Summary
Her præsenterer vi en protokol til at frigøre hornhinde endotelceller (CEC) fra Descemets membran (DM) ved hjælp af en neodym:YAG (Nd:YAG) laser som en ex vivo sygdom model for bullous keratopathy (BK).
Abstract
Nd: YAG lasere er blevet brugt til at udføre noninvasive intraokulær kirurgi, såsom capsulotomy i flere årtier nu. Den skarpe effekt er afhængig af den optiske opdeling på laser fokus. Akustiske chokbølger og kavitationsbobler genereres, hvilket forårsager vævsbrud. Boblestørrelser og trykamplitudes varierer med pulsenergi og position af omdrejningspunktet. I denne undersøgelse, enucleated svin øjne var placeret foran en kommercielt tilgængeligE Nd: YAG laser. Variable puls energier samt forskellige positioner af brændpunkterne posteriort til hornhinden blev testet. Resulterende læsioner blev evalueret ved to-foton mikroskopi og histologi for at bestemme de bedste parametre for en eksklusiv løsrivelse af hornhinde endotelceller (CEC) med minimal følgeskader. Fordelene ved denne metode er den præcise ablation af CEC, reduceret følgeskader, og frem for alt, den ikke-kontakt behandling.
Introduction
Gennemsigtighed af hornhinden er afgørende for transmission af lys til nethinden og dens fotoreceptorer1. I denne henseende er en relativ tilstand af dehydrering afgørende for at holde kollagen fibre i hornhinden stroma korrekt justeret. Denne homøostase vedligeholdes af hornhindeens endotelceller (CEC), der er placeret på Descemets membran (DM)2. Endotel er det inderste hornhindelag. Det har en vigtig barriere og pumpe funktion, som er afgørende for hornhinde gennemsigtighed3. I modsætning til epitel, endotel er ikke i stand til selvforny4. Derfor stimulerer enhver celleskade forårsaget af sygdom eller traumer de resterende endotelceller til at forstørre og migrere, for at dække resulterende defekter og for at opretholde hornhindens funktionalitet5. Men hvis CEC tæthed falder til under en kritisk tærskel, decompensation af endotel fører til et ødem, resulterer i sløret syn og ubehag eller endda alvorlige smerter4. På trods af tilgængeligheden af lægemidler til at lindre symptomerne, i øjeblikket den eneste endelige behandling i disse tilfælde er hornhinde transplantation, som kan udføres i form af en fuld tykkelse graft eller en lamel endotel transplantation. Sidstnævnte procedure er tilgængelig som Descemets membran endotel keratoplasty (DMEK) samt Descemet's stripping automatiseret endotel keratoplasty (DSAEK)6. Men beskyttelsen af resterende CEC og forbedre deres overlevelse kunne være et alternativt mål, som har brug for en passende sygdommodel til at teste potentielle terapeutiske lægemidler.
De nuværende CEC-tabssygdomsmodeller fokuserer på ødelæggelse af endotel ved injektion af giftige agenser (f.eks. benzalkoniumchlorid) i det forreste kammer eller ved mekanisk slid af cellerne ved hjælp af en invasiv descemetorhexis-teknik7,8. Mens disse modeller er veletablerede, ulemper såsom generel inflammatorisk respons og upræcise følgeskader findes. Derfor er disse modeller er mere tilbøjelige til at repræsentere de sidste stadier af sygdommen, når de ovennævnte kirurgiske muligheder er uundgåelige.
Med fremskridt inden for cellulære behandlingsstrategier såsom stamceller og genterapi kan anvendelsen af disse cellulære behandlinger være nyttig i de tidlige stadier af CEC-tab9. Derefter har vi brug for en model, der repræsenterer disse tidligere stadier af sygdommen mere hensigtsmæssigt. I denne henseende er cellekulturmodellerne blevet bedre i løbet af det seneste årti, men er stadig begrænset i deres gyldighed, da celler in vitro ikke kan komme tæt på at gentage de komplekse interaktioner, der opstår mellem de forskellige celletyper i hornhinden10. Derfor er ex vivo og in vivo sygdom modeller stadig i høj efterspørgsel og forbedre de eksisterende er af største interesse.
Noninvasive, intraokulær kirurgi ved photodisruption ved hjælp af en neodym: YAG (Nd:YAG) laser er blevet en rutinemæssig procedure for øjenlæger over hele verden siden dens indførelse i slutningen af 1970'erne11. Photodisruption er afhængig af ikke-lineær lysabsorption, der fører til dannelse af plasma, generation af akustiske chokbølger, og skabelse af kavitationsbobler, når påføringsstedet er placeret i et flydende miljø12. Generelt bidrager disse processer til den tilsigtede virkning af præcis vævsskæring. Men, de kan også være kilden til unødvendige følgeskader begrænse den lokale indespærring af laser kirurgi13.
Forudsigelsen af de deraf følgende mekaniske virkninger er blevet væsentligt forbedret gennem karakterisering af chokbølgen formering og kavitation kursus. Det er vores mål at målrette CEC med så lidt skade på omgivende væv som muligt at give en noninvasive, laser-assisteret eksperimentel sygdom model for de tidlige stadier af CEC tab. Til dette formål er det nødvendigt at bestemme de optimale pulsenergier og positioner af laserens brændpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer animalsk væv, følger retningslinjerne fra den lokale dyrepleje- og etiske komité.
1. Forberedelse af organkultur og laserbehandling
- Få frisk enucleated svin øjne fra det lokale slagteri. Hold dem afkøles (4 °C) i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med høj glukose, suppleret med L-glutamin, natriumpyruvat, penicillin/streptomycin (1%), og svineserum (10%), fremover benævnt i denne artikel som fuld medium.
- Fjern ekstracellulære væv med en saks og suge øjnene i 5% povidon-jod oftalmologiske opløsning i 5 min før du placerer dem i steriliseret fosfat-buffered saltvand (PBS) indtil brug.
- Screen øjne for større anterior segment patologier, såsom hornhinde ardannelse, ødem, og andre uklarheder med en spektral-domæne optisk sammenhæng tomografi enhed (Table of Materials).
- Placer øjnene foran en slidslampe enhed udstyret med en Nd:YAG laser (Table of Materials), som har en bølgelængde på 1.064 nm og en brændpunkt diameter på 10 μm i luft.
BEMÆRK: For optimal placering anvendes et 3D-printet holdeapparat, som er designet til at holde øjet fast, uden at lægge for meget pres på det (Figur 1). - Brug en forstørrelse på 12x og aflede belysningen til at visualisere de enkelte hornhindelag.
- Indstil pulsenergien (f.eks. 1,6 mJ) og fokuspunktet (f.eks. 0,16 mm) til selektiv ablation af endotelceller.
- Placer en klar hornhinde paracentesis tæt på limbus og injicere viskoelastisk (Tabel af materialer) for at stabilisere den forreste kammer.
- Punktafgifter laser-behandlede centrale hornhinde ved hjælp af en 8 mm trephin.
- Den punkterede hornhinde anbringes i en brønd af en 12-brøndsplade med endotelstedet vendt opad og inkuberprøven i 3 ml af det fulde medium ved 37 °C i op til 3 dage.
BEMÆRK: Potentielle cytobeskyttende midler kan føjes til mediet i løbet af dette trin.
2. Forberedelse til histologi
- Klargør Sørensens buffer med en pH-visning på 7,4, der indeholder 19,6 ml 133 mM KH2PO4 og 80,4 ml 133 mM Na2HPO4.
- Mediet fjernes fra hornhinden, der indeholder brønden, og fikser vævet i 20 min. ved stuetemperatur (RT) med methanolfri paraformaldehyd (4 %) i Sørensens buffer.
- Væv anbringes i 20% i PBS, indtil væv synker (1 time) og derefter i 30% saccharose i PBS natten over ved RT. Pas på at undgå kontakt med bobler og luftoverfladens grænseflade. Integrer væv i optimal skæretemperatur (OLT) sammensatte og opbevares ved -80 °C.
- Skær sektionerne 10 μm tykke ved hjælp af en kryostat ved -27 °C.
BEMÆRK: En kamel hårbørste er nyttig til at hjælpe guide den nye sektion over knivbladet. - Overfør sektionen til et mikroskop dias ved at røre diaset til vævet inden for 1 minut for at skære det for at undgå frysetørring af vævet. Opbevar objektglassene ved -80 °C.
3. Hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning
- Lufttørre sektioner i flere minutter for at fjerne fugt.
- Pletten med filtreret 0,1% Mayers hematoxylin i 10 min i et 50 ml rør.
- I en Coplin krukke skylles i køligt kørende ddH2O i 5 minutter og dyppes i 0,5% eosin 10x.
- Dyp i ddH2O indtil eosin stopper striber og derefter dyppe i 50% (10x) samt 70% (10x) EtOH.
- Ækvilibrere i 95% EtOH (30 s) og 100% EtOH (60 s) før dypning i xylen flere gange.
- Endelig montere og dækkeslip prøven, før du tager billeder ved hjælp af en lys mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, behandlede vi øjne med en Nd:YAG laser, der evaluerer forskellige pulsenergier (1,0−4,6 mJ) og positioner af brændpunkter (afstand fra den bageste overflade af hornhinden: 0,0−0,2 mm) for at finde de optimale parametre. Flere replikater (n = 3) blev evalueret for hver konstellation af laserparametrene (12 x 21).
Ud over ovennævnte protokol blev prøven analyseret med et tofotonmikroskop før fiksering og H&E-farvning. De to-foton mikroskop brugt en solid-state, mode-låst 80 MHz Ti: safir laser med en tuning rækkevidde på 690−1b040 nm og en gennemsnitlig laser output på > 900 mW ved 800 nm som lyskilde. Det leverede impulser med en bredde på ca. 150 fs til prøven. Billeder blev taget med et mikroskop mål (20x/0.95) ved en bølgelængde på 730 nm og 30 mW lasermagt.
Tofoton- og lysmikroskopibilleder blev uafhængigt gennemgået af 3 anmeldere, som var blindt for eksperimentelle indstillinger og måtte tildele billederne til tre kategorier: (1) ingen skade, (2) for meget skade, eller (3) ret mængde skade (Figur 2 og Figur 3). På grundlag af deres evaluering blev der beregnet et varmekort (figur 4). Ved hjælp af denne heatmap er det muligt at vælge den rigtige konstellation af laserparametre til selektivt at ablate CEC med minimal skade på omgivende væv (grøn). Resultaterne viser, at laserens omdrejningspunkt skal være mindst 0,15 mm bag hornhindens endotel for den laveste pulsenergi (1,0 mJ), der testes. For pulsenergier på over 2,9 mJ er den længste testede brændvidde (0,2 mm) stadig for tæt på endotel.
Figur 1: Eksperimentel opsætning. (A) Øjnene blev fastgjort i et delvist 3D-printet holdeapparat, som tillod præcis justering med hensyn til laserstrålen. (B) Før laserbehandling blev vævet evalueret med en optisk kohærenstomografienhed i det første segment for at kontrollere, om der er større patologier i det tidligere segment. Positioner af fokale laserpunkter er angivet med eksemplarisk for 0,0 mm (sort stjerne), 0,1 mm (rød stjerne), og 0,2 mm (blå stjerne). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mikroskopi med to fotoner. Resultaterne varierede fra ingen skade overhovedet (A), omfattende følgeskader (B) til selektiv ablation af endotelceller (C). Den røde pilespids viser en bristet Descemets membran, og grønne pilespidser indikerer selektiv ablation af CEC-klynger. Skalabar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Histologi. Hæmatoxylin og eosin farvning bekræftede skaden spænder fra ingen skader overhovedet (A), omfattende følgeskader (B) til selektiv ablation af endotelceller (C). Den røde pilespids viser en bristet Descemets membran, og grønne pilespidser indikerer selektiv ablation af CEC-klynger. Skalabar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Et heatmap, der viser sandsynligheden for selektiv CEC-skade. I denne henseende skal pulsenergien samt placeringen af Nd:YAG laseromdrejningspunktet tages i betragtning. Overdreven skade vises med rødt, og den ønskede del af skaden vises med grønt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resultaterne af denne pilotundersøgelse viser, at en Nd:YAG-laser kan anvendes til selektivt at ablate hornhinde endotelceller, når der vælges passende parametre for energidosis og fokuspunktsposition.
Da endotelfunktionen er vigtig for hornhindens gennemsigtighed og beskyttelse af hornhinden mod stromale ødem, spiller modeller af endoteldysfunktion en vigtig rolle i udviklingen af anti-ødemerende lægemidler eller kirurgiske procedurer. Der er flere etablerede in vitro modeller til efterligning af in vivo situation10,14,15, men som almindeligt kendt, in vitro modeller kan ikke helt efterligne påvirkninger af enzymer og cytokiner eller effekten af celle-celle-interaktion. I modsætning hertil giver denne nyudviklede ex vivo-model af endotelcelletab mulighed for at overvåge forskellige tilstande af sygdommen og afkompensation af hornhinden i det naturlige miljø.
Som hornhinden i vores model er punkteret med en trephine efter laser procedure, fysiologi af hornhinden ændringer og ligner in vitro situation, regionale interaktioner er betydeligt hæmmet. Men den lokale grænseflade forbliver intakt, og især den cellulære kommunikation til andre celler i hornhinden fortsætter. Vores undersøgelse viste, at under disse omstændigheder hornhinden fastholder sin funktion i tre dage i kultur, som giver tilstrækkelig tid til at observere og evaluere potentielle terapeutiske midler. På den anden side kan longtime helbredende processer ikke undersøges.
I vores model brugte vi svin øjne som større mængder af disse let kan opnås. Desuden svin øjne efterligne menneskelige øjne meget godt. I modsætning til kaniner, der regelmæssigt anvendes til forsøg, svin øjne har en Bowman's membran. Ikke desto mindre, hornhinden tykkelse af svin øjet adskiller sig betydeligt fra det menneskelige øje. Især svin stroma er meget tykkere, og der er ingen forskel mellem centrale og perifere tykkelse i svin hornhinder16. Det skal også tages i betragtning, at cec-humant CEC ikke har nogen helbredende evne, mens denne regenerative funktion rapporteres hos nogle dyr, såsom svin og kaniner17,18. Vores undersøgelse fokuserede ikke på sårheling processer, men denne forskel bør holdes for øje, når oversætte resultater. Da sårheling af dyr CEC ikke overstiger fire dage, kan det stadig observeres i vores kultiverede væv, selv om de kun varer i tre dage.
Sammenligner vores eksperimentelle setup med tidligere undersøgelser, de anvendte energi niveauer var ens19. I stedet for kun at fokusere på endotel, blev forskellige steder af knudepunkter evalueret. Derfor er den største forskel i vores setup til tidligere undersøgelser dens potentiale til at fremkalde specifikke endotelskader uden at beskadige hverken DM eller stromale væv. Nøjagtig overvågning af energidosis og fokusposition muliggør selektiv CEC-ablation uden at forårsage stødbølgeskader på andre dele af hornhinden. Også, vi har ikke bemærket stromale eller subepithelial ødem direkte efter laser behandling20.
En tidligere undersøgelse viste, at temperaturer på ~ 40 °C kan føre til CEC-skader21. Vi har ikke måle den inducerede temperatur, men det kan være af interesse for yderligere undersøgelser. Desuden bør virkningen af forskellige typer lasersystemer evalueres. Tidligere undersøgelser viste en forskel mellem laserinduceret afskåret CEC-skade og andre CEC-skader19,22. Dette kan også begrænse sammenligneligheden med humane væv og sygdomme, fordi laser induceret skade synes at blive efterfulgt af forskellige sygdomsudviklingsprocesser. Interessant, sårheling efter laser ansøgning stoppet ved den brændte DM i tidligere undersøgelser19. Skadeskilden kan være mindre vigtig, hvis DM forbliver intakt.
Højere energiniveauer kan udgøre en højere risiko for længere skade22. Vores resultater viser, at brug af højere energiniveauer (<2,9 mJ) til selektiv CEC-skader kræver et tættere fokusområde. Mens skaden på CEC blev mekanisk anvendt i tidligere undersøgelser17, laser-induceret skade, der anvendes her har en mere præcis dosering af læsionen og kan let bruges i in vivo undersøgelser.
Det skal bemærkes, at kun et lille antal øjne er blevet behandlet og undersøgt i henhold til denne protokol. Som nævnt ovenfor kan der være interindividuelle forskelle i reaktionen på laserbehandlingen samt forskelle mellem hornhinderne af forskellige dyrearter. Da CEC-skader kan produceres på forskellige brændpunkter, bør visse tærskler ikke overskrides for at undgå længere skader.
Endelig blev de læsioner, der blev genereret i denne undersøgelse, placeret i den centrale del. En tidligere undersøgelse af svin øjne viste accelereret sårheling i hornhinden periferien, hvilket kan skyldes dens nærhed til limbale stamceller17 som hornhinden tykkelse i svin øjne ikke adskiller sig mellem regionerne. Det bør evalueres i fremtidige undersøgelser, om laserparametre skal justeres, når der skiftes fra midten af hornhinden til periferien.
Afslutningsvis introducerer vores undersøgelse en noninvasive model for yderligere undersøgelser af CEC dysfunktion. Begrænsninger i ex vivo- eller in vivo-undersøgelser med hensyn til anvendelse af animalsk i stedet for humant væv opretholdes og skal tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Christine Örün og Jan A. M. Sochurek for deres hjælp med eksperimentelle metoder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
- Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
- Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
- He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047 (2016).
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
- Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
- Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
- Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
- Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
- Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
- Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
- Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
- Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
- Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
- Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
- Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).
- Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
- Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
- McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
- Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).
