Summary
Ici, nous présentons un protocole pour détacher les cellules endothéliales cornéennes (CEC) de la membrane de Descemet (DM) à l’aide d’un neodymium:YAG (Nd:YAG) laser comme modèle de maladie ex vivo pour la kératompathie bullous (BK).
Abstract
Nd:YAG lasers ont été utilisés pour effectuer la chirurgie intraoculaire non invasive, comme la capsulotomie depuis plusieurs décennies maintenant. L’effet incisif repose sur la dégradation optique au laser. Des ondes de choc acoustiques et des bulles de cavitation sont générées, provoquant une rupture tissulaire. La taille des bulles et les amplitudes de pression varient en fonction de l’énergie des impulsions et de la position du point focal. Dans cette étude, des yeux porcins enucléés ont été placés devant un laser Nd:YAG disponible dans le commerce. Des énergies variables d’impulsion ainsi que différentes positions des taches focales postérieures à la cornée ont été testées. Les lésions résultantes ont été évaluées par microscopie et histologie à deux photon pour déterminer les meilleurs paramètres pour un détachement exclusif des cellules endothéliales cornéennes (CEC) avec des dommages collatéraux minimaux. Les avantages de cette méthode sont l’ablation précise de la CEC, la réduction des dommages collatéraux, et surtout le traitement sans contact.
Introduction
La transparence de la cornée est essentielle pour la transmission de la lumière à la rétine et ses photorécepteurs1. À cet égard, un état relatif de déshydratation est essentiel pour garder les fibres de collagène dans le stroma cornéen correctement aligné. Cette homéostasie est maintenue par des cellules endothéliales cornéennes (CEC) situées sur la membrane du Descemet (DM)2. L’endothélium est la couche cornéenne la plus intime. Il a une barrière importante et la fonction de pompe, qui est cruciale pour la transparence cornéenne3. Contrairement à l’épithélium, l’endothélium n’est pas en mesure de se renouvelersoi-même 4. Par conséquent, tout dommage cellulaire causé par la maladie ou le traumatisme stimule les cellules endothéliales restantes à agrandir et à migrer, à couvrir les défauts résultants et à maintenir la fonctionnalité cornéenne5. Cependant, si la densité de la CEC tombe en dessous d’un seuil critique, la décompensation de l’endothélium conduit à un œdème, entraînant une vision floue et l’inconfort ou même une douleur sévère4. En dépit de la disponibilité des drogues pour soulager des symptômes, actuellement le seul traitement définitif dans ces cas est la transplantation cornéenne, qui peut être exécutée sous la forme d’une greffe pleine épaisseur ou d’une transplantation endothéliale lamellaire. Cette dernière procédure est disponible sous forme de kératomie endothéliale membrane de Descemet (DMEK) ainsi que de la kératothéplastie endothéliale automatisée de Descemet (DSAEK)6. Cependant, la protection du maintien de la CEC et l’amélioration de leur survie pourraient être une cible alternative, qui a besoin d’un modèle de maladie adéquat pour tester les médicaments thérapeutiques potentiels.
Les modèles actuels de la maladie de perte de CEC se concentrent sur la destruction de l’endothélium par l’injection d’agents toxiques (p. ex., chlorure de benzalkonium) dans la chambre antérieure ou par abrasion mécanique des cellules utilisant une technique invasive de descemétorhexis7,8. Bien que ces modèles soient bien établis, des inconvénients tels que la réponse inflammatoire générale et les dommages collatéraux imprécis existent. Par conséquent, ces modèles sont plus susceptibles de représenter les derniers stades de la maladie, lorsque les options chirurgicales mentionnées ci-dessus sont inévitables.
Avec les progrès dans les stratégies de traitement cellulaire tels que les cellules souches et la thérapie génique, l’application de ces thérapies cellulaires pourrait être utile dans les premiers stades de la perte de CEC9. Par la suite, nous avons besoin d’un modèle qui représente ces premiers stades de la maladie de façon plus adéquate. À cet égard, les modèles de culture cellulaire se sont améliorés au cours de la dernière décennie, mais sont encore limités dans leur validité, que les cellules in vitro ne peuvent pas venir près de reproduire les interactions complexes qui se produisent entre les différents types de cellules dans la cornée10. Par conséquent, les modèles de maladies ex vivo et in vivo sont toujours en forte demande et l’amélioration des modèles existants est d’un intérêt primordial.
La chirurgie intraoculaire non invasive par photodisruption à l’aide d’un laser neodymium:YAG (Nd:YAG) est devenue une procédure de routine pour les ophtalmologistes du monde entier depuis son introduction à la fin des années 197011. La photodissoupstion repose sur l’absorption de la lumière non linéaire conduisant à la formation de plasma, à la génération d’ondes de choc acoustiques et à la création de bulles de cvitation, chaque fois que le site d’application est situé dans un environnement liquide12. En général, ces processus contribuent à l’effet prévu de la coupe précise des tissus. Cependant, ils peuvent également être la source de dommages collatéraux inutiles limitant l’enfermement local de la chirurgie au laser13.
La prédiction des effets mécaniques résultants s’est considérablement améliorée grâce à la caractérisation de la propagation de l’onde de choc et du cours de cvitation. Notre objectif est de cibler la CEC avec le moins de dommages possible aux tissus environnants afin de fournir un modèle de maladie expérimentale non invasif et assisté par laser pour les premiers stades de la perte de la CEC. À cette fin, il est nécessaire de déterminer les énergies et les positions optimales des impulsions du laser.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des tissus animaux suivent les lignes directrices du Comité local de soins aux animaux et d’éthique.
1. Préparation de la culture d’organe et du traitement au laser
- Obtenez des yeux porcins fraîchement enuclésés de l’abattoir local. Gardez-les au frais (4 oC) dans le milieu eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec un glucose élevé, complété par de la L-glutamine, du pyruvate de sodium, de la pénicilline/streptomycine (1 %), et du sérum porcin (10 %), dorénavant appelé moyen complet.
- Enlever les tissus extracellulaires avec des ciseaux et tremper les yeux dans 5% de solution ophtalmique povidone-iode pendant 5 min avant de les placer dans le phosphate stérilisé tamponné saline (PBS) jusqu’à l’utilisation.
- Écran des yeux pour les principales pathologies du segment antérieur, telles que les cicatrices cornéennes, l’oedème, et d’autres opacities avec un dispositif de tomographie de cohérence optique spectral-domaine (Tableau des matériaux).
- Placez les yeux devant une unité de lampe fendue équipée d’un laser Nd:YAG(Tableau des matériaux), qui a une longueur d’onde de 1 064 nm et un diamètre focal de 10 m dans l’air.
REMARQUE : Pour un positionnement optimal, un appareil de détention imprimé en 3D est utilisé, qui a été conçu pour tenir l’œil ferme, sans mettre trop de pression sur elle(figure 1). - Utilisez un grossissement de 12x et dévier l’éclairage pour visualiser les couches cornéennes individuelles.
- Réglez l’énergie de l’impulsion (p. ex. 1,6 mJ) et le point de focalisation (p. ex., 0,16 mm) pour l’ablation sélective des cellules endothéliales.
- Placez une parcentese claire de cornée près du limbus et injectez viscoélastique(tableau des matériaux) pour stabiliser la chambre antérieure.
- Accisez la cornée centrale traitée au laser à l’aide d’une tréphine de 8 mm.
- Placer la cornée excisée dans un puits d’une plaque de 12 puits avec le site endothélial orienté vers le haut et incuber le spécimen en 3 ml de plein milieu à 37 oC pendant 3 jours.
REMARQUE : Des agents cytoprotecteurs potentiels peuvent être ajoutés au milieu pendant cette étape.
2. Préparation à l’histologie
- Préparer le tampon de Sorensen avec un pH de 7,4 contenant 19,6 mL de 133 mM KH2PO4 et 80,4 mL de 133 mM Na2HPO4.
- Retirer le milieu du puits contenant de la cornée et fixer le tissu pendant 20 min à température ambiante (RT) à l’aide de paraformaldéhyde sans méthanol (4 %) dans le tampon de Sorensen.
- Placez le tissu dans 20% de saccharose dans PBS jusqu’à ce que le tissu coule (1 h) et puis dans 30% de saccharose dans PBS pendant la nuit à RT. Veillez à éviter tout contact avec les bulles et l’interface de surface de l’air. Incorporer le tissu dans le composé optimal de température de coupe (OCT) et stocker à -80 oC.
- Couper les sections de 10 m d’épaisseur à l’aide d’un cryostat à -27 oC.
REMARQUE : Une brosse à cheveux de chameau est utile pour aider à guider la section émergente au-dessus de la lame de couteau. - Transférer la section sur une diapositive de microscope en touchant la glissière au tissu dans un délai de 1 min suivant sa coupe pour éviter le séchage du tissu. Conservez les toboggans à -80 oC.
3. Coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H et E)
- Sections sèches à l’air pendant plusieurs minutes pour éliminer l’humidité.
- Tache avec 0,1% d’hématoxyline Mayers filtrée pendant 10 min dans un tube de 50 mL.
- Dans un bocal Coplin, rincez-le dans la course fraîche ddH2O pendant 5 min et trempez dans 0,5% d’éosin 10x.
- Plongez dans ddH2O jusqu’à ce que l’éosine cesse de stries, puis plongez dans 50% (10x) ainsi que 70% (10x) EtOH.
- Équilibre dans 95% EtOH (30 s) et 100% EtOH (60 s) avant de tremper dans le xylène à plusieurs reprises.
- Enfin monter et coverlip le spécimen avant de prendre des images à l’aide d’un microscope léger.
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Representative Results
À l’aide de la procédure présentée ici, nous avons traité les yeux avec un laser Nd:YAG, évaluant différentes énergies d’impulsion (1,0 à 4,6 mJ) et les positions des points focaux (distance de la surface postérieure de la cornée : 0,0 à 0,2 mm) pour trouver les paramètres optimaux. Plusieurs répliques (n - 3) ont été évaluées pour chaque constellation des paramètres laser (12 x 21).
En plus du protocole mentionné ci-dessus, le spécimen a été analysé avec un microscope à deux photon avant fixation et coloration de H et E. Le microscope à deux photon a utilisé un laser à deux photon à l’état solide, verrouillé en mode 80 MHz Ti:sapphire avec une portée de réglage de 690 à 1b040 nm et une puissance laser moyenne de 900 mW à 800 nm comme source lumineuse. Il a livré des impulsions d’une largeur d’environ 150 fs à l’échantillon. Les images ont été prises avec un objectif de microscope (20x/0.95) à une longueur d’onde de 730 nm et 30 mW de puissance laser.
Trois examinateurs ont examiné de façon indépendante des images à deux photon ainsi qu’à des images de microscopie légère, qui ont été aveuglées dans des milieux expérimentaux et qui ont dû attribuer les images à trois catégories : (1) aucun dommage, (2) trop de dommages, ou (3) la quantité droite de dommages(figure 2 et figure 3). Sur la base de leur évaluation, une carte thermique a été calculée(figure 4). À l’aide de cette canicule, il est possible de sélectionner la bonne constellation de paramètres laser pour abler sélectivement ceC avec un minimum de dommages aux tissus environnants (vert). Les résultats montrent que le point focal du laser doit être d’au moins 0,15 mm derrière l’endothélium cornéen pour l’énergie d’impulsion la plus basse (1,0 mJ) testée. Pour les énergies d’impulsion supérieures à 2,9 mJ, la plus longue distance focale testée (0,2 mm) est encore trop proche de l’endothélium.
Figure 1 : Configuration expérimentale. (A) Les yeux ont été fixés dans un appareil de détention partiellement imprimé en 3D, ce qui a permis un alignement précis par rapport au faisceau laser. (B) Avant le traitement au laser, le tissu a été évalué avec un dispositif antérieur de tomographie optique de cohérence de segment pour vérifier les pathologies antérieures principales de segment. Les positions des points laser focals sont indiquées avec une vitesse exemplaire de 0,0 mm (astérisque noir), de 0,1 mm (astérisque rouge) et de 0,2 mm (astérisque bleu). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Microscopie à deux photon. Les résultats allaient de l’absence de dommages du tout (A), dommages collatéraux étendus (B) à l’ablation sélective des cellules endothéliales (C). La pointe de flèche rouge montre la membrane d’un Descemet rompu, et les pointes de flèche vertes indiquent une ablation sélective des grappes ceC. Barre d’échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Histologie. La coloration de l’hématoxyline et de l’éosine a confirmé la portée des dommages de l’absence de dommages du tout (A), dommages collatéraux étendus (B) à l’ablation sélective des cellules endothéliales (C). La pointe de flèche rouge montre la membrane d’un Descemet rompu, et les pointes de flèche vertes indiquent une ablation sélective des grappes ceC. Barre d’échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Une carte thermique montrant la probabilité de dommages sélectifs à la CEC. À cet égard, l’énergie de pouls ainsi que la position du point focal laser Nd:YAG doivent être pris en compte. Les dommages excessifs sont indiqués en rouge, et la partie désirée des dommages est indiquée en vert. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les résultats de cette étude pilote indiquent qu’un laser Nd:YAG peut être utilisé pour abler sélectivement les cellules endothéliales cornéennes lorsque des paramètres appropriés pour la dose d’énergie et la position de point de focalisation sont choisis.
Comme la fonction endothéliale est importante pour la transparence cornéenne et la sauvegarde de la cornée contre l’oedème stromal, les modèles de dysfonctionnement endothélial jouent un rôle important dans le développement de médicaments anti-edematous ou de procédures chirurgicales. Il existe plusieurs modèles in vitro établis pour imiter la situation in vivo10,14,15, mais comme généralement connu, les modèles in vitro ne peuvent pas imiter complètement les influences des enzymes et des cytokines ou l’effet de cellule-cellule-interaction. En revanche, ce modèle ex vivo nouvellement développé de la perte de cellules endothéliales offre la possibilité de surveiller différents états de la maladie et la décompensation cornéenne dans l’environnement naturel.
Comme la cornée dans notre modèle est excisée avec une tréphine après la procédure laser, la physiologie des changements de cornée et similaire à la situation in vitro, les interactions régionales sont significativement entravées. Cependant, l’interface locale reste intacte et en particulier la communication cellulaire à d’autres cellules dans la cornée persiste. Notre étude a révélé que dans ces circonstances la cornée maintient sa fonction pendant trois jours dans la culture, ce qui offre suffisamment de temps pour observer et évaluer les agents thérapeutiques potentiels. D’autre part, les processus de guérison de longue date ne peuvent pas être étudiés.
Dans notre modèle, nous avons utilisé des yeux porcins comme de plus grandes quantités de ceux-ci peuvent être facilement obtenus. En outre, les yeux porcins imitent très bien les yeux humains. Contrairement aux lapins qui sont régulièrement utilisés pour l’expérience, les yeux porcins ont une membrane de Bowman. Néanmoins, l’épaisseur cornéenne de l’œil porcin diffère considérablement de l’œil humain. En particulier, le stroma porcin est beaucoup plus épais et il n’y a aucune différence entre l’épaisseur centrale et périphérique dans les cornées porcines16. Il faut également considérer que la CEC humaine n’a aucune capacité de guérison alors que cette caractéristique régénératrice est rapportée chez certains animaux, tels que les porcs et les lapins17,18. Notre étude ne s’est pas concentrée sur les processus de cicatrisation des plaies, mais cette différence doit être gardée à l’esprit lors de la traduction des résultats. Comme la cicatrisation des plaies de la CEC animale ne dépasse pas quatre jours, elle pourrait encore être observée dans nos tissus cultivés, même si elles ne durent que trois jours.
En comparant notre configuration expérimentale avec des études antérieures, les niveaux d’énergie appliquée étaient similaires19. Au lieu de se concentrer uniquement sur l’endothélium, différents endroits des points focaux ont été évalués. Par conséquent, la principale différence de notre configuration à des études antérieures est son potentiel d’induire des dommages endothéliaux spécifiques sans endommager le DM ou le tissu stromal. Une surveillance précise de la dose d’énergie et de la position de mise au point permet une ablation sélective de la CEC sans causer de dommages aux ondes de choc à d’autres parties de la cornée. Aussi, nous n’avons pas remarqué l’oedème stromal ou subépithelial directement après le traitement au laser20.
Une étude précédente a montré que des températures de 40 oC peuvent entraîner des dommages à la CEC21. Nous n’avons pas mesuré la température induite, mais elle pourrait intéresser d’autres études. En outre, l’effet de différents types de systèmes laser devrait être évalué. Des études antérieures ont montré une différence entre les dommages induits au laser ceC circonscrits et d’autres blessures ceC19,22. Cela pourrait également limiter la comparabilité aux tissus humains et aux maladies parce que les dommages induits par le laser semblent être suivis par différents processus de développement de la maladie. Fait intéressant, la cicatrisation de blessure après l’application de laser arrêté au DM brûlé dans les études antérieures19. La source de blessures pourrait être moins importante si le DM reste intact.
Des niveaux d’énergie plus élevés peuvent présenter un risque plus élevé de blessures prolongées22. Nos résultats montrent que l’utilisation de niveaux d’énergie plus élevés (2,9 mJ) pour les dommages sélectifs à la CEC nécessite une plage de concentration plus serrée. Tandis que les dommages à CEC ont été mécaniquement appliqués dans les études précédentes17,dommages laser-induits utilisés ici a un dosage plus précis de la lésion et peut être facilement employé dans des études in vivo.
Il convient de noter que seul un petit nombre d’yeux ont été traités et examinés selon ce protocole. Comme mentionné ci-dessus, il pourrait y avoir des différences interindividuelles dans la réponse au traitement au laser ainsi que les différences entre les cornées de différentes espèces animales. Étant donné que les dommages causés par la CEC peuvent être produits à différentes positions focales, certains seuils ne doivent pas être dépassés pour éviter des dommages prolongés.
Enfin, les lésions générées dans cette étude ont été placées dans la partie centrale. Une étude antérieure des yeux porcins a montré la guérison accélérée de blessure dans la périphérie cornéenne, qui pourrait être due à sa proximité aux cellules souches limbales17 car l’épaisseur cornéenne dans les yeux de porcine ne diffère pas d’une région à l’autre. Il devrait être évalué dans de futures études si les paramètres laser doivent être ajustés lors du passage du centre de la cornée à la périphérie.
En conclusion, notre étude introduit un modèle non invasif pour d’autres investigations sur le dysfonctionnement de la CEC. Les limites des études ex vivo ou in vivo en termes d’utilisation des tissus animaux au lieu du tissu humain demeurent et doivent être prises en considération lors de l’interprétation des résultats.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Christine 'ron et Jan A. M. Sochurek pour leur aide à l’expérimentation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
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