Summary
这里介绍的是一种使用显微镜和荧光染色检测活细胞培养中巨噬细胞外陷阱 （MET） 生产的协议。此方案可进一步扩展，通过免疫荧光染色检查特定的 MET 蛋白标记物。
Abstract
嗜中性粒细胞释放细胞外陷阱（ETs）已被确定为导致慢性炎症相关疾病发展的一个因素。中性粒细胞（NETs）由DNA、组蛋白和各种颗粒蛋白（即骨髓过氧化物酶、电感酶和卡西普辛G）组成的网状物组成。其他免疫细胞，包括巨噬细胞，也可以产生ET;然而，这在体内发生的程度，以及巨噬细胞外陷阱（METs）是否在病理机制中发挥作用，尚未得到详细研究。为了更好地了解MET在炎症性病理中的作用，开发了一种方案，用于在体外可视化来自原发性人类巨噬细胞的MET释放，在免疫荧光实验中也可以加以利用。这允许进一步描述这些结构，并将其与从嗜中性粒细胞释放的ET进行比较。人类单细胞衍生巨噬细胞（HMDM）在接触不同炎症刺激后，在M1亲炎表型分化后产生MET。MET的释放可以通过显微镜可视化，使用绿色荧光核酸染色，不透过活细胞（例如，SYTOX绿色）。使用新鲜分离的原生巨噬细胞（如 HMDM）有利于模拟与潜在临床应用相关的体内炎症事件。该协议还可用于研究从人类单细胞细胞系（例如，THP-1）的MET释放后分化为巨噬细胞与磷酸酯或其他巨噬细胞系（例如，鼠巨噬细胞一样的J774A.1细胞）。
Introduction
从嗜中性粒细胞释放的ET首先被确定为由细菌感染1触发的先天免疫反应。它们由DNA骨干组成，各种具有抗菌特性的颗粒蛋白被结合，包括嗜中性乳酸酶和骨髓过氧化物酶2。中性粒细胞（NETs）的主要作用是捕获病原体并促进其消除3。然而，除了ETs在免疫防御中的保护作用外，越来越多的研究也发现了疾病发病机制的作用，特别是在炎症驱动型疾病（即风湿性关节炎和动脉粥样硬化4。ET的释放可以由各种亲炎细胞因子触发，包括白细胞介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子α（TNF+）5，6，并且ET的局部积累可以增加组织损伤，并引起亲炎反应7。例如，ET被牵连为在动脉粥样硬化8的发展，促进血栓形成9，和预测心血管风险10的因果作用。
现在人们认识到，除了嗜中性粒细胞外，其他免疫细胞（即乳腺细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞）也可以在暴露于微生物或亲炎刺激11、12时释放ETs。考虑到巨噬细胞在慢性炎症疾病的发展、调节和解决中的重要作用，这可能在巨噬细胞方面特别重要。因此，有必要更好地了解从巨噬细胞中释放ET与炎症相关疾病发展之间的潜在关系。最近的研究表明，在完整的人类动脉粥样硬化斑块和有组织的血栓13中存在MET和NET。类似地，METS也涉嫌通过调节炎症反应14来驱动肾损伤。然而，与嗜中性粒细胞相比，关于巨噬细胞的MET形成机制的数据有限。最近使用MET形成人类体外模型的研究表明，每种细胞类型（即缺乏巨噬细胞组蛋白的细胞）所涉及的途径存在一些差异。然而，一些已经表明，NET释放也可以发生在没有组蛋白的切口15。
该协议的总体目标是提供一种简单而直接的方法，在临床相关的巨噬菌体模型中评估MET释放。有许多不同的体外巨噬细胞模型，已用于研究METs（即，THP-1人类单细胞细胞系和各种鼠巨噬细胞系）16。这些模型存在一些限制。例如，THP-1单核细胞与巨噬细胞的分化通常需要一个启动步骤，例如添加醋酸磷酸酯（PMA），它本身激活蛋白质激酶C（PKC）依赖通路。此过程已知可触发 ET 释放4，并产生 THP-1 细胞的低基底 MET 释放。其他研究也突显了与PMA处理的THP-1细胞17相比，体内巨噬细胞在生物活性和炎症反应方面的差异。
同样，不同鼠群状细胞系的行为和炎症反应并不完全代表人类原发性巨噬细胞18的反应谱。因此，为了研究在临床环境中的巨噬细胞ET形成，主要人类单细胞衍生巨噬细胞（HMDMs）被认为是一个更相关的模型，而不是单细胞或鼠狼类似细胞的细胞系。
M1极化HMDM的ET释放已经证明，这些细胞暴露于许多不同的炎症刺激，包括骨髓过氧化物酶衍生的氧化氯酸（HOCl），PMA，TNF®和IL-86。此处描述的是一种将 HmDM 与 M1 表型极化的协议，并在暴露于这些炎症刺激时可视化后续 MET 释放。PMA被用作MET释放的刺激，以方便与以前使用中性粒细胞的研究进行比较。重要的是，HOCl、IL-8和TNF®也用于刺激MET释放，这被认为是体内炎症环境的更好模型。ET释放可视化的微观方法涉及使用SYTOX绿色染色活细胞培养物中的细胞外DNA，这是一种不透水的荧光绿色核酸染色，已成功应用于以前的中性粒细胞研究。此方法允许对 ET 释放进行快速和定性的评估，但它不适合作为 ET 释放范围的量化的独立方法。如果需要量化以比较不同治疗条件或干预措施产生的 ET 释放程度，则应使用替代方法。
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Protocol
HMDM与血库提供的人体布漆制剂分离，并经悉尼当地卫生区道德认证。
1. HMDM文化
- 利用市售制剂分离淋巴细胞，从健康人类捐献者外周血中制备的单核细胞，然后逆流离心性电镀19， 20.
- 确认单核细胞的存在，通过细胞旋转和染色与修饰的吉姆萨染色单细胞表征19。
- 在无菌条件下，使用不含血清的RPMI-1640培养基，将单核细胞的密度调整至1 x 106细胞/mL。将1mL的这种细胞悬浮液添加到12孔组织培养板的每个孔中。在细胞培养箱中培养在37°C下，在5%CO2的存在下2小时，以促进粘附在组织培养板上。
- 在无菌条件下，取出细胞介质，用含有10%（v/v）汇集的人类血清和20 mM L-谷氨酰胺的完整RPMI-1640培养基替换。
- 在细胞培养箱中以5%CO2的存在在37°C下培养细胞8天，每2天更换一次介质。
2. HMDM的极化
- 在无菌条件下，通过在完整的 RPMI-1640 培养基介质中加入干扰素 +（IFN®;20 纳克/mL）和脂多糖（LPS;1 μg/mL），制备 M1 注注介质。通过在完整的 RPMI-1640 培养基介质中添加白莱素 4 （IL-4; 20 纳克/mL），准备 M2 充注介质。
- 在无菌条件下，从含有HMDM的组织培养板井中吸出培养的介质，如第1节所述，HMDM已播种和培养。
- 用无菌PBS（预加热至37°C）仔细清洗含有细胞3倍的井，使用1mL等分的PBS。
- 将 1 m1 或 M2 注油介质添加到包含 HMDM 的每个井中（以适合实验者为准）。
- 在细胞培养箱中，在5%CO2存在的情况下，在37°C下孵育细胞48小时。
3. 刺激HMDM诱导MET释放
- 在无菌条件下，将含有不同MET释放（以适合实验者为准）的培养培养基制备到完整的RPMI-1640介质：PMA（25 nM）、人体重组TNF+（25纳克/mL）或人体重组IL-8（50纳克/mL）).
- 对于使用HOCl刺激的实验，在HBSS中制备HOCl（200μM），在加入细胞之前，预热至37°C。确保 HOCl 未在完整的电池介质中制备。
注：通过测量溶液的紫外线吸收度在292nm和pH = 116，并使用350M-1cm-121的消光系数，对HOCl的库存溶液的浓度进行量化。 - 在第2节所述的极化处理后，从每个孔中吸出细胞介质，用1mL等分液仔细清洗细胞3x：无菌PBS（PMA、TNF+和IL-8）或HBSS（对于HOCl），这些细胞被预加热至37°C。
- 对于 PMA、TNF® 或 IL-8 的实验：在最终洗涤步骤中去除 PBS 后，添加包含 PMA、TNF+ 或 IL-8 的完整介质的 1 mL。
- 对于TNF®实验，在细胞培养箱中存在5%CO2的情况下，在37°C下孵育细胞6小时。对于PMA和IL-8的实验，在细胞培养箱中存在5%CO2的情况下，在37°C下孵育细胞24小时。
-
对于 HOCl 实验，在最后洗涤步骤中去除 HBSS 后，在 HBSS 中加入 1 mL 的 HOCl。然后，在细胞培养箱中，在5%CO2的情况下，在37°C下孵育细胞15分钟。
- 如步骤 3.3 所述，小心地吸出细胞上清液，用 1 mL 等分的 HBSS 洗涤细胞 3x。
- 从最终洗涤步骤中取出 HBSS 后，添加 1 mL 的完整 RPMI-1640 培养基。然后，在细胞培养箱中，在存在5%CO2的情况下，在37°C下孵育细胞24小时。
4. 活细胞培养中的MET可视化
- 在HBSS中制备SYTOX绿色染料，浓度为40μM。
- 在第3节描述的诱导MET释放的处理结束时，直接向每口含有HMDM的染料中加入25μL的40μM染料。
- 在黑暗中在室温（RT）下孵育细胞5分钟。
- 将HMDM置于组织培养井中，置于倒置荧光显微镜的显微镜阶段进行成像。
-
显微镜程序
- 打开装有高分辨率彩色数码相机的广谱荧光光源、广场光源和倒置显微镜（参见材料表）。
- 将滤芯旋转到绿色荧光的"2号"位置（激发 = 504 nm，发射 = 523 nm），用于对组织培养孔中所含的绿色染色样品进行成像。
- 使用 5x 目标，用粗焦聚焦图像，然后在显微镜上聚焦精细对焦旋钮，直到通过显微镜目镜查看图像时图像呈现锐利、清晰和聚焦。
- 将显微镜切换到相机模式。
- 启动关联的软件。
- 选择软件上的"捕获"选项卡。
- 单击"播放"按钮可预览图像并调整显微镜上的精细对焦旋钮，直到图像在软件预览窗口中显示清晰、清晰和聚焦。
- 单击"捕获"按钮。
注：捕获的图像将自动显示在随附的软件中。 - 在软件中，单击"文件|另存为所需的图像文件类型。
- 在显微镜上，将滤清轮旋转到"5号"位置进行明场成像，并重复步骤 4.5.2~4.5.9 以获得相应的亮场图像。
- 根据需要重复步骤 4.5.2_4.5.10，以便进行后续图像采集。
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Representative Results
显示HMDM在细胞分化刺激中形态变化的图像如图1所示。M1 与暴露于 IFN® 和 LPS 的 HMDM 实验中产生的 M1 极化巨噬细胞显示了一个长而轴状的细胞形状，如图1（中间面板）中的黑色箭头所示。相比之下，M2极化巨噬细胞在暴露于IL-4444小时后的形态通常是圆形和扁平的，如图1（最右侧面板）中的黑色箭头所示。
分化HMDM表型释放MET的能力通过带SYTOX绿色的活细胞荧光成像可视化，如图2所示。图2A显示了在没有任何促进炎症刺激的情况下，从孵育了24小时的每种HMDM表型中获得的对照数据。在这种情况下，有非常有限的绿色染色，正如预期的那样，鉴于这种染色的细胞不透水的性质。图 2B显示了由于 M1 HMDM 暴露于 HOCl、PMA、IL-8 或 TNF® 而导致的 MET 的正染色。MET由白色箭头表示，显示为绿色条纹，由细胞外DNA链产生。使用HOCl，除了染色细胞外DNA外，细胞中还有明显的绿色染色。这种细胞染色也在一定程度上与其他刺激观察到，并且被认为反映了由于治疗条件导致与ET无关的细胞死亡造成的膜完整性损失。
图 2B还显示了对 M2 HMDM 进行的相应实验，这些 M2 HmDM 暴露于 IL-4 中。在这种情况下，没有从细胞中释放DNA，这表现在细胞外DNA的链/条纹没有;然而，在HOCl和TNF®中，绿色荧光染料的细胞内有一些接受。为了进行比较目的，图 3显示了代表性数据，表明 THP-1 巨噬细胞在 4 小时内暴露于 TNF®（50 纳克/mL） 的 MET 释放。在这种情况下，应该注意，使用非极化细胞群，THP-1单核细胞通过PMA（50纳克/mL为72小时）的预处理分化为巨噬细胞，如前所述22。
图1：微分极化HMM的形态变化。来自非差别和差异化 HMDM （n +5） 的代表性亮场图像。HMDM在暴露于IFN®和LPS或IL-4时，用含有人血清和谷氨酰胺的完整培养基培养8天，然后分别注录到M1或M2表型，分别为48小时。箭头表示显示M1或M2 HMDM形态特征的细胞的例子。请点击这里查看此图的较大版本。
图2：M1 HMDM在HOCl、PMA、IL-8和TNF+刺激后产生的MET。SYTOX绿色染色HMM的代表性图像从 （A） 非刺激 M1 和 M2 HMDM 孵育 24 小时，没有任何炎症刺激用作控制， 表明没有 MET 释放.（B） M1 和 M2 HMDM 用 1） HOCl （200 μM， 15 分钟）、 PMA （25 nM） 或 IL-8 （50 纳克/mL） 进行培养，孵育 24 h 或 2） TNF+（25 纳克/mL），孵育6 h，诱导MET释放。MET 通过添加 SYTOX 绿色来可视化，M1 HMDM 上面板中的白色箭头表明了这一点。在M2 HMDM的相应实验中未发现METS。数据代表来自n+3个个体捐赠者的复制文化井。刻度条 = 500 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：TNF+刺激后非极化THP-1巨噬细胞产生的MET。SYTOX 绿色染色 TNP-1 巨噬细胞的代表性图像，通过 PMA 预处理（50 纳克/mL，72 小时）进行区分，在 TNF® （50 纳克/mL） 不存在的情况下进一步孵育 4 小时，以诱导 MET 释放。MET 通过添加 SYTOX 绿色来可视化。数据代表从n =3实验复制文化井。刻度条 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
使用M1分化HMDM生成和可视化MET形成是一种新的体外模型，可能有助于研究这些巨噬菌体结构的潜在病理作用，特别是在慢性炎症下条件。它为刺激原发性人类巨噬细胞释放MET提供了强有力的方案，也可用于与人类单核细胞或鼠群细胞系相关的研究。HMDM刺激MET形成的该协议的成功实施取决于仔细的细胞培养和处理，以保持良好的细胞活力。这将提高所观察到的 MET 的范围和质量。为了提供更好的细胞营养，用于维持HMDM的RPMI培养基应包含人血清，而不是胎儿牛血清以及L-谷氨酰胺。此完整 RPMI 介质的每个库存解决方案应在 1 周内使用。正确存储介质也很重要。在没有光线的情况下，介质应储存在 4°C 下。
此外，在HMDM的培养过程中，定期观察和监测细胞的形状和形态，这一点很重要。在添加IFN®和LPS或IL-4（使巨噬细胞偏振）之前观察到的细胞形状的任何异常或意外变化可能表明细胞存活率下降。HMDM 应坚持且不扩散。因此，在正常8天培养期间，监测细胞的形态、细胞密度或依从性丧失的任何变化是很重要的。隔离后头两天细胞密度的急剧下降表明，产生的HMDM可能不足以用于后续实验。使用原发性人细胞的一个限制是捐赠者之间的变异，这可能显著影响MET释放的程度。此外，为分离单核细胞而收到的布漆制剂的质量可能有所不同。重要的是对至少三个单独的细胞捐赠者进行重复实验，以确保数据能够代表更大的细胞群。
需要注意的是，HMDM分化所述方案已针对通过逆流抗性抗流化从人类牛皮涂层制剂中分离的细胞进行了优化，从而产生高纯度单细胞制剂。通过流动细胞测定和M1标记CD86和M2标记CD206的表达，以前已经使用这种HMDM6的制备方法对极化处理（确认表型）进行了验证。人们认识到，这种隔离方法可能无法广泛访问，并且替代隔离方法（即磁珠排序）可能更可取。如果使用单核细胞的替代来源或不同的隔离协议，建议进行额外的流式细胞测量实验以验证表型变化，并且可能需要对治疗条件进行一些优化，以刺激 MET 释放。
为了获得最佳荧光图像，应仔细调整曝光时间并尽可能缩短曝光时间，以避免塑料培养板的背景荧光和染色伪影，塑料培养板具有附着涂层。从包含单元格的每个井中获取多个图像非常重要。如果在荧光显微镜分析之前使样品失明，则这是有利的。除了染色细胞外链的DNA，也有证据的细胞吸收SYTOX绿色。这被认为反映了膜完整性的丧失，这可能是由于MET释放，它也可以揭示细胞死亡的替代途径（另见下文）。这突出了执行其他实验以量化和进一步描述 MET 释放的重要性。
为了定量比较不同治疗条件下或根据不同的干预措施调节MET释放的MET释放程度，需要进一步分析。这可以通过对细胞上生子中存在的核和线粒体DNA进行qPCR分析来实现，如前6所述。这种方法通常与乳酸脱氢酶释放测定相结合，以控制与MET版本6无关的细胞解脱。SYTOX 绿色染色也可以通过荧光板读取器在 DNase 处理后进行量化，以部分消化 MET 并将其从培养板中释放。该方法在以前与中性粒细胞NETs1、2、23的工作中被广泛使用。
该协议的未来应用涉及为使用免疫性化学进一步表征MET提供机会。利用这种方法与靶向抗体（即，针对柠檬酸组蛋白或MPO）探讨METs的蛋白质组成，以进一步了解这些结构在更复杂的生物样本中的作用。这些实验对于在其他形式的细胞死亡（如丙酮病15）之后对MET释放的划定也非常重要。值得注意的是，根据我们的经验，来自巨噬细胞的MET不像嗜中性粒细胞的NET那样强烈地粘附在板块上，这使得免疫性细胞化学分析更具挑战性。尽管如此，这些实验的数据将引起人们的兴趣，因为巨噬细胞在慢性炎症疾病中往往起主导作用。进一步描述这些结构对于评估它们在体内的作用至关重要，迄今为止，这种结构只在有限的程度上进行了16次。据认为，使用HMDM达到这一目的的所述方法与其他不朽的细胞系衍生的巨噬细胞源相比，在临床上可能更具有临床相关性;虽然，这些细胞系可能有用的为MET表征提供一个更稳定的模型，减少供体变异的可能性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了永久IMPACT赠款（IPAP201601422）和诺和诺德基金会生物医学项目赠款（NNF17OC0028990）的支持。YZ 还感谢悉尼大学获得澳大利亚研究生奖。我们要感谢帕特·皮桑萨拉基特先生和摩根·琼斯女士在单核细胞隔离和组织培养方面给予的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
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