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sürekli IMPACT Hibesi (IPAP201601422) ve Novo Nordisk Vakfı Biyomedikal Proje Hibesi (NNF17OC0028990) tarafından desteklenmiştir. YZ ayrıca Sydney Üniversitesi'nden Avustralya Lisansüstü Ödülü'nü kabul eder. Biz monosit izolasyon ve doku kültürü ile yardım için Bay Pat Pisansarakit ve Bayan Morgan Jones teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
