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Immunology and Infection

Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60541

Summary

Présenté ici est un protocole pour détecter la production de pièges extracellulaires macrophages (MET) dans la culture cellulaire vivante en utilisant la microscopie et la coloration de fluorescence. Ce protocole peut être étendu pour examiner des marqueurs spécifiques de protéine de MET par coloration d'immunofluorescence.

Abstract

La libération de pièges extracellulaires (ET) par les neutrophiles a été identifiée comme un facteur contribuant au développement de maladies liées à l'inflammation chronique. Les ETs de Neutrophiles (NET) se composent d'un maillage d'ADN, de protéines histones et de diverses protéines granules (c.-à-d. myeloperoxidase, élastase et cathepsine G). D'autres cellules immunitaires, y compris les macrophages, peuvent également produire des ET; cependant, dans quelle mesure cela se produit in vivo et si les pièges extracellulaires macrophages (MET) jouent un rôle dans les mécanismes pathologiques n'a pas été examiné en détail. Pour mieux comprendre le rôle des MET dans les pathologies inflammatoires, un protocole a été développé pour visualiser la libération de MET des macrophages humains primaires in vitro, qui peuvent également être exploités dans des expériences d'immunofluorescence. Cela permet une caractérisation plus poussée de ces structures et leur comparaison avec les ET libérées par les neutrophiles. Les macrophages humains dérivés du monocyte (HMDM) produisent des MET lors de l'exposition à différents stimuli inflammatoires après différenciation avec le phénotype pro-inflammatoire M1. La libération des MET peut être visualisée par microscopie à l'aide d'une tache d'acide nucléique fluorescent vert qui est imperméable aux cellules vivantes (p. ex., sYTOX vert). L'utilisation de macrophages primaires fraîchement isolés, tels que hmDM, est avantageuse dans la modélisation des événements inflammatoires in vivo qui sont pertinents pour les applications cliniques potentielles. Ce protocole peut également être employé pour étudier la libération de MET des lignées humaines de cellules de monocyte (par exemple, THP-1) suivant la différenciation en macrophages avec l'acétate de myristate de phorbol ou d'autres lignées de cellules de macrophage (par exemple, les cellules de Macrophage-like de macrophage murine-comme J774A.1).

Introduction

La libération d'ETs des neutrophiles a d'abord été identifiée comme une réponse immunitaire innée déclenchée par une infection bactérienne1. Ils se composent d'une colonne vertébrale de l'ADN à laquelle diverses protéines de granule avec des propriétés antibactériennes sont liés, y compris l'élastase neutrophile et myeloperoxidase2. Le rôle principal des ET neutrophiles (ENe) est de capturer les agents pathogènes et de faciliter leur élimination3. Cependant, en plus du rôle protecteur des ET dans la défense immunitaire, un nombre croissant d'études ont également découvert un rôle dans la pathogénie de la maladie, en particulier pendant le développement de maladies induites par l'inflammation (c.-à-d. la polyarthrite rhumatoïde et l'athérosclérose4). La libération des ET peut être déclenchée par diverses cytokines pro-inflammatoires, y compris l'interleukine 8 (IL-8) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF)5,6, et l'accumulation localisée d'ET peut augmenter les lésions tissulaires et évoquer un réponse pro-inflammatoire7. Par exemple, les ET ont été impliqués comme jouant un rôle causal dans le développement de l'athérosclérose8, la promotion de la thrombose9, et la prévision du risque cardiovasculaire10.

Il est maintenant reconnu qu'en plus des neutrophiles, d'autres cellules immunitaires (c.-à-d. les mastocytes, les éosinophiles et les macrophages) peuvent également libérer des ET lors de l'exposition à la stimulation microbienne ou pro-inflammatoire11,12. Ceci peut être particulièrement significatif dans le cas des macrophages, considérant leur rôle clé dans le développement, la régulation, et la résolution des maladies inflammatoires chroniques. Par conséquent, il est important d'acquérir une meilleure compréhension de la relation potentielle entre la libération d'ET des macrophages et le développement de la maladie inflammation-connexe. Des études récentes ont montré la présence de METs et NETs dans les plaques atherosclérotiques humaines intactes et organisé thrombi13. De même, les MET ont été impliqués dans la conduite des lésions rénales par la régulation des réponses inflammatoires14. Cependant, contrairement aux neutrophiles, il existe peu de données sur les mécanismes de formation du MET à partir de macrophages. Des études récentes utilisant des modèles in vitro humains de formation MET montrent certaines différences dans les voies impliquées dans chaque type de cellule (c.-à-d., en ce qui concerne l'absence de citrullination histone avec des macrophages)6. Cependant, certains ont montré que la libération NET peut également se produire en l'absence de citrullination histone15.

L'objectif global de ce protocole est de fournir une méthode simple et directe pour évaluer la libération de MET dans un modèle de macrophage cliniquement pertinent. Il existe un certain nombre de différents modèles de cellules macrophages in vitro qui ont été utilisés pour étudier les ETM (c.-à-d., la lignée cellulaire monocyte humaine THP-1 et diverses lignées de cellules macrophages murine)16. Ces modèles sont liés à certaines limites. Par exemple, la différenciation des monocytes THP-1 aux macrophages nécessite généralement une étape d'amorçage, comme l'ajout d'acétate de myristate phorbol (PMA), qui active lui-même les voies dépendantes de la protéine kinase C (PKC). Ce processus est connu pour déclencher la libération ET4 et les résultats dans une libération basale faible MET des cellules THP-1. D'autres études ont mis en évidence certaines différences dans la bioactivité et les réponses inflammatoires montées par macrophages in vivo par rapport aux cellules THP-1 traitées par PMA17.

De même, le comportement et les réponses inflammatoires de différentes lignées cellulaires de type macrophage murine ne représentent pas complètement le spectre de réponse des macrophages humains primaires18. Par conséquent, dans le but d'étudier la formation d'ET de macrophage dans le cadre clinique, les macrophages humains primaires de monocyte-dérivé (HMDMs) sont censés être un modèle plus pertinent plutôt que monocytic ou murine macrophage-comme des lignes de cellules.

Et libération de M1 polarisé HMDMs a été démontré e après l'exposition de ces cellules à un certain nombre de stimuli inflammatoires différents, y compris l'acide hypochloreux oxydant dérivé de myeloperoxidase (HOCl), PMA, TNFMD, et IL-86. Décrit ici est un protocole pour polariser des HMDM au phénotype de M1 et visualiser la libération suivante de MET sur l'exposition à ces stimulus inflammatoires. La PMA est utilisée comme stimulus de la libération de MET pour faciliter les comparaisons avec les études précédentes qui ont utilisé des neutrophiles. Fait important, HOCl, IL-8, et TNF sont également utilisés pour stimuler la libération met, qui sont censés être de meilleurs modèles de l'environnement inflammatoire in vivo. La méthode microscopique pour la visualisation de la libération et consiste à tacher l'ADN extracellulaire dans les cultures cellulaires vivantes à l'aide de SYTOX vert, une tache d'acide nucléique vert fluorescent imperméable qui a été appliquée avec succès dans les études précédentes neutrophile. Cette méthode permet une évaluation rapide et qualitative de la libération et de l'ET, mais elle n'est pas appropriée comme méthode autonome pour la quantification de l'étendue de la libération ET. Une autre méthode devrait être utilisée si la quantification est nécessaire pour comparer l'étendue de la libération d'ET résultant de différentes conditions de traitement ou interventions.

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Protocol

Les HMDM ont été isolés des préparations de manteau buffy humain fournies par la banque de sang avec l'approbation éthique du district sanitaire local de Sydney.

1. Culture HMDM

  1. Isoler les monocytes des préparations de pelage bouffi préparées à partir du sang périphérique de donneurs humains sains à l'aide d'une préparation disponible dans le commerce pour isoler les lymphocytes, suivie d'une élutriation centrifuge contre-courant19, 20.
  2. Confirmer la présence de monocytes par cytospinning et coloration avec tache modifiée giemsa pour la caractérisation monocyte19.
  3. Dans des conditions stériles, ajuster la densité des monocytes à 1 x 106 cellules/mL à l'aide de milieux RPMI-1640 sans sérum. Ajouter 1 ml de cette suspension cellulaire à chaque puits d'une plaque de culture de tissu de 12 puits. Culture dans un incubateur cellulaire à 37 oC en présence de 5 % de CO2 pour 2 h afin de favoriser l'adhérence à la plaque de culture tissulaire.
  4. Dans des conditions stériles, retirez le milieu cellulaire et remplacez-le par un milieu culturel RPMI-1640 complet contenant 10 % (v/v) de sérum humain mis en commun et 20 mM de L-glutamine.
  5. Culture des cellules à 37 oC en présence de 5% de CO2 dans un incubateur cellulaire pendant 8 jours, en changeant les médias tous les 2 jours.

2. Polarisation du HMDM

  1. Dans des conditions stériles, préparez le milieu d'amorçage M1 en ajoutant l'interféron (IFNMD; 20 ng/mL) et le lipopolysaccharide (LPS; 1 g/mL) au média culturel complet RPMI-1640. Préparer le média d'amorçage M2 en ajoutant l'interleukine 4 (IL-4; 20 ng/mL) au média culturel complet RPMI-1640.
  2. Dans des conditions stériles, aspirez les supports des puits de plaque de culture tissulaire qui contiennent le HMDM, qui ont été ensemencés et cultivés comme décrit à la section 1.
  3. Laver soigneusement les puits contenant les cellules 3x avec du PBS stérile (pré-chauffé à 37 oC), en utilisant 1 ml d'aliquots de PBS.
  4. Ajouter 1 mL du support d'amorçage M1 ou M2 à chaque puits contenant le HMDM (selon le cas approprié à l'expérience).
  5. Incuber les cellules pendant 48 h à 37 oC en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.

3. Stimulation de HMDM pour induire la libération de MET

  1. Dans des conditions stériles, préparez le support culturel contenant différents stimulateurs de libération de MET (selon le cas approprié pour l'expérience) au support complet RPMI-1640 : PMA (25 nM), tNFmD recombinant humain (25 ng/mL), ou IL-8 recombinant humain (50 ng/mL) ).
  2. Pour les expériences de stimulation HOCl, préparer HOCl (200 M) dans HBSS (pré-chauffé à 37 oC), immédiatement avant l'ajout aux cellules. Assurez-vous que le HOCl n'est pas préparé dans un support cellulaire complet.
    REMARQUE: La concentration de la solution de stock de HOCl est quantifiée en mesurant l'absorption UV de la solution à 292 nm et pH 116 et en utilisant un coefficient d'extinction de 350 M-1cm-121.
  3. Après le traitement de polarisation décrit dans la section 2, aspirer le support cellulaire de chaque puits et laver soigneusement les cellules 3x avec 1 mL d'aliquots de l'un ou l'autre: stérile PBS (pour PMA, TNF et IL-8) ou HBSS (pour HOCl), qui ont été pré-chauffés à 37 oC.
  4. Pour les expériences avec PMA, TNFMD ou IL-8 : ajoutez 1 mL du support complet contenant des PMA, TNFMD ou IL-8 après avoir enlevé le PBS dans l'étape finale du lavage.
  5. Pour les expériences avec le TNMD, incuber les cellules pendant 6 h à 37 oC en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire. Pour les expériences avec PMA et IL-8, incuber les cellules pendant 24 h à 37 oC en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.
  6. Pour les expériences avec HOCl, ajouter 1 ml de HOCl dans HBSS après avoir enlevé le HBSS dans l'étape finale de lavage. Ensuite, incuber les cellules pendant 15 min à 37 oC en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.
    1. Aspirez soigneusement le supernatant de cellules et lavez les cellules 3x avec 1 mL d'aliquots de HBSS comme décrit dans l'étape 3.3.
    2. Après avoir retiré le HBSS de l'étape finale de lavage, ajoutez 1 ml de support culturel complet RPMI-1640. Ensuite, incuber les cellules pendant 24 h à 37 oC en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.

4. Visualisation du MET dans la culture des cellules vivantes

  1. Préparer le colorant vert SYTOX dans le HBSS à une concentration de 40 M.
  2. À la fin des traitements décrits à la section 3 pour induire la libération du MET, ajoutez directement 25 ll de 40 M de colorant à chaque puits contenant du HMDM.
  3. Incuber les cellules à température ambiante (RT) pendant 5 min dans l'obscurité.
  4. Placez le HMDM dans des puits de culture tissulaire au stade du microscope d'un microscope fluorescent inversé pour l'imagerie.
  5. Procédures de microscope
    1. Allumez une source de lumière fluorescente à large spectre, une source lumineuse de brightfield et un microscope inversé installé à l'abri d'un appareil photo numérique couleur haute résolution (voir Tableau des matériaux).
    2. Faites pivoter la roue du filtre jusqu'à la position « numéro 2 » pour la fluorescence verte (excitation de 504 nm, émission de 523 nm) pour l'imagerie des échantillons verts tachés contenus dans les puits de culture tissulaire.
    3. En utilisant l'objectif 5x, concentrer l'image avec la mise au point grossière, puis les boutons de mise au point fine sur le microscope, jusqu'à ce que l'image semble nette, claire et ciblée lorsqu'on la regarde à travers l'oculaire du microscope.
    4. Passez le microscope en mode caméra.
    5. Démarrez le logiciel associé.
    6. Sélectionnez l'onglet Capture sur le logiciel.
    7. Cliquez sur le bouton Play pour prévisualiser l'image et ajuster le bouton de mise au point fine sur le microscope jusqu'à ce que l'image semble nette, claire et focalisée dans la fenêtre de prévisualisation du logiciel.
    8. Cliquez sur le bouton Capture.
      REMARQUE: L'image capturée s'affiche automatiquement dans le logiciel d'accompagnement.
    9. Dans le logiciel, cliquez sur Fichier Enregistrer comme le type de fichier d'image requis.
    10. Au microscope, faites pivoter la roue du filtre jusqu'à la position « numéro 5 » pour l'imagerie brightfield et répétez les étapes 4.5.2-4.5.9 pour obtenir l'image de brightfield correspondante.
    11. Répétez les étapes 4.5.2-4.5.10 si nécessaire pour l'acquisition d'image ultérieure.

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Representative Results

Les images brightfield montrant les changements morphologiques de HMDM en réponse aux stimuli pour la différenciation cellulaire sont montrées dans la figure 1. Les macrophages polarisés M1 provenant d'expériences avec HMDM exposés à l'IFNMD et au LPS ont montré une forme cellulaire allongée et en forme de fuseau, comme l'indiquent les flèches noires de la figure 1 (panneau du milieu). À titre de comparaison, la morphologie des macrophages polarisés M2 après l'exposition du HMDM à l'ILDM pendant 48 h était généralement ronde et plate, comme l'indiquent les flèches noires de la figure 1 (panneau d'extrême droite).

La capacité des phénotypes HMDM différenciés à libérer des MET a été visualisée par imagerie par fluorescence cellulaire vivante avec SYTOX vert, tel que présenté dans la figure 2. La figure 2A montre les données de contrôle obtenues à partir de chaque phénotype HMDM incubé pendant 24 h en l'absence de stimuli pro-inflammatoires. Dans ce cas, il y avait très peu de taches vertes, comme on s'y attendait, étant donné la nature impérieuse de la cellule de cette tache. La figure 2B a montré des taches positives pour les MET, résultant de l'exposition des HMDM M1 à HOCl, PMA, IL-8, ou TNFMD. Les MET sont indiqués par les flèches blanches, représentées sous forme de stries vertes, résultant des brins d'ADN extracellulaire. Avec HOCl, en plus de tacher l'ADN extracellulaire, il y avait une certaine coloration verte apparente dans les cellules. Cette coloration cellulaire a également été observée dans une certaine mesure avec les autres stimuli et est censé refléter la perte de l'intégrité de la membrane résultant de la mort cellulaire ET-indépendante en raison des conditions de traitement.

La figure 2B montre également les expériences correspondantes effectuées avec les MDM M2, qui ont été exposés à l'IL-4. Dans ce cas, il n'y avait aucune libération d'ADN des cellules, comme indiqué par l'absence des brins/streaks de l'ADN extracellulaire ; cependant, il y avait une certaine prise cellulaire de colorant fluorescent vert avec le HOCl et le TNF. À des fins comparatives, la figure 3 montre des données représentatives indiquant la libération de MET des macrophages THP-1 exposés à TNFMD (50 ng/mL) pendant 4 h. Dans ce cas-ci, il convient de noter qu'une population non polarisée de cellules a été employée, et les monocytes de THP-1 ont été différenciés aux macrophages par pré-traitement avec PMA (50 ng/mL pour 72 h) comme décrit précédemment22.

Figure 1
Figure 1 : Changements morphologiques des HMDM polarisés différentiels. Images lumineuses représentatives de HMDM non différenciés et différenciés (n 5). Les HMDM ont été cultivés avec des supports complets contenant du sérum humain et de la glutamine pendant 8 jours avant d'amorçage au phénotype M1 ou M2 lors de l'exposition à l'IFNMD et au LPS ou à l'IL-4, respectivement, pendant 48 h. Barre à l'échelle de 200 m. Les flèches indiquent des exemples de cellules présentant des caractéristiques morphologiques des HMDM M1 ou M2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Les MET produits par les HMDM M1 après hoCl, PMA, IL-8 et stimulation TNMMD. Des images représentatives de HMDM teintés verts SYTOX de (A) M1 non stimulés et M2 HMDMs incubés pendant 24 h en l'absence de stimuli inflammatoires ont été utilisés comme le contrôle, démontrant l'absence de libération MET. (B) Les HMDM M1 et M2 ont été traités avec 1) HOCl (200 M, 15 min), PMA (25 nM), ou IL-8 (50 ng/mL) avec incubation pendant 24 h ou 2) TNHMD (25 ng/mL) avec incubation pendant 6 h pour induire la libération de MET. Les MET ont été visualisés par l'ajout de SYTOX vert, comme indiqué par les flèches blanches dans le panneau supérieur de M1 HMDMs. Aucun METS n'a été observé dans les expériences correspondantes avec les MDM M2. Les données sont représentatives des puits de culture répliqués provenant de 3 donneurs individuels. Barre d'échelle de 500 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Les MET produits par des macrophages THP-1 non polarisés après la stimulation du TNMD. Images représentatives des macrophages TNP-1 teintés de vert SYTOX, qui ont été différenciés par prétraitement par PMA (50 ng/mL pour 72 h) avant d'être incubations pendant 4 h en l'absence ou la présence de TNFMD (50 ng/mL) pour induire la libération du MET. Les MET ont été visualisés par l'ajout de SYTOX vert. Les données sont représentatives des puits de culture répliqués des expériences n '3. Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La génération et la visualisation de la formation MET à l'aide de HMDM différenciés M1 représente un nouveau modèle in vitro qui peut être utile pour étudier le rôle pathologique potentiel de ces structures macrophages, en particulier sous inflammatoire chronique Conditions. Il fournit un protocole robuste pour la stimulation des macrophages humains primaires pour libérer des METs, qui peuvent également être utilisés dans des études connexes avec des lignées de cellules de macrophage de monocyte humain ou de macrophage murine. La mise en œuvre réussie de ce protocole pour la stimulation de la formation de MET par HMDM dépend de la culture cellulaire et de la manipulation soigneuses pour maintenir une bonne viabilité cellulaire. Cela augmentera l'étendue et la qualité des MET observés. Pour fournir une meilleure nutrition cellulaire, le support RPMI utilisé pour maintenir le HMDM devrait contenir du sérum humain, plutôt que du sérum bovin fœtal, ainsi que de la L-glutamine. Chaque solution d'achat de ce support COMPLET RPMI doit être utilisée dans un délai d'une semaine. Un stockage correct des supports est également important. Les supports doivent être stockés à 4 oC en l'absence de lumière.

En outre, il est important d'observer et de surveiller régulièrement la forme et la morphologie des cellules par microscopie pendant la culture de HMDM. Tout changement anormal ou inattendu de la forme des cellules observé avant l'ajout d'IFNet et de LPS ou de l'IL-4 (pour polariser les macrophages) peut indiquer une réduction du taux de survie cellulaire. HMDM doit être adhérent et ne pas proliférer. Il est donc important de surveiller les cellules pour tout changement dans la morphologie, la densité cellulaire, ou la perte d'adhérence au cours de la période normale de culture de 8 jours. Une diminution spectaculaire de la densité cellulaire au cours des 2 premiers jours après l'isolement suggère que les HMDM qui en résultent pourraient ne pas être suffisamment viables pour les expériences ultérieures. Une limitation de l'utilisation des cellules humaines primaires est la variation entre les donneurs, qui peut influencer de façon marquée l'étendue de la libération de MET. En outre, la qualité des préparations de pelage buffy reçues pour l'isolement des monocytes peut varier. Il est important de répéter des expériences avec au moins trois donneurs de cellules individuels pour s'assurer que les données sont représentatives de plus grandes populations de cellules.

Il est important de noter que le protocole décrit pour la différenciation HMDM a été optimisé pour les cellules isolées des préparations de pelage buffy humain par l'élutriation contre-courante, qui a comme conséquence une préparation de monocyte de haute pureté. La validation des traitements de polarisation (pour confirmer le phénotype) par cytométrie de flux et évaluation de l'expression du marqueur M1 CD86 et du marqueur M2 CD206 a été réalisée précédemment en utilisant cette préparation de HMDM6. Il est reconnu que cette méthode d'isolement peut ne pas être largement accessible, et que d'autres méthodes d'isolement (c.-à-d., le tri de perles magnétiques) peuvent être préférables. Si une autre source de monocytes ou différents protocoles d'isolement est utilisée, des expériences de cytométrie de flux supplémentaires pour valider le changement de phénotype sont recommandées, et une certaine optimisation des conditions de traitement pour stimuler la libération de MET peut être nécessaire.

Pour des images de fluorescence optimales, le temps d'exposition doit être soigneusement ajusté et gardé aussi court que possible pour éviter la fluorescence de fond et les artefacts de coloration des plaques de culture en plastique, qui ont des revêtements adhérents. Il est important de prendre plusieurs images de chaque puits contenant des cellules. Il est avantageux si les échantillons sont aveuglés avant l'analyse de microscopie de fluorescence. En plus de tacher des brins extracellulaires d'ADN, il y a également des preuves de l'utilisation cellulaire du vert SYTOX. On pense que cela reflète une perte dans l'intégrité de la membrane, qui peut être en raison de la libération de MET, et il peut également révéler d'autres voies de la mort cellulaire (voir aussi ci-dessous). Cela souligne l'importance d'effectuer d'autres expériences pour quantifier et caractériser davantage la libération de MET.

Pour une comparaison quantitative de l'étendue de la libération du MET dans différentes conditions de traitement ou à la suite d'interventions différentes pour moduler la libération de MET, une analyse plus approfondie est nécessaire. Ceci peut être réalisé en effectuant l'analyse qPCR de l'ADN nucléaire et mitochondrial présent dans les supernatants de cellules, comme décrit précédemment6. Cette méthode est généralement combinée avec des essais de libération de déshydrogénase de lactate pour contrôler la lyse cellulaire sans rapport avec la libération de MET6. La coloration verte SYTOX peut également être quantifiée par un lecteur de plaque de fluorescence suivant le traitement DNase pour digérer partiellement les MET et les libérer des plaques de culture. Cette méthodologie a été largement utilisée dans des travaux antérieurs avec les NET neutrophiles1,2,23.

Les applications futures de ce protocole se rapportent à fournir des occasions pour davantage de caractérisation des MET utilisant l'immunohistochimie. Il sera possible de sonder la composition protéique des ETM à l'aide de cette approche à l'aide d'anticorps ciblés (c.-à-d. contre les histones citrullinées ou MPO) afin d'obtenir un aperçu supplémentaire des rôles de ces structures dans des échantillons biologiques plus complexes. Ces expériences seront également importantes pour faire la lumière sur la délimitation de la libération de MET suite à d'autres formes de mort cellulaire, comme la pyroptose15. Il est intéressant de noter que, d'après notre expérience, les MET des macrophages n'adhèrent pas aussi fortement aux plaques que les NET des neutrophiles, ce qui peut rendre l'analyse d'immunohistochimie plus difficile. Néanmoins, les données de ces expériences seront intéressantes, étant donné que les macrophages jouent souvent un rôle dominant dans les maladies inflammatoires chroniques. Une caractérisation plus poussée de ces structures est essentielle pour évaluer leurs rôles in vivo, qui n'ont jusqu'à présent été réalisés que dans une mesure limitée16. On croit que la méthode décrite utilisant HMDM pour atteindre cet objectif peut être plus pertinente sur le plan clinique par rapport à d'autres sources de macrophage dérivées de la lignée cellulaire immortalisée; bien que, ces lignées cellulaires puissent être utiles en fournissant un modèle plus stable pour la caractérisation du MET avec moins de potentiel de variation des donneurs.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention IMPACT perpétuelle (IPAP201601422) et Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ reconnaît également la réception d'un Australian Postgraduate Award de l'Université de Sydney. Nous tenons à remercier M. Pat Pisansarakit et Mme Morgan Jones pour leur aide dans l'isolement des monocytes et la culture tissulaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
120Q broad spectrum fluorescent light source EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) Sigma-Aldrich CLS3336 For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) Polysciences Inc. 24606 Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS) Thermo-Fisher 14025050 For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl) Sigma-Aldrich 320331 For MET stimulation
Interferon gamma Thermo-Fisher PMC4031 For M1 priming
Interleukin 4 Integrated Sciences rhil-4 For M2 priming
Interleukin 8 Miltenyl Biotec 130-093-943 For MET stimulation
L-Glutamine Sigma-Aldrich 59202C Added to culture media
Lipopolysaccharide Integrated Sciences tlrl-eblps For M1 priming
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS 1114544 For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D5652 For washing steps
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R8758 For cell culture
SYTOX green Life Technologies S7020 For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source Olympus, Tokyo, Japan x-cite series
Tumor necrosis factor alpha Lonza 300-01A-50 For MET stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie et infection numéro 153 piège extracellulaire macrophage MET inflammation sYTOX vert microscopie fluorescence
Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes
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Zhang, Y., Rayner, B. S., Jensen,More

Zhang, Y., Rayner, B. S., Jensen, M., Hawkins, C. L. In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (153), e60541, doi:10.3791/60541 (2019).

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